UNIVERSIDADE DO VALE DO PARAÍBA
INSTITUTO DE PESQUISA E DESENVOLVIMENTO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA BIOMÉDICA
CLEBER NUNES DE ALMEIDA
PRODUÇÃO E BIOCOMPATIBILIDADE DE FILMES DE CARBONO-TIPO
DIAMANTE CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE DIAMANTE
INCORPORADAS VISANDO RECOBRIMENTO DE FIXADORES
EXTERNOS
SÃO JOSÉ DOS CAMPOS-SP
2012
CLEBER NUNES DE ALMEIDA
PRODUÇÃO E BIOCOMPATIBILIDADE DE FILMES DE CARBONOTIPO DIAMANTE CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE DIAMANTE
INCORPORADAS VISANDO RECOBRIMENTO DE FIXADORES
EXTERNOS
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Engenharia Biomédica, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do título de Mestre em Engenharia
Biomédica.
Orientadora: Profa. Dra. Fernanda Roberta Marciano
Co-orientador: Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo
SÃO JOSÉ DOS CAMPOS-SP
2012
TERMO DE AUTORIZAÇÃO DE DIVULGAÇÃO DA OBRA
Ficha catalografica
M545a
Almeida, Cleber Nunes de
Produção e biocompatibilidade de filmes de carbono-tipo diamante contendo
nanopartículas de diamante incorporadas visando recobrimento de fixadores externos /
Cleber Nunes de Almeida; Orientadora: Profa. Dra. Fernanda Roberta Marciano, Coorientador: Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo. – São José dos Campos, 2013.
87p., 1 disco laser: Color
Universidade do Vale do Paraíba, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento. Programa de
Pós-Graduação em Engenharia Biomédica.
Inclui referências
1. Engenharia Biomédica 2. Materiais biomédicos. 3. Materiais nanoestruturados.
4.
Fixadores Externos. I. Marciano, Fernanda Roberta, orient. II. Lobo, Anderson de Oliveira,
orient. III. Universidade do Vale do Paraíba, Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento.
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica. IV. Título.
Eu, Cleber Nunes de Almeida, autor da obra acima referenciada:
CDU: 62:61
Autorizo a divulgação total ou parcial da obra impressa, digital ou fixada em outro tipo de
mídia, bem como, a sua reprodução total ou parcial, devendo o usuário da reprodução atribuir
os créditos ao autor da obra, citando a fonte.
São José dos Campos, 18 de julho de 2013
_________________________________
Autor da Obra
Defesa em: 17 de dezembro de 2012.
Cleber Nunes de Almeida
PRODUÇÃO E BIOCOMPATIBILIDADE DE FILMES DE CARBONOTIPO DIAMANTE CONTENDO NANOPARTÍCULAS DE DIAMANTE
INCORPORADAS VISANDO RECOBRIMENTO DE FIXADORES
EXTERNOS
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, do
Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da
Universidade do Vale do Paraíba, São José dos Campos, SP, pela seguinte banca examinadora:
___________________________________________________________________
Profa. Dra. Fernanda Roberta Marciano (UNIVAP)
_____________________________________________________________
Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo (UNIVAP)
______________________________________________________________
Profa. Dra. Gislene Valdete Martins (INPE)
______________________________________________________________
Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares (UNIVAP)
_____________________________________________________________
Profa. Dra. Sandra Maria Fonseca Costa
Diretora do IP&D – UNIVAP
São José dos Campos, 17 de dezembro de 2012.
À minha mãe Cicera, minha esposa Gerusa e meu filho Thales.
AGRADECIMENTOS
A Deus eminha mãe Cicera sem os quais nada disto seria possível.
Minha esposa Gerusa e meu filho Thales, pela paciência nos momentos de minha
ausência e verdadeiro apoio.
Meus irmãos e amigos pela força e incentivo.
A Profa. Dra. Fernanda Roberta Marciano e Prof. Dr. Anderson de Oliveira Lobo por
me orientarem e acreditarem em mim.
A Profa. Dra. Cristina Pacheco Soares e Prof. Dr. Newton Soares da Silva pela
atenção, paciência e pelo espaço no laboratório de cultura celular.
A Profa. Ms. Luciene Reginato Chagas nas orientações no estágio docência.
Aos meus colegas e amigos de doutorado, mestrado e iniciação cientifica.
Ao Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba pela
formação em nível de pós-graduação e pela oportunidade de realização desta dissertação de
Mestrado.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE), nas pessoas do Prof.Dr.
Vladimir Jesus Trava Airoldi, Prof. Dr. Evaldo José Corat e Prof. Dr. Bruno Bacci, também
do INPE.
"QUEM OBSERVA O VENTO NUNCA SEMEARÁ, E O QUE OLHA PARA AS
NUVENS NUNCA SEGARÁ". EC 11: 4.
RESUMO
Fixadores externos são uma das formas de tratamento para fraturas de ossos na qual permite o
alinhamento e a estabilização óssea através de haste, pinos e fios a fim de fornecer um
ambiente propício para a recuperação. Estes instrumentos em sua maioria são constituídos de
aços inoxidáveis (AISI 316L ou F-138) devido a sua biocompatibilidade e seu baixo custo.
Todavia, estando dentro das especificações de biocompatibilidade, ainda há uma gama de
risco de complicações que podem decorrer durante este tratamento, sendo uma delas a
corrosão do material e a liberação de íons ao organismo levando a resposta inflamatória e
dificuldade de cicatrização. Uma das propostas é reduzir estas complicações através do
revestimento da superfície do material por filmes de carbono tipo-diamante (DLC), que
possuem diversas qualidades como biomaterial. Os filmes de DLC contendo nanopartículas
de diamante cristalino (NDC) incorporadas em sua estruturase mostraram mais protetores
contra a corrosão eletroquímica. Todavia, esse filme de NDC-DLC, ainda não havia sido
testado biologicamente. Este estudo traz a caracterização biológica do filme de NDC-DLC,
através de testes in vitro com células L929 (fibroblastos), por meio de ensaios colorimétricos
MTT e LDH liberado, microscopia eletrônica de varredura, microscopia de fluorescência,
ângulo de contato, energia de superfície, força de adesão e rugosidade. Foi possível concluir
que o filme de NDC-DLC pode ser uma alternativa para o revestimento em fixadores externos
de fraturas ósseas, a fim de se proteger o material contra a corrosão e liberação de íons e
assim melhorar sua biocompatibilidade.
Palavras-chave: carbono tipo-diamante, nanopartículas de diamante, células L929, fixadores
externos, biocompatibilidade.
ABSTRACT
External fixators are one of the ways of treating bone fractures in which allows alignment and
stabilization marrow stem through, pins and wires in order to provide an environment
conducive to recovery. These instruments are mostly made of stainless steel (AISI 316l or F138) due to its biocompatibility and low cost. However, being within the specifications of
biocompatibility, there is a range of risk of complications that can arise during this treatment.
One being the corrosion of the material and ions release to the body leading to inflammatory
response and poor wound healing. One proposal is to reduce these complications by coating
the surface of the material by diamond-like carbon (DLC) films, which have different
qualities as a biomaterial. Nanocrystalline diamond (NCD) particles-incorporated DLC films
improved their corrosion protection. However, NCD-DLC films have never tested
biologically. This study characterize NCD-DLC films through in vitro assays with L929 cells
(fibroblasts) using MTT and LDH release colorimetric assays, scanning electron microscopy,
fluorescence microscopy, contact angle, surface energy,adhesion force and roughness. It was
possible to conclude that NCD-DLC films can be an alternative to coating external fixators
for bone fractures, in order to protect the material against corrosion and ion release and
thereby improve their biocompatibility.
Keywords: diamond-like
biocompatibility.
carbon,
diamond
nanoparticles,
L929,
external
fixators,
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Fixador externo de quadril e fêmur. .......................................................................... 18
Figura 2. Diagrama de equilíbrio de fases ternário .................................................................. 19
Figura 3. Sistema de deposição de PECVD (a), e interior da câmera de deposição com o
catodo refrigerado (b) ............................................................................................................... 26
Figura 4. Espectros Raman de filmes de DLC e NDC-DLC. ................................................... 35
Figura 5. Viabilidade celular (método MTT) x Amostras. Em 96h de plaqueamento de células
L929 .......................................................................................................................................... 36
Figura 6. Microscopia Eletrônica de varredura de fibroblastos (L929) sobre a superfície das
amostras. Após 96h de plaqueamento. (A) Filmes de DLC; (B) Filmes de NDC-DLC nas
concentrações 0,1; (C) 0,3; (D) 0,5; (E) Fragmentos de látex; (F) Aço AISI 316L. As
concentrações de NDC são g/L em hexano e a barra de erros corresponde ao desvio padrão de
5 amostras diferentes. ............................................................................................................... 37
Figura 7. LDH-Liberado por células x Amostras. Em 96h de plaqueamento de células L929.
As concentrações de NDC são g/L em hexano e a barra de erros corresponde ao desvio padrão
de 5 amostras diferentes. .......................................................................................................... 38
Figura 8. Microscopia de fluorescência de fibroblastos (L929) espalhados sobre a superfície
das amostras. Após 96h de plaqueamento. (a) aço AISI 316L e (b) filmes de DLC; e filmes de
NDC-DLC nas concentrações (c) 0,1, (d) 0,3 e (e) 0,5 g/L...................................................... 39
Figura 9. Energia livre de adesão celular (mJm) e Componentes de energia de superfície
(mN/m) x Amostras. As concentrações de NDC são g/L em hexano ...................................... 41
Figura 10. Rugosidade Rt (µm) x Amostras. As concentrações de NDC são g/L em hexano . 42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Sequência de passos iniciais para a deposição do filme de DLC. ............................ 27
Tabela 2. Resultados dos Espectros Raman de filmes de DLC e NDC-DLC. ......................... 34
Tabela 3. Ângulo de contato formado na superficie das Amostras por 3µL de água e
diiodometano. As concentrações de NDC são g/L em hexano e a barra de erros corresponde
ao desvio padrão de 5 amostras diferentes. .............................................................................. 40
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
a-C:H – Carbono Amorfo Hidrogenado
C6H14 – Hexano
CH4 – Metano
CO2– Dióxido de carbono
DAPI -(4’, 6-diamidino-2-fenilindol)
DLC – Diamond-LikeCarbon (Carbono tipo-diamante)
DC – Directcurrent (corrente direta)
DMEM – Meio de Eagle modificado por Dulbecco
DMSO – Dimetilsulfóxido
ELISA – EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay (Teste imunoenzimático)
HMDS – Hexadimetilsulfoxido
LDH- Lactado desidrogenase
MEM – Minimal essencial medium(meio mínimo essencial)
MEV – Microscopia Eletrônica de Varredura
MTT – Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difeniltetrazólio
NDC – Nanopartículas de diamante cristalino
nm - Nannmetro
PECVD – Plasma EnhancedChemical Vapor Deposition (Deposição Química na Fase Vapor
Assistida por Plasma)
PBS – PhosphateBuffered Saline (Salina Tamponada com Fosfato)
Rt – Rugosidade total
Sccm - Standard centimeter cubic per second
SFB – Soro fetal bovino
SiH4 – Silano
ta-C – Carbono amorfo tetraédrico não hidrogenado
ta-C:H – Carbono amorfo tetraédrico hidrogenado
µm – Micrometro
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .......................................................................................................... 14
1.1
Objetivo geral............................................................................................................. 15
1.2
Objetivos específicos..................................................................... .............................15
2
REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 16
2.1
Fixadores externos ..................................................................................................... 16
2.2
Filmes finos de carbono tipo diamante (DLC) ........................................................ 257
2.2.1
Biocompatibilidade de filmes de DLC .................................................................... 258
2.2.2
Limitações no uso do filme ...................................................................................... 258
2.2.3
Células L929 ............................................................................................................ 259
2.2.4
Espectroscopia Raman ............................................................................................... 20
2.2.5
Teste colorimétricos de citotoxicidade ...................................................................... 21
2.2.6
Análise morfológica e adesão celular ........................................................................ 21
2.2.7
Molhabilidade, energia de superficie e força de adesão ............................................ 22
2.2.8
Rugosidade e adesão celular ...................................................................................... 23
3
MATERIAIS E MÉTODOS ...................................................................................... 24
3.1
Caracterização do aço ortopédico .............................................................................. 24
3.2
Preparação e limpeza dos substratos .......................................................................... 25
3.3
Deposição dos filmes de DLC e NDC-DLC .............................................................. 26
3.4
Espectroscopia Raman ............................................................................................... 27
3.5
Caracterização biológica dos filmes de DLC e NDC-DLC ....................................... 27
3.5.1
Plaqueamento de células L-929 sobre amostras ........................................................ 28
3.5.2
Ensaio MTT ............................................................................................................... 29
3.5.3
Microscopia Eletrônica de Varredura ........................................................................ 29
3.5.4
Ensaio LDH-Liberado................................................................................................ 30
3.5.5
Microscopia Óptica de Fluorescência ........................................................................ 31
3.5.6
Molhabilidade das amostras....................................................................................... 31
3.5.7
Enêrgia de Superficie e Força de Adesão .................................................................. 31
3.5.8
Análise da rugosidade ................................................................................................ 32
3.5.9
Análise estatística ...................................................................................................... 32
4
RESULTADOS ......................................................................................................... 33
4.1
Caracterização do aço ortopédico .............................................................................. 33
4.2
Raman ........................................................................................................................ 33
4.3
Caracterização biológica dos filmes de DLC e NDC-DLC ....................................... 35
4.3.1
Ensaio colorimétrico .................................................................................................. 35
4.3.2
Microscopia Eletrônica de Varredura ........................................................................ 36
4.3.3
Ensaio LDH-Liberado............................................................................................... 37
4.3.4
Microscopia Óptica de Fluorescência ........................................................................ 38
4.3.5
Molhabilidade e Ângulo de Contato .......................................................................... 39
4.3.6
Enêrgia de Superficie e Força de Adesão .................................................................. 39
4.3.7
Rugosidade................................................................................................................. 40
5
DISCUSSÃO ............................................................................................................. 41
6
CONCLUSÕES ......................................................................................................... 45
7
TRABALHOS FUTUROS ........................................................................................ 45
REFERENCIAS ....................................................................................................................... 46
15
1
INTRODUÇÃO
O tratamento de fraturas ósseas pode ser auxiliado por fixadores externos que devem
ser constituídos de materiais biocompatíveis e resistentes a corrosão em meio biológico.
Sendo assim, o revestimento da superfície destes fixadores por filmes de carbono tipodiamante (diamond-like carbon, DLC), incorporado com nanopartículas de diamante
cristalino (NDC-DLC); pode trazer estes benefícios e melhorar a compatibilidade do material
por diminuir a adesão celular através da hidrofobicidade das nanopartículas.
A ocorrência de fraturas ósseas está relacionada a fatores que podem ser intrínsecos ao
indivíduo como idade, doenças, hereditariedade, entre outras; e a fatores extrínsecos como
trauma, acidentes automobilísticos, lesões desportivas, etc. (CAMARGO, 2003). O uso de
fixadores externos é uma das formas de tratamento a fraturas ósseas, na qual permite o
alinhamento e a estabilização a fim de fornecer um ambiente propício para a recuperação
(SILVA; OLIVEIRA, 2011).
A superfície de implantação de um fixador externo é a zona de contato entre o material
e o organismo, onde ocorre todo o problema de rejeição do tecido biológico. Além das boas
propriedades mecânicas e químicas que os materiais devem possuir, os mesmos têm que ser
biocompatíveis (ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2008). Sendo assim, o tratamento de
superfícies ou a sua modificação pode superar tal problema, do ponto de vista de uma boa
interação com o corpo humano, como na estabilização da corrosão e desgaste (BOSETTI et
al., 2002; ESCUDEIRO, 2010).
Os revestimentos de DLC surgiram como uma possível resposta a tais problemas,
devido às excelentes propriedades mecânicas e tribológicas que apresentam, além de serem
biocompatíveis. Em especial, os filmes de DLC contendo nanopartículas de diamante
cristalino incorporados em sua estrutura, produzidos pela primeira vez por Marciano (2011),
mostraram uma excelente capacidade de proteção contra a corrosão eletroquímica ao cloreto
de sódio, chegando a melhorar em cerca de cinco ordens de grandeza sua impedância
dependendo da concentração e do tamanho da partícula de diamante (MARCIANO et al.,
2010; 2011). Entretanto, sua interação biológica ainda não havia sido avaliada.
Havendo estes benefícios com a incorporação de nanopartículas de diamante cristalino
ao filme, o revestimento de aços ortopédicos utilizados em fixadores de fraturas pode
favorecer a alta durabilidade do material, com características anticorrosivas. Todavia, o
estudo de sua biocompatibilidade faz-se necessária para a área biomédica.
16
1.1
Objetivo geral
O objetivo desse trabalho é estudar a biocompatibilidade in vitro de aços ortopédicos
revestidos por filmes de DLC contendo nanopartículas incorporadas de diamante cristalino,
visando à sua aplicabilidade na área ortopédica.
1.2
Objetivos específicos
Os objetivos específicos dessa dissertação são:
•
Caracterizar o aço de uso comum na ortopedia em fixadores externos;
•
Avaliara citotoxicidade dos filmes de NDC-DLC de acordo com a ISO 10993-5;
•
Analisar a interação dos filmes de NDC-DLC com a linhagem celular L-929 de
fibroblastos de camundongos;
•
Avaliar a molhabilidade, ângulo de contato e energia de superfície dos filmes
produzidos;
•
Calcular a força de adesão entre os filmes de NDC-DLC e a linhagem celular;
•
Relacionar a molhabilidade do filme com a sua força de adesão celular.
17
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1
Fixadores externos
Os fixadores externos fazem parte de um grupo de aparelhos metálicos utilizados no
tratamento de fraturas, que permitem a manutenção da rigidez ou estabilidade da estrutura
óssea através de fios ou pinos de aplicação percutânea, confeccionados quase sempre em aço
(SISK, 1983). Em seus estudos, Behrens (1989), relata que os componentes básicos para a
caracterização de um fixador externo são os fios ou pinos de fixação, as hastes de sustentação
longitudinais e os elementos de conexão entre eles [Figura 1].
A indicação e a aplicação correta de um sistema de fixação externa dependem de três
conceitos básicos: conhecimento anatômico da região, da fisiopatologia da lesão e
conhecimento biomecânico do aparelho de fixação externa. Devem ser também consideradas
a habilidade do cirurgião em manipular esses aparelhos e as características socioeconômicas e
psicológicas do paciente (BEHRENS, 1989; BARRAL; GIL; VERGANA; 1988).
As complicações mais comuns causadas pelos fixadores externos podem estar
relacionadas ao paciente como lesões neurovasculares ou muscular, pseudoartrose, fratura
secundária, osteoporose, retardo ou ausência de consolidação óssea e edema do membro em
tratamento, infecção no trajeto de fios e pinos e ulceras de pressão; como podem estar
relacionadas ao material como ruptura dos fios e deformidade dos anéis (GIORDANO, et al.,
2000; SILVA; OLIVEIRA, 2002; RULAND, 2000). De modo geral, na estabilização
cirúrgica de fraturas, o objetivo principal consiste em obter condições necessárias para a
cicatrização dos tecidos, evitando complicações e ajudando a reabilitação do paciente
(AHLBORG; JOSEFSSON, 1999; BEHRENS, 1989; DOUGHERTY et al., 2004; KUME, et
al., 2010).
Atualmente, os fixadores externos são feitos de materiais metálicos como aço
inoxidável (austenítico AISI 304 L e AISI 316 L ou F-138) e liga de titânio (Ti-6Al-7Nb e Ti6Al-4V), sendo mais comuns os de aço inoxidável devido à resistência mecânica e menor
custo (PARAMESWARAN et al., 2003; SCHALAMON et al., 2007; VASCONCELOS;
OLIVEIRA; OLIVEIRA, 2004). Estes materiais, para servirem como fixadores devem ser
altamente resistentes às tensões mecânicas e à corrosão, pois geralmente os produtos de
corrosão são sais do metal, que estando no meio extracelular podem ser nocivos aos tecidos,
causando inflamação e posterior necrose tecidual (RIBEIRO NETO; DUARTE, 1978).
18
Testes comparativos entre o aço inoxidável e outras ligas, mostraram que a resistência
à corrosão no aço é menor, sendo mais facilmente atacado pelos fluidos corpóreos, ricos em
íons cloreto. Todavia ainda devido ao custo e à facilidade de manuseio, os aços inoxidáveis
continuam sendo os mais utilizados (DISEGI; ESCHBACH, 2000; PASCHOAL, 2000).
Figura 1. Fixador externo de quadril e fêmur.
Fonte: Artrofix® 1
2.2
Filmes finos de carbono tipo diamante (DLC)
Filmes de carbono amorfo (a-C) são compostos principalmente por átomos de carbono
ligados por hibridações sp³, sp² e sp e a concentração relativa das mesmas estabelece a
variação de sua estrutura e consequentemente suas propriedades (MACKENZIE, 1996).
Filmes de a-C com alto grau de hibridações sp³, são chamados de carbono amorfo tetraédrico
(ta-C), apresentam propriedades muito semelhantes às do diamante, tais como, alta dureza,
inércia química, módulo elástico e um amplo gap óptico. Apresentando concentração entre 10
e 30% de hidrogênio, os filmes a-C podem ser denominados filmes de carbono amorfo
hidrogenado (a-C: H) (VENÂNCIO, 2005; VIEIRA, 2009). Por esta razão estes filmes são
conhecidos como carbono tipo-diamante e são mais fáceis de se produzir que o diamante
(BOEHM; JIN; NARAYAN, 2011).
Sua distribuição de várias formas de misturas amorfas no diagrama de equilíbrio de
fases ternário C-H em função das concentrações de ligações sp³, sp² e sp de hidrogênio foi
mostrado por Jacob e Moller (JACOB; MOLLER, 1993), onde nos vértices do triângulo estão
o diamante, grafite e o polímero [Figura 2].
1
Disponível em: <http://artrofix.com.br/produtos_prod.php?id=286 > Acesso em jan. 2013.
19
Figura 2. Diagrama de equilíbrio de fases ternário
Fonte: Jacob e Moller (1993).
2.2.1 Biocompatibilidade dos filmes de DLC
O DLC possui biocompatibilidade devido a sua composição de apenas carbono e
hidrogênio, que são biologicamente compatíveis a células humanas (HASEBE, 2007;
TRAVA-AIROLDI et al., 2007; VENÂNCIO, 2005).
O revestimento de biomateriais por DLC não provoca reações ao tecido e a corrosão
de implantes pode ser diminuída significativamente com tal revestimento (GRILL, 2003;
HASEBE, 2007; MARCINIAK, 2010; LI, 2011, VIONET, 2005). Em alguns casos, a
propriedade de melhorar a biocompatibilidade dos materiais, como em aços para implantes
ortopédicos e stents coronários, uma vez revestidos por DLC, é devido à proteção quanto a
liberação de íons como de Cr e Al, que causam irritação ao tecido (YETIM, 2011).
2.2.2 Limitações no uso do filme
Os primeiros implantes revestidos por filmes de DLC que foram comercializados
apresentaram bons resultados nos primeiros meses e anos, e após este período, todos
falharam, tendo sido necessária a total ou parcial remoção das próteses e substituição
(HAUERT et al., 2004, 2008).
20
O maior problema associado aos revestimentos de DLC em superfícies metálicas é a
fraca adesão, que é associada às elevadas tensões residuais de compressão e às fracas ligações
que ocorrem entre o revestimento e o substrato (JIN et al., 2009). O desenvolvimento de
tensões internas em filmes finos é também dependente da técnica de deposição utilizada
(PAULEAU, 2008). Durante o processo de crescimento dos filmes a tensão interna se
desenvolve seja devido à diferença da dilatação térmica entre o filme e o substrato ou devido
a tensões intrínsecas pela presença de impurezas e/ou distorções das ligações químicas, como
ocorre em sistemas desordenados. Muitas vezes elevadas tensões internas nas amostras
provocam a delaminação do filme do substrato devido à fraca adesão entre as duas superfícies
na interface (PAULEAU et al., 2004; WEI et al., 2009).
Quando se pretende utilizar estes revestimentos em ambiente biológico, é necessário
levar em consideração todos estes fatores, pois a liberação de resíduos para o organismo ativa
a resposta imunológica, resultando num processo inflamatório (HAUERT et al., 2004).
A incorporação de nanopartículas aos filmes de DLC surge como uma possível
resposta às limitações referidas. A introdução de diferentes elementos possibilita a
modificação da natureza e das propriedades dos revestimentos, mantendo a fase de carbono
amorfa do revestimento. Através disso, as diferentes propriedades dos filmes, tais como:
estabilidade térmica, dureza, tensões internas, propriedades tribológicas, condutividade
elétrica, energia superficial e biocompatibilidade; podem ser continuamente adaptadas de
modo a responder as especificações da aplicação do revestimento (SANCHEZ-LOPEZ et al.,
2008).
2.2.3 Células L929
A avaliação da biocompatibilidade de um material consiste de uma sequência de
testes, in vitro utilizando células e tecidos e/ou ex vivo (quando aplicável), utilizando-se de
animais ou ensaios clínicos. Estes procedimentos foram padronizados por órgãos como a
Sociedade Americana de Testes e Materiais (American Society for Testingand Materials,
ASTM) e a Organização Internacional de Normalização (International Organization for
Standardization, ISO) (DEE, PULEO, BIZIOS, 2002).
21
O teste in vitro com cultura de células tem sido utilizado com sucesso para avaliar a
citotoxicidade de biomateriais (LOBO et al., 2009). A ISO 10993-5 recomenda a utilização de
células de linhagens permanentes para a realização de ensaios de citotoxicidade, visando-se a
padronização dos ensaios e permitindo sua reprodutibilidade (SCHMALZ, 1994). Dentre
estas estão a L-929 da linhagem celular de fibroblastos de camundongos que são uma das
mais utilizadas, pois são fáceis de manter em cultura e produzem resultados que têm uma
correlação elevada com ensaios ex vivo (RATNER et al., 2004).
Outro fator é que as células L-929 possuem importante papel no processo de rejeição
de implantes através do encapsulamento fibroso (BAXTER et al., 2002).
2.2.4 Espectroscopia Raman
A espectroscopia Raman trata-se de uma técnica que visa caracterizar materiais, pela
analise estrutural, através da utilização de uma fonte monocromática de luz que ao incidir
sobre um material em análise, é espalhado por ele gerando luz de mesma energia
(espalhamento elástico) ou de energia diferente (espalhamento inelástico) e neste último caso
de interesse para análise das características do material (FARIA, SANTOS, GONÇALVES,
1997).
Geralmente é utilizado um feixe de radiação laser de baixa potência para incidir sobre
a área definida, que é espalhado em todas as direções, sendo que uma pequena parcela dessa
radiação é espalhada inelasticamente, isto é, com frequência (ou comprimento de onda)
diferente da incidente [Equação 1]. Esse fenômeno foi observado experimentalmente em 1928
por ChandrasekharaVenkata Raman, na Índia e por esse motivo, foi chamado de efeito Raman
(CLARK, DINES, 1986; FARIA, SANTOS, GONÇALVES, 1997).
(E = hν ou E = h.c.λ-1)
(Equação 1)
22
2.2.5 Testes colorimétricos de citotoxicidade
A análise da citotoxicidade in vitro de um material integra a primeira etapa de testes
sobre biocompatibilidade, onde pode ser avaliado através de ensaios colorimétricos pela
aplicação de corantes. Dentre os mais utilizados na literatura estão o brometo de 3-[4,5dimetiltiazol-2-il) 2,5 difeniltetrazolio (MTT) e a liberação da lactato desidrogenase (LDH).
Onde em ambos os casos, a partir da absorção óptica se obtêm a redução de produtos de
enzimas específicas, sendo consequentemente correlacionadas com avaliações de funções
celulares, determinando atividades fisiológicas vitais (LOBO, 2008).
O teste por MTT consiste na absorção do sal MTT pelas células, sendo reduzido no
interior da mitocôndria a um produto chamado formazana. Este produto, acumulado dentro da
célula, é extraído através da adição de um solvente apropriado. Sendo assim, sua intensidade
de coloração (azul) é proporcional ao numero de células viáveis (MOSMANN, 1983).
O teste de LDH-liberado analisa o dano sofrido pela membrana celular em contato com
o biomaterial. Sendo que o LDH, lactato desidrogenase, é uma enzima citosólica encontrada
no interior das células sendo liberada apenasquando agentes citototóxicos causam aumento da
permeabilidade da membrana ou dano irreversível a mesma. A percentagem LDH-liberado a
partir de células fornece uma análise extremamente precisa de citotoxicidade do material
(CUI; LI, 2000). O LDH permite avaliar o número total de células viáveis relacionando com a
proliferação (GROTH; FALK; MIETHKE, 1995).
2.2.6 Análise morfológica e adesão celular
A avaliação da citotoxicidade do material pode ser feita também através de métodos
qualitativos, através da análise da morfologia celular, proliferação e adesão celular. Um dos
métodos utilizados é a observação em Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) (LOBO et
al., 2009; NAKAMURA et al., 2005; SCHMALZ, 1994).
O princípio de funcionamento do MEV, é através da emissão de um feixe de elétrons
por um filamento de tungstênio, sobre a amostra provocando uma série de emissões de sinais
relacionados com a interação do feixe de elétrons incidente e a amostra. Estes sinais são
captados por detectores apropriados, sendo amplificados e processados num sistema
analisador específico para cada tipo de sinal, podendo fazer ampliações de 100-200.000 vezes
(ORÉFICE; PEREIRA; MANSUR, 2006).
23
Outro método qualitativo é a Microscopia Óptica por Fluorescência, onde o
mecanismo utilizado é através de indicadores de fluorescência, os fluoróforos, que produzem
fluorescência no material de estudo, através da absorção da luz num determinado
comprimento de onda. Ajudando a visualizar com maior nitidez estruturas e processos
celulares (ALBERTS et al., 1997).
2.2.7 Molhabilidade, energia de superfície e força de adesão.
Considerando que a biocompatibilidade depende da interação das células com a
superfície do biomaterial, é importante analisar a molhabilidade da superfície e as
propriedades de adesão. Geralmente, superfícies hidrofóbicas possuem ângulo de contato
coma água superior a 70°, logo, superfícies hidrofílicas possuem ângulo de contato inferior a
70°(CHOI et al., 2008). Alguns estudos relatam que a adesão celular pode ser aumentada em
superfícies moderadamente molháveis, com um ângulo de contato com a água na faixa de 60°
(TAMADA, IKADA, 1994; IKADA, 1994). Com a medida do ângulo de contato e com
auxílio de modelos físico-matemáticos é possível inferir sobre os valores da energia de
superfície (EISENBARTH et al., 1996).
Quanto mais hidrofílica é a superfície, menor é a energia superficial entre as fases
sólida e líquida. Isto porque dipolos elétricos da molécula de água são atraídos pelo
componente polar, que reduz a energia superficial entre a gota e a superfície (ROY et al.,
2007). Sendo assim o valor de energia de superfície é influenciado pela diferença entre as
forças entre átomos e moléculas na interface (BENDAVID, et al. 2009). O componente polar
é controlado pelas diferentes forças intermoleculares, permanentes, dipolos induzidos e pontes
de hidrogênio (BENDAVID et al., 2009, ROY et al., 2009).
Os valores de energia de superfície podem ser utilizados para calcular a força de
adesão das células na superfície dos materiais utilizando a metodologia proposta por Ong e
colaboradores, onde o aumento da energia de superfície é inversamente proporcional a força
de adesão celular (ONG et al., 1999).
A influência de componentes polares e dispersivos na adesão de fibroblastos já foi
relatada em estudos com diferentes biomateriais poliméricos (REDEY, 1999; HALLAB,
2001). Hallab et al. (2001) correlacionou a energia de superfície do biomaterial com a adesão
celular e afirmou que o componente polar da energia livre de superfície parece determinar a
adesão celular, muito mais que o componente dispersivo (HALLAB, 2001).
24
2.2.8 Rugosidade e adesão celular
Outro fator de extrema importância na interação celular com o biomaterial é a
rugosidade de superfície (NEBE; LUETHEN; LANGE, 2007; ZHU; CHEN; SCHEIDELER,
2004). Isto porque a interação celular é afetada pela topografia do material em caráter
macroscópico para que haja crescimento do tecido; também em microscópico onde é
necessário controle; pois as células necessitam de pontos de ancoragem para iniciar a
proliferação (ELIAS; LIMA, 2001). Para Murilo (2007) se a superfície possui rugosidade
muito menor que o tamanho das células, poderá ocorrer ausência dos sítios de fixação. Por
outro lado, se o implante possuir grandes números de picos ou vales, mas, estes possuem
superfícies lisas, as células, igualmente, não poderão se fixar.
A rugosidade da superfície também afeta a molhabilidade, pois é imprescindível
salientar que nos testes de molhabilidade a heterogeneidade da superfície causada pela
variação da rugosidade, causa alterações locais nas energias de superfície, proporcionando
valores de ângulo de contato diferentes (SIDDIQI et al., 2000a, 2000b; LONG et al., 2005). A
este comportamento de variação do molhamento é dado o nome de histerese do ângulo de
contato, sendo que outro fator, responsável por esta alteração, é a não homogeneidade
química devido à presença de contaminantes, segregação e inclusões na superfície do sólido
(EUSTATHOPOULOS et al., 2005; LUZ; RIBEIRO; PANDOLFELLI, 2008; SOBCZAK;
SINGH; ASTHANA, 2006).
A medida da rugosidade pode ser dada através de um perfilômetro, que é um
instrumento que mede o perfil da superfície do filme e descreve a topografia da superfície.
Existem basicamente dois tipos de perfilômetros: o mecânico e o óptico.
Perfilômetros mecânicos se utilizam de uma ferramenta que desliza sobre a superfície e
seus movimentos descrevem os relevos da superfície. Entretanto, possui um tempo de
medição longo, necessita de um controle quanto ao tamanho do medidor e pode ser um teste
destrutivo. Perfilômetro óptico possui fotossensores e através de feixes de luz, medem a
superfície da amostra, todavia possui limitação quanto à leitura de materiais com algum nível
de transparência ao seu comprimento de onda, necessitando de programas apropriados para a
correção destes erros (BRUNDLE; EVANS; WILSON, 1992).
25
3
MATERIAIS E MÉTODOS
Neste capítulo são apresentados os materiais e métodos utilizados na produção e
caracterização dos filmes, incluindo os testes de biocompatibilidade in vitro.
3.1
Caracterização do aço ortopédico
Como substratos para a deposição dos filmes, foi utilizado o aço inoxidável AISI
316L, comum para fim ortopédico, gentilmente cedido pelo setor de ortopedia do Hospital
Municipal Dr. José de Carvalho Florence de São José dos Campos/SP.
A caracterização do aço foi feita gentilmente pelo Prof. Dr. Bruno Bacci do
Departamento de Ciência e Tecnologia Aeroespacial, do Instituto de Aeronáutica e Espaço de
São José dos Campos/SP, onde sua composição foi avaliada pelo método de fusão da amostra
e detecção por infravermelho, de acordo com procedimento PI/LQCM 35 – “Determinação de
carbono e enxofre em metais ferrosos por combustão direta”, o qual é baseado na norma
ASTM E1019 (ASTM, 2000).
3.2
Preparação e limpeza dos substratos
Os substratos foram submetidos a processos de limpeza, responsáveis pela total
remoção de impurezas, como poeira, óxidos, óleos que pudessem comprometer a aderência
dos filmes de DLC à sua superfície.
Inicialmente, os substratos metálicos de aço inoxidável foram polidos seguindo uma
sequência de lixas (# 220 a 2000) e finalizando com o polimento em feltro com pasta de
diamante de 2 µm. Após o polimento, as amostras foram limpas em banho de ultrassom com
acetona PA, por 10 minutos, e secas utilizando um jato de nitrogênio seco.
26
3.3
Deposição dos filmes de DLC e NDC-DLC
A deposição dos filmes finos de DLC foi realizada no Instituto Nacional de Pesquisas
Espaciais (INPE – São José dos Campos), com o apoio do Prof. Dr. Vladimir Jesus Trava
Airoldi, utilizando-se a técnica de deposição química da fase vapor assistida por plasma
(Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition, PECVD). A câmara de vácuo para deposição
desses filmes, conforme apresentado na Figura 3, possui um sistema de bombeamento
composto por uma bomba mecânica de 90 m3/h e uma difusora de 2000 L/s. À câmara estão
acoplados medidores de vácuo do tipo Pirani, Penning e do tipo membrana capacitiva (para
medida de pressão total durante os estudos e crescimento dos filmes).
O fluxo dos gases injetados é regulado por controladores eletrônicos de fluxos
devidamente calibrados para cada tipo de gás. A fonte de tensão utilizada foi desenvolvida por
Bonetti (2008) e tem características especiais para garantir a deposição do filme e aumentar
sua aderência ao substrato. É possível variar a tensão de polarização desde -100V até -1000V,
com corrente controlável desde 1 mA até cerca de 5 A (BONETTI, 2008).
Figura 3. Sistema de deposição de PECVD (a), e interior da câmera de deposição com o catodo refrigerado
(b)
a)
b)
Com as amostras em vácuo no interior da câmara de deposição, fez-se uma descarga
DC pulsada com frequência de 25 kHz, em vácuo e seguindo a sequência de passos iniciais
mostrada na Tabela 1.
27
Tabela 1. Sequência de passos iniciais para a deposição do filme de DLC.
Fluxo dos gases (sccm)
Sequência
Tensão
(V)
Pressão
(Torr)
Tempo
(min)
Ar
SiH4
CH4
1°
1
-
-
-750
8,5 x 10-2
20
2°
-
1
-
-600
8,5 x 10-2
20
-
1
-750
8,5 x 10-2
20
3°
-
Para a deposição propriamente dita do filme de DLC, foi utilizado o hexano (C6H14)
como fonte de carbono, durante um tempo pré-estabelecido de 2 h com uma tensão de
autopolarização de -700 V. E para a deposição dos filmes de NDC-DLC, foram preparadas
dispersões de pó de diamante (~500 nm) em hexano nas concentrações de 0,1, 0,3 e 0,5 g/L.
Essas dispersões substituíram o hexano durante o processo de deposição, mantendo-se a
mesma tensão de autopolarização, baseando assim no método descrito por Marciano (2011).
3.4
Espectroscopia Raman
As medidas dos espectros Raman foram feitas utilizando um sistema Renishaw 2000
com um laser iônico de Ar+ (λ = 514,5 nm) com geometria de retroespalhamento. A potência
do laser sobre a amostra foi de aproximadamente 0,6 mW e a área do laser de
aproximadamente 10 µm2. O deslocamento Raman foi calibrado usando a banda do diamante
em 1.332 cm-1. O equipamento está instalado no Laboratório Associado de Sensores e
Materiais (LAS), do Centro de Tecnologias Especiais (CTE), do Instituto Nacional de
Pesquisas Espaciais (INPE).
3.5
Caracterização biológica dos filmes de DLC e NDC-DLC
O estudo da caracterização biológica in vitro dos filmes de DLC e NDC-DLC foi
realizado no Laboratório de Dinâmica de Compartimentos Celulares, do IP&D/Univap. Os
testes de biocompatibilidade in vitro foram aplicados de acordo com a norma ISO 10993-5
para testes de biomateriais (ISO, 1992; 2003; 2007).
28
A linhagem celular utilizada foi a CLL I NCTC (ATCC) clone 929 - clone da
linhagem L, tecido conjuntivo de camundongo, designada L-929. As células foram adquiridas
no Laboratório de Cultura de Células do Instituto Adolfo Lutz e cultivadas em Meio Mínimo
Essencial (MEM) (Gibco) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (SFB), 1% de
antibiótico e antimicótico (Gibco) e incubadas em atmosfera de 5% de CO2 a 37ºC, em
garrafas plásticas de 25 cm2.
As linhagens foram mantidas em estoque no nitrogênio líquido. Partindo deste, foi
preparada uma garrafa de cultura de 25 cm3, contendo 1 mL de cultura de células (106
células/mL), foram adicionados 2 mL de meio de cultura MEM, enriquecido com 10% SFB.
As células foram mantidas em estufa com controle automático de temperatura (37ºC) e
atmosfera de 5% de CO2. Após estes procedimentos foram retiradas e quantificadas para a
realização dos estudos.
Para realização dos testes, foram utilizadas amostras de aço AISI 316L sem
revestimento e revestidos por filmes de DLC e NDC-DLC (nas concentrações de
nanopartículas de diamante cristalino de 0,1; 0,3 e 0,5g/L de hexano). Foram utilizados
controles como: fragmentos de luva de látex e papel utilizado para filtrar meio de cultura.
Todas as amostras apresentavam a mesma área circular (diâmetro de 1 cm) e foram
esterilizadas utilizando luz ultravioleta por um período de 24 horas antes da realização dos
testes. Os tempos de incubação das amostras foram de 24 e 96 horas.
As células extraídas nas concentrações de 1x104 células/mL foram semeadas em
volumes de 0,2 mL utilizando placas de 24 poços de fundo chato e 0,47 mL de MEM (meio
mínimo essencial). Estas foram incubadas por 24 horas, a 37ºC em atmosfera úmida com 5%
de CO2 para a formação da monocamada celular. Depois deste período, as amostras foram
plaqueadas sobre o fundo dos poços e os controles positivo e negativo foram adicionados.
Todos os testes foram realizados em triplicata.
3.5.1 Plaqueamento de células L-929 sobre amostras.
O plaqueamento das amostras ocorreu em 2 tempos, ambos sobre incubação em 0,47
mL de MEM, em estufa a 37ºC em atmosfera úmida com 5% de CO2.
29
1° Tempo: As células L-929 foram plaqueadas sobre o fundo dos poços a quantidade
4
de 10 células/mL, e incubadas por 24h, formando uma monocamada, em seguida foram
colocados sobre elas as amostras de aço com e sem revestimento. Sobre a superfície das
amostras ocorreu novo plaqueamento de 104 células/mL (L-929) e novamente incubadas por
96h. Após este período, as amostras foram retiradas e sobre o fundo do poço realizada a
leitura do MTT. Sobre as amostras retiradas dos poços, foi realizada a microscopia (MEV).
2° Tempo: Foi realizado novo plaqueamento a 104 células/mL sobre a superfície das
novas amostras, e passado o período de incubação de 96h, as amostras foram retiradas, e
sobre o meio de cultura (MEM) realizada a leitura do LDH-liberado. Sobre a superfície das
amostras foi feita análise por microscopia por fluorescência.
3.5.2 Ensaio MTT
Para a leitura do Brometo de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il) 2,5 difeniltetrazólio (MTT),
após o período de incubação, os poços foram lavados com 300 µL de solução salina
tamponada (PBS). Em seguida foram colocados 200 µL de MTT, numa concentração final de
0,5 mg/mL de MTT-formazana, deixando-as incubadas por um período de 1 hora em estufa,
sob proteção da luz. Após esta etapa foi retirado o MTT, e acrescentados 400 µL do solvente
dimetilsulfóxido (DMSO) sobre os precipitados de formazana. Em seguida, a placa foi
mantida em agitação por 30 minutos para a solubilização dos cristais de formazana
(MOSMANN, 1983).
A leitura da absorbância dos cristais de formazana foi feita sobre a placa dos poços
onde anteriormente havia sido plaqueada uma monocamada, utilizando um leitor teste
imunoenzimático (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, ELISA) do Laboratório de
Dinâmica de Compartimentos Celulares, do IP&D/Univap, com comprimento de onda de
570nm e em seguida para normalizar os resultados nos testes com MTT foi utilizada a
equação 2:
(Equação 2)
Onde a leitura do branco é realizada para determinação do sinal de fundo (background) e
como controle positivo no MTT foi utilizado os valores do filtro de papel.
30
3.5.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
Para a realização da avaliação morfológica das células sobre os substratos, foi utilizado
o Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) JEOL JSM 5610 VPI, instalado no Instituto de
Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
As amostras foram retiradas dos seus respectivos poços e a fixação das células foi
adicionando às amostras soluções contendo 1,1 mL de tampão cacodilato de sódio, 100 µL de
glutaraldeído e 800 µL de paraformaldeído a 4%. Foi adicionado1 mL desta solução em cada
placa. Esta etapa de fixação é realizada por um período de 2 horas em temperatura ambiente.
Após este procedimento, as amostras passaram por um processo de desidratação, em séries de
etanol, que variaram suas concentrações, em água deionizada, entre 30 e 100% (30, 50, 70, 90
e 100%). Cada etapa de concentração teve um tempo total de 10 minutos.
Em seguida, foram retiradas as soluções de etanol a 100% e adicionado uma solução
de 1:1 de etanol e Hexadimetilsulfoxido (HMDS) por 10 minutos. Após estas etapas foi
retirada a solução de 1:1 de etanol e HMDS e adicionou-se 500 µL de HMDS em cada poço
deixando-se secar em temperatura ambiente. Para a realização de MEV foi necessário a
deposição de uma fina camada filme de ouro (10 nm) sobre as amostras, tornando-as
condutivas, para permitir a visualização, utilizando um detector de elétrons secundários.
3.5.4 Ensaio LDH-Liberado
Para a leitura do lactato desidrogenase (LDH) liberado, foi utilizado o kit do SIGMA
(TOX-7). Foram colocados 50 µL (1/10 vol.) de solução de lise em cada poço, mantendo
incubados por um período de 45 minutos. Após o período de incubação foram retiradas
alíquotas de 50 µL para teste de cada poço, e colocados 100 µL de corante deixando-as
incubadas por um período de 30 minutos. Após este período foram colocados 50 µL de HCl
em cada poço para que a reação fosse interrompida. Após este procedimento as placas foram
mantidas em agitação por um período de dez minutos. Para leitura da absorbância, utilizou-se
o teste de ELISA com o comprimento de onda de 490 nm e em seguida os dados foram
normalizados utilizando a equação 2. No entanto, para controle positivo foi utilizado o valor
dos fragmentos de látex.
31
3.5.5 Microscopia Óptica de Fluorescência
As amostras foram removidas dos respectivos meios de cultura, lavadas com PBS e
fixadas em Paraformaldeído 4% e Triton X-100 (solução contendo t-octilfenoxipoliletoxietanol utilizada para permeabilizar membrana externa para entrada do corante em PBS
por 10 minutos. Logo em seguida foi adicionado DAPI (4’, 6-diamidino-2-fenilindol) como
marcador do núcleo celular e Rodamina-Faloidina para marcar a actina do citoesqueleto.
Depois as amostras foram incubadas ao abrigo da luz por 1 h.
Foram
registradas
fotomicrografias
do
material
em
um
microscópio
de
epifluorescência Leica DMLB com sistema fotográfico Leica MPS-30, instalado no Instituto
de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP).
3.5.6 Molhabilidade das amostras
A molhabilidade dos filmes de DLC e NDC-DLC foi realizada no Instituto Nacional
de Pesquisas Espaciais (INPE – São José dos Campos), sendo determinada pelas medidas de
ângulo de contato realizado pelo método da gota séssil (Young-Laplace), em um goniômetro
Kruss, modelo Easy Drop Contact Angle Measuring Instrument (EasyDrop DAS 100). Esse
equipamento possui uma câmera (CCD) que grava a imagem da gota, que por sua vez é
tratada num algoritmo para a determinação do ângulo de contato.
3.5.7 Energia de Superficie e Força de Adesão
Depois de mensurada a molhabilidade pelo ângulo de contato, foi calculada a energia
de superfície (ou tensão interfacial) de cada grupo de amostras, utilizando a metodologia
proposta por Owens (OWENS; WENDT, 1969; ROY, 2007). Os valores dos componentes de
tensões superficiais do meio de cultura foram calculados através do tensiômetro (Kruss Easy
Dyne K20). Esses valores de energia de superfície foram utilizados para calcular a força de
adesão das células na superfície dos filmes utilizando a metodologia proposta por Ong e
colaboradores. Sendo assim, a adesão das células na superfície dos filmes foi calculada
usando aproximações termodinâmicas (ONG et al, 1999):
∆FAdh = γ SC − γ SL − γ CL
(Equação 3)
32
Onde ∆FAdh é a energia livre interfacial de adesão, γSC a energia livre interfacial entre o
sólido e a célula, γSL a energia livre interfacial entre o sólido e o líquido, e γCL a energia livre
interfacial entre a célula e o líquido. Todas essas variáveis podem ser calculadas por medidas
de ângulo de contato e energia de superfície (LIU et al, 1998; SCHNEIDER, 1996; WANG et
al, 2004).
A Equação 4 foi usada para determinar a energia interfacial da adesão celular (∆FAdh) à
superfície sólida (WANG et al., 2004):
∆FAdh
 γ LW γ LW + γ +γ − + γ −γ + + γ LW γ LW + γ +γ − 
S
L
S L
S L
C
L
C L 
= 2

− +
+ −
− +
LW LW
 + γ Cγ L − γ S γ C − γ S γ C − γ S γ C − γ L

(Equação 4)
OndeγL é a energia de superfície do líquido. Termodinamicamente, se o valor de ∆FAdh
é negativo, a adesão é termodinamicamente favorável, caso valor seja positivo a adesão é
termodinamicamente desfavorável. Sendo assim, a força de adesão celular, para que haja boa
aderência da célula com o material, é favorável quanto mais negativo tender a energia de
adesão interfacial (∆FAdh) (ONG et al, 1999).
3.5.8 Análise da rugosidade
As medidas de rugosidade foram feitas no perfilômetro óptico WYKO NT 1100, série
Optical Profiling System Wyko, da Veeco, localizado no Laboratório Associado de Sensores
e Materiais (LAS) no Instituto Nacional de Pesquisas Espaciais (INPE – São José dos
Campos).
3.5.9 Análise estatística
Os dados obtidos no ensaio de viabilidade e citotoxicidade (média ± desvio padrão)
foram tratados com teste estatístico ANOVA e Tukey como pós-teste (p<0.01), utilizando o
software Graph Pad Prism 4.
33
Os dados são apresentados nos gráficos com médias e desvios padrão utilizando um
número total de cinco amostras. Para a análise estatística foi utilizado o programa Graph Pad
Prism®, onde se utiliza a análise de variância a 2 critérios (2-way Anova), considerando
valores de significância de 5% (p<0,05) ou 1 % (p<0,01).
34
4
RESULTADOS
Neste capítulo são apresentados os resultados a partir da produção e caracterização dos
filmes, incluindo os testes de biocompatibilidade in vitro.
4.1
Caracterização do aço ortopédico
A partir da análise do aço ortopédico, obteve-se uma concentração de 0,022 ± 0,006%
de carbono e 0,003 ± 0,002% de enxofre sendo considerado aço austenítico AISI 316L
conforme a norma de classificação de aços mais relevante no mercado, a American Iron and
Steel Institute (DIAS, 2009).
4.2
Raman
A Espectroscopia Raman foi utilizada para avaliar a estrutura química do filme de
DLC e NDC-DLC. O espectro foi composto por duas bandas de aproximadamente 1400 cm-1
(banda D) e 1550 cm-1 (banda G) [Tabela2]. A posição das bandas foi determinada através do
cálculo de uma função gaussiana com base na área da banda e da largura máxima a meia
altura (FWHM). A posição da banda, a largura e a relação entre as áreas integradas sob D e G
foram utilizadas para determinar ID e IG [Figura 4].
Tabela 2. Resultados dos Espectros Raman de filmes de DLC e NDC-DLC.
Amostras
DLC
NDC-DLC
(500 nm)
Banda D
BandaG
Posição
Posição
(cm-1)
(cm-1)
1301,3 + 1,1
1304,2 + 0,5
FWHM
FWHM
(D)
(G)
1522,8 + 1,4
185,2 + 2,8
1524,6 + 1,0
222,9 + 2,3
ID/IG
[H] (%)
153,6 + 0,4
0,65+0,1
34.1 + 0,3
156,1 + 1,7
0,57+ 0,1
34.1 + 0,7
35
Figura 4. Espectros Raman de filmes de DLC e NDC-DLC.
a) DLC puro
b) NDC-DLC, 500nm
Intensidade relativa (u.a.)
60000
50000
G
40000
D
30000
20000
10000
800
b)
a)
1000
1200
1400
1600
1800
2000
Deslocamento Raman (cm-1)
4.2.1
Caracterização biológica dos filmes de DLC e NDC-DLC
4.2.2 Ensaio colorimétrico
Os resultados da leitura podem ser observados no gráfico da Figura 5. Onde o aço
316L apresentou viabilidade de 46% (+ 2), seguido: DLC 63% (+ 2); NDC-DLC 0,1g/L 65%
( + 2); NDC-DLC 0,3g/L 79% ( + 6); NDC-DLC 0,5 g/L 73% ( + 1); filtro de papel 100% ( +
2).
36
Figura 5. Viabilidade celular (método MTT) x Amostras. Em 96h de plaqueamento de células L929
Viabilidade celular
100%
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
aço
DLC
NDC-DLC NDC-DLC NDC-DLC
(0,1g/L) (0,3g/L) (0,5g/L)
filtro
Amostras
Legenda: As concentrações de NDC são g/L em hexano e a barra de erros corresponde ao desvio
padrão de 5 amostras diferentes.
37
4.2.3 Microscopia Eletrônica de Varredura
A imagem das amostras por microscopia eletrônica de varredura (MEV) é apresentada
na figura 6. O comportamento celular (L929) é indiferente sobre o aço, DLC e NDC-DLC
(0,1; 0,3 e 0,5 g/L), caracterizado pela retração e proliferação celular, formando camadas com
interconexões celulares. Porém sobre o látex é visualizado um processo de morte celular.
Figura 6. Microscopia Eletrônica de varredura de fibroblastos (L929) sobre a superfície das amostras. Após
96h de plaqueamento. (A) Filmes de DLC; (B) Filmes de NDC-DLC nas concentrações 0,1; (C) 0,3;
(D) 0,5; (E) Fragmentos de látex; (F) Aço AISI 316L. As concentrações de NDC são g/L em hexano e
a barra de erros corresponde ao desvio padrão de 5 amostras diferentes.
38
4.2.4 Ensaio LDH-Liberado
Na figura 7 são observados os resultados com o LDH-liberado, indicador de toxicidade
dos materiais. Onde os valores correspondem ao aço 316L 91% (+ 2), seguido: DLC 68% ( +
3); NDC-DLC 0,1g/L 44,7% ( + 1); NDC-DLC 0,3 g/L 57,8% ( + 2); NDC-DLC 0,5 70% ( +
3); Látex 100% ( + 8).
110
100
90
80
70
60
50
Lu
va
DL
C
ND
C+
DL
C(
0,
1g
/L
)
ND
C+
-D
LC
(0
,3
g/
L)
ND
C+
DL
C
(0
,5
g/
L)
31
6L
40
Aç
o
LDH-Liberado por celulas (%)
Figura 7. LDH-Liberado por células x Amostras. Em 96h de plaqueamento de células L929. As
concentrações de NDC são g/L em hexano e a barra de erros corresponde ao desvio padrão de 5
amostras diferentes.
Amostras
4.2.5 Microscopia Óptica de Fluorescência
As imagens de microscopia por fluorescência mostradas na Figura 8 apresentam a
viabilidade celular de células L929 sobre amostras de aço AISI 316L, DLC e NDC-DLC em
diferentes concentrações. É possível observar a proliferação celular nas mostras de aço 316L;
a integridade do citoesqueleto na marcação dos filamentos de actina das células L929 sobre o
filme de DLC; a marcação do núcleo, espraiamento e proliferação sobre as amostras contendo
nanocristais de diamante incorporadas ao DLC (NDC 0,1; 0,3 e 0,5g/L).
39
Figura 8. Microscopia de fluorescência de fibroblastos (L929) espalhados sobre a superfície das amostras.
Após 96h de plaqueamento. (a) aço AISI 316L e (b) filmes de DLC; e filmes de NDC-DLC nas
concentrações (c) 0,1, (d) 0,3 e (e) 0,5 g/L.
4.2.6
Molhabilidade e Ângulo de Contato
Os resultados referentes ao ângulo de contato da água destilada e diiodometano (3
)
sobre a superfície de diferentes amostras, medidos pelo goniômetro podem ser observados na
Tabela 3. Onde pode ser observado um aumento no ângulo de contato com a incorporação de
nanopartículas de diamante ao filme, indo de um material hidrofílico como: aço 316L e DLC,
a hidrofobicidade na concentração de NDC-DLC 0,5g/L.
30µm
40
Tabela 3. Ângulo de contato formado na superficie das Amostras por 3µL de água e diiodometano. As
concentrações de NDC são g/L em hexano e a barra de erros corresponde ao desvio padrão de 5
amostras diferentes.
Materiais
Angulo de Contato (°)
Água
Diiodometano
Aço 316L
46,4+ 0,9
39,3+ 3,3
DLC
50,8 + 7,6
35 + 3,3
NDC-DLC 0,1g/L
66,7 + 2,1
37,7+ 1,1
NDC-DLC 0,3g/L
83,8 + 3,4
43,4 + 1,6
NDC-DLC 0,5g/L
89,8 + 2,5
38,3 + 0,3
4.2.7 Energia de superficie e força de adesãocelular
A energia de superfície total (γ) das amostras foi estimada como a soma das
componentes dispersiva e polar. É possível notar um decréscimo na energia de superfície
polar das amostras com a adição de nanopartículas de diamante [Figura 8].
Para o cálculo da força de adesão das células nas amostras, primeiramente foi
calculada a tensão interfacial do meio MEM sem e com células L929 na quantidade de 5,0 x
105 células/mL no tensiômetro. Apesar de o plaqueamento ter sido em 104 células/mL, as
medidas se basearam no valo de 105 células/mL, pois como as análises ocorreram após 96 h,
houve proliferação celular.
O valor encontrado da tensão interfacial foi de 30,2 + 0,03 mN/m para o meio MEM e
33,1 + 0,02 mN/m para o meio com as células L929. Esses valores foram encontrados e
utilizando como referência a massa específica de 1,0068 1 g/cm3 para o meio MEM.
Em seguida, utilizando a metodologia de Owens e colaboradores, foi calculada a
energia livre de adesão (∆FAdh) das células em cada amostra [Figura 9], onde os valores
correspondem ao DLC -9,61 mJm; NDC-DLC 0,1g/L -9,28 mJm; NDC-DLC 0,3g/L -4,18
mJm; NDC-DLC 0,5 -2,88 mJm.
Sendo assim, baseado no método de Ong et al. (1999), quanto menor for o valor da
energia livre de adesão interfacial (∆FAdh) maior será a força de adesão celular.
41
Figura 9. Energia livre de adesão celular (mJm) e Componentes de energia de superfície (mN/m) x
Amostras. As concentrações de NDC são g/L em hexano
40
-3
35
-4
30
-5
25
-6
20
-7
15
-8
10
-9
5
-10
0
DLC
NDC+DLC (0,1g/L)
NDC+DLC(0,3g/L)
NDC+DLC(0,5g/L)
Componentes de energia de superficie (mN/M)
Energia livre de adesão intefacial (MJ/m)
-2
Energia livre de adesão interfacial
Componentes de energia de superficie polar
Componentes de energia de superficie dispersiva
Amostras
4.2.8 Rugosidade
A rugosidade da superfície, a altura máxima da rugosidade (Rt), foi medida ao longo
de uma área de 736 µm x 480μm × 480 μm [Figura 10].
O filmes tornaram-se mais ásperos, com o aumento da concentração de NDC em
hexano, onde os valores correspondem (µm) ao aço 316L 2,57 (+ 0,5), seguido: DLC 1,46 ( +
0,4); NDC-DLC 0,1g/L 1,83 ( + 0,2); NDC-DLC 0,3g/L 2,34 ( + 0,5); NDC-DLC 0,5g/L 3,46
( + 0,4).
42
Figura 10. Rugosidade Rt (µm) x Amostras. As concentrações de NDC são g/L em hexano
Rugosidade Rt (µm)
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
C
DL
C
ND
L)
1g/
(0,
C
L
+D
C+
ND
L)
3g/
(0,
C
DL
C+
ND
L)
5g/
(0,
C
DL
Amostras
16L
o3
Aç
43
5
DISCUSSÃO
O aumento a hidrofobicidade, com a incorporação de nanopartículas de diamante ao
filme de DLC, diminuiu a adesão celular. Logo, favorece o desempenho de materiais que
necessitam ser biocompatíveis e ao mesmo é previsível sua retirada do organismo.
O aço inoxidável analisado e utilizado como amostra e substrato para deposição do
filme foi o AISI 316L, o qual está entre os mais utilizados na indústria ortopédica para
produção de fixadores externos e possui a melhor relação custo benefício (CAMARGO, 2003;
SILVA; OLIVEIRA, 2011).
A Espectroscopia Raman mostra que com a incorporação de NDC ao filme de DLC há
diminuição da relação ID/IG, juntamente com o deslocamento da banda D, acompanhada por
um aumento da largura da banda. Sendo assim, provavelmente a razão sp3/sp2 aumenta com a
presença das partículas de diamante nos filmes de DLC, o que já havia sido observado em
trabalhos de Marciano (2011). Isto ocorre provavelmente porque as partículas metálicas
promovem a grafitização dos carbonos ao seu redor devido ao aumento da atividade catalítica
das partículas de carbono “arrancadas” com alta energia cinética; além de melhorar sua
resistência a corrosão (LEE, 2004; HAYASHI, 2001). O aumento da ligação sp3 confere ao
DLC muitas vantagens das propriedades do diamante, assim como a inércia química e
eletroquímica (ROBERTSON, 2001) [Tabela 2].
Vários estudos foram realizados sobre a biocompatibilidade do filme de DLC com a
incorporação de elementos como flúor (F), nitrogênio (N), silício (Si), prata (Ag), dióxido de
zircônio (ZrO2), cromo (Cr) e Titânio (Ti) (ALI, 2006; BHARATHY, 2010; BENDAVID,
2007; RANDENIYA et al., 2009; 2010a, 2010b). Destes, alguns se restringiram a análise de
hemocompatibilidade e outros a viabilidade celular. Sobre a viabilidade celular há um
consenso geral de que o DLC sozinho não inibe o desenvolvimento celular, mas a introdução
destes elementos ao filme causa alteração neste padrão por vezes aumentando a viabilidade ou
diminuindo, o que tem levado a uma discussão da influência do elemento, sua concentração,
topografia do filme e sua energia superficial.
44
Este estudo apontou através do teste colorimétrico MTT há um aumento na viabilidade
celular com a adição de nanopartículas de diamante no filme, porem uma redução em NDCDLC 0,5g/L [Figura 5]. Esse resultado se assemelha a outros estudos que apontam um
aumento na viabilidade celular ainda em baixas concentrações de elementos, como a adição
ao filme de até 6,8% de flúor, 4% de dióxido de zircônio (ZrO2), 21% de Silício, 5% de
cromo, 1,1% a 3% de dióxido de titânio (ALI, 2006; BHARATHY, 2010; BENDAVID, 2007;
RANDENIYA et al., 2009; 2010a, 2010b).
A análise morfológica da célula, por microscopia eletrônica de varredura, é
influenciada pela confluência ou densidade celular (ASSIS, 2008; PALSSON; BHATIA,
2004) [Figura 6]. Assim, estudos mostram que fibroblastos aderem nas superfícies dos
substratos que são favoráveis à adesão, mostrando rápidas mudanças morfológicas que vão
desde formatos arredondados a formatos alongados (espraiamento) (CHO et al., 1996).
Fibroblastos interconectados apresentam natureza contrátil. Assim, se a força de
contração entre os fibroblastos for maior que a adesão ao substrato, grupos de células serão
formados [Figura 6] (SANCHAVANAKIT et al., 2006). Este comportamento, também é
devido à limitação do espaço resultante da multiplicação celular (CHO et al., 1996;
SANCHAVANAKIT et al., 2006).Contudo,a formação de uma monocamada celular sobre a
superfície dos materiais (aço 316L, DLC e NDC-DLC) não foi possível avaliar a interação
direta da célula com a superfície e o espraiamento esteve possivelmente em camadas mais
inferiores. Todavia o ambiente se mostrou favorável ao desenvolvimento celular.
O filme de DLC já teve sua biocompatibilidade confirmada pelo teste de liberação de
LDH por fibroblastos, quando diferentes substratos (vidro, aço e poliestireno) foram
revestidos pelo filme de DLC. Analisando outros grupos celulares como macrófagos
(camundongos), fibroblastos e osteoblastos (humanos), pelo mesmo teste de liberação da
enzima, o filme não apresentou diferença estatística quando comparado com um grupo
controle bioinerte (vidro), comprovando que os revestimentosde DLC proporcionam uma
superfícienão tóxica ao meio celular (ALLEN; LAW; RUSHTON, 1994; BUTTER et al.,
1995).
45
Todavia sobre o ambiente vascular, a enzima LDH possui papel fundamental na
resposta inflamatória (TSAI; GRUNKEMEIER; HORBETT, 1999). E utilizando este teste
(LDH liberado) como marcador da adesão plaquetária, o DLC apresentou alto índice de
liberação de LDH no revestimento de stents, sendo menos biocompatível quando comparados
com os biofilmes produzidos por óxidos como o TiO e ZrO (MIKHALOVSKY, 2011;
WERNER; SPERLING, 2007). Contudo, quando comparado com filmes de carbonitreto de
boro no revestindo de aços inoxidáveis para válvulas cardíacas, pelo mesmo critério de
análise, o filme de DLC apresentou menor liberação do LDH, até mesmo quando comparado
ao aço inoxidável comum neste tipo de implante (MAITZ et al., 2006).
Através da análise estatística, a adição de nanopartículas de diamante ao filme
forneceu um ambiente com menor toxicidade à membrana celular sobre a concentração de
NDC-DLC 0,1 e 0,3 g/L, todavia em NDC-DLC 0,5g/L, é observado o aumento da liberação
de LDH, porem ainda abaixo dos valores referente ao aço 316L [Figura 7]. Estes resultados
possui semelhança nos encontrados no ensaio MTT, todavia inversamente proporcional
devido ao tipo de análise.
Na análise por fluorescência, o marcador DAPI possibilitou a visualização do núcleo
celular em todas as amostras, todavia não é possível identificar diferenças significativas,
apenas a integridade do núcleo. Porém, o marcador Rodamina-faloidina trouxe a visualização
do citoesqueleto pela marcação dos filamentos de actina [Figura 8]. A fluorescência neste
estudo trouxe dados qualitativos sobre o núcleo e o citoesqueleto, assim como nas imagens
por MEV, comprovou que o ambiente sobre o filme de DLC e NDC-DLC, há condições para
o desenvolvimento celular, através da adesão, espraiamento e proliferação.
Os motivos apresentados sobre a viabilidade celular sobre a superfície do material
ainda não estão bem elucidados, todavia alguns apontam para a molhabilidade, energia
superficial e rugosidade do material (ALI et al, 2006; MICHIARDI, 2007; OWENS, 1969;
TAMADA; IKADA, 1994; VAN DER VALK et al. 1983). O trabalho de Marciano et al.
(2011), apresentou através do ensaio MTT em fibroblastos, o aumento da biocompatibilidade
com incorporação de TiO2 ao filme, devido a fatores como diminuição do ângulo de contato
com a água e da energia superficial do filme (MARCIANO et al., 2011b).
46
Neste estudo, avaliando estes fatores (molhabilidade, energia de superfície e força de
adesão) apontou que com o aumento da concentração de nanopartículas de diamante no filme,
o ângulo de contato da água aumentou de 50,8° para 80° [Tabela 3]. A propriedade
hidrofóbica do filme de NDC-DLC está relacionada à presença de nanopartículas de diamante
na superfície do filme (MARCIANO et al., 2010). O fato de o filme se tornar hidrofóbico com
a adição de nanopartículas de diamante (NDC) diminuiu a capacidade de adesão celular ao
material (TAMADA, IKADA, 1994; IKADA, 1994).
Outro fator que reforça a teoria da diminuição da adesão celular de L929, com a
incorporação de nanopartículas de diamante ao filme está baseado na análise termodinâmica.
Pois este estudo apresentou um aumento da energia livre de adesão interfacial (∆FAdh) com o
aumento da incorporação de NDC ao filme de DLC, reduzindo assim a força de adesão
celular ao material (ONG et al, 1999) [Figura 9].
Todas estas condições reforça a teoria que a relativa diminuição na adesão celular de
L929 na concentração NDC-DLC 0,5 g/L, contribuiu nos resultados dos testes MTT e LDHLiberado.
A rugosidade das amostras também teve seu valor mais alto em NDC-DLC 0,5 g/L, o
que colaborou na diminuição da viabilidade, pois havendo grandes picos na topografia do
filme, dificultará a ancoragem e fixação celular [Figura 10] (ELIAS; LIMA, 2001; MURILO,
2007).
47
6
CONCLUSÕES
É possível concluir que o filme de NDC-DLC pode ser uma alternativa para
revestimento em fixadores externos de fraturas ósseas, a fim de proteger o material contra a
corrosão e liberação de íons e assim, melhorar sua biocompatibilidade. Os resultados mais
favoráveis apontam para a maior concentração de nanopartículas de diamante cristalino (no
caso 0,5g/L). Essas amostras mantiveram sua biocompatibilidade; todavia em um ambiente
com menor tendência para a adesão celular. Visto que os fixadores externos não são
permanentes havendo previsão, após cumprirem sua finalidade, de serem removidos do corpo
com o menor risco de lesão possível, o uso de revestimentos de NDC-DLC nos fixadores
pode ser considerada como uma alternativa viável. Entretanto, testes mecânicos e de
biocompatibilidade in vivo precisam ser realizados a fim de se confirmar essa possibilidade.
48
7
TRABALHOS FUTUROS
A partir da realização desse trabalho, ficam as seguintes sugestões para trabalhos
futuros:
•
Análise de NDC-DLC sobre outras concentrações acima de 0,5g/L;
•
Analisar biocompatibilidade utilizando outros testes como LDH total e vermelho
neutro;
•
•
Teste mecânico: ensaio tração de aços 316L revestidos por DLC e NDC-DLC;
Teste de biocompatibilidade in vivo;
49
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APÊNDICE
Trabalhos publicados
Trabalhos publicados em periódicos científicos
NUNES, C.A.; RAMOS, B.C.; STEIN, M.F.; ALMEIDA, E.C.; DA-SILVA, N.S.; SOARES,
C.P.; TRAVA-AIROLDI, V.J.; LOBO, A.O.; MARCIANO, F.R. Thin film composites of
nanocrystalline diamond particles and diamond-like carbon: structural, electrochemical and
biological properties. Journal of Aerospace Engineering, Sciences and Applications, v.4,
p.131-138, 2012.
Trabalhos apresentados em eventos científicos
NUNES, C.A.; RAMOS, B.C.; DA-SILVA, N.S.; SOARES, C.P.; TRAVA-AIROLDI, V.J.;
LOBO, A.O.; MARCIANO, F.R. Morphological Analysis and Cell Viability on Diamond-like
Carbon Films Containing Nanocrystalline Diamond Particles.5th Latin American
Conference on Metastable and Nanostructured Materials (Nanomat), São Carlos, 2012.
NUNES, C.A.; RAMOS, B.C.; DA-SILVA, N.S.; SOARES, C.P.; TRAVA-AIROLDI, V.J.;
LOBO, A.O.; MARCIANO, F.R. Biocompatibillity Assay on Diamond-like Carbon Films
Containing Nanocrystalline Diamond Particles. 7th International Conference on Surfaces,
Coatings and Nano-Structured Materials (Nanosmat), Praga (RepúblicaTcheca), 2012.
NUNES, C.A.; RAMOS, B.C.; SILVA, G.R.; DA-SILVA, N.S.; SOARES, C.P.; TRAVAAIROLDI, V.J.; LOBO, A.O.; MARCIANO, F.R.Viabilidade celular de filmes de carbonotipo diamante contendo nanopartículas de diamante cristalino incorporadas. XXXIII
Congresso Brasileiro de Aplicações de Vácuo na Indústria e na Ciência (CBRAVIC),
São José dos Campos, 2012.
NUNES, C.A.; RAMOS, B.C.; STEIN, M.F.; SILVA, G.R.; DA-SILVA, N.S.; SOARES,
C.P.; TRAVA-AIROLDI, V.J.; LOBO, A.O.; MARCIANO, F.R. Estudo da adesão de
fibroblastos (L929) sobre filmes de carbono-tipo diamante contendo nanopartículas de
diamante incorporadas. XVI Encontro Latino Americano de Iniciação Científica (INIC),
São José dos Campos, 2012.