Técnicas de Esterilização e Desinfecção
Esterilização:
Em Microbiologia é importante a esterilização de meios, soluções e material
de vidro ou metal que se utiliza. Uma das formas de esterilização obtem-se
através do uso do Autoclave, para grandes quantidades de meios, ou de
uma panela de pressão, para pequenas quantidades de meios. Um produto
é microbiológicamente estéril quando não contem nenhuma forma de
microrganismo vivo. A assépsia é extremamente importante na
microbiologia. Entende-se por assépsia todas as condições, gestos e atitutes
tendentes a manterem o estado de ausência de microrganismos
contaminantes no meio em que actua.
Alguns instrumentos de dissecção como tesouras, pinças podem ser
esterilizadas mergulhando em 70% de alcool (70 ml de etanol absoluto e 30
ml de água destilada).
O material contaminado, por exemplo as ansas que tocaram em cultura de
bactérias, devem ser descontaminados através da chama de um bico de
Bunsen, aparelho igualmente necessário num laboratório de microbiologia.
As bocas de tubos contendo cultura de bactérias, as bocas de frascos de
vidro contendo os meios de cultura, devem sempre que destapados ser
chamuscados á chama do Bunsen.
Meios contaminados com as culturas de bactérias, devem ser
descontaminados por autoclavagem, e em seguida despejados em sacos
plásticos fortes. Placas de petri de plástico com culturas, bem como outro
material de plástico utilizado, devem ser colocados em sacos de plástico e
enviados para incineração. O material de vidro contaminado por sua vez
após autoclavagem deve ser lavado com lexivia e detergente, passado por
água destilada e seco na estufa de secagem.
As pipetas de vidro utilizadas no laboratório deverão ser imersas numa
proveta de plástico grande contendo lexivia ou outro liquido desinfectante,
e posteriormente lavadas e autoclavadas.
As bancadas devem ser esterilizadas passando um líquido desinfectante, e
idealmente o laboratório deve ser isolado, ou então o trabalho deverá ser
realizado dentro de uma câmara de fluxo laminar.
Esterilização por calor húmido:
1. Autoclavagem
Faz-se através do autoclave cujo funcionamento é idêntico ao da panela de
pressão sendo a temperatura necessária para esterilizaçao de 121oC, e o
tempo de esterilização de cerca de 15 minutos. Este tempo de esterilização
deverá ser aumentado quando se enche bastante o autoclave com meios
para esterilizar. Objectivo: morte de todos os possiveis organismos vivos. As
soluções ao sair do autoclave estão estéreis. Utiliza-se este tipo de
esterilização pelo calor húmido para meios de cultura e diversas soluções.
Existem vários tipos de autoclaves verticais ou horizontais.
2. Tindalização
Este método consiste numa esterilização fraccionada em que o meio sofre 3
aquecimentos em 3 dias consecutivos, para destruição de formas vegetativas
bacterianas que evoluem de esporos. Utiliza temperaturas inferiores a
100oC, e faz-se em banho-maria, onde se mergulham os frascos de meio a
esterilizar herméticamente fechados, durante cerca de 1h, repetindo-se o
tratamento em 3 dias consecutivos. Objectivo: eliminação de formas
esporuladas, as quais germinam quando submetidas a temperaturas de
100oC, resultando desta germinação as formas vegetativas não resistentes a
essa temperatura.
3. Pasteurização:
Esterilização utilizando uma temperatura inferior a 100oC, geralmente 57 a
600C em banho-maria. Objectivo: eliminação de microrganismos sensíveis
ao calor, entre estes, estirpes patogénicas, sem adulteração das qualidades
do produto a pasteurizar.
Esterilização por calor seco
Pode constar do processo de chamuscar o material á chama do Bunsen, ou
por um periodo prolongado numa estufa a 160oC por periodos de no
minimo 45 minutos. Este tipo de esterilização é utilizado para material de
vidro, para material de dissecção, mas não é muito efectivo contra aquelas
bactérias e fungos que produzem esporos resistentes à secura.
Irradiação e Filtração
Outros métodos de esterilização incluem a irradiação e a filtração. A
filtração é especialmente utilizada para esterilização de meios e soluções.
Unidades de filtração (acetato) que podem ser posteriormente autoclavadas.
Esterilização Quimica
Com substâncias voláteis, alcool etílico a 70%, com sais metálicos ou
compostos orgânicos de metais, como mertiolato e mercurocromo, com
halógeneos, como o cloro sob a forma de hipoclorito de cálcio e o iodo, os
ácidos e álcalis aumentam a concentração hidrogeniónica do meio e
aceleram a taxa de mortalidade dos microorganismos. Os compostos de
amónio quaternários são atóxicos e extremamente enérgicos sobre bactérias
e virus.
A glicerina em solução a 50%, tem utilização na perservação de alguns
virus, que mantêm a sua virulência ou viabilidade nessa solução. Os
antibióticos são produtos orgânicos não bactericidas, mas bacteriostáticos
ou seja impedem a evolução de germes. São geralmente produtos do
metabolismo de fungos e alguns são produzidos por bactérias. Alguns
exemplos de antibióticos:
Bacteriostáticos: Penicilina, Estreptomicina, Neomicina, Tetraciclina
Fungostáticos: Micostatina, Fungisone
Compostos sulfonamídicos, sulfamidas, são também utilizados para
bacteriostase em trabalhos de laboratório.
Manuseamento de Microrganismos
Essencial, uma ansa de fio recto e outra redonda na ponta, feita de metal de
niquel e crómio, por exemplo. Também se utilizam ansas de material
plástico de usar e deitar fora, cotonetes (swabs).
Para cultura de microorganismos em meio sólido, utilizam-se caixas de petri
de plástico ou vidro, as primeiras são deitadas fora após o uso, e as
segundas podem ser reutilizadas após descontaminação por autoclavagem.
Os meios liquidos e os meios de conservação de microorganismos estão
contidos em tubos de ensaio de vidro com tampas de algodão cardado ou
rolha de cortiça embebida em parafina (demonstrar com algodão hidrófilo
como se faz uma rolha e se coloca no tubo de ensaio).
Bibliografia de apoio:
Penn, C (1991). Chapter 1. Equipment and materials; Chapter 5. Sterility
and aseptic technique. In “Handling Laboratory Microorganisms”, Open
University Press, Philadelphia: 5-25 e 41-48 pp.
DIFCO Manual, Section 1: 12-16.