AVALIAÇÃO DA INFLUÊNCIA DE TECIDO TONSILAR NA SENSIBILIDADE DO TESTE
DE PCR PARA DETECÇÃO DE Actinobacillus pleuropneumoniae
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Souza, K.K ; Klein, C.S. ; Kich, J.D.* ; Coldebella, A. ; Alberton, G.C.
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Méd.Vet. mestranda da Universidade Federal do Paraná-Curitiba, PR, [email protected];
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MSc. Biól. Embrapa Suínos e Aves –Concórdia, SC; DSc. Méd.Vet. Embrapa Suínos e Aves –Concórdia,
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SC; DSc. Méd.Vet. Embrapa Suínos e Aves –Concórdia, SC; DSc. Méd.Vet. Universidade Federal do
Paraná-Curitiba, PR
PALAVRAS-CHAVE: Teste de PCR; Pleuropneumonia suína; PPS; Suínos.
INTRODUÇÃO
A pleuropneumonia suína (PPS) é uma das mais importantes doenças respiratórias dos
suínos, estando presente em todos os países suinocultores (4). Para minimizar o impacto
econômico e a disseminação da doença é necessário o desenvolvimento de métodos diagnósticos
rápidos, sensíveis e espécie-específicos para identificação do agente (2). A utilização de métodos
moleculares baseados na Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) vem se tornando fundamental
na detecção do Actinobacillus pleuropneumoniae, sendo capaz de identificar a infecção antes do
estabelecimento da doença e em animais cronicamente infectados (8). O primeiro passo da
infecção é a aderência da bactéria às células do epitélio tonsilar do hospedeiro (1). Portanto, no
diagnóstico da PPS subclínica, pelo método da PCR, são coletados materiais provenientes das
tonsilas e, menos frequentemente, da cavidade nasal (6, 7). A padronização da técnica é iniciada
com amostras da bactéria pura, porém seu valor diagnóstico depende da validação na espécie
alvo. A PCR, sabidamente, sofre influência de substâncias inibidoras presentes no tecido animal
(12), esse fato deve ser considerado na otimização da técnica para que sejam minimizados os
resultados falso-negativos. Com o objetivo de adequar esta técnica às condições de campo, foi
necessário um experimento, independente, para avaliar a interferência do tecido tonsilar na
sensibilidade do teste de PCR, para genes de transporte de cápsula (cpx) de A.
pleuropneumoniae.
MATERIAL E MÉTODOS
O efeito do material tonsilar, sobre os resultados da PCR, foi avaliado por um experimento
de contaminação artificial de tonsilas com A. pleuropneumoniae sorotipo 5. O material foi obtido de
dois animais soronegativos no ELISA e suas tonsilas negativas no isolamento bacteriológico e
PCR.
Delineamento experimental: as variáveis testadas foram diferentes quantidades de tecido
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tonsilar, uma, duas e três porções, coletadas com pinça de biopsia e diluição bacteriana, 10 e
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10 , a partir de cultivo correspondente ao tubo 5 da escala de MacFarland (1,5X10 bactérias/mL).
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Os tratamentos foram: T1= salina estéril como controle negativo; T2= diluição 10 como controle
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positivo; T3= diluição 10 como controle positivo, T4= uma porção de tonsila + salina estéril, T5=
duas porções de tonsila + salina estéril; T6= três porções de tonsila + salina estéril; T7= uma
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porção de tonsila + diluição 10 , T8= duas porções de tonsila + diluição 10 ; T9= três porções de
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tonsila + diluição 10 ; T10= uma porção de tonsila + diluição 10 , T11= duas porções de tonsila +
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diluição 10 ; T12= três porções de tonsila + diluição 10 .
Processamento laboratorial: as porções de tonsila foram maceradas e armazenadas em
microtubos e acrescidas de 100L/porção de solução salina ou diluição bacteriana de acordo com
o tratamento. Para o preparo das diluições bacterianas, a amostra padrão de A. pleuropneumoniae
foi cultivada em meio agar Nicolet e o crescimento bacteriano padronizado na concentração
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1,5x10 /mL e diluído na base 10. Foram utilizadas as diluições 10 e 10 com contagem paralela
de Unidades Formadoras de Colônias (UFC) e medida de densidade óptica (DO) (540 nm). O
tecido tonsilar tratado e os controles permaneceram por 30 minutos a 37°C para possibilitar o
contato da bactéria com possíveis inibidores, adicionados a 5 mL de caldo Lincomicina Bacitracina
(LB) (5) e incubados a 37°C por 24 horas. Após o período de incubação, foi realizada a extração
do DNA segundo Kuchiishi et al. (3). Para realização da PCR, 5 L do DNA extraído foram
adicionados em 20 L da mistura contendo tampão de Taq (10 mM Tris, 50 mM KCL e 2,5 mM
MgCl2 ), 30 pmol dos primers específicos para o gene cpx, 200 M de dNTP’s, 1U de Taq DNA
polimerase e 1U de Platinum Taq Antibody (Invitrogen). As amostras foram submetidas a 30
ciclos constituídos de 2 minutos a 57°C, 2 minutos a 72°C e 1 minuto a 94°C e, posteriormente, à
eletroforese em gel de agarose (1,5%) contendo 0,5 g/mL de brometo de etídio e visualizadas em
luz ultravioleta.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
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A suspensão bacteriana diluída a 10 , com DO de 0,006, conteve uma quantidade de UFC
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incontável enquanto que a diluição 10 conteve 1,99x10 UFC/mL, correspondendo a 0,001 de
DO, antes de serem adicionadas ao caldo LB.
Os resultados (Tabela 1) demostram que nos tratamentos T1, T4, T5 e T6, que não
receberam a suspensão bacteriana, o resultado foi sempre negativo, como esperado. Nos
tratamentos T2 e T3 onde havia apenas a suspensão bacteriana, sem adição de tecido tonsilar, os
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resultados foram sempre positivos, independente da diluição. Na diluição 10 (T7, T8 e T9), onde
o número de bactéria, em UFC/mL, foi incontável, não houve influência negativa pela presença de
tecido tonsilar na amplificação pela PCR, onde todas as reações foram positivas, independente do
número de porções de tonsilas. Co ntudo, nos tratamentos T10, T11 e T12, que continham
inicialmente 199 UFC por porção houve efeito negativo da adição do tecido tonsilar. Este efeito foi
comprovado pela teste exato de Fisher, quando esses tratamentos foram comparados ao T3 que
continha o mesmo número de bactérias, porém sem tecido tonsilar. Especificamente, o teste
estatístico resultou em diferenças entre o T3 e T10 (p=0,0003), T3 e T11 (p=0,001) e T3 e T12
(p=0,0098). O número de reações positivas foi, 2, 3 e 5 para o T10, T11 e T12, respectivamente, o
que pode ser explicado pelo aumento no número inicial de bactérias uma vez que o T11 e T12
receberam, duas e três vezes mais bactérias do que o T10, proporcionalmente ao número de
porções de tonsila.
A inibição da reação pode ser decorrente da presença de sangue na coleta das porções de
tecido tonsilar e/ou presença de outras substâncias inibidoras, como enzimas (9), as quais
interferem negativamente nos resultados obtidos pela PCR, limitando o seu uso como diagnóstico
em quantidades baixas de bactérias (10).
CONCLUSÃO
Os resultados obtidos neste experimento demonstraram que a interferência do tecido
tonsilar nas amplificações da PCR depende da quantidade de bactérias presente. As infecções
com poucas células podem resultar em falsos-negativos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. CHIERS, K. et al. Early in vivo interatios of Actinobacillus pleuropneumoniae with tonsils of pigs. Vet. Microbiol., v.68,
p.301-306, 1999. 2. GRAM, T.; AHRENS, P.; NIELSEN, J.P. Evaluation of a PCR for detection of Actinobacillus
pleuropneumoniae in mixed bacterial cultures from tonsils. Vet. Microbiol., v.51, p.95-104, 1996. 3. KUCHIISHI, S. S. et al.
Avaliação de ensaio imunoenzimático indireto, isolamento bacteriológico tradicional e reação em cadeia da polimerase no
diagnóstico da pleuropneumonia suína. In: CONGRESSO BRASILEIRO DE VETERINÁRIOS ESPECIALISTAS EM
SUINOS, 11., Goiânia, 2003. Anais... Goiânia, 11o Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em Suínos, 2003.
p.25-26. 4. PIFFER, I. A. et al. Pleuropneumonia suína. I. Alguns aspectos epidemiológicos da doença em nosso meio. In:
CONGRESSO BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 18., Balneário Camboriú, 1982. Anais... Balneário Camboriú,
18o Congresso Brasileiro de Medicina Veterinária, 1982. p.45. 5. PIJOAN, C.; MORRISON, R.B.; HILLEY, H.D. Dilution
technique for isolation of Haemophilus from swine lungs collected at slaughter. J. Clin. Microbiol., v.18, n.1, p.143-145,
1983. 6. SAVOYE, C. et al. A PCR assay used to study aerosol transmission of Actinobacillus pleuropneumoniae from
samples of live pigs under experimental conditions. Vet. Microbiol., v.73, p.337-347, 2000. 7. SIDIBÉ, M. et al. Detection of
Actinobacillus pleuropneumoniae in the porcine upper respiratory tract as a complement to serological test. Can. J. Vet.
Res., v.57, p.204-208, 1993. 8. SIROIS, M.; LEMIRE, E. G.; LEVESQUE, R. C. Construction of a DNA probe and detection
of Actinobacillus pleuropneumoniae by using polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol., v.29, p.1183-1187, 1991. 9.
SOINI, H. et al. Detection And Identification Of Mycobacteria By Amplification Of A Segment Of The Gene Coding The 32
Kilodalton Protein. J. Clin. Microbiol., v.30, p.2025-2028, 1992. 10. STONE, G.G. et al. Detection of Salmonella serovars
from clinical samples by enrichment broth cultivation – PCR procedure. J. Clin. Microbiol., v.32, n.7, p.1742-1749, 1994.
Tabela 1. Resultados obtidos pelo método da PCR cpx, na detecção do A. pleuropneumoniae em diferentes
diluições
bacterianas e porções de tecido tonsilar.
Trata-m
ento
Material
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
Salina
T11
T12
Bactéria
Diluição
bacteriana
-3
10
-6
10
Salina
Tecido
tonsilar
10
-3
10
-6
Porção
de
tecido
1
2
3
1
2
3
1
2
3
Resultados (por repetição)
4ª
5ª
6ª
7ª
8ª
1ª
2ª
3ª
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9ª
10ª
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