Universidade Federal de São João del-Rei
Coordenadoria do Curso de Química
Métodos para determinação de avermectinas
em diferentes matrizes
Leila Suleimara Teixeira
São João del-Rei – 2015
MÉTODOS PARA DETERMINAÇÃO DE AVERMECTINAS EM
DIFERENTES MATRIZES
Monografia de Trabalho de Conclusão de Curso,
apresentado no 1° semestre do ano de 2015 ao Curso
de Química, Grau Acadêmico Bacharelado, da
Universidade Federal de São João del-Rei, como
requisito parcial para obtenção do título Bacharel em
Química.
Autor: Leila Suleimara Teixeira
Docente Orientador: Keyller Bastos Borges
Modalidade do Trabalho: Revisão Bibliográfica
São João del-Rei – 2015
RESUMO
As avermectinas (AVMs) são lactonas macrocíclicas derivadas da fermentação do fungo
Streptomyces avermitilis, este grupo inclui abamectina, ivermectina, eprinomectina,
doramectina, selamectina, e emamectina drogas quimicamente relacionadas e utilizadas na
medicina veterinária e humana, como antiparasitários, e na agricultura. Atualmente
encontram-se entre as drogas antiparasitárias mais utilizadas mundialmente, sobretudo
devido ao seu amplo espectro de ação e boa margem de segurança. Apresenta como
principais características físico-químicas alto peso molecular e elevada lipofilicidade, o que
diminui a possibilidade de atravessarem a barreira hematoencefálica dos animais,
minimizando os efeitos tóxicos e também aumenta persistência no organismo, sobretudo
nas gorduras corpóreas. Contudo, o uso intensivo e inadequado desta droga leva a
necessidade de métodos analíticos capazes de determinar e aperfeiçoar o grande potencial
desse grupo. Nestas circunstâncias, o presente trabalho de conclusão de curso tem por
objetivo
apresentar
uma
revisão
bibliográfica
sobre
as
metodologias
de
identificação/quantificação de AVMs em diferentes de tipos amostras (matrizes). A
determinação das AVMs tem sido dada em especial pela cromatografia líquida de alta
eficiência acoplada com diferentes tipos de detectores, como por exemplo, o espectrômetro
de massas, detector de fluorescência e de absorbância no ultravioleta, além de diversas
técnicas de preparo de amostras. Desta maneira, foi possível a identificação/quantificação
de componentes semelhantes de amostras complexas, tais como: alimentos, plasma, soro,
dejetos fecais, formulações farmacêuticas dentre outros.
Palavras-chave: avermectina, métodos de separação, preparo de amostras, fluidos
biológicos.
ABREVIATURAS
ABA: Abamectina
LC-ES-MS:
Cromatografia
Líquida
com
Espectrometria de Massas com Ionização por
Eletrospray
ASE: Extração Acelerada por Solvente
AVMs: Avermectinas
LC–ESI-MS-MS: Cromatografia Líquida com
Espectrometria de Massas Triplo Quadrupolo
com Ionização por Eletrospray
CE: Eletroforese Capilar
CG: Cromatografia Gasosa
LC–MS:
Cromatografia
Espectrometria de Massas
CCD: Cromatografia em Camada Delgada
com
LC-MS-MS:
Cromatografia
Líquida
com
Espectrometria de Massas Triplo Quadrupolo
CFS: Cromatografia com Fluido Supercrítico
DOR: Doramectina
LLE: Extração Líquido-Líquido
EDTA: Ácido Etilenodiamino Tetracético
LMs: Lactonas Macrocíclicas
EMA: Emamectina
LOD: Limite de Detecção
EPR: Eprinomectina
LOQ: Limite de Quantificação
FIA: Análise por Injeção em Fluxo
LTP: Purificação em Baixa Temperatura
GABA: Ácido gama amino butírico
MAE: Extração Assistida por Micro-ondas
HF-SLM: Extração com Fibra Oca Suportada por
Membrana
HPLC: Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
HPLC-DAD:
Cromatografia
Líquida
Detecção por Arranjo de Diodos
com
HPLC-FL: Cromatografia Líquida de
Eficiência com Detector de Fluorescência
Alta
Líquida
MSPD: Dispersão da Matriz em Fase Sólida
NIR: Espectrometria de Infravermelho Próximo
NMIM: N-metilimidazol
PLA: Polilactida
HPLC-UV: Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência com Detector de Absorbância no
Ultravioleta
HPLC-MS:
Cromatografia
Espectrometria de Massas
Líquida
com
IVR: Ivermectina
LC-APCI-MS:
Cromatografia
Líquida
com
Espectrometria de Massas com Ionização
Química à Pressão Atmosférica
LC-APCI-MS-MS: Cromatografia Líquida com
Espectrometria de Massas Triplo Quadrupolo
com Ionização Química à Pressão Atmosférica
PLE: Extração com Líquidos Pressurizados
PP: Precipitação de Proteína
PTFE: Politetrafluoretileno
QqQ: Detector Triplo Quadrupolo
QuEChERS: Quick, Easy, Cheap, Effective,
Rugged, Safe
SEL: Selamectina
SFE: Extração de Fluidos Supercríticos
SPE: Extração em Fase Sólida
TFAA: Anidrido Trifluoroacético
UV-vis: Ultravioleta Visível
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1
2. OBJETIVOS
3
3. RESULTADOS
3
3.1.
Alimentos
3
3.2.
Plasma
10
3.3.
Soro
11
3.4.
Sangue
12
3.5.
Dejetos Fecais
12
3.6.
Formulações Farmacêuticas
13
3.7.
Água/Solo/Sedimentos
14
3.8.
Tecidos/Órgãos
16
3.9.
Outros
17
4. CONSIDERAÇÕES FINAIS
18
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
21
Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
1.
INTRODUÇÃO
As avermectinas (AVMs) são endectocidas que pertencem a uma família de
compostos denominada lactonas macrocíclicas (LMs) com ação em nematódeos e
artrópodes. Descobertas em 1975, são produzidas pela fermentação do fungo actomiceto
Streptomyces avermitilis, detectado primeiramente no solo do Japão e depois da Itália, o
grupo das AVMs é constituído por abamectina (ABA), ivermectina (IVR), eprinomectina
(EPR), doramectina (DOR), selamectina (SEL) e emamectina (EMA) [1,2].
Através do processo de fermentação do S. avermitilis é gerada uma mistura de oito
componentes: A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a e B2b, os quais se diferenciam conforme
algumas características em suas estruturas: os compostos A apresentam ligado ao carbono
5 um grupo metoxi, ao passo que os compostos B apresentam um grupo hidroxila. Os
compostos do tipo 1 possuem dupla ligação entre os carbonos 22 e 23 enquanto que os do
tipo 2 apresentam ligações simples. Já os da série “a” têm ligado ao carbono 25 um grupo
sec-butil e os da série “b” um radical isopropil [3,4].
Figura 1. Fórmulas estruturais das avermectinas naturais [4].
Devido à alta eficiência e ao amplo espectro parasiticida, as AVMs do tipo B1a são as
mais importantes, e na indústria farmacêutica a separação dos grupos B1a e B1b ainda é
inviável. Assim, os produtos comerciais são uma mistura de aproximadamente 90% dos
compostos “a” e 10% dos compostos “b”, sendo quase similar as atividades biológicas
destes dois grupos. A abamectina é um produto natural do processo de fermentação do S.
1 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
avermitilis, e serve de partida para a produção da 22,23 – dihidroavermectina B1, ou
ivermectina, seu derivado sintético, a qual foi a primeira entre as LMs a ser comercializada
[4,5].
O modo como as LMs se comportam no organismo depende da forma como foram
administradas, formulação, tipo e estrutura física do animal. Dentre as principais
características físico-químicas das AVMs estão o alto peso molecular e elevada
lipofilicidade. Esses aspectos fazem com que haja um grande volume de distribuição com
maior concentração no tecido adiposo, o qual apresenta vascularização reduzida fazendo
com que sua retenção no plasma seja maior. A sua farmacodinâmica é muito complexa, não
estando totalmente elucidada a via pela qual estes compostos atingem os parasitos
gastrointestinais [2,6].
O modo de ação das AVMs é hipoteticamente resultado de sua grande afinidade com
os receptores de glutamato. Quando se ligam a estes receptores, elas desenvolvem um
incremento na permeabilidade dos íons cloreto, o que faz com que haja uma
hiperpolarização da membrana celular, e com isso, abra os canais de cloreto controlados
pelo ácido glutâmico e pelo ácido gama amino butírico (GABA), ou glutamato. Devido a isso,
o fluxo de íons cloreto para dentro das sinapses nervosas em vermes, e no sistema
neuromuscular em artrópodes, aumenta, de forma que leva a paralisia, resultando na morte
de nematóides e artrópodes. Isto explica porque as AVMs não agem sobre cestódeos e
trematódeos, uma vez que estes não possuem os receptores GABA. Já a baixa toxicidade
para os mamíferos pode ser elucidada pela dificuldade de atravessar a barreira
hematoencefálica, e desta forma não atingir tais receptores, os quais se encontram, quase
que, exclusivamente no sistema nervoso central [4,5].
Apesar das LMs possuírem grande eficácia contra endo e ectoparasitos, além de
evidenciarem certa segurança em relação a efeitos que possam afetar a tolerância física dos
animais, uma dose elevada deste fármaco aumenta sua capacidade de penetrar a barreira
hematoencefálica e assim afetar qualquer espécie causando intoxicação. Além disso, a
excreção da droga, sobretudo nas fezes e urina e seu efeito tóxico sobre diferentes tipos de
insetos encarregados da degradação dos depósitos fecais tem merecido interesse especial
devido ao potencial de impacto ambiental destes fármacos. A eliminação através da
glândula mamária de vacas em lactação também é um ponto importante [5,6].
Outra questão se dá devido ao uso intensivo das LMs nos últimos 30 anos para o
controle principalmente de doenças parasitárias em ruminantes, levando ao surgimento de
elevados níveis de resistência [8]. Portanto, surge a necessidade de métodos analíticos
capazes de determinar o enorme potencial dessas LMs, uma vez que estas apesar de se
2 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
mostrarem muito eficientes podem apresentar certas adversidades em virtude de seu uso
equivocado [6,7].
2.
OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho consiste em fornecer uma revisão sobre as metodologias
analíticas para determinação de AVMs em diferentes matrizes, tais como: alimentos, fluidos
biológicos (soro, sangue, plasma, dejetos fecais), formulações farmacêuticas, solo, dentre
outros.
3.
RESULTADOS
Esta revisão foca nos diferentes métodos de separação empregados para a
determinação das AVMs, sobretudo, na técnica instrumental analítica de cromatografia
líquida de alta eficiência (HPLC) [9-11]. Este método é acoplado a diferentes tipos de
detectores, principalmente ao detector de fluorescência e ao espectrômetro de massas
[11,12]. A revisão foi dividida pela análise de AVMs em diferentes matrizes.
3.1.
Alimentos
Com a melhoria dos padrões de vida da população, cada vez mais atenção tem sido
dada aos problemas de segurança alimentar e uma vez que a presença de AVMs na
alimentação representa um risco para a saúde humana, o desenvolvimento de metodologias
para sua determinação torna-se essencial [13].
As análises de AVMs em alimentos foram realizadas por diversos métodos. Borges
et al. [3] determinaram resíduos de abamectina em abacates através da cromatografia
líquida de alta eficiência com detecção por fluorescência (HPLC-FL). Foi realizada a
derivatização dos analitos com anidrido trifluoroacético (TFAA) e N-metilimidazol (NMIM). A
extração das amostras homogeneizadas de abacate foi feita duas vezes com acetonitrila:
água (8: 2, v/v) e limpas com cartuchos C18 empregando a SPE. A fase móvel era composta
por de água: metanol: acetonitrila (5: 47,5: 47,5 v/v/v) com vazão de 1 mL/min. Os valores
de desvio padrão relativo (RSD) estavam abaixo de 13% e os LOD e LOQ foram de 0,001 e
0,003 mg/kg, respectivamente.
Hernando et al. [7] elaboraram um método que permite uma análise rápida para a
determinação de resíduos de abamectina, ivermectina, benzoato de emamectina e
doramectina em produtos alimentares selecionados (músculo, salmão e pimenta) por
3 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
cromatografia líquida com espectrometria de massa triplo quadrupolo (LC-MS-MS). As
amostras foram extraídas pelo processo de extração em fase sólida (SPE), utilizando
acetonitrila e alumina para limpeza. As recuperações médias obtidas foram na faixa de 8095%.
Huang et al. [13] determinaram abamectina e ivermectina em óleos comestíveis,
como óleo de amendoim, óleo de oliva, banha, por meio de um método de purificação em
baixa temperatura (LTP) acoplado a cromatografia líquida com espectrometria de massas
triplo quadrupolo com ionização por eletrospray (LC-ESI-MS-MS). As amostras foram
extraídas utilizando a técnica de extração líquido-líquido (LLE) seguidas por purificação
através de precipitação de componentes interferentes a baixa temperatura, sem uma etapa
de limpeza adicional. Os LOD e LOQ estavam na faixa de 0,1-0,4 µg/kg e 0,3-1,3 µg/kg,
respectivamente.
Vuik et al. [14] desenvolveram um método para determinação de traços de
abamectina em alface e pepino utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência com
detecção de absorção no ultravioleta (HPLC-UV). A fase móvel era composta por metanol:
água (90: 10, v/v) com vazão de 1,0 mL/min e detecção UV a 245 nm. As amostras foram
homogeneizadas com acetato de etila e extraídas por meio da técnica de SPE.
Diserens et al. [15] realizaram o desenvolvimento e a validação de um método de
HPLC-FL para determinação de resíduos de abamectina em maças, peras e tomates. A fase
móvel continha acetonitrila: água (94: 6, v/v). A vazão foi de 1.5 mL/min e volume de injeção
50 µL. O tempo de eluição foi de 8 min e 10 min para avermectina B1a e avermectina B1b,
respectivamente. Os resíduos foram extraídos com acetonitrila através da SPE e
derivatizados com ácido trifluoroacético e 1-metilimidazol.
Valenzuela et al. [16] determinaram abamectina em laranjas por meio de
cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas com ionização por eletrospray
(LC-ES-MS) operada em modo positivo. A fim de identificar os principais íons para o analito
foi utilizada a análise por injeção em fluxo (FIA). Adotaram como método de extração a
técnica de dispersão da matriz em fase sólida (MSPD). A interface de ES-MS em modo
positivo foi operada com temperatura do gás de 350 °C, fluxo de gás de secagem de
13,0 L/min, pressão do gás nebulizador de 30 p.s.i. e 4000 V de tensão capilar. A média
global de recuperação para abamectina foi de 96%.
Yoshii et al. [17] desenvolveram um método analítico para determinação simultânea
de resíduos de emamectina, ivermectina e abamectina em culturas de vegetais. As
amostras foram extraídas com acetona por SPE e derivatizadas com anidrido trifluoroacético
e 1-metilimidazol em acetonitrila. A análise foi feita por cromatografia líquida de alta
4 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
eficiência com detecção por fluorescência (HPLC-FL), com vazão de 1,0 mL/min, volume de
injeção de 5 µL. O solvente A foi acetonitrila e o solvente B água. As condições de eluição
em gradiente foram inicialmente A: B (80: 20, v/v), depois por 5 min A: B (90: 10, v/v), nos
20 min seguintes A-B (93: 7, v/v) e por fim 100% de A ao longo 2 min. As amostras
detectadas foram confirmadas LC-ES-MS. O limite de detecção por LC-ES-MS foi
semelhante para o nível de detecção de fluorescência de 0,1-0,3 ppt.
Valenzuela et al. [18] realizaram um estudo de comparação de alguns métodos
cromatográficos líquidos para a análise de resíduos de avermectina em frutas cítricas após
extração pela dispersão da matriz em fase sólida (MSPD), a qual se apresenta vantajosa em
relação à simplicidade, menor consumo de solventes, maior precisão e menor interferência.
Foram comparadas as técnicas de cromatografia líquida por detecção por UV, detecção por
fluorescência e espectrômetro de massas com ionização por eletrospray. Destas a HPLC-FL
e a LC-ES-MS obtiveram resultados comparáveis, entretanto a HPLC-FL apresenta a
vantagem de ser econômica e de ter elevado grau de especificidade e boa sensibilidade,
resultante da forte fluorescência do derivado. Além disso, pode ser utilizado para quantificar
o isômero geométrico da abamectina.
Pollmeier et al. [19] desenvolveram um método para determinar resíduo de
eprinomectina B1a no leite bovino. A extração de eprinomectina B1a foi feita com
acetonitrila, após a adição de um padrão interno. O extrato contendo os analitos foi
evaporado até à secura e reconstituído numa solução contendo 30% de 1-N-metilimidazol
em acetonitrila. A análise das amostras foi realizada por HPLC-FL de fase reversa com fase
móvel constituída por metanol, acetonitrila, água, trietilamina e ácido fosfórico. A
recuperação global de extração de eprinomectina B1a é de 94%.
Pozo et al. [20] trabalharam com um método por LC-ESI-MS-MS para a
determinação de resíduos de azadiractina e abamectina em amostras de laranja. As
amostras foram extraídas com acetonitrila e nelas adicionado acetato de sódio, obtendo de
forma eficiente os adutos de sódio [M+Na]+, íons precursores que atribuem ao método maior
sensibilidade.
Sheridan et al. [21] desenvolveram um método utilizando extração líquido-líquido
(LLE) e LC-ES-MS-MS para determinação de cinco AVMs (abamectina, doramectina,
emamectina, eprinomectina, ivermectina) e uma milbemicina (moxidectina) no leite. Os
analitos foram extraídos a partir de leite integral em acetonitrila com uma subsequente troca
de solvente para metanol-água.
Sannino et al. [22] descreveram um método para a determinação de abamectina e
outras duas lactonas macrocíclicas em purê de maçã, suco de limão concentrado, purê de
5 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
tomate e ervilhas enlatadas. O procedimento analítico envolve uma extração com acetona e
partição líquido-líquido com acetato de etila e cicloexano combinados em um só passo. Os
extratos foram analisados por LC-ES-MS-MS em fase reversa e por gradiente sem qualquer
passo adicional de limpeza. Para fase móvel: solvente A era 10 mM de formato de amônio
aquoso, pH 3.9 e o solvente B acetonitrila. Iniciou-se a eluição com A: B (70: 30, v/v), em
seguida A: B (10: 90, v/v) durante 4 min e por fim A: B (50: 50, v/v) por 7 min.
Wang et al. [23] desenvolveram um método para a determinação de resíduos de
abamectina, ivermectina, doramectina e eprinomectina em vários produtos alimentares de
origem animal, tais como o músculo de porco, fígado de porco, peixe e leite. As amostras
foram homogeneizadas, extraídas e desprotonadas por acetonitrila e limpas em duas
etapas, primeiro utilizando colunas do SPE com C18 e depois cartuchos de alumina. Os
resíduos foram separados e determinados por LC-ESI-MS-MS. Os parâmetros de validação
analisados, como linearidade, recuperação, precisão e estabilidade apresentaram-se dentro
dos limites estabelecidos na literatura.
Frenich et al. [24] realizaram um estudo de comparação de quatro métodos de
extração para a determinação de drogas veterinárias, dentre elas as AVMs, em ovos por LCMS-MS. Os métodos de extração por solventes, extração em fase sólida (SPE), a dispersão
de matriz em fase sólida (MSPD) e procedimento QuEChERS modificado foram comparados
em termos de recuperação e número de medicamentos veterinários extraídos. O
procedimento de extração por solvente com uma etapa de clean-up proporcionou melhores
resultados do que os outros procedimentos testados. O procedimento QuEChERS foi mais
simples e mais rápido, mas extraiu menos compostos do que extração por solvente. MSPD
não extraiu tetraciclinas e quinolonas, enquanto tetraciclinas e macrólidos não foram
extraídos por SPE. O procedimento de extração por solvente foi validado e obteve
recuperação entre 60 - 119%.
Giannetti et al. [25] desenvolveram um método analítico qualitativo de HPLC-FL para
determinação
simultânea
de
ivermectina,
abamectina,
moxidectina,
eprinomectina,
doramectina e emamectina em gêneros alimentícios, musculares, ovos e leite. As amostras
foram extraídas com acetonitrila, purificadas através da LLE e derivatizadas com anidrido
trifluoroacético (TFAA) em presença de 1-metilimidazol e ácido acético. A precisão variou
entre 9,2 - 17,1% para o músculo, 9,9 - 16,6% para o leite e 9,4-17,4% para os ovos.
Xie et al. [26] descreveram um método de HPLC-FL em fase reversa para a
determinação de resíduos de abamectina em vegetais e frutas. Os resíduos de abamectina
foram extraídos com acetonitrila e derivatizados diretamente sem necessidade de clean-up.
6 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
A fase móvel foi filtrada utilizando um filtro de 0,22 µm e era composta de acetonitrila: água
(95: 5, v/v). Os LOD e LOQ foram respectivamente 0,0005 e 0,002 mg/g.
Liu et al. [27] desenvolveram um método para quantificação de resíduos de
abamectina e ivermectina em vegetal. O processo foi realizado pela derivatização por
acilação química que inicialmente utiliza N-metilimidazol e anidrido trifluoroacético e, em
seguida, reage com a hidroxila de abamectina para gerar um resíduo fluorescente. A análise
foi realizada por HPLC-FL com fase móvel de acetonitrila: água (95: 5, v/v), vazão de
0,4 mL/min e volume de injeção de 0,2 mL. A separação cromatográfica ocorreu em 3 min.
Kauffman et al. [28] operaram um método para a determinação de alguns fármacos
anti-helmínticos e fenilbutazona no leite e no músculo. Foi realizado um procedimento de
extração e evaporação simples, e posteriormente o extrato foi injetado em diferentes
sistemas de cromatografia líquida. A partir deste estudo pode-se concluir que os analitos
com propriedades fracas de fragmentação podem ser mais facilmente quantificados por
espectrometria de massas de alta resolução do que pela espectrometria de massa
empregando triplo quadrupolo.
Ruiz et al. [29] desenvolveram um procedimento para determinação de pesticidas
naturais, dentre eles a abamectina, em matrizes de frutas. Para extração das amostras foi
utilizado o método de preparo de amostras conhecido por QuEChERS. A análise dos
extratos foi feita por LC-ESI-MS-MS. A abamectina obteve como melhor íon precursor o
aduto de sódio [M+Na]+. A fase móvel, eluída em gradiente, era composta por A: água
contendo 0.1% de ácido fórmico e 5 mM de formato de amônio e B: acetonitrila contendo
2mM de acetato de sódio.
Rezzae et al. [30] descreveram um método para a determinação de abamectina em
frutas cítricas utilizando a técnica de SPE combinada com microextração dispersiva líquidolíquido e detecção por HPLC-UV. Neste estudo as amostras das frutas foram extraídas pelo
método de extração assistida por ultrassom seguida de SPE. Posteriormente a SPE, a
microextração dispersiva líquido-líquido para consecutiva purificação e enriquecimento da
abamectina foi empregada. Os efeitos dos parâmetros sobre a eficácia da extração do
método proposto foram investigados e otimizados. Um deles foi a linearidade que
apresentou valores adequados, obtendo um coeficiente de correlação de 0.998 para
abamectina B1a e 0.991 para B1b.
Pérez et al. [31] realizaram a análise de medicamentos veterinários, dentre eles a
abamectina, em queijos por meio da técnica de LC-MS-MS. A extração dos resíduos de
medicamentos veterinários no queijo foi realizada através do QuEChERS, que foi baseado
7 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
numa extração simples com acetonitrila e posterior adição de EDTA para facilitar a extração
das diferentes classes de medicamentos analisados.
A Tabela 1 apresenta alguns parâmetros da determinação de AVMs em alimentos.
Tabela 1. Alguns trabalhos sobre análise de AVMs em alimentos.
Analitos
Técnica de
análise
Técnica de
extração
% RSD ou
CV
Recuperação
(%)
ABA
HPLC-FL
ABA, EMA,
DOR, IVR
ABA, IVR
LC-MS-MS
SPE
13
87-98
SPE
< 15
80-95
LLE
3,2-10,3%
71,1-119,3
ABA
LC-ESI-MSMS
HPLC-UV
SPE
-
76-109
ABA
HPLC-FL
SPE
-
88-106
ABA
LC-ES-MS
MSPD
3-5
94-99
EMA, IVR,
ABA
ABA
HPLC-FL/LCES-MS
HPLC-UV/
HPLC-FL/ LCES-MS
HPLC-FL
SPE
-
80-110
0,01-10
mg/kg
-
MSPD
0,5-4,3
94
LLE
3-4,3
94
SPE
9-34%
> 80
LLE
-
99,6-128
SPE
3-20
70-100
SPE
4,7-13,8
62,4-104,5
LLE/
SPE/MSPD/
QuEChERS
LLE
8,8-22
57,1-120
9,2-17,4
63-89
EPR
ABA
IVR, DOR,
ABA,EPR,
EMA
ABA
ABA, IVR,
DOR, EPR
AVMs
IVR, DOR,
ABA,EPR,
EMA
ABA
LC-ESI-MSMS
LC-ESI-MSMS
LC-ESI-MSMS
LC-ESI-MSMS
LC-MS-MS
HPLC-FL
Faixa
Linear
LOD
LOQ
Ref
.
-
0,001mg/kg
0,003 mg/kg
3
1-500
µg/kg
5-1000
µg/L
0,054- 0.54
mg/kg
-
0,05-1,0 µg/kg
7
0,1-0,4 µg/kg
0,15-5,0
µg/kg
0,3-1,3 µg/kg
13
40 µg/kg
-
14
1 µg/kg
15
12 pg
0,002-0,005
mg/kg
0,0025 mg/kg
0,1-0,3 ppt
-
17
-
0,5-50 pg
0,005 - 0,03
mg/kg
18
2,3-51
ng/mL
0,01-0,1
mg/kg
-
0,25 ng/mL
2 ng/mL
19
< 0,007 mg/kg
0,001 mg/kg
20
0,016-1,0
ng/mL
-
21
-
1-10 µg/kg
22
0,05-0,68 µg/kg
23
-
0,17-2,27
µg/kg
0,1-5 µg/kg
5-200
µg/kg
-
-
25
0,0005 µg/g
0,002 µg/g
26
2,5-100
µg/kg
2,5-200
µg/kg
-
16
24
HPLC-FL
LLE
< 16,7
83,2-123,7
ABA,IVR
HPLC-FL
LLE
2,48-10
78,5- 110,2
0,001-5
µg/mL
-
-
-
27
ABA, IVR
LLE
-
-
-
-
-
28
ABA
LC-MS-MS/LCMS
LC-ESI-MS-MS
QuEChERS
20
70-110
-
-
29
ABA
HPLC-UV
SPE
11
87-96%
10-100
µg/kg
0,005-10
mg/kg
10,5 µg/kg
0,001-0,008
mg/kg
3,1 µg/kg
(ABA)/1,6
µg/kg (IVR)
14 µg/L
-
30
10,5 µg/kg
(ABA)/5,5
µg/kg (IVR)
46,7 µg/L
31
ABA, IVR
LC-MS-MS
QuEChERS
< 25
70-110
LLE
1.01
90-94
DOR
HPLC-FL
ABA
HPLC-FL
SPE
< 10.1
86-100.4
50,0-1000
µg/L
-
0,001 µg/kg
0,003 µg/kg
33
ABA, DOR,
IVR
IVR, DOR,
ABA,EPR,
EMA
IVR, DOR,
ABA,EPR,
EMA
HPLC-FL
LLE
< 7.5
72,4-106,5
-
0,04-0,05 µg/kg
34
36
LC–ESI-MS-MS
QuEChERS
3,714,1
74-102
-
-
0,12-0,16
µg/kg
-
HPLC-FL
QuEChERS
14
83-112
0,2-22,5
µg/L
0,4-3,2 µg/L
0,2-10 µg/L
32
35
8 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
Maia et al. [32] produziram um método de derivatização para determinação de
doramectina em leite bovino usando espectroscopia de fluorescência. Embora a capacidade
fluorescente seja uma função da estrutura molecular, o solvente também pode ter um efeito
forte sobre ele. Entre os solventes estudados, como etanol, acetonitrila, acetona e
isopropanol, o que apresentou maior rendimento quântico de fluorescência foi o etanol. Às
soluções etanólicas de doramectina foi adicionado hidróxido de sódio 0,25 mol/L e posterior
aquecimento, o que produziu sinais fluorescentes 1000 vezes mais elevados do que a
solução etanólica original.
Miao et al. [33] desenvolveram um método para a determinação de resíduos de
abamectina em óleos comestíveis por HPLC-FL. tetrahiOs resíduos foram extraídos usando
vórtex com acetonitrila e em seguida derivatizado com anidrido trifluoroacético e Nmetilimidazol. Foi utilizado metanol como fase móvel. O método apresentou LOD e LOQ de
0,001 mg/kg e 0,003 mg/kg, respectivamente, além de recuperação e precisão satisfatórias.
Macedo et al. [34] desenvolveram e validaram um método analítico para a
determinação simultânea de quatro lactonas macrocíclicas: abamectina, doramectina,
moxidectina e ivermectina em manteiga, utilizando HPLC-FL. A extração das amostras
foram feitas através do método de LLE aquecido e uma mistura de acetonitrila, acetato de
etila e água, com a pré-concentração e derivatização, a fim de produzir derivados
fluorescentes estáveis. As separações das amostras foram realizadas em aproximadamente
12,5 min através de uma eluição em gradiente de acetonitrila e água com vazão de
1,2 mL/min e volume de injeção de 20 µL.
Rúbies et al. [35] elaboraram um método baseado na técnica de preparo de amostra
QuEChERS seguido de LC–ESI-MS-MS para determinação de ivermectina, abamectina,
emamectina, eprinomectina, doramectina e moxidectina em carne. O método permite a
análise de AVMs em concentração de até 2,5 µg/kg e também proporciona alto rendimento
da amostra.
Furlani et al. [36] desenvolveram um método analítico para determinar ivermectina,
abamectina, doramectina, eprinomectina e moxidectina em produtos lácteos. Para extração
das amostras foi utilizado o método de preparo QuEChERS. O extrato foi derivatizado com
200 mL de 1-metilimidazole: acetonitrila (1: 1, v/v), 200 mL de anidrido trifluoroacético:
acetonitrila (1: 2, v/v) e 5 mL de ácido acético a 65 °C durante 30 min. Após arrefecido e
filtrado o extrato foi analisado por HPLC-FL com fase móvel composta por acetonitrila,
metanol e ácido acético a 2% com vazão de 1,2 mL/min.
9 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
3.2. Plasma
Rabel et al. [37] realizaram um estudo para melhorias na sensibilidade da detecção
para determinação de ivermectina no plasma do cão, utilizando cromatografia líquida de alta
eficiência. O aperfeiçoamento da sensibilidade de detecção para análise da ivermectina foi
observado por meio da utilização de detecção de fluorescência induzida por laser com
derivatização automatizada e por manipulação das condições cromatográficas. Cada
amostra foi derivatizada através da adição de 100 µL de N-metilimidazol: acetonitrila
(1: 1, v/v) seguido por 150 µL de anidrido trifluoroacético: acetonitrila (1: 2, v/v). As amostras
foram extraídas por meio da técnica de extração em fase sólida (SPE).
Fischer et al. [38] desenvolveram e validaram um método para a determinação de
ivermectina no plasma bovino, através da HPLC-UV com SPE on-line. A média de
recuperação do fármaco a partir do plasma é de 76,4%. A concentração mínima detectável
de ivermectina no plasma foi 0,8 ng/mL e o LOQ foi de 2 ng/mL.
Antonian et al. [39] desenvolveram um ensaio automatizado para quantificação de
eprinomectina em plasma bovino. Este ensaio determinou a concentração de eprinomectina
em plasma por HPLC-FL em fase reversa. No preparo das amostras foi realizada a extração
líquido-líquido (LLE) seguida de SPE. Cada coluna C18 da SPE foi condicionada
sequencialmente com 4 mL de acetonitrila, 4 mL de acetonitrila: clorofórmio contendo 0,1%
de 1-metilimidazol, 4 mL de acetonitrila e 4 mL de tampão de fosfato de sódio 0,1 M.
A Tabela 2 apresenta alguns parâmetros da determinação de AVMs em plasma de
diferentes trabalhos.
Tabela 2. Alguns trabalhos sobre análise de avermectinas em plasma.
Analitos
Técnica de
análise
Técnica de
extração
% RSD
ou CV
Recuperação
(%)
Faixa
Linear
LOD
LOQ
Ref.
0,06-0,60
ng/mL
2-100
ng/mL
0,05-200
ng/mL
1,0-200
ng/mL
1,0-30
ng/mL
-
-
37
0,8 ng/mL
0,01 ng/
mL
2 ng/L
-
0,05 ng/mL
39
-
-
40
0,3 ng/mL
-
41
-
-
42
-
-
43
IVR
HPLC-FL
SPE
-
-
IVR
HPLC-UV
SPE
3,8-6,7
76,4
EPR
HPLC-FL
SPE
10
> 84,9
SEL
HPLC-FL
SPE
1.3-17
101-118
IVR
CE-UV
-
-
81.8-87.1
IVR
LC-ESI-MS-MS
PP
0,09-81,7
76-97
IVR
HPLC-FL
2,3-6,1
> 80
SPE
0,2-200
ng/mL
38
Walker et al. [40] desenvolveram um método analítico para selamectina no plasma do
cão e do gato. O método envolve SPE e derivatização química utilizando trietilamina e
anidrido trifluoroacético. As amostras foram analisadas através de técnica de HPLC-FL com
10 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
uma fase móvel de acetonitrila: água: tetrahidrofurano (67: 17: 15, v/v/v), com vazão de
0,5 mL/min.
Kowalski et al. [41] determinaram ivermectina no plasma do porco e do cavalo por
meio de um método de eletroforese capilar (CE). O método foi validado por meio de
avaliações de uma série de fatores, como a linearidade, seletividade, precisão, exatidão e
sensibilidade. Obteve-se um intervalo linear de 1 a 30 ng/mL, com coeficientes de
correlação superiores a 0,999. O limite de detecção (LOD) foi de 0,3 ng/mL e o limite de
quantificação (LOQ) de 1 ng/mL, utilizando um tamanho de amostra de 0,5 mL. Os melhores
resultados foram obtidos utilizando uma solução tampão composta por 25% (v/v) de metanol
e 75% (v/v) de tetraborato de sódio decahidratado (pH 9,26, 10 mM), dihidrogenofosfato de
sódio (pH 5,73; 10 mM) e ácido bórico (pH 6,94; 10 mM).
Pereira et al. [42] utilizaram um método de cromatografia líquida com espectrometria
de massas com ionização por eletrospray (LC-ESI-MS-MS) operada em modo positivo para
a determinação de ivermectina no plasma humano e de rato. A emamectina foi utilizada
como o padrão interno. O preparo de amostra envolveu a precipitação de proteína e filtração
do plasma fortificado. O método apresentou boa precisão e exatidão.
Kitzman et al. [43] desenvolveram um método para a quantificação de ivermectina no
plasma humano, a droga foi extraída a partir de 0,2 mL de plasma utilizando cartuchos de
extração em fase sólida. Após extração foi feita a reação dos derivados fluorescentes de
ivermectina com anidrido trifluoroacético e N-metilimidazol. As análises foram feitas pela
técnica de HPLC-FL com fase móvel composta por tetrahidrofurano: água: acetonitrila
(40: 38: 22, v/v/v). As recuperações de ivermectina foram maiores do que 80%.
3.3.
Soro
Sams et al. [44] utilizaram um método para análise de AVMs em soro bovino que
possibilitou um aumento na sensibilidade de detecção por meio da desidratação do anel
dihidroxiciclohexano empregando anidrido acético: piridina (1: 3, v/v) e assim produzindo um
derivado intensamente fluorescente com uma absorção máxima a 365 nm e emissão a
475 nm. As amostras foram extraídas pela técnica de SPE utilizando acetato de etila após o
tratamento do soro com dois volumes de etanol: água (1: 1, v/v). As amostras foram
analisadas por meio da técnica HPLC-FL e detectadas em concentrações menores que
1,0 ng/mL.
Taylor et al. [45] realizaram um estudo sobre a detecção de ivermectina no soro de
gado por CCD após derivatização da droga através de uma reação com anidrido
trifluoroacético e 1-metilimidazol. As placas pré-revestidas de sílica-gel possuíam 0,2 mm de
11 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
espessura e foram desenvolvidas à temperatura ambiente com uma mistura de hexano:
acetona: decano: metanol (59: 30: 10: 1, v/v/v/v). Através desse método simples é possível
detectar ivermectina no soro do gado durante três a quatro semanas após tratamento
subcutâneo.
3.4.
Sangue
Gupta et al. [46] realizaram um estudo para determinar resíduos de selamectina no
sangue do cão e em luvas usadas para acariciar cães após a aplicação de RevolutionTM. As
análises foram realizadas utilizando a técnica de HPLC-UV, com fase móvel de acetonitrila:
tetrahidrofurano: água (68: 17: 15, v/v/v) e vazão de 1 mL/min. A recuperação de
selamectina das luvas e do sangue foi de 98% e 96%, respectivamente.
3.5.
Dejetos Fecais
Uma das principais formas de excreção de AVMs do corpo do animal,
independentemente da via de administração é pelas fezes [6]. Floate et al. [47] descreveram
um método qualitativo baseado em cromatografia de camada delgada (CCD) para detecção
de ivermectina como um derivado fluorescente em extratos de estrume de gado. O limite de
detecção (LOD) foi de aproximadamente 40 ng/g de esterco molhado. Os resíduos foram
detectados em fezes frescas depositadas por animais tratados com uma dose tópica de
ivermectina, 500 mg/kg de peso corporal 10 dias antes da análise.
Kolar et al. [48] determinaram abamectina e doramectina em fezes de ovelha. As
AVMs foram extraídas a partir dos excrementos com acetonitrila, utilizando SPE. As análises
realizadas por HPLC-FL após derivatização com N-metilimidazol. O método apresentou uma
boa recuperação na faixa de 66,4 - 80,8% para abamectina e 67,7 - 85,5% para
doramectina, além de um baixo LOD e LOQ de 1,0 ng/g e 2,5 ng/g, respectivamente.
A Tabela 3 apresenta três trabalhos para a determinação de AVMs em dejetos fecais.
Tabela 3. Alguns trabalhos sobre análise de avermectinas em fezes.
Analitos
Técnica de
análise
Técnica de
extração
% RSD ou
CV
Recuperação
(%)
Faixa
Linear
LOD
LOQ
R
ef.
ABA,
DOR
EPR
HPLC-FL
SPE
-
66,4-85,5
-
1,0 ng/g
2,5 ng/g
48
HPLC-FL
SPE
-
79,5
-
HPLC-FL
SPE
< 15
85-89
-
0,0036
mg/kg
-
49
EPR
0,0018
mg/kg
2,5 ng/g
50
12 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
Halley et al. [49] realizaram um estudo para determinar se haveria quaisquer efeitos
nas minhocas a partir de fezes de gado tratado com a formulação comercial de
eprinomectina (EPRINEX®). O extrato inicial foi evaporado até à secura, reconstituído em
cloreto de metileno e diluído com hexano. A análise foi efetuada através da HPLC-FL. A
recuperação global foi de 79,5%.
Litskas et al. [50] desenvolveram um método de HPLC-FL para determinação
quantitativa de eprinomectina (EPM) nas fezes do gado e no solo. A EPM foi extraída com
acetona e acetonitrila a partir do solo e das fezes do gado, respectivamente. Foram
realizadas a SPE e a reação de derivatização com N-metilimidazol, na presença de anidrido
trifluoroacético e ácido acético. A recuperação global foi de 89% no solo e 85% em fezes do
gado. Além disso, o método apresentou baixos LOD e LOQ e boa reprodutibilidade.
3.6.
Formulações Farmacêuticas
Abend et al. [51] desenvolveram um método de controle de ivermectina em
HEARTGARD CHEWABLES®, tratamento contra vermes a base de carne. A determinação
da substância ativa foi feita por meio de HPLC-UV de fase inversa, em modo isocrático. O
método consiste na extração automática de ivermectina a partir da formulação à base de
carne, em condições de temperatura e pressão elevadas, conhecida como extração
acelerada por solvente (ASE).
Webster et al. [52] propuseram um método rápido de espectrometria de infravermelho
próximo (NIR) para determinações quantitativas de selamectina e umidade em formulações
para cães e gatos. Os dados foram gerados utilizando um espectrômetro de módulo de
transporte de amostra de transmitância e um aquecimento de 30 °C. Os espectros foram
obtidos usando uma célula de quartzo ao longo de um intervalo de comprimento de onda de
400-2500 nm. O funcionamento do instrumento, bem como o recolhimento e posterior
manipulação dos espectros, foi controlado. Este método produz resultados de ensaio não
significativamente diferente dos cromatográficos.
A Tabela 4 mostra alguns parâmetros para a determinação de IVM em formulação
farmacêutica.
Tabela 4. Trabalho sobre análise de ivermectina em formulação farmacêutica.
Analitos
IVR
Técnica de
análise
HPLC-UV
Técnica de
extração
% RSD ou
CV
-
-
Recuperação
(%)
Faixa
Linear
LOD
LOQ
Ref.
99,98
27,01-81,02
µg/mL
0,07
µg/mL
0,20
µg/mL
53
13 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
Shurbaji et al. [53] propuseram o desenvolvimento e a validação de um método por
HPLC-UV em fase reversa para determinação simultânea de triclabendazol e ivermectina
em formulação farmacêutica. A fase móvel era composta por acetonitrila: metanol: água:
ácido acético (56,0: 36,0: 7,5: 0,5, v/v/v/v) com vazão de 1 mL/min. Foram analisados vários
parâmetros de validação, como linearidade, precisão, recuperação, LOD, LOQ, robustez,
estabilidade. Para a ivermectina a curva de calibração foi linear no intervalo de 27,01 –
81,02 µg/mL com r = 0,9999, LOD e LOQ foi de 0,07 e 0,20 µg/mL, respetivamente.
Precisão intra-dia 100,79% e RSD 0,73% e inter-dia 100,55% e RSD 0,59%.
3.7.
Água, solo e sedimentos
Brewer et al. [54] utilizaram cromatografia líquida acoplada à espectrometria de
massas triplo quadruplo com ionização química à pressão atmosférica (LC-APCI-MS-MS)
para a separação e a determinação dos isómeros de avermectina em amostras de solo. O
solvente A era água e o solvente B acetonitrila. O gradiente de eluição utilizado foi
inicialmente A: B (80: 20, v/v) durante 1 min, em seguida A: B (50: 50, v/v), e durante 14 min
um gradiente convexo de A: B (5: 95, v/v) e posterior a isso o gradiente foi invertido para
reduzir o tempo de equilíbrio. A vazão foi de 1,0 mL/min.
Raich-Montiu et al. [55] fizeram um estudo de um método com base na extração com
fibra oca suportada por membrana (HF-SLM) seguido por HPLC-MS-MS para determinar
ivermectina em águas ambientais. A fase móvel A continha acetonitrila: metanol: 10 mM do
tampão formiato de amônio, pH 4 (43: 34: 23, v/v/v) e B acetonitrila (100%). O gradiente
consistiu em 100% de A de 0 a 20 min, 50% A e 50% B de 20 para 25 min e 100% de A
novamente de 25 a 30 min. O volume de injeção foi de 10 µL.
Krogh et al. [56] desenvolveram um método analítico para a determinação de seis
AVMs (abamectina, doramectina, ivermectina, benzoato de emamectina, eprinomectina e
selamectina) e uma milbemicina (moxidectina) na água, sedimentos e amostras de
superfície do solo. Todas as amostras foram extraídas através da extração com líquido
pressurizado (PLE) seguido por uma extração em fase sólida (SPE), com exceção das
amostras aquosas em que a extração foi feita apenas utilizando SPE. Todos os compostos
foram analisados usando cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas com
ionização química à pressão atmosférica (LC-APCI-MS-MS).
Raich-Montiu et al. [57] propuseram um método analítico para a análise de
abamectina, doramectina e ivermectina em solos. As análises foram realizadas pela técnica
de HPLC-MS. Os analitos foram extraídos através da extração assistida por micro-ondas
(MAE) da seguinte maneira: 5 mL de acetonitrila: água (90: 10, v/v) foi adicionada a 1 g de
14 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
amostra de solo num vaso de extração de 35 mL de PTFE. Após 15 min de irradiação de
micro-ondas a 120 oC os vasos foram arrefecidos a ar e seu conteúdo foi centrifugado a
1500 g durante 15 min. Em seguida o extrato foi devidamente tratado para ser analisado.
Park et al. [58] realizaram um estudo para desenvolver um método analítico para a
determinação de multiresíduos das AVMs: abamectina, ivermectina, e doramectina e, da
milbemicina, moxidectina em amostras de solo. As amostras foram extraídas pela técnica de
extração de fluido supercrítico (SFE) usando CO2 supercrítico modificado com etanol e
analisadas por HPLC-MS-MS. As principais condições para extração foram temperatura de
80 °C, pressão a 300 kg/cm2 e tempo de extração de 40 min. A linearidade das curvas de
calibração foi excelente e apresentou os coeficientes de correlação entre 0,998 - 0,999,
numa faixa linear de 1,5 - 500 ng/g.
Islam et al. [59] desenvolveram um método de HPLC-MS-MS para determinação de
anti-helmínticos no solo e na água, incluindo a eprinomectina. O preparo de amostras
envolveu a técnica de SPE, sendo que no preparo das amostras de solo houve a etapa de
clean-up enquanto nas amostras de água não. O LOQ para eprinomectina foi de 20 µg/L.
A Tabela 5 mostra alguns parâmetros para a determinação de algumas AVMs em
águas, solos e sedimentos.
Tabela 5. Alguns trabalhos sobre análise de avermectinas em águas, solos e sedimentos.
Analitos
Técnica de
análise
Técnica de
extração
% RSD
ou CV
Recuperação
(%)
Faixa
Linear
LOD
LOQ
Ref.
ABA
LC-APCI-MS-MS
SPE
-
-
-
-
-
54
IVR
HPLC-MS/MS
HF-SLM
< 15
-
13 µg/L
43 µg/L
55
IVR, DOR,
ABA,EPR,
EMA, SEL
ABA,
DOR, IVR
ABA,DOR,
IVR
EPR
LC-APCI-MS/MS
PLE/SPE
9-26
38-88
13-7500
µg/L
-
-
-
56
HPLC-MS/MS
MAE
3,6-11
88-91
-
18-25 ng/g
-
57
HPLC-MS/MS
SFE
-
82,5-96,2
1,5 ng/g
5 ng/g
58
HPLC-MS/MS
SPE
-
35,4-125,1
1,5-500
ng/g
-
-
20 µg/kg
59
IVR
LC-APCI-MS/MS
SPE
-
88-96
--
20 ng/g
60
Löffler et al. [60] produziram um método analítico para determinação de fármacos
ácidos, antibióticos e ivermectina em sedimentos de um rio utilizando, no caso da
ivermectina, cromatografia líquida acoplada à LC-APCI-MS-MS no modo para íons
negativos. Para extração da ivermectina foram misturados 500 mL de sedimento aquoso a
25 mL de tampão acetato de amônio (1 mol/L, pH 4,0). A SPE foi realizada em cartuchos de
vidro preenchidos com 250 mg LiChrolute® EN (40-120 µm). Em seguida, os cartuchos
foram eluídos com 4 x 1 mL de acetato de etila. Os eluatos foram reduzidos até à secura
15 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
sob uma corrente suave de azoto e os resíduos foram dissolvidos em 500 µL de uma
mistura de tampão de acetato de amónio (15 mmol L-1, pH 4,0) e acetonitrila (90: 10, v/v).
3.8.
Tecidos e órgãos
Samsonova et al. [61] desenvolveram um biosensor óptico para detectar resíduos de
ivermectina no fígado bovino. A extração da ivermectina ocorreu da seguinte forma: as
amostras de fígado foram homogeneizadas e pesadas (20 ± 0,1 g). As amostras de fígado
foram misturados com 25 mL das soluções de ivermectina em tampão HBS-EP (0,01 M
HEPES, 0,15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% polissorbato 20, pH 7,4). Após incubação, 4 mL
de acetonitrila foi adicionada a cada amostra que após agitação passou por centrifugação. A
3 mL de sobrenadante adicionou-se 7 mL de água destilada e 20 mL de trietanolamina. As
soluções foram aplicadas em colunas C8 de SPE previamente pré-condicionadas por 3 mL
de acetonitrila, seguido por 3 mL de acetonitrila: água (30: 70, v/v) contendo 0,1% de
trietanolamina. A ivermectina foi eluída utilizando 3 mL de acetonitrila. Os eluatos foram
evaporados até à secura sob uma corrente de azoto e transferidos para tubos após adição
de etanol.
Shi et al. [62] desenvolveram um teste de ELISA (do inglês, Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) para detectar resíduos de AVMs, incluindo abamectina, ivermectina e
eprinomectina em fígado bovino. Os tampões utilizados no ELISA foram o tampão de
revestimento de 0,05 M de carbonato (pH 9,6); o tampão de ensaio foi de solução de
tampão fosfato, contendo 0,01 M de fosfato (pH 7,2) e 0,145 M de NaCl; o tampão de
lavagem foi o tampão fosfato contendo 0,05% de polissorbato 20; o tampão de
bloqueamento consistia de tampão de revestimento e 0,5% de caseína. As recuperações
destas drogas variaram de 53,8% a 80,6%.
A Tabela 6 mostra alguns parâmetros para a determinação de algumas AVMs em
tecidos e órgãos.
Tabela 6. Alguns trabalhos sobre análise de avermectinas em tecidos e órgãos.
Analitos
Técnica de
análise
IVR
Biossensor
SPE
ELISA
LLE
ABA,IVR,
EPR
ABA, IVR,
DOR
ABA, IVR,
EPR, DOR,
EMA
Técnica de
extração
% RSD
ou CV
Recuperação
(%)
Faixa
Linear
LOD
LOQ
Ref.
-
82
-
3,4-17,9
53,8-80,6
-
19,1 ng/g
-
61
-
1,06 ng/mL
62
HPLC-FL
SPE
-
72-81
-
-
1 µg/kg
63
LC-ESI-MS/MS
LLE
1,5-8,4
87,9-99,8
-
0,07-1,8 ng/g
0,2-10 ng/g
64
16 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
Wang et al. [63] por meio da técnica de HPLC-FL determinaram simultaneamente
abamectina, ivermectina e doramectina no fígado do boi. As amostras foram extraídas
utilizando acetonitrila e limpeza feita sobre uma coluna SPE de alumina. Realizou-se a
derivatização com anidrido trifluoroacético. O LOQ para as três AVMs analisadas foi
aproximadamente 1 µg/kg. A especificidade do método foi determinada por comparação dos
cromatogramas de amostras do plasma bovino livre de drogas com o cromatogramas das
amostras com as AVMs.
Inoue et al. [64] desenvolveram um método analítico para a quantificação das AVMs:
abamectina B1a, abamectina 8,9-Z isômero B1a, benzoato de emamectina B1a, benzoato
de emamectina 8,9-Z isômero B1a, ivermectina, eprinomectina B1a, doramectina em tecidos
bovinos, como músculo, fígado e tecido adiposo por meio de LC-ESI-MS/MS em modo de
íon positivo. A fase móvel consistia em acetonitrila e solução aquosa de formato de amónio
0,1 mM contendo 0,1% de ácido fórmico (v/v) com uma vazão de 0,2 mL/min. As extrações
das amostras foram feitas através da técnica de extração liquido-liquido (LLE) utilizando isooctano. O método apresentou-se linear com r2 variando na faixa entre 0,997–0,999.
3.9.
Outros
Brimer et al. [65] desenvolveram um método in vitro para determinação do efeito
acaricida da ivermectina no gel de ágar utilizando o artrópode Sarcoptes scabiei var. suis
como organismo teste. O método se baseia na capacidade de migração e sobrevivência do
artrópode sobre a superfície do gel que comporta a ivermectina. Foi utilizada a técnica de
HPLC com detecção por UV-Vis.
Zangh et al. [66] realizaram um estudo de preparação e caracterização físico-química
de microcápsulas biodegradáveis de benzoato de emamectina. A preparação e
caracterização físico-química das microcápsulas foram estudadas pelo método de
evaporação/extração de solvente modificado utilizando polilactida (PLA) como material da
parede. Foi examinada a influência das composições de solvente orgânico na fase interna
aquosa e na externa em diâmetro, extensão, carga de pesticida e taxa de retenção das
microesfera. De acordo com os resultados o processo de extração de solvente e a formação
das microcápsulas podem ser acelerados por adição de solventes orgânicos miscíveis com
a água tais como éter etílico, acetona, acetato de etilo, ou n-butanol em fase orgânica e fase
aquosa interna externa.
Pietruk et al. [67] propuseram um procedimento analítico para determinação de
ivermectina em ração medicada no nível recomendado de 2,0 mg/kg. O analito foi extraído
de amostras de rações moídas com acetonitrila e derivatizado com N-metilimidazol e
17 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
anidrido trifluoroacético. Os extratos foram analisados por HPLC-FL em condições
isocráticas utilizando acetonitrila, metanol, água e tetrahidrofurano. O tempo total de análise
foi de 10 min.
Garric et al. [68] desenvolveram um estudo para avaliar a toxicidade da ivermectina
para dois organismos de água doce, o cladócero Daphnia magna e a alga verde
Pseudokirchneriella subcapitata. A toxicidade crônica de ivermectina para D. magna foi
extremamente elevada: com 0,001 e 0,0003 ng/L, mostrando haver possível risco de
intoxicação por ivermectina para os ecossistemas aquáticos.
A Tabela 6 apresenta alguns trabalhos da determinação de AVMs em diferentes
matrizes.
Tabela 6. Alguns trabalhos sobre análise de avermectinas em diferentes matrizes.
Analitos
Técnica de
análise
Técnica de
extração
% RSD
ou CV
Recuperação
(%)
Faixa
Linear
LOD
LOQ
Ref.
IVR
HPLC-UV
SPE
-
91
50-100
ng/mL
0,5-5
mg/kg
-
-
65
0,03 mg/kg
0,5 mg/kg
67
IVR
4.
HPLC-FL
SPE
<8
70-110
CONSIDERAÇÕES FINAIS
Após uma análise dos artigos revisados foi possível verificar uma grande variedade
de metodologias para a determinação de AVMs em diferentes matrizes. Foram realizadas
diversas técnicas de análise e diferentes métodos de preparo de amostra. Alguns métodos
descritos empregam mais de uma técnica de preparo de amostras, isto se deve ao fato de
algumas matrizes serem muito difíceis de trabalhar.
A Figura 2 mostra uma relação entre número de artigos publicados no período de
1991 a 2015 associando tipos de matrizes, técnicas instrumentais e técnicas de preparo de
amostras. Na Figura 2A, nota-se um maior número de determinação de AVMs em matrizes
de alimentos, uma vez que a preocupação com os possíveis danos a saúde causados por
resíduos destes fármacos vem aumentando com o crescimento da qualidade de vida da
população em geral. 18 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
Figura 2. (A) Número de artigos versus os tipos de matrizes; (B) Número de artigos versus
as técnicas instrumentais; (C) Número de artigos versus os métodos técnicas de preparo de
amostra no período de 1991 a 2015.
19 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
A técnica analítica instrumental mais utilizada nas metodologias para a determinação
de AVMs é a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), particularmente aquelas
acopladas a detectores de fluorescência (FL) e de espectrometria de massas (MS), como se
observa na Figura 2B. A grande seletividade e sensibilidade dos métodos analíticos
desenvolvidos podem ser constatadas por meio das tabelas apresentadas no decorrer do
trabalho. Outra importante etapa para a determinação das AVMs foi a técnica de preparo de
amostras, que teve como técnicas mais utilizadas a extração em fase sólida (SPE), a
extração líquido-líquido (LLE) e QuEChERS, como pode ser visto na Figura 2C.
Além dessas relações associadas aos tipos de matrizes, técnicas instrumentais e
técnicas de preparo de amostras empregadas, também foi realizada uma análise dos tipos
de avermectinas mais determinadas nos métodos revisados, sendo a IVR seguida pela ABA
os fármacos mais utilizados do grupo, como pode ser observado na Figura 3.
Figura 3. Número de artigos versus os tipos de avermectinas.
Finalmente,
as
AVMs
são
fármacos
muito
potentes
em
suas
atividades
antiparasitárias e necessitam de pequenas doses para obter eficácia, o que leva a sua
ampla utilização. Entretanto, seu uso indiscriminado pode ocasionar danos à saúde e até
mesmo ao ambiente. Desta maneira, a busca por metodologias baratas e eficientes que
apresentem, dentre outras características, maior sensibilidade e seletividade, levam a crer
em estudos promissores para as AVMs em diferentes matrizes, o que poderá solucionar
diferentes problemas nas áreas envolvidas nesta temática.
20 Monografia de TCC – Química – Bacharelado – UFSJ -2015
4.
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