ESTUDO COMPARATIVO DE METODOLOGIAS PARA DETERMINAÇÃO DE
PROTEÍNAS EM ESGOTOS BRUTOS E TRATADOS
Patrícia Procópio Pontes*
Engenheira Química, Mestre em Saneamento e Meio Ambiente, Doutoranda em Saneamento,
Meio Ambiente e Recursos Hídricos pela UFMG, Professora do Centro Federal de Educação
Tecnológica de Minas Gerais, Coordenação de Química
Carlos Augusto de Lemos Chernicharo
Professor adjunto do Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade
Federal de Minas Gerais
Marco Túlio Rocha Porto
Mestrando do Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais
Endereço (*): Av. do Contorno, 842/701 – Belo Horizonte – MG – Brasil - CEP 30110-060 – Tel: (55-31) 32381020 – Fax : (55-31) 3238-1879 – E-mail: calemos@ desa.ufmg.br
RESUMO
O presente trabalho objetivou o estudo comparativo de metodologias para a determinação de proteínas em esgotos
sanitários. Foram analisadas amostras de esgoto bruto e de efluentes tratados, pelos métodos do Micro-biureto, de
Lowry e de Bradford. Realizou-se, ainda, uma comparação entre esses métodos e o método Kjeldahl. A análise dos
resultados obtidos indica a obtenção de teores de proteínas mais elevados através do método do Micro-biureto em
relação aos outros métodos. Os resultados do método de Lowry foram os mais próximos do método Kjeldahl,
enquanto o método de Bradford pareceu apresentar uma tendência em subestimar o teor de proteínas nas amostras.
Através do cálculo da DQOequivalente da amostra, a partir da sua concentração em termos de lipídios, carboidratos e
proteínas, pôde-se observar que o método de Lowry e o método Kjeldahl propiciaram uma melhor estimativa da
DQOfiltrada das amostras. O método do Micro-biureto apresentou valores muito elevados para a estimativa da
DQOfiltrada.
Palavras-chave: Determinação de proteínas, método de Bradford, método de Lowry, método do Micro-biureto,
método Kjeldahl.
INTRODUÇÃO
A determinação de material orgânico em águas residuárias é realizada através de métodos indiretos, pelas análises
de Demanda química de oxigênio (DQO) e Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO). Quando se deseja um maior
conhecimento sobre o tipo de composto orgânico presente, outros métodos de análise tornam-se necessários.
O método mais utilizado para análise de proteínas em águas residuárias é o Método Kjeldahl. Inúmeros métodos são
citados na literatura especializada para a análise de proteínas, sendo mais comuns os métodos do Micro-biureto, de
Lowry e de Bradford. Esses métodos apresentam como vantagens a rapidez e economia na realização das análises,
entretanto, deve-se ter cuidado em relação à presença de compostos que causem interferências nos resultados.
O método de Lowry, ou método do folin-fenol, é o método mais utilizado pelos pesquisadores, devido à sua
simplicidade, precisão e sensibilidade. Entretanto, pode apresentar resultados diferentes para diferentes proteínas. O
método de Bradford tem apresentado um aumento de popularidade nos últimos anos, como resultado de sua
simplicidade e falta de interferência de reagentes laboratoriais, que geralmente afetam os outros métodos, entretanto
pode, também, apresentar diferentes resultados em função do tipo de proteína presente. Quando se utiliza uma
mistura com diferentes proteínas, os erros produzidos como conseqüência desse problema são reduzidos. O método
do Micro-biureto tem como vantagem, em relação a esses métodos, o fato de seu resultado ser independente do tipo
de proteína presente, entretanto tem uma menor sensibilidade em relação aos outros métodos colorimétricos e a
turbidez da amostra pode causar grande interferência no resultado.
A escolha do método para análise de proteínas e o padrão utilizado pode, em casos extremos, provocar
inconsistência entre os resultados. Recomenda-se o uso do método de Lowry como método de escolha para usos
gerais para se obter uma maior consistência entre os laboratórios. Raunjaer et al. (1994) sugere o uso do método de
Lowry para a análise de proteínas em águas residuárias. De acordo com os pesquisadores, embora o método de
Lowry possa fornecer valores mais elevados de proteínas quando compostos interferentes estiverem presentes, a
presença desse tipo de compostos interferentes não foi observada em águas residuárias. Os pesquisadores não
avaliaram o uso do método em efluentes tratados.
O presente trabalho objetivou o estudo comparativo entre os métodos do Micro-biureto, de Lowry e de Bradford
para a análise de proteínas em esgotos sanitários. Realizou-se, ainda, uma comparação desses métodos com o
método Kjeldahl e um cálculo da DQOequivalente da amostra, a partir da sua concentração em termos de lipídios,
carboidratos e proteínas, para comparação com a DQOfiltrada obtida para a amostra.
MATERIAL E MÉTODOS
Descrição do aparato experimental
Para avaliação do uso dos métodos de análise de proteínas em esgotos sanitários e efluentes tratados, foi realizado o
monitoramento de um sistema de tratamento de esgotos sanitários que consistiu de um reator UASB, em escala
piloto, seguido de um filtro biológico percolador (FBP), utilizado para o pós-tratamento do efluente anaeróbio. O
sistema reator UASB/FBP foi alimentado com esgoto sanitário retirado diretamente do interceptor da margem
direita do ribeirão Arrudas, na cidade de Belo Horizonte - Brasil. Os esgotos passavam, inicialmente, por unidades
de tratamento preliminar (cesto perfurado e caixa de areia) e por um tanque de acumulação/distribuição, localizados
a montante do reator UASB. Os experimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Instalações Piloto – LIP do
Departamento de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais.
Monitoramento do sistema
Durante o monitoramento das unidades piloto, foram realizadas análises do esgoto bruto, do efluente do reator
UASB e do efluente final do decantador secundário do FBP. Os parâmetros analisados foram: DBO (total e filtrada),
DQO (total e filtrada), Sólidos Suspensos Totais, alcalinidade, ácidos graxos voláteis, pH, e temperatura. Foram
realizadas amostragens compostas, sendo as análises desenvolvidas segundo o Standard Methods for the
Examination of Water and Wastewater (AWWA/APHA/WEF, 1998).
Complementarmente, e para efeito de comparação, foram realizadas análises de proteínas, pelos métodos de Lowry
(Lowry, et al., 1951), de Bradford (Bradford, 1976) e do Micro-biureto modificado (Itzhaki & Gil, 1964). Uma
breve descrição desses métodos é apresentada a seguir.
Método do Micro-biureto modificado
O método consiste na adição de hidróxido de sódio e sulfato de cobre à solução que contém proteínas. O excesso de
sulfato de cobre é removido por centrifugação. Mede-se a absorbância do sobrenadante, que apresenta cor violeta,
em um espectrofotômetro a 310 nm. A intensidade da cor desenvolvida é proporcional à quantidade de proteínas
presente na amostra. Determina-se a concentração de proteínas através de uma curva padrão previamente construída,
por exemplo, para a caseína. A determinação de proteínas é realizada em triplicata, sendo considerada para cálculo
da concentração a absorbância média (Blundi & Gadelha, 2001).
Método de Lowry
O método de Lowry se baseia na reação do cobre com a proteína, em meio alcalino, e posteriormente redução do
reagente de fosfomolibdato-fosfotungstenato no reagente folin. Quando o reagente folin é adicionado à proteína
tratada com o cobre, ocorre a redução do reagente folin que resulta em uma cor mais intensa, com absorção máxima
em 550 nm. A concentração de proteínas é determinada através de uma curva padrão previamente construída para a
soroalbumina bovina e a análise é realizada em triplicata.
2
Método de Bradford
O método de Bradford se baseia na ligação do reagente Coomassie Blue com as proteínas. Utiliza-se soroalbumina
bovina como padrão e realiza-se o teste em triplicata. A leitura da absorbância é realizada em espectrofotômetro a
595 nm.
Determinação da DQO equivalente
Para a determinação da DQO correspondente a carboidratos, proteínas e lipídios (DQOequivalente.), foram realizadas,
também, análises de lipídios (Postma & Stroes, 1968) e carboidratos (Dubois et al., 1956). A partir dos resultados
destes constituintes específicos, foram utilizados os seguintes fatores de equivalência para se estimar a concentração
de DQO filtrada equivalente: carboidratos = 1,1; proteínas = 1,5; e lipídeos = 2,9, conforme Miron et al. (2000).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Caracterização das amostras
Os resultados médios obtidos para a caracterização das amostras, em termos de DQO, DBO e SST, são apresentados
na TABELA 1.
TABELA 1: Valores médios obtidos para DBO, DQO e SST das amostras analisadas (N=21)
Parâmetro
Esgoto Bruto
Efluente do reator
Efluente do Filtro
anaeróbio
Biológico
DBO (mg.L-1)
381 ± 50
68 ± 32
33 ± 6
DQO (mg.L-1)
536 ± 72
160 ± 31
102 ± 19
SST (mg.L-1)
233 ± 70
33 ± 16
23 ± 12
Comparação entre os métodos Kjeldahl, Lowry, Micro-biureto e Bradford
Inicialmente, foram realizados experimentos com os métodos de Bradford, de Lowry e do Micro-biureto, para a
determinação de proteínas em esgoto bruto e no efluente do reator anaeróbio. Os resultados obtidos são
apresentados na TABELA 2 e nas Figuras 1 e 2.
TABELA 2: Resumo dos resultados médios obtidos para a análise pelos métodos de Lowry,
Bradford e Micro – biureto (N=9)
Método de análise
Esgoto Bruto
Efluente do reator anaeróbio
Lowry (mg.L-1)
104 ± 3,9
51 ± 12
Bradford (mg.L-1)
24 ± 2,8
12 ± 3
Micro – biureto (mg.L-1)
213 ± 8
180 ± 20
3
250
200
200
Conc.(mg/L)
Conc.(mg/L)
250
150
100
50
0
150
100
50
Biureto
Lowry
Bradford
Figura 1: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Bradford para a análise de
esgoto bruto
0
Biureto
Lowry
Bradford
Figura 2: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Bradford para a análise de
efluente anaeróbio
Observaram-se resultados muito diferentes, obtidos a partir de cada método de análise utilizado. O método de
Bradford foi o que apresentou valores mais baixos e uma pior estimativa do teor de proteínas. Por esta razão, os
experimentos passaram a ser realizados com os métodos de Lowry, do Micro-biureto e Kjeldahl.
Os resultados médios obtidos através dos métodos de Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto, para as amostras estudadas,
são apresentados na TABELA 3 e os resultados da DQOequivalente na TABELA 4.
TABELA 3: Resumo dos resultados médios obtidos para a análise pelos métodos de Lowry, Kjeldahl
e Micro-biureto (N=12)
Método de análise
Esgoto Bruto
Efluente do reator
Efluente do Filtro
anaeróbio
Biológico
Lowry (mg.L-1)
102 ± 9
69 ± 15
43 ± 1,7
Kjeldahl (mg.L-1)
93 ± 27
49 ± 30
69 ± 40
Micro-biureto (mg.L-1)
222 ± 51
209 ± 47
188 ± 35
TABELA 4: Resumo dos resultados médios obtidos para a DQOequivalente calculada pelos métodos de
Lowry, Kjeldahl e Micro-biureto (N=12)
Método de análise
Esgoto Bruto
Efluente do reator
Efluente do Filtro
anaeróbio
Biológico
DQO Filtrada (mg.L-1)
256 ± 40
105 ± 34
95 ± 21
DQOeqL(1) (mg.L-1)
232 ± 12
139 ± 35
82 ± 2
DQOeqB(2) (mg.L-1)
411± 79
334 ± 67
320 ± 84
DQOeqK(3) (mg.L-1)
189 ± 38
94 ± 45
136 ± 90
(1) DQOeqL: DQOequivalente calculada a partir da análise de proteínas pelo método de Lowry
(2) DQOeqB: DQOequivalente calculada a partir da análise de proteínas pelo método do Micro-biureto
(3) DQOeqK: DQOequivalente calculada a partir da análise de proteínas pelo método Kjeldahl
A partir dos resultados obtidos, realizou-se uma análise comparativa entre os métodos, para cada tipo de amostra.
Para a amostra de esgoto bruto (EB), a comparação entre os métodos de análise é apresentada na Figura 3, enquanto
a comparação entre a DQOfiltrada do esgoto bruto (DQOF EB) e a DQOequivalente determinada a partir dos métodos de
Lowry (DQOeqL), do Micro-biureto (DQOeqB) e Kjeldahl (DQOeqK) é apresentada na Figura 4.
4
350
600
300
500
400
Conc(mg/L)
Conc.(mg/L)
250
200
150
100
200
100
50
0
300
Biureto
Lowry
0
Kjeldahl
Figura 3: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a análise de
esgoto bruto
DQOF EB
DQOeqB
DQOeqL
DQOeqK
Figura 4: Comparação entre os valores de DQO e
DQOequivalente. para a análise de proteínas pelos
métodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl,
em esgoto bruto
O método com resultados mais próximos do método Kjeldahl foi o método de Lowry (Figura 3). A DQOequivalente
calculada para o esgoto bruto pelo método de Lowry foi um pouco inferior ao valor de DQOfiltrada obtida pelas
análises, enquanto que o valor obtido pelo método do Micro-biureto foi acima do valor de DQO obtido na prática.
O método do Micro-biureto pareceu apresentar uma tendência em superestimar o teor de proteínas nas amostras.
A comparação entre os métodos de Lowry, do Micro-biureto e Kjeldahl, para os efluentes anaeróbio e aeróbio, é
apresentada nas Figuras 5 e 7, sendo a comparação do cálculo da DQOequivalente., para esses efluentes, com o valor da
DQOfiltrada (DQOefl. UASB e DQO FB) apresentada nas Figuras 6 e 8.
300
450
400
350
200
Conc.(mg/L)
Conc.(mg/L)
250
150
100
250
200
150
100
50
0
300
50
Biureto
Lowry
Kjeldahl
Figura 5: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a análise de
efluente anaeróbio
0
DQOefl.UASB
DQOeqB
DQOeqL
DQOeqK
Figura 6: Comparação entre os valores de DQO e
DQOequivalente. para a análise de proteínas pelos
métodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl,
em efluente anaeróbio
5
500
200
400
150
300
Conc(mg/L)
Conc(mg/L)
250
100
50
0
200
100
Biureto
Lowry
Kjeldahl
Figura 7: Comparação entre os métodos do Microbiureto, de Lowry e Kjeldahl para a análise de
efluente de filtro biológico percolador
0
DQOFB
DQOeqB
DQOeqL
DQOeqK
Figura 8: Comparação entre os valores de DQO e
DQOequivalente. para a análise de proteínas pelos
métodos do Micro-biureto, de Lowry e Kjeldahl ,
em efluente de filtro biológico percolador
Pela análise das Figuras 4, 6 e 8, pode-se observar que, para as amostras analisadas, os métodos Kjeldahl e de Lowry
são os métodos que permitem uma melhor estimativa do valor da DQOfiltrada. Os resultados obtidos pelo método de
Lowry foram melhores para o esgoto bruto e para o efluente do filtro biológico percolador, obtendo-se teores de
proteínas mais próximos do método Kjeldahl e uma melhor estimativa da DQOequivalente. No efluente do reator
anaeróbio, o método superestimou um pouco tanto a DQO quanto o teor de proteínas.
A comparação dos métodos de Lowry, Kjeldahl e Bradford e o cálculo da DQOequivalente indicou que o método de
Lowry foi o mais adequado para as amostras analisadas. Os resultados obtidos mostraram que o método de Bradford
apresentou uma tendência em subestimar o teor de proteínas nas amostras, enquanto que o método do Micro-biureto
apresentou um tendência em superestimar esses valores. Na presente pesquisa, o método de Lowry foi o que
apresentou resultados mais próximos do esperado. Esses resultados são semelhantes aos de Sapan et al. (1999), que
apresentaram métodos para a análise de proteínas em diferentes tipos de amostras. Em seu estudo, Sapan et al.
(1999) apresentaram a comparação do teor de proteínas obtidos pelos métodos de Lowry, do Biureto e de Bradford
com o teor de proteínas obtido por análise quantitativa de aminoácidos que foi considerado o método padrão, e
também observaram a tendência do método do Biureto em superestimar o teor de proteínas enquanto o método de
Bradford subestimava esse valor.
Os resultados obtidos indicaram, ainda, que as proteínas, em relação aos demais compostos orgânicos específicos,
foram os principais compostos responsáveis pela DQO do esgoto bruto e dos efluentes tratados. Em esgotos brutos,
a DQOequivalente das proteínas correspondeu, em média, a aproximadamente 65% da DQOequivalente total das amostras
analisadas, enquanto para os efluentes do reator anaeróbio e do filtro biológico a DQOequivalente média correspondeu
a 82 e 81% da DQOequivalente total, respectivamente. Todos os métodos de análise indicaram essa mesma tendência.
Observou-se, portanto, um aumento na proporção de proteínas nas amostras de efluentes tratados em relação ao
esgoto bruto, que pode ser explicado pelas menores eficiências de remoção de proteínas no sistema de tratamento
estudado, em relação a lipídios e carboidratos.
6
CONCLUSÕES
Dentre os métodos testados, o método de Lowry parece ser o mais indicado para a determinação de proteínas em
esgotos sanitários e em efluentes tratados, pois seus resultados foram os mais próximos do Método Kjeldahl, que é
considerado o método padrão para essa análise. Observou-se, entretanto, uma tendência do método em superestimar
o teor de proteínas e a DQOequivalente. no efluente do reator anaeróbio.
O método do Micro-biureto apresentou uma tendência em superestimar o teor de proteínas e a DQO das amostras
estudadas, enquanto o Método de Bradford apresentou uma tendência em subestimar esses valores. Para o esgoto
bruto e para os efluentes tratados, a estimativa da DQO pelos métodos Kjeldahl e de Lowry permitiu obter
resultados bem próximos daqueles obtidos na prática.
Agradecimentos: Os autores agradecem ao CNPq, pelas bolsas concedidas, e à FAPEMIG e à FINEP, através do
PROSAB, pelo financiamento da pesquisa. Agradecem, ainda, à bolsista de apoio técnico Lucilaine Santos, pelo
auxílio nas análises de matéria orgânica específica.
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