UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE,
ANTICOAGULANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS
AQUOSOS DE Marsdenia megalantha
NATAL
2011
RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE,
ANTICOAGULANTE E ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS
AQUOSOS DE Marsdenia megalantha
Dissertação apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Orientador: Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.
NATAL
2011
RUTH MEDEIROS DE OLIVEIRA
AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, ANTICOAGULANTE E
ANTIPROLIFERATIVA DE EXTRATOS AQUOSOS DE Marsdenia megalantha
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Bioquímica da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Bioquímica.
Aprovado em: 21/03/2011
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________________
Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha
Departamento de Bioquímica - UFRN
Orientador
____________________________________________________
Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade
Departamento de Biologia Celular- UFPR
1º Examinador
____________________________________________________
Profª. Drª. Kátia Castanho Scortecci
Departamento de Biologia Celular e Genética – UFRN
2º Examinador
À minha família, pelo amor, carinho e incentivo sempre dispensados,
sem os quais esta jornada não seria possível; Ao meu namorado
Rafael Barros pela paciência e amor; Ao meu orientador Hugo Rocha
por toda atenção e ensinamentos.
AGRADECIMENTOS
"A vida é em parte o que nós fazemos dela, e em parte o que é feito pelos
amigos que nós escolhemos".
Tennessee Williams
A Deus por ter permanecido ao meu lado e me guiado por caminhos de luz e por
ter colocado na minha vida pessoas sempre tão especiais.
Aos meus pais, Clóvis Almeida e Maria Barros, pelo apoio, incentivo,
preocupação, amor e carinho, por terem me ensinado o significado da palavra
família e também por terem me ensinado as coisas boas e ruins da vida. E,
principalmente, por estarem sempre vigilantes para que eu não seguisse por
caminhos tortuosos. Vocês são pais e pessoas maravilhosas. Amo muito vocês.
Aos meus irmãos, Thiago Medeiros e Raquel Medeiros, por toda atenção que
vocês têm por mim, companheirismo, pelo amor e por terem ajudado na minha
educação. Apesar de nossas brigas, sei que nos amamos muito.
Ao meu namorado Rafael Barros pelo companheirismo, cumplicidade,
compreensão, ajuda, paciência e amor despendidos comigo no último ano e,
principalmente, nos últimos meses. Não canso de te dizer a sorte que tenho por ter
te conhecido e por você me aceitar como sou. Sem dúvida, minha melhor
companhia. Te amo muito.
A minha prima e afilhada Ingrid Medeiros por sempre compartilhar de
momentos tão importantes na minha vida, por sempre estar presente e ser essa
pessoa tão prestativa. Pelos passeios com Uni na praça e as confidências
contadas. Se aquela praça falasse...Também te amo muito Pitxuca.
Ao meu cachorro Uni que, por durante 11 anos, me espera chegar em casa sentado
na frente do portão com um sorriso estampado no rosto. Este, literalmente, está
sempre ao meu lado, em dias alegres ou tristes. Não canso de dizer o quanto te
amo e adoro seu cheirinho peculiar.
Ao meu cunhado Eduardo Melo pelos momentos alegres que você proporciona a
toda minha família.
A minha sobrinha e afilhada Beatriz Medeiros que, apesar de não entender nada
na vida, já sabe conquistar a todos com seu lindo sorriso banguelo. Apesar das
noites em claro que você me proporcionou e proporciona, principalmente quando
eu precisava escrever esta dissertação, saiba que te amo muito. Chegar em casa
após um cansativo dia e te ver dormindo é ótimo, mas melhor ainda é chegar em
casa e ganhar um sorriso seu e escutar sua voz.
Ao meu orientador Hugo Rocha por ter me aceitado em seu laboratório, mesmo
sem me conhecer muito bem; por ser um exemplo de orientador e por ser sempre
tão compreensivo. Enfim, obrigada por ter me orientado, pela liberdade, paciência
e pela amizade.
Aos meus companheiros do BIOPOL: Arthur, Cinthia, Daniel, Dayanne,
Fernando, Gabriel, Hugo, Ivan, Jailma, Joanna, Kaline, Karol, Leandro,
Leonardo, Letícia, Mariana, Moacir, Nednaldo, Pablo, Rafael, Raniere, Roni,
Sara e Vinícius, por tornarem agradáveis meus dias no laboratório. Gostaria de
agradecer a todos por terem me recebido tão bem, mas em especial agradeço a:
Leandro (por todos os ensinamentos matemáticos, desculpe-me ter roubado seu
juízo, por seus conselhos sempre cabíveis e por ser, não oficialmente, meu coorientador. Nunca conseguirei retribuir sua ajuda). Mariana (minha M.A. que
está sempre disposta a ajudar, sempre com alguma sugestão. Muito obrigada
por ter me permitido fazer parte de seu ciclo de amigos e por ser minha confidente.
E nós não somos fofoqueiras). Jailma (o coração mais puro do laboratório, uma
pessoa muito fácil de conviver e de se gostar. Muito obrigada por sua paciência,
atenção e por ser uma boa ouvinte). Leonardo (amigo da turma do mestrado,
amigo do laboratório, amigo para toda a vida. Muito obrigada pelos momentos de
alegria que você me proporciona, pelas conversas úteis e fúteis). Nednaldo
(muito conhecido por Chatonaldo, Vladinaldo ou Nedélope...nunca vi o nome de
uma pessoa combinar com tudo. Ned, você é um grande companheiro e amigo,
adoro estar com você. Sem dúvida alguma, o laboratório não fica completo sem
sua presença). Rafael (sou muito suspeita para falar, mas muito obrigada pelos
conselhos, pela atenção, por estar sempre disposto a ajudar e a ouvir. Com
certeza você torna meus dias no BIOPOL muito mais agradáveis e completos).
Cinthia (apesar dos nossos desentendimentos iniciais, hoje sei que posso contar
com você. Obrigada por nossas agradáveis conversas e por ser minha amiga de
bar). Raniere (pelas boas conversas, pelos conselhos e muito obrigada por
sempre tirar minhas dúvidas). Kaline (pelos maravilhosos momentos que
passamos juntas. Nem sei em que momento nos tornamos tão amigas. Te adoro
irmã péssima). Dayanne (por trazer tanta alegria ao laboratório com sua risada
contagiante). Sara (por sempre bater em quem merece apanhar e por irradiar
alegria). Enfim, muito obrigada a todos por tornarem meus dias agradáveis e por
despertarem em mim a vontade diária de ir ao laboratório. OBRIGADA!
A minha amiga Luciana Rabelo pelos maravilhosos momentos que
compartilhamos nos dois anos de mestrado e por ter sido minha companheira nos
momentos ruins (disciplinas) e nos bons. Te adoro.
Aos colegas da turma do mestrado por, juntos, termos conseguido superar todas
os obstáculos.
Aos professores do Departamento de Bioquímica, que de alguma forma,
contribuíram para minha formação, em especial à professora Edda, por ser um
exemplo de luta e perseverança.
Aos funcionários do Departamento em especial a Rogério por ser uma pessoa tão
prestativa.
A Margarita Mavromatis, secretária da pós-graduação, por ser um exemplo de
disciplina, elegância e competência.
Aos integrantes dos demais laboratórios do Departamento de Bioquímica. Muito
obrigada pela ajuda em experimentos e por permitirem a utilização de alguns
aparelhos.
Ao Programa de Mestrado em Bioquímica da Universidade Federal do Rio
Grande do Norte pelas condições necessárias para o desenvolvimento deste
trabalho;
À Coordenação de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Conselho Nacional
de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo financiamento desta
pesquisa;
OBRIGADA!
“Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas
também sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar".
Anatole France
RESUMO
As espécies do gênero Marsdenia, Apocynaceae, são bastante utilizadas na
medicina popular de vários países. No Brasil são encontradas várias espécies
pertencentes a esse gênero. As atividades antioxidante, anticoagulante e
antiproliferativa foram avaliadas para os extratos de caule, folha e raiz de Marsdenia
megalantha. Na capacidade antioxidante total (expressa como equivalente de ácido
ascórbico), o extrato do caule apresentou 76,0 mg/g, enquanto os extratos da folha e
raiz apresentaram, respectivamente, 14,3 mg/g e 57,0 mg/g. Os extratos do caule e
da folha mostraram habilidade quelante em torno de 40% na concentração de 1,5
mg/mL, enquanto o extrato da raiz, na mesma concentração, apresentou 17%.
Apenas o extrato da folha apresentou uma capacidade significante em sequestrar
radicais superóxidos (80% em 0,8 mg/mL). Nenhum extrato mostrou capacidade em
seqüestrar radicais hidroxila, bem como atividade anticoagulante. A atividade
antiproliferativa dos extratos foi avaliada contra a linhagem tumoral HeLa. Os
extratos inibiram, de forma dose-dependente, o crescimento celular. Entretanto, o
extrato da folha foi capaz de inibir em 80% a proliferação celular na concentração de
1,0 mg/mL, enquanto os extratos de caule e raiz inibiram 63% e 30%,
respectivamente. Para avaliar o mecanismo de morte celular causada pelo extrato
da folha nas células HeLa, foi realizada citometria de fluxo e western blot. Os
resultados mostraram que o extrato da folha induz morte celular por apoptose
através de uma via de ativação independente de caspase. Estes resultados indicam
que os extratos de caule e folha obtidos têm potencial para serem futuramente
utilizados como fármacos antioxidantes e anticâncer.
Palavras-chave: Antitumoral. HeLa. Caatinga.
ABSTRACT
The species of the genus Marsdenia, Apocynaceae, are widely used in folk
medicine of several countries. In Brazil is found several species belonging to this
genus. The in vitro antioxidant, anticoagulant and antiproliferative activities were
evaluated to aqueous extracts of stalk, leaf and root of Marsdenia megalantha. In
the total antioxidant capacity assay (expressed as ascorbic acid equivalents) the
stalk extract showed 76.0 mg/g, while leaf and root extracts 141.3 mg/g and 57.0
mg/g, respectively. The stalk and leaf extracts showed chelating activity around 40%
at 1.5 mg/mL, while root extract, at the same concentration showed, 17%. Only the
leaf extract showed a significant ability in superoxide scavenging (80% at 0.8
mg/mL). Any extract was able in scavenge hydroxyl, as well anticoagulant activity.
The antiproliferative activity of the extracts was evaluated against HeLa tumor cell
line. The extracts inhibited in a dose-dependent manner the cell growth. However,
the leaf extract showed 80% of inhibition at 1.0 mg/mL, while stalk and root extracts
inhibited 63% and 30%, respectively. To assess the mechanism of cell death caused
by the leaf extract in HeLa, was performed flow cytometry and western blot. The
results show that leaf extract induces cell death by apoptosis through an activation
caspase-independent pathway. These data indicate that stalk and leaf extracts
obtained have potential to be used as antioxidants and anticancer drugs.
Word Keys: Antitumor. HeLa. Caatinga.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Redução tetravalente do oxigênio molecular (O2) na mitocôndria
até a formação de água (H2O), com a formação de espécies
reativas do oxigênio (EROs)...........................................................
Figura 2.
23
Complexo NADPH oxidase de células vasculares. O ânion
superóxido é produzido intracelularmente. A subunidade Nox (1
ou 4) se liga a p22 na membrana plasmática.................................. 23
Figura 3.
Eliminação das espécies reativas superóxido e peróxido de
hidrogênio pelas enzimas antioxidantes SOD, catalase e
GPx.................................................................................................. 24
Figura 4.
Eliminação das espécies reativas superóxido e peróxido de
hidrogênio pelas enzimas antioxidantes SOD, catalase e
GPx.................................................................................................. 24
Figura 5.
Modelo
esquemático
da
produção
de
EROs
mitocondrial.....................................................................................
Figura 6.
Modelo
clássico
da
cascata
25
de
coagulação......................................................................................
30
Figura 7.
Representação esquemática dos complexos procoagulantes.......
31
Figura 8.
Esquema representativo de dois processos de morte celular:
(a)necrose e (b)apoptose................................................................
35
Figura 9.
Marsdenia megalantha....................................................................
39
Figura 10.
Capacidade antioxidante total dos extratos aquosos do caule,
folha e raiz de M. megalantha.........................................................
Figura 11.
51
Ensaio do poder redutor dos extratos aquosos de diferentes
partes de M. megalantha................................................................. 52
Figura 12.
Quelação férrica dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de
M. megalantha................................................................................. 54
Figura 13.
Atividade antiproliferativa dos extratos aquosos do caule, folha e
raiz de M. megalantha frente à linhagem tumoral HeLa.................. 55
Figura 14.
Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M.
megalantha frente a quatro linhagens celulares tumorais............... 56
Figura 15.
Microfotografias das células HeLa visualizadas em microscópio
de contraste de fase........................................................................
Figura 16.
57
Imagem de microscopia de varredura das células HeLa. As fotos
foram obtidas a partir de microscópio de varredura. As setas
verdes evidenciam filopódios, as brancas, os lemelipódios e as
vermelhas, os “ruffles”.....................................................................
Figura 17.
58
Imagens de microscopia de fluorescência das células HeLa
coradas com DAPI. As fotos foram obtidas a partir de
microscópio de fluorescência. As setas brancas evidenciam
fragmentação nuclear...................................................................... 60
Figura 18.
Marcação das células HeLa com anexina V-FITC e iodeto de
propídio. As células HeLa foram tratadas com EAF 0,50 mg/mL
por 24 horas. Os dados foram obtidos por citometria de
fluxo.................................................................................................
Figura 19.
62
Efeitos de EAF na expressão de proteínas envolvidas na morte
celular.............................................................................................
63
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Composição química dos extratos aquosos do caule, folha e raiz
de M. megalantha............................................................................
Tabela 2.
50
Atividade sequestradora do anion superóxido dos extratos
aquosos do caule, folha e raiz de M. megalantha...........................
53
LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS
AIF
Apoptosis Inducing Factor
aPTT
activated Parcial Thromboplastin Time
ATCC
American Type Culture Collection
ATP
Adenina Trifosfato
CAT
Capacidade Antioxidante Total
CHOP
C/EBP Homologous Protein
CTE
Cadeia Transportadora de Elétrons
DAPI
4'-6-Diamidino-2-phenylindole
DD
Death Domain
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DNA
Desoxiribunucleic Acid
DPPH
1,1-difenil-2-pricrilhidrazil
DTT
Ditiotreitol
EAC
Extrato Aquoso do Caule
EAF
Extrato Aquoso da Folha
EAR
Extrato Aquoso da Raiz
EDTA
Ácido Etilenodiamino Tetra-acético
EGTA
Ethylene Glycol Tetraacetic Acid
EROs
Espécies Reativas do Oxigênio
FITC
Fluorescein Isothiocyanate
FT
Fator Tecidual
FVIIa
Fator VII ativado
FXII
Fator XII
FXIIa
Fator XII ativado
GPx
Glutationa Peroxidase
IP
Iodeto de Propídeo
JNK
c-Jun-N-Terminal Kinase
MAPK
Mitogen-Activated Protein Kinase
MEV
Microscopia Eletrônica de Varredura
mg
Miligrama
mL
Mililitro
mRNA
Messenger Ribonucleic Acid
mtDNA
Mitochondrial Desoxiribonucleic Acid
MTT
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
NADPH
Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo Fosfato
NBT
Nitroblue Tetrazolium
Nd
Não Detectado
nm
nanômetro
PBS
Phosphate Buffer Saline
pH
Potencial Hidrogeniônico
PT
Prothrombin Time
PVDF
Polyvinylidene Fluoride
RE
Retículo Endoplasmático
SDS-PAGE
Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis
SFB
Soro Fetal Bovino
SOD
Superóxido Dismutase
TCA
Ácido Tricloroacético
TNF
Tumor Necrosis Factor
TRAIL
Tumor Necrosis Factor-Related Apoptosis-Inducing Ligand
TT
Thrombin Time
UEFS
Universidade Estadual de Feira de Santana
UFPR
Universidade Federal do Paraná
UFRN
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Z-VAD-FMK
Carbobenzoxy-Valyl-Alanyl-Aspartyl-[O-Methyl]- Fluoromethylketone
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
20
1.1 FAMÍLIA APOCYNACEAE
20
1.2 GÊNERO Marsdenia
20
1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
22
1.3.1 Espécies reativas e antioxidantes
22
1.3.2 Atividade antioxidante em extratos de plantas
27
1.4 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE
29
1.4.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes
29
1.4.2 Atividade anticoagulante de extratos e compostos obtidos de
Plantas
32
1.5 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA
33
1.5.1 Efeitos antiproliferativos de extratos e compostos obtidos de plantas36
2 OBJETIVOS
38
3 MATERIAIS E MÉTODOS
39
3.1 MATERIAIS
39
3.1.1 Material biológico
39
3.1.2 Linhagens tumorais e culturas das células
40
3.1.3 Outros materiais
40
3.1.4 Aparelhos
41
3.2 MÉTODOS
42
3.2.1 Obtenção dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M.
megalantha
42
3.2.2 Determinação dos componentes dos extratos aquosos de M.
megalantha
42
3.2.3 Atividades biológicas dos extratos aquosos de M. megalantha
43
3.2.3.1 Atividade antioxidante in vitro
43
3.2.3.2 Atividade anticoagulante
44
3.2.3.3 Atividade antiproliferativa
45
3.2.3.4 Análise das células em microscópio de luz e microscópio eletrônico de
varredura
46
3.2.3.5 Fragmentação nuclear
46
3.2.3.6 Avaliação da viabilidade e morte celular por Anexina V-FITC/ Iodeto de
Propídio
47
3.2.3.7 Western blot
47
3.2.4 Análise estatística
49
4 RESULTADOS
50
4.1 DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES DOS EXTRATOS AQUOSOS
M. megalantha
50
4.2 ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS EXTRATOS AQUOSOS DE M.
Megalantha
50
4.2.1 Atividade antioxidante in vitro
50
4.2.2 Atividade anticoagulante dos extratos do caule, folha e raiz de M.
megalantha
54
4.2.3 Atividade antiproliferativa dos extratos do caule, folha e raiz de M.
megalantha
54
4.2.4 Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M. megalantha
frente a linhagens tumorais
55
4.2.5 Análises morfológicas das células HeLa na presença do extrato aquoso
da folha de M. megalantha
57
4.2.6 Fragmentação nuclear nas células HeLa na presença do extrato aquoso
da folha de M. megalantha
59
4.2.7 Detecção e quantificação de células apoptóticas induzidas pelo extrato
aquoso da folha de M. megalantha
61
4.2.8 Efeito do extrato aquoso da folha de M. megalantha na expressão de
proteínas relacionadas com a apoptose das células HeLa
62
5 DISCUSSÃO
64
6 CONCLUSÃO
72
REFERÊNCIAS
73
INTRODUÇÃO
20
1. INTRODUÇÃO
1.1 FAMÍLIA APOCYNACEAE
As angiospermas da família Apocynaceae são representadas por espécies
de grande porte e herbáceas. Esta família possui distribuição predominantemente
pantropical, mas com representantes também na região temperada e abrange cerca
de 3700 a 5100 espécies distribuídas em cerca de 250 a 515 gêneros, sendo uma
das dez maiores famílias de angiospermas em número de espécies. No Brasil
ocorrem cerca de 90 gêneros e 850 espécies (JUDD et al.,2009, RAPINI et al., 2000,
SOUZA, 2000).
Muitas espécies desta família são cultivadas como plantas ornamentais, com
destaque para a alamanda (Allamanda spp.), a vinca (Catharanthus roseus) e a
espirradeira (Nerium oleander). Nesta família estão incluídas árvores fornecedoras
de madeira de boa qualidade, como as perobas e os guatambus (Aspidosperma
spp.). As Apocynaceae são ricas em glicosídeos e alcalóides, especialmente nas
sementes e no látex. Entre as principais substâncias extraídas das Apocynaceae
estão a leucocristina e a vincristina, ambas extraídas de Catharanthus roseus,
utilizadas no tratamento do câncer (JUDD et al., 2009).
1.2 GÊNERO Marsdenia
O
gênero
Marsdenia
(Apocynaceae,
subfamília
Asclepiadoideae)
é
amplamente distribuído em todo o globo (composto de aproximadamente 300
espécies), estando ausente no Havaí, nos Açores, nas Ilhas Britânicas, na Tasmânia
e na Nova Zelândia (MORILLO, 1997). As espécies desse gênero são bastante
utilizadas pela medicina popular de vários países como: China, Índia, Coréia e
Tailândia. No Brasil o gênero Marsdenia sp é amplamente distribuído, sendo
representado por dezenas de espécies. Porém, tanto no Brasil como em outras
partes do mundo, há poucos estudos farmacológicos ou biológicos relacionados a
este gênero, a grande maioria são estudos sistemáticos.
São encontradas três espécies de Marsdenia em clima semi-árido, sendo
duas delas espécies de lianas e apenas uma espécie arbustiva, a Marsdenia
megalantha, uma espécie endêmica do Brasil, restringindo-se aos domínios da
Caatinga. Essa espécie foi descrita em 1994 por Goyder & Morillo e trabalhos com a
espécie, inclusive sistemáticos, são bem escassos (GOYDER; MORILLO, 1994).
INTRODUÇÃO
21
Nos últimos anos, as espécies de Marsdenia vêm atraindo a atenção de
diversos pesquisadores. Isso se deve pelo fato de o gênero sintetizar uma série de
compostos bioativos, e também pela necessidade de consolidar o conhecimento
popular em conhecimento científico. Estudos mais antigos relatados na literatura
mostram que extratos clorofórmicos do tronco de M. tenacissima apresentam
atividade antiasmática (ZHOU; YANG; YANG, 1980) e antiproliferativa frente ao
carcinoma de Ehrlich (MIYAKAWA et al., 1986). Um estudo realizado por Wang e
colaboradores em 2006 mostrou que o extrato aquoso do tronco de M. tenacissima
apresenta atividade antiproliferativa frente às linhagens tumorais C-26 (carcinoma do
cólon) e Hepal-6 (carcinoma hepático de rato) (WANG et al., 2006). Por sua vez, Hu
e colaboradores, em 2008, relataram que extratos metanólicos do rizoma e raiz de
M. tenacíssima apresentaram a capacidade de diminuir a resistência às drogas que
a linhagem tumoral HepG2/Dox (hepatoma humano) apresenta (HU et al., 2008).
Outra espécie que vem sendo bem investigada é a M. condurango. Desde o
início da década de 80 estudos vêm sendo realizados com extratos de várias
naturezas dessa espécie. Trabalhos pioneiros como o de Hayashi e colaboradores
(1981) mostram que o extrato da casca inibe a proliferação do carcinoma de Ehrlich.
Dentre os estudos destaca-se o realizado por Umehara e colaboradores em 1994,
onde obtiveram um extrato metanólico da casca da M. condurango e observaram
que o extrato induz a diferenciação da linhagem leucemica mielóide de ratos em
fagócitos (UMEHARA et al., 1994). Há também um estudo verificando a atividade
antioxidante de extratos etanólicos da folha de M. glabra (TACHAKITTIRUNGROD;
OKONOGI;CHOWWANAPOONPOHN, 2007).
Os principais compostos extraídos e estudados das plantas do gênero
Marsdenia sp são as pregnanas e pregnanas glicosiladas. As pregnanas são
compostos apolares, semelhantes à progesterona, que apresentam um núcleo
esteróide, com algumas ligações ésteres ao longo desse núcleo. Já as pregnanas
glicosiladas, são semelhantes às pregnanas, porém apresentam um açúcar ligado
ao anel A do núcleo esteróide, conferindo-as solubilidade em água (CHEN et al.,
1999). Ambas são encontradas em Marsdenia sp, e as principais atividades
farmacológicas apresentadas por esses compostos foram as de antiasmático,
antiproliferativo, inclusive contra células tumorais, e efeito regulatório de fertilidade.
(GUPTA et al., 2003 ).
INTRODUÇÃO
22
1.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE
1.3.1 Espécies reativas e antioxidantes
O termo radical livre refere-se a um átomo ou uma molécula altamente
reativa, que contém número ímpar de elétrons em seus orbitais mais externos. É
este desemparelhamento de elétrons, nestes orbitais, que confere alta reatividade a
esses átomos ou moléculas (BHOOLA; ODHAV; REDDY, 2003; WICKENS, 2001).
Os radicais livres são formados a partir de reações de óxido-redução, isto é, podem
ceder elétrons, oxidando-se, ou receber elétrons, reduzindo-se. Esses átomos ou
moléculas altamente reativos são, em sua maioria derivados do metabolismo do O2
e, dessa forma, são denominados espécies reativas do oxigênio (EROs) como por
exemplo os radicais hidroxila (OH●), hidroperoxila (HO2●) e o ânion superóxido (O2●-)
(FERREIRA; MATSUBARA, 1997; Li et al., 2003). São também EROs moléculas ou
átomos que não apresentam elétrons desemparelhados nos seus orbitais externos,
mas que podem causar efeitos deletérios nos sistemas biológicos. Dentre estes
pode-se citar o peróxido de hidrogênio (H2O2) e o oxigênio singlet (¹O2).
Há vários modos pelos quais os radicais livres podem ser formados e o
principal local de formação no meio intracelular é na mitocôndria, onde o oxigênio
sofre uma redução tetravalente em passos seqüentes, resultando na formação de
água, como ilustrado na figura 1 (ACHARYA et al., 2010).
INTRODUÇÃO
23
Figura 1. Redução tetravalente do oxigênio molecular (O2) na mitocôndria até a
formação de água (H2O), com a formação de espécies reativas do oxigênio (EROs). Fonte:
Adaptado de FERREIRA; MATSUBARA, 1997.
Durante a fosforilação oxidativa, elétrons são ocasionalmente capturados
pelo oxigênio formando, através de sua primeira redução, o ânion superóxido. Este
radical pode ser formado através de outros processos como, por exemplo, através
de um processo regulado pelas NADPH oxidases, as quais têm sido descritas em
quase todas as células (figura 2) (ARNOLD et al., 2001; CHENG et al., 2001).
.
Figura 2. Complexo NADPH oxidase de células vasculares. O ânion superóxido é
produzido intracelularmente. A subunidade Nox (1 ou 4) se liga a p22 na membrana plasmática.
Fonte: DUSTING, SELEMIDIS e JIANG, 2005.
Dentro da mitocôndria, esses radicais são prontamente inativados pela ação
da enzima superóxido dismutase (SOD), resultando na formação de peróxido de
hidrogênio (Reação 1 da figura 3), o qual é subsequentemente convertido em água
INTRODUÇÃO
24
(Reações 2 e 3 da figura 3) pela ação concomitante de outras enzimas como a
catalase e a glutationa peroxidase (GPx) (figuras 3 e 5). Tem sido demonstrado que
os complexos I e III da cadeia respiratória são os principais sítios de formação do
superóxido, apesar de haverem indícios de que o complexo II também possa
produzir (BUETTNER et al., 2006; FORMAN, 2010).
Reação 1
Reação 2
Reação 3
Figura 3. Eliminação das espécies reativas superóxido e peróxido de hidrogênio pelas enzimas
antioxidantes SOD, catalase e GPx. Fonte: Adaptado de VALKO et al., 2006.
No segundo passo da redução do O2 é formado o peróxido de hidrogênio
(figura 01). Apesar de não ser um radical livre, o peróxido de hidrogênio é um
metabólito do oxigênio altamente deletério, uma vez que participa na formação do
radical hidroxila quer pela via da redução tetravalente do O2, ou pela reação de
Haber-Weiss (Reação 4 da figura 4) ou ainda pela reação de Fenton (Reações 5 e 6
da figura 04) (MASSEY et al.,1969; FORMAN, 2007).
Reação 4
Reação 5
Reação 6
Figura 4. Reações de formação do radical hidroxila a partir do peróxido de hidrogênio. Fonte:
Adaptado de ANDRADE JÚNIOR, 2005.
O passo seguinte da redução tetravalente do oxigênio molecular é a
formação do radical hidroxila. Este ERO é altamente reativo e apresenta um tempo
de meia-vida de apenas 10-9 s, reagindo prontamente no seu sítio de formação,
INTRODUÇÃO
25
sendo considerada, portanto, a espécie mais danosa a sistemas biológicos (WELLS
et al., 2009). O radical hidroxila é formado in vivo, principalmente a partir da reação
entre metais e espécies reativas de oxigênio (Reações de Fenton e Haber-Weiss)
(figuras 4 e 5).
Figura 5. Modelo esquemático da produção de EROs mitocondrial. Durante a respiração
mitocondrial, uma pequena quantidade do oxigênio molecular consumido pelas células é convertido
●em ânion superóxido (O2 ) pelos complexos I e III como um produto tóxico da fosforilação oxidativa.
●Enzimas superóxido dismutase convertem o (O2 ) a peróxido de hidrogênio (H2O2) o qual pode ser
convertido sequencialmente em água pela glutationa peroxidase (GPx) ou enzimas peroxiredoxinas.
2+
●
O H2O2 pode também reagir com o Fe gerando o radical hidroxila (OH ). Este radical pode atacar
todas as moléculas incluindo o mtDNA e consequentemente causa uma diminuição no mRNA
mitocondrial e altera a expressão de proteínas mitocondriais essenciais para a cadeia transportadora
de elétrons (CTE) e síntese de ATP. Defeitos nas proteínas mitocondriais afetam a atividade da CTE
culminando em um ciclo vicioso de produção de EROs.Fonte: Moura, Santos e Van Houten.
A necessidade dos organismos de apresentarem um complexo sistema de
vias para metabolizarem as EROS, se dá pelo fato destas espécies apresentarem
um papel dúbio, podendo ser benéficas ou prejudiciais aos organismos. Os efeitos
benéficos das EROs envolvem funções fisiológicas como a participação do peróxido
de hidrogênio na formação dos hormônios da glândula tireóide (MILENKOVIC et al.,
2007). Outro exemplo é seu papel defensivo nas respostas celulares à nóxia, onde
os fagócitos produzem o ânion superóxido e peróxido de hidrogênio, e na função de
uma série de sistemas de sinalização celular. Além disso, em baixas concentrações,
as EROs induzem respostas mitogênicas. (VALKO et al., 2007)
INTRODUÇÃO
26
Estas propriedades benéficas acontecem quando a concentração das EROS
está em níveis baixos. No entanto, em altas concentrações, as EROs podem atuar
danificando estruturas celulares. Por exemplo, o ânion superóxido não reage
diretamente com polipeptídeos, açúcares ou ácidos nucléicos, e sua habilidade em
peroxidar lipídeos é controversa (VALKO et al., 2006). No entanto, sob algumas
condições de estresse, um excesso de ânions superóxido, por exemplo, pode reagir
e liberar o ferro que se encontra associado a algumas proteínas e, uma vez livres,
esses íons de ferro podem participar da reação de Fenton formando radicais
hidroxila, que uma vez formados atacam proteínas, DNA, ácidos graxos
poliinsaturados das membranas celulares e outras moléculas biológicas as quais
eles tenham contato (JOMOVA et al., 2010).
Controlar a concentração das EROs em níveis benéficos é extremamente
importante e para tal os organismos durantes seus processos evolucionários
desenvolveram sistemas de defesa cujo objetivo é diminuir a alta concentração de
EROs. No caso dos humanos, este sistema é formado por várias moléculas
endógenas, principalmente enzimas, mas também por substâncias exógenas que
são provenientes dos alimentos. Todas estas moléculas são atualmente chamadas
de antioxidantes. Estes podem ser definidos como substâncias que, quando
presentes em baixas concentrações em relação ao seu substrato oxidável, retardam
ou inibem, significativamente, a oxidação desse substrato (HALLIWELL, 1997). Os
antioxidantes apresentam três principais mecanismos de ação. Eles podem
seqüestrar os radicais formados, prevenir a formação destes e reparar os danos
provocados por estas espécies (NIKI et al., 1995).
Os antioxidantes que previnem a formação de radicais livres atuam como
uma primeira linha de defesa, como por exemplo, através da redução do peróxido de
hidrogênio a água ou seqüestrando íons metálicos como ferro e cobre. Os
antioxidantes seqüestradores removem as espécies reativas rapidamente antes que
estas “ataquem” moléculas biologicamente essenciais (NIKI, 2010). Por exemplo, a
enzima superóxido dismutase (SOD) converte o ânion superóxido a peróxido de
hidrogênio, enquanto carotenóides seqüestram o oxigênio singlet, quer fisicamente
ou quimicamente. Muitos compostos fenólicos e aminas aromáticas também atuam
como seqüestradores de radicais livres (NIKI, 2010). Várias enzimas atuam na
terceira linha de defesa reparando danos, limpando os resíduos e reconstituindo
funções perdidas. Além disso, existe uma quarta linha de defesa, que na verdade se
INTRODUÇÃO
27
trata de um mecanismo de adaptação, onde novos antioxidantes são gerados em
uma concentração desejada, no momento certo, e são prontamente deslocados para
uma localização precisa (NIKI, 2010).
Apesar da existência de um sistema antioxidante, sob certas condições, as
espécies reativas do oxigênio excedem a capacidade antioxidante do organismo,
resultando no conhecido estresse oxidativo, o qual vem sendo relacionado a várias
condições patofisiológicas, incluindo aterosclerose, câncer, desordens neurológicas,
diabetes, isquemia e envelhecimento (BARNHAM; MASTERS; BUSH, 2004;
PRASETYO, 2010).
As evidências relacionando o estresse oxidativo a várias desordens e
doenças têm atraído a atenção de pesquisadores para o papel dos antioxidantes na
manutenção da saúde humana e na prevenção e tratamento dessas doenças (NIKI,
2010).
1.3.2 Atividade antioxidante em extratos de plantas
As plantas assim como os animais possuem sistemas antioxidantes. Dentre
estes mecanismos, destacam-se as substâncias do metabolismo secundário, como
por exemplo, terpenos oxidados, fenóis, alcalóides, lignanas, cafeína e aminas
(COTELLE et al., 1996; LARSON 1988; OKADA; KANEKO; OKAJIMA, 1996). Essas
substâncias, além de serem antioxidantes, também contribuem com diversas
funções ecológicas de extrema importância nas relações de competição de
ecossistemas terrestres, como defesa contra herbívoros e patógenos, polinização e
alelopatia (GOTTLIEB; BORIN, 2002; LANGENHEIN, 1994).
Os antioxidantes de origem vegetal têm recebido considerável atenção das
indústrias alimentícia e cosmética. Dentro deste contexto, a capacidade desses
antioxidantes tem sido foco de diversas pesquisas científicas. (GORDON, 1996)
Ozsoy e colaboradores, em 2008, por exemplo, realizaram estudos com
extratos obtidos da folha de Smilax excelsa pelo uso de diferentes solventes. Dentre
os extratos obtidos, o aquoso e o etanólico apresentaram uma elevada atividade
antioxidante frente ao teste do DPPH (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil). Já para ensaios
antioxidantes referentes aos sequestros de radicais superóxido e hidroxila o extrato
aquoso apresentou uma boa capacidade em seqüestrar ambos, enquanto o extrato
etanólico e com acetato de etila apresentaram capacidade apenas em seqüestrar o
radical hidroxila (OZSOY et al., 2008). Resultado semelhante foi encontrado para o
INTRODUÇÃO
28
extrato aquoso da folha de Helichrysum pedunculatum (AIYEGORO; OKOH, 2009).
Ozen, Demirtas e Aksit, em 2011, também obtiveram diferentes extratos a partir da
espécie Thymus praecox. Neste trabalho a capacidade antioxidante dos extratos foi
avaliada pelo teste do poder redutor e foi observado que os extratos aquosos e
metanólico apresentaram maior capacidade, seguidos dos extratos cetônico e
hexânico. Novamente, a capacidade dos extratos em seqüestrar radicais livres
específicos, no caso o radical superóxido, foi avaliada. Mais uma vez, o extrato
aquoso apresentou ótimo sequestro do radical superóxido. Todos os extratos
apresentaram capacidade em quelar íons metálicos (OZEN; DEMIRTAS; AKSIT,
2011). Estes resultados mostram a promissora atividade antioxidante multipotente
de compostos obtidos a partir de plantas, bem como a diferença existente entre as
atividades antioxidantes de extratos obtidos de diferentes solventes, uma vez que,
de acordo com a polaridade, cada solvente tem a capacidade em extrair compostos
diferentes e estes expressam-se de formas diferentes, respondendo de formas
específicas quando submetidos a testes antioxidantes (MENSOR et al., 2001).
Outros tipos de pesquisas para avaliação da atividade antioxidante são
realizadas no intuito de se avaliar as possíveis capacidades antioxidantes existentes
entre diferentes porções vegetativas das plantas. Sabe-se que os diferentes tecidos
vegetais sintetizam e são formados por substâncias específicas. Além disso, cada
tecido responde de forma diferente às pressões exercidas pelo ambiente devido
justamente aos seus componentes moleculares, sendo, portanto, importante a
investigação das possíveis atividades que um extrato dos tecidos vegetais possa
apresentar. Neste contexto enquadra-se o trabalho realizado por Koncic e
colaboradores em 2010, onde são realizados ensaios antioxidantes in vitro
comparativos entre caule, flores e folhas de Moltkia petraea (KONCIC et al., 2010).
Os resultados deste trabalho indicam que extratos obtidos de diferentes porções
vegetativas de uma planta apresentam distintas atividades antioxidantes quando
submetidas aos diferentes testes antioxidantes, uma vez que os tecidos vegetais são
constituídos por moléculas diferentes e estas, por sua vez, influenciam nos ensaios
antioxidantes.
A ação antioxidante dos extratos obtidos de plantas pode ir além do
sequestro e impedimento da formação de espécies reativas. Por exemplo, em 2007,
Naik e colaboradores demonstraram que o extrato aquoso da raiz da espécie vegetal
Decalepis hamiltonii era capaz de proteger a mucosa gástrica de lesões mucosas
INTRODUÇÃO
29
induzidas por estresse quando ingerido em doses adequadas por ratos do tipo
Wistar antes de serem submetidos a esse estresse. Além disso, o tratamento dos
ratos com o extrato mostrou que este inibia a secreção gástrica provavelmente pelo
bloqueio da ação da bomba H+–K+–ATPase. De acordo com os autores uma das
causas para esse efeito protetor pode ser também explicado devido a um aumento
das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e catalase nos animais que tinham
sido submetidos ao tratamento com o extrato (NAIK et al., 2007)
1.4 ATIVIDADE ANTICOAGULANTE
1.4.1 Coagulação sanguínea x anticoagulantes
A formação do coágulo de fibrina envolve complexas interações entre
proteases plasmáticas e seus cofatores, que culminam na gênese da enzima
trombina, que, por proteólise, converte o fibrinogênio solúvel em fibrina insolúvel
(FRANCO, 2001).
Em 1964, foi proposta a hipótese da “cascata” para explicar a fisiologia da
coagulação. Este modelo descreve cada um dos fatores de coagulação como uma
pró-enzima que pode ser convertida para uma enzima ativa. O mecanismo de
coagulação é dividido em duas vias: via intrínseca, assim chamada porque todos os
componentes estão presentes no sangue; e via extrínseca, em que a proteína da
membrana das células subendotelias, o fator tecidual (FT), é necessária, além de
componentes circulantes.
Como é apresentada na figura 6, a via extrínseca é
desencadeada pela formação do complexo Fator Tecidual (FT): Fator VIIa (FVIIa)
que resulta na ativação do fator X. A via intrínseca é iniciada pela ativação do fator
XII (FXII), quando o sangue entra em contato com qualquer superfície contendo
cargas negativas (ativação por contato), este processo requer ainda a presença de
outros componentes do plasma: pré-calicreína (uma serino-protease) e cininogênio
de alto peso molecular (um cofator não enzimático). O fator XII ativo (FXIIa),
desencadeia uma série de ativações protéicas, que culmina na ativação do fator X
(RIDELL et al., 2007)
O ponto de convergência das vias extrínseca e intrínseca é conhecido como
via comum da coagulação, e é caracterizada pela ativação de fibrinogênio à fibrina
pela trombina, formando uma malha de fibrina que vai ser estabilizada pelo fator
XIIIa (FRANCO, 2001).
INTRODUÇÃO
30
Figura 6. Modelo clássico da cascata de coagulação. Fonte: FRANCO, 2001
Posteriormente, foi proposto um novo modelo de cascata de coagulação, no
qual são relacionados três complexos enzimáticos pró-coagulantes que vão culminar
na ativação da trombina: Complexo “tenase” extrínseco, complexo “tenase”
intrínseco e complexo protrombinase. Após uma lesão no endotélio vascular, o FT é
exposto e se liga ao Fator VIIa que é normalmente encontrado no sangue. O
complexo FT/VIIa ativa os fatores IX e X na presença do cálcio. O fator IXa, por sua
vez, potencializa a formação de Xa através da formação do “complexo tenase
intrínseco” . Por fim, o fator Xa forma complexo com o fator Va convertendo o fator II
(protrombina) em fator IIa (trombina), como observado na figura 7 (ADAMS; BIRD,
2009;FRANCO, 2001).
INTRODUÇÃO
A
B
31
C
D
EE
Figura 7. Representação esquemática dos complexos procoagulantes. (A) O Fator VII encontrase ativado em concentrações muito baixas no sangue. (B) O Fator VIIa tem alta afinidade pelo FT. O
complexo FT/VIIa é capaz de converter uma quantidade significativamente maior de Fator VII,
gerando o Fator VIIa. (C) No entanto o principal papel de FT/VIIa é formar um complexo com os
Fatores X e IX (Complexo tenase extrínseco), levando a formação dos Fatores Xa e IXa. O Fator Xa,
por sua vez, leva a formação de pequenas concentrações de trombina, que por sua vez ativam os
cofatores V e VIII. (D) Os Fatores IXa e VIIIa se complexam ao Fator X (Complexo tenase intrínseco)
ativando mais moléculas de trombina. (E) Os Fatores Va e Xa se complexam ao Fator II (Complexo
protrombinase) aumentando consideravelmente sua conversão em trombina (a formação de trombina
por este complexo é 50 vezes maior do que pelos demais). FT: Fator tecidual. As setas tracejadas
indicam pontos de retroalimentação do sistema
Anticoagulantes têm sido amplamente utilizados para o tratamento de
sangue durante diálises e cirurgias; como medicamentos em várias doenças, como
coagulação intravascular disseminada e trombose; e para testes sanguíneos in vitro
(WANG et al., 2010).
O principal fármaco anticoagulante, usado há mais de 80 anos, é a heparina,
um polissacarídeo sulfatado de origem animal, extraído de intestino de suínos e
pulmão de bovinos, constituído por unidades dissacarídicas repetitivas, onde um dos
resíduos é uma hexosamina (glucosamina); e o outro, um ácido urônico (L-idurônico
e D-glucurônico), a sulfatação pode ocorrer em vários pontos da molécula (NADER
et al., 2004). No entanto, o uso deste composto pode apresentar algumas reações
adversas, como trombocitopenia decorrente do seu uso prolongado (FABRIS et al.,
2000) e efeito hemorrágico residual, apresentado por fragmentos da heparina sem
atividade anticoagulante (NADER et al., 1979; 2004). Portanto, se faz necessário a
busca por novos compostos anticoagulantes, com menores efeitos colaterais ou sem
INTRODUÇÃO
32
efeitos colaterais, que possam vir a substituir a heparina, ou o seu uso em algumas
situações específicas.
1.4.2 Atividade anticoagulante de extratos e compostos obtidos de plantas
Extratos de plantas vasculares constituem uma rica fonte de compostos
farmacologicamente ativos, dentre as atividades que vem sendo avaliadas tem-se a
atividade anticoagulante. E alguns resultados positivos são encontradosna literatura,
como por exemplo, dados sobre o estrato aquoso da casca da raiz de Paeonia lutea
apresentou atividade anticoagulante, fibrinolítica e antitrombótica, no entanto, porém,
os autores não identificaram os compostos ativos deste extrato (PASTORAVA et
al.,1999). Um outro gênero de planta que teve seus extratos avaliados quanto a
atividade anticoagulante foi o Panax. Extratos Panax notoginseng prolongaram o
tempo de coagulação para os testes de aPTT, PT e TT, já os extratos de Panax
ginseng e Panax quinquefolium apresentaram atividade somente para o teste de TT
(LAU et al., 2009).
No entanto, há também trabalhos que demonstram extratos de certas
plantas não possuem atividade anticoagulante, como os extratos aquosos das
folhas, sementes e cascas das sementes de Azadirachta indica e seus derivados
sulfatados quimicamente, os quais foram submetidos a testes anticoagulantes, mas
não apresentaram atividade (HELMY et al., 2007).
Dentre os compostos anticoagulantes isolados de plantas pode-se citar os
compostos fenólicos (compostos cumarínicos, flavonóides, taninos), terpenos e
polissacarídeos (DONG et al., 1998; YOON et al., 2002). Por exemplo, Zheng et al
em 1998 obtiveram triterpernóides (pertencem à classe dos terpenos) do extrato
metanólico
de
Geum
japonicum,
os
quais
mostraram
significante
efeito
anticoagulante na via extrínseca da coagulação (ZENG et al., 1998). Neste mesmo
ano, Dong et al. (1998) isolaram sete taninos desta planta, destes um tem um efeito
inibitório competitivo diretamente contra a trombina, outros quatro tiveram efeito
inibitório não competitivo com a trombina e os demais não apresentaram atividade
anticoagulante.
Dentre os trabalhos realizados que avaliam a atividade anticoagulante de
espécies vegetais, há apenas um trabalho que demonstra a presença de
polissacarídeos anticoagulantes em vegetais terrestres (YOON et al., 2002). Estes
autores avaliaram o potencial anticoagulante de 59 espécies de plantas medicinais e
INTRODUÇÃO
33
verificaram que os extratos de Porana volubilis e Litsea cerbeba são potentes
anticoagulantes pelos testes de APTT e TT. Outros extratos também tiveram uma
boa atividade pelo teste de APTT, como os de Swietenia macrophylla, Piper
retrofractum,
Abelmoschus
moschatus.
Além
disso,
verificaram
que
os
polissacarídeos de Areca catechu e Woodfordia floribunda eram potentes inibidores
da agregação plaquetária induzida por colágeno. O polissacarídeo de Porana
volubilis foi purificado e verificou-se que sua atividade anticoagulante era mediada
pelo cofator II da heparina. Viu-se ainda, que este composto, diferente de outros
polissacarídeos anticoagulantes, não tinha éster de sulfato, no entanto, sua atividade
biológica exigia a presença de resíduos de ácido galacturônico (YOON et al., 2002).
Recentemente, Gomes et al. (2009) avaliaram ação anticoagulante de
polissacarídeos da macrófita aquática Eichhornia crassipes. Para tal E. crassipes foi
dividida em quatro porções vegetativas (raiz, rizoma, pecíolo e folha), e destas foram
obtidos
macerados
ricos
em
polissacarídeos
hidrossolúveis.
Os
ensaios
anticoagulantes demonstraram que todos os extratos tiveram a capacidade de
prolongar o tempo de coagulação no teste de APTT, sendo o extrato da raiz o mais
potente (GOMES et al., 2009).
1.5 ATIVIDADE ANTIPROLIFERATIVA
O câncer é uma doença genética, decorrente de um acúmulo de mutações
que promovem seleção clonal de células com comportamento agressivo como, por
exemplo, proliferação independente dos controles normais. As células selecionadas
são conhecidas como células tumorais e apresentam a capacidade de invadir e
colonizar os tecidos circunvizinhos de seu sítio de origem (FEARON, 1997;
VIDEIRA, et al., 2002). De acordo com a Organização Mundial de Saúde (WHO)
entre os anos de 2005 a 2015 oitenta e quatro milhões de pessoas irão morrer
acometidos de câncer (WHO, 2010).
A proliferação celular normal é regulada diretamente, por mecanismos que
determinam quando uma célula deve passar o seu ponto de restrição do ciclo
celular, ou indiretamente, através da regulação de seu caminho à diferenciação final.
Em ambos os casos os genes reguladores normais podem ser geneticamente
classificados naqueles cujo produto auxilia no estímulo da proliferação celular e
naqueles cujo produto possa inibi-la. Correspondentemente, há duas rotas
mutacionais pelas quais a proliferação celular se torna descontrolada podendo
INTRODUÇÃO
34
caracterizar um câncer. A primeira seria aquela na qual um gene “estimulador”
poderia estar hiperativo e a segunda quando um gene “inibidor” estivesse inativo
(VIDEIRA et al., 2002).
O gene normal responsável pela codificação de produtos (oncoproteínas)
que estimulem a proliferação celular é chamado proto-oncogene. Por sua vez, o
termo oncogene se refere a um proto-oncogene alterado que ativado codifica
produtos que super estimulem a proliferação celular. Aquele gene que codifica
produtos de inibição da proliferação celular é denominado gene supressor de tumor
ou antioncogene (VIDEIRA et al., 2002).
Uma característica marcante das células tumorais é a perda da capacidade
de realização da morte celular. A morte celular é uma estratégia essencial para o
controle do equilíbrio dinâmico nos sistemas vivos e algumas formas de morte já
foram identificadas e classificadas em: clássica, sendo elas, apoptose; autofagia;
cornificação e necrose, enquanto a outra classificação engloba os tipos de morte
celular que não são tão comuns ocorrendo em circunstâncias e tipos celulares
específicos, como por exemplo: catástrofe mitótica; excitotoxicidade; degeneração
Walleriana; piropoptose, entre outras (KROEMER et al., 2007; 2009). No entanto, de
todas essas formas, duas formas fundamentais de morte celular já são bem
definidas e estudadas: a necrose e a apoptose (VERMEULEN et al., 2005).
A necrose é um processo passivo acidental caracterizado pelo aumento do
volume intracelular, cariólise e lise da célula (COTRAN; HUMAR; COLLINS, 1999;
KANNAN; JAIN, 2000). Em virtude do envolvimento de elevado número de grupos
celulares e da perda precoce dos componentes citoplasmáticos para o espaço
extracelular, a necrose geralmente resulta em resposta inflamatória intensa
(VANENGELAND et al., 1998; WYLLIE, 1997; WILLINGHAM, 1999). Na figura 8, de
forma simplificada, pode-se observar como ocorre o processo de necrose.
Já a apoptose é um complexo processo no qual estímulos intrínsecos e
extrínsecos ativam um programa molecular para a execução de uma série de
eventos específicos que culminam em morte celular (ver figura 8) (BOLETI et al.,
2008). Células que estão sofrendo apoptose apresentam mudanças morfológicas
específicas as quais incluem: formação de bolhas na membrana plasmática,
condensação do citoplasma e da cromatina, fragmentação nuclear e formação dos
corpos apoptóticos os quais são posteriormente submetidos à ação dos fagócitos
(CONRADT, 2009).
INTRODUÇÃO
35
Figura 8. Esquema representativo de dois processos de morte celular: (a) necrose e (b)
apoptose. Fonte: http://conhecendoapatologia.blogspot.com/2010/08/apoptose.html
No processo apoptótico, são conhecidas três vias de ativação na apoptose:
A) Via extrínseca, mediada pela interação ligante–receptor. Os receptores de
membrana plasmática que desencadeiam sinalização para apoptose pertencem à
superfamília de receptores do Fator de Necrose Tumoral (TNF), incluindo Fas, TNFR1, DR3, TRAIL-R1, TRAIL-R2 e DR6. Uma vez unidos aos seus ligantes, estes
receptores são trimerizados e recrutam proteínas adaptadoras ao domínio de morte
citosólico (DD). Subseqüentemente, as proteínas ativam a caspase-8 e/ou 10
formando
o
complexo
DISC,
onde
as
caspases
efetoras
são
ativadas
(principalmente caspase-3) (KROEMER, 2007; VERMEULEN, 2005). B) Via
intrínseca, mediada pela via mitocondrial. A liberação de proteínas pró-apoptóticas
normalmente localizadas no espaço intermembranar da mitocôndria, caracterizam
esta via. A liberação destas proteínas se dá pela permeabilização da membrana
externa mitocondrial, principalmente, via componentes da família de proteínas Bcl-2,
a qual contém membros antiapoptóticos (proteínas Bcl-2 e Bcl-XL) e proteínas próapoptóticas (Bax, Bid e Bak). Quando o citocromo c é liberado no citosol é
desencadeada uma via apoptótica dependente de caspase, onde o citocromo c ativa
Apaf-1 e, por sua vez, na presença de ATP, liga-se à procaspase-9, formando o
apoptosoma. Após esta associação, a caspase-9 ativa as caspases-3-6 e -7,
permitindo a fragmentação de DNA. No entanto, quando a proteína AIF (fator indutor
de apoptose) é liberada no citosol, uma via de morte celular por apoptose
independente de caspase é ativada, uma vez que AIF transloca-se para o núcleo
INTRODUÇÃO
36
onde induz fragmentação de DNA e condensação de cromatina (BROKER, 2005;
KROEMER, 2007). C) A terceira via envolve estresse causado no Retículo
Endoplasmático (RE). Embora pouco conhecida, acredita-se que a apoptose
induzida pelo estresse do RE envolve diferentes mecanismos, incluindo a ativação
direta de caspases (caspases 12 e 4), quinases (JNK e p-38-MAPK e de fatores de
transcrição mediadores da apoptose (CHOP) (KADOWAKI; NISHITOH; ICHIJO,
2004; MOMMOI, 2004).
1.5.1 Efeitos antiproliferativos de extratos e compostos obtidos de plantas
Por ser uma das principais causas de morte em todos os países, grande é a
busca pela identificação de novas substâncias que sejam realmente efetivas contra
o câncer. Além disso, com o incentivo de que quimioterápicos largamente utilizados
foram obtidos de espécies vegetais (como por exemplo, vincristina e vimblastina são
alcalóides obtidos de Catharanthus roseus), e que estes fármacos causam muitos
efeitos colaterais aos pacientes, grande é a busca por compostos naturais com
efeito anticâncer obtidos a partir de plantas (ER et al., 2007) .
Diversos são os extratos obtidos para se avaliar a ação antiproliferativa, quer
aquoso, etanólico, metanólico, hexânico ou clorofórmico, entre outros. Além disso,
esses extratos são obtidos das diferentes porções vegetativas das plantas: folha,
raiz, caule e flor (DEMARCHI, 2007).
Em 2004 Shu-Jing Wu e colaboradores obtiveram extrato etanólico da
espécie Physalis peruviana L e demostraram que este extrato apresenta atividade
anti-hepatoma, uma vez que induz apoptose em um carcinoma hepatocelular
humano, Hep G2 (SHU-JING WU et al., 2004). A fim de isolar compostos bioativos
presentes em Physalis peruviana L, Ching-Yu Yen e colaboradores, em 2010,
obtiveram o composto 4β-Hydroxywithanolide E a partir do extrato etanólico das
partes aéreas desta planta. Neste estudo foi demonstrado que o composto obtido foi
capaz de induzir danos no DNA e inibir a proliferação da linhagem tumoral de
pulmão H1299 (CHING-YU YEN et al., 2010).
Em 2009, Rejiya, Cibin e Abraham avaliaram o extrato metanólico obtido das
folhas de Cassia tora frente à linhagem tumoral HeLa. Eles sugerem que as folhas
da espécie apresentam potencial para ser uma nova terapia contra o câncer, pois
pelo ensaio do MTT o extrato metanólico inibiu a proliferação e induziu fragmentação
INTRODUÇÃO
37
do DNA das células HeLa. Além disso, foi observada atividade aumentada de
caspase-3 avaliada por kit colorimétrico (REJIVA; CIBIN; ABRAHAM, 2009).
Também em 2009 Mesquita e colaboradores realizaram um estudo com
extratos de 50 espécies de plantas do Cerrado brasileiro utilizando vários solventes.
Dos 412 extratos testados, 28 apresentaram efeito antiproliferativo, inibindo 85% da
proliferação das células tumorais MDA-MB-435, HCT-8, SF-295 e HL-60 na
concentração de 50 µg/mL. Dentre os 28 extratos que apresentaram efeito frente às
linhagens tumorais, os extratos hexânicos das folhas, tronco e raiz de Casearia
sylvestris e raiz de Simarouba versicolor; bem como o extrato etanólico da raiz de
Simarouba versicolor, mostraram-se mais citotóxicos frente às linhagens tumorais
testadas (MESQUITA et al., 2009).
Com relação ao gênero Marsdenia poucos estudos nas diversas áreas foram
encontrados, porém se destacam estudos farmacológicos com extratos e compostos
extraídos de espécies desse gênero. Contudo, quando se busca dados da espécie
Marsdenia megalantha, que é uma espécie endêmica da caatinga, não se encontra
nenhum estudo de suas propriedades farmacológicas.
Tendo em vista os trabalhos mostrando o potencial farmacológico em
extratos de espécies do gênero Marsdenia, aliados à escassez de trabalhos com
Marsdenia megalantha, uma espécie com ampla distribuição na região Seridó, fazse necessário um estudo farmacológico com essa planta, para avaliar quais
atividades desempenhadas pelos compostos presentes na mesma.
OBJETIVOS
38
2. OBJETIVOS
Principal
• Avaliar as atividades antioxidante, anticoagulante e antiproliferativa dos
extratos aquosos de caule, folha e raiz de Marsdenia megalantha;
Específicos
• Obter os extratos aquosos de caule, folha e raiz de M. megalantha;
• Avaliar o potencial antioxidante dos extratos obtidos utilizando os seguintes
testes: Capacidade antioxidante total (CAT), Sequestro de radical hidroxila,
Sequestro de radical superóxido, Poder redutor e Quelação férrica;
• Avaliar o potencial anticoagulante dos extratos através dos ensaios de tempo
de protrombina (PT) e de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT);
• Avaliar a capacidade dos extratos em influenciar a proliferação de células
tumorais através do ensaio de MTT, selecionando aquele (s) extrato (s) com melhor
potencial antiproliferativo e analisar o processo de morte celular através de
citometria de fluxo e western blot.
MATERIAIS E MÉTODOS
39
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 MATERIAIS
3.1.1 Material Biológico
FILO: Magnoliophyta
CLASSE: Magnoliopsida
ORDEM: Gentianales
FAMÍLIA: Apocynaceae
GÊNERO: Marsdenia
ESPÉCIE: Marsdenia megalantha GOYDER & MORILLO(Figura 9)
Figura 9. Marsdenia megalantha. Fonte: Goyder;Morillo, 1994.
A planta Marsdenia megalantha foi utilizada como objeto de estudo deste
trabalho. Os espécimes foram coletados em abril de 2008 no município de Caicó/RN
(S 6º 30` W 37º 05`), sendo em seguida acondicionados em sacos de polietileno e
levados no mesmo dia da coleta ao BIOPOL (Laboratório de Biotecnologia de
Polímeros Naturais), Departamento de Bioquímica da UFRN, onde foram lavados em
água corrente para a retirada de possíveis contaminantes. Um exemplar de M.
megalantha foi identificado pelo professor Dr. Alessandro Rapini da Universidade
Estadual de Feira de Santana (UEFS) e outro exemplar foi depositado no Herbário
da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (N° UFRN 9361).
MATERIAIS E MÉTODOS
40
3.1.2 Linhagens tumorais e cultura das células
As linhagens tumorais humanas do cólon do útero (HeLa) e de pâncreas
(PANC-1) foram mantidas em meio DMEM; já as linhagens tumorais humanas de
próstata (PC-3), de leucemia promielocítica (HL-60), e renal (786-0) foram mantidas
em meio RPMI 1640. Todas as células foram cultivadas a 37 °C em uma incubadora
umidificada na presença de 5% CO2, com os respectivos meios suplementados com
10% de soro fetal bovino (SFB) e penicilina/estreptomicina (10000 U e 10 mg para
cada litro de meio, respectivamente). Todas as células foram obtidas da American
Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD).
3.1.3 Outros materiais
• Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomasie brilliant blue R 250,
fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio monobásico, glicina, hidróxido de
sódio, peróxido de hidrogênio e sulfato de ferro heptahidratado da CRQ
(Diadema, SP, Brasil);
•
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) da VETEC (Duque de Caxias, RJ,
Brasil);
•
Ácido clorídrico e metionina da Synth (Diadema, SP, Brasil);
•
Ácido gálico da CAQ Casa da Química Ind. e Com. (Diadema, SP, Brasil);
•
Ácido ascórbico, ferrozina, nitroblue tetrazolium (NBT) e riboflavina da SigmaAldrich Brasil (São Paulo, SP, Brasil);
•
Cloreto de ferro, reagente de Folin-Ciocalteau e inibidor geral de caspases (ZVAD-FMK) da Merck (Darmstadt, Alemanha);
•
Fenol e molibdato de amônio da Reagen Quimibrás Indústrias Químicas S.A.
(Rio de Janeiro, RJ, Brasil);
•
Kit de tempo de tromboplastina parcial ativada e Kit de tempo protrombina da
Labtest (Lagoa Santa, MG, Brasil);
•
Reagente de Bradford da Bio-Rad (NY, EUA)
•
Anticorpos policlonais produzidos em coelho (Bax e Bcl-2), anticorpo
monoclonal produzido em coelho (caspase-3 clivada) e anticorpo secundário
conjugado com peroxidase produzido em cabra anti-coelho foram obtidos da
Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA).
O anticorpo monoclonal
produzido em camundongo (AIF) e anticorpo secundário conjugado com
MATERIAIS E MÉTODOS
41
peroxidase obtido de cabra anti-camundongo foram obtidos da Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA);
•
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e RPMI 1640 da Cultilab
(Campinas, SP, Brasil);
•
DAPI (4´,6´-diamidino-2-phenylindole) da Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);
•
Membrana de PVDF da Millipore Corp. (Bedford, MA, USA).
•
Anexina V-FITC e Iodeto de propídio (BD Pharmingen, San Diego, CA, USA)
Todos os demais materiais e reagentes utilizados foram da melhor qualidade
disponível.
3.1.4 Aparelhos
Além dos aparelhos usuais do laboratório pode-se destacar:
•
Agitador orbital modelo 255-B, banhos-maria e estufas de temperatura
constante da FANEM Ltda. (São Paulo, SP, Brasil);
•
Balanças analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
•
Bomba de Vácuo da TECNAL (Piracicaba, SP, Brasil);
•
Centrífuga refrigerada CR 21 da Hitachi Koki Co. Ltda (Tóquio, Japão);
•
Coagulômetro da Drake (SãoPaulo, SP, Brasil);
•
Destilador de água MA-270 da Marconi Ltda (Piracicaba, SP, Brasil);
•
Espectrofotômetro da FEMTO Ltda (São Paulo, SP, Brasil);
•
Fontes de corrente contínua da BioAgency Biotecnologia Ltda. (São Paulo,
SP, Brasil);
•
Medidor de pH da PHS-3B da PHTEK (Japão);
•
Purificador de água Milli-Q® Water System da Millipore Corp. (Bedford, MA,
USA);
•
PowerPacTM Power Supply; MiniPROTEAN® Tetra Caell; Mini Trans-blot Cell
®
, da BIO-RAD (São Paulo, SP, Brasil);
•
Bancada de Fluxo Laminar Pachane Pa300 (Piracicaba, SP, Brasil);
•
Incubadora Thermoforma Serie II Water CO2 Incubator HEPA Filter Model
3110 (USA);
•
Microscópio NIKON CFI60, Spectrum – Spectrum Bioengenharia médica
hospitalar LTDA (São Paulo, SP, Brasil);
RESULTADOS
50
4. RESULTADOS
4.1. DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES DOS EXTRATOS AQUOSOS DE M.
megalantha
Os extratos aquosos do caule, folha e raiz de Marsdenia megalantha foram
submetidos às análises químicas para determinação do conteúdo de proteínas,
açúcares e fenólicos totais como mostrado na tabela 1. Extrato aquoso da folha
(EAF) e extrato aquoso da raiz (EAR) apresentaram os menores teores de açúcares
totais (27,53% e 28,16%, respectivamente), enquanto EAC apresentou o maior
conteúdo de açúcares (47,45%). Com relação à presença de compostos fenólicos,
EAF apresentou o maior conteúdo (37,01 equivalentes de ácido gálico), enquanto
EAC e EAR apresentaram, respectivamente, 15,23 e 11,53 equivalentes de ácido
gálico. Em todos os extratos, nas condições testadas, não foi detectada quantidades
significativas (<0,1%) de proteínas.
Tabela 1. Composição química dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de
M. megalantha.
Extratos
aquosos
Proteína
(%)
Açúcares
totais (%)
Fenólicos totais
(EAG)a
Caule
Folha
Raiz
< 0,1
< 0,1
< 0,1
47,45 ± 0,04a
27,53 ± 0,02 b
28,16 ± 0,01 c
15,23 ± 0,07 a
37,01 ± 0,03 b
11,53 ± 0,05 c
a
O conteúdo de fenólicos totais é expresso como equivalentes de ácido gálico (EAG). Os valores são
a,b
expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Letras distintas indicam diferença significativa
(p<0,05) entre os extratos.
4.2. ATIVIDADES BIOLÓGICAS DOS EXTRATOS AQUOSOS DE M. megalantha
4.2.1. Atividade antioxidante in vitro
A atividade antioxidante in vitro dos extratos aquosos foi avaliada por
diferentes ensaios: capacidade antioxidante total (CAT), poder redutor, quelação
férrica, sequestro do radical hidroxila e sequestro do radical superóxido.
No teste de CAT todos os extratos apresentaram atividade detectável (figura
10). A atividade de EAF foi significativamente maior (p < 0,05) do que a atividade
dos demais extratos, sendo possível se detectar cerca 141 equivalentes de ácido
ascórbico. Já as atividades de EAC e EAR foram de 76 e 57 equivalentes de ácido
RESULTADOS
51
ascórbico, respectivamente, não havendo diferenças significativas entre os mesmos.
A correlação realizada entre compostos fenólicos e o CAT mostrou um coeficiente
de 0,9966, enquanto para açúcares totais este coeficiente foi de -0,3279.
Figura 10. Capacidade antioxidante total dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M.
megalantha. Os resultados são expressos como equivalentes de ácido ascórbico. Os valores são
a,b
expressos como a média ± desvio padrão (n=3). Letras distintas indicam diferença significativa (p <
0,05) entre os extratos.
O ensaio de poder redutor dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M.
megalantha foi avaliado através do monitoramento da formação do azul de prussian.
Na figura 11 observa-se que todos os extratos aquosos de M. megalantha
apresentaram poder redutor. Pode-se observar também que esta atividade se
mostrou dose-dependente, se estabilizando a uma concentração em torno de 1,500
mg/mL (Raiz e caule). Já com relação ao EAF, os valores obtidos com este extrato
não se estabilizaram. Porém há fortes indícios de que estes chegariam a uma região
de platô. Novamente, os melhores resultados foram obtidos com EAF. Contudo,
quando se compara os dados obtidos com os extratos de folha e de caule, esta
diferença foi menos pronunciada do que no teste de CAT. Para o ensaio de poder
redutor não foi detectada correlação entre compostos fenólicos ou açúcares totais.
RESULTADOS
52
Figura 11. Ensaio do poder redutor dos extratos aquosos de diferentes partes de M.
a,b,c
megalantha. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Letras distintas
x, y, z
indicam diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações de um mesmo extrato;
Letras
distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma concentração de cada extrato.
Não foi possível detectar atividade seqüestradora de radicais hidroxilas nos
extratos aquosos obtidos da Marsdenia megalantha até a concentração máxima
testada (1,0 mg/mL).
Quando os extratos foram avaliados quanto a sua capacidade de seqüestrar
radicais superóxido, observou-se um efeito crescente de forma dose-dependente.
Mais uma vez destacou-se EAF, sendo capaz de sequestrar cerca de 80% dos
radicais existentes, a uma concentração de 0,8 mg/mL (Tabela 2). Este resultado foi
bastante interessante, uma vez que quando se utilizou o ácido gálico, antioxidante
utilizado como controle positivo nesse teste, observou-se que sua capacidade em
sequestrar o radical superóxido estava em torno de 85% nesta mesma
concentração. A capacidade em sequestrar estes radicais não foi observada para
EAR até a máxima concentração testada (1,0 mg/mL). Já para EAC esta atividade
só começou a ser observada a partir da concentração de 0,8 mg/mL. A análise dos
valores obtidos indica que este extrato apresentou cerca de 35% de atividade
seqüestradora,
na
máxima
concentração
testada
(1,0
mg/mL),
que
foi
aproximadamente 2,4 vezes menor que aquela observada com o ácido gálico na
mesma concentração. O coeficiente de correlação entre compostos fenólicos e
RESULTADOS
53
atividade seqüestradora foi expressivo (r = 0,9502), ao contrário do observado para
a relação entre açúcares totais e esta atividade antioxidante (r = -0,0997).
Tabela 2. Atividade sequestradora do anion superóxido dos extratos aquosos
do caule, folha e raiz de M. megalantha.
Extratos
aquosos
Concentração
(mg/mL)
Sequestro
(%)
Caule
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
nd
nd
nd
nd
10,93±1,64a,x
35,03±2,33b,x
Folha
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
8,82±1,73a,x
13,51±1,07b,x
37,02±2,16c,x
66,77±1,55d,x
79,31±1,38e,y
80,76±1,26e,y
Raiz
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
nd
nd
nd
nd
nd
nd
Ácido gálico
0,1
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
15,26 ± 1,73a,y
37,15 ± 0,89b,y
58,50 ± 0,44c,y
82,24 ± 1,01d,y
85,68 ± 1,43d,z
84,86 ± 1,70d,z
a,b,c
Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Letras distintas indicam diferença
x, y, z
significativa (p < 0,05) entre os extratos;
Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05)
entre a mesma concentração de cada extrato. nd: não detectado.
Na figura 12 ilustra-se a atividade de quelação férrica dos extratos aquosos
de Marsdenia megalantha. A análise dos resultados revelou que EAC e EAF
apresentam um comportamento dose-dependente similar, e a atividade máxima (em
torno de 42%) foi detectada na concentração de 1,0 mg/mL. Entretanto, quando se
analisa os dados de quelação obtidos com concentrações entre 0,05 a 0,5 mg/mL
verifica-se que os valores obtidos com EAF foram significativamente maiores do que
RESULTADOS
54
aqueles obtidos com EAC. Já os valores obtidos com EAR não excederam 17,6% de
quelação mesmo na maior concentração testada (2,0 mg/mL). O coeficiente de
correlação mais uma vez foi determinado e observou-se baixa correlação entre
compostos fenólicos ou açúcares totais e a capacidade quelante das amostras (r =
0,5904 para compostos fenólicos e r = 0,4991 para açúcares totais).
Figura 12. Quelação férrica dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M.
a,b,c
megalantha. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão (n=3).
Letras distintas
x, y, z
indicam diferença significativa (p<0,05) entre as concentrações de um mesmo extrato;
Letras
distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma concentração de cada extrato.
4.2.2 Atividade anticoagulante dos extratos do caule, folha e raiz de M.
megalantha
Os extratos de M. megalantha não apresentaram atividade anticoagulante
detectável nas condições testadas (0,05 a 2,0 mg/mL) quer para o teste de PT ou
aPTT.
4.2.3 Atividade antiproliferativa dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de
M. megalantha
Para avaliação do potencial antiproliferativo dos extratos aquosos de M.
megalantha escolheu-se uma linhagem tumoral da região cervical de útero humano
(HeLa). Pode-se observar na figura 13 que as células apresentaram uma diminuição
da proliferação celular na presença das várias concentrações dos extratos, e que na
RESULTADOS
55
presença de EAC e EAF esta diminuição se deu de forma dose-dependente. Dentre
os extratos, EAF foi o mais ativo, podendo-se observar que ele inibiu a proliferação
da linhagem HeLa em 80% na concentração de 1,0 mg/mL. Além disso, na
concentração de 0,50 mg/mL EAF já alcança inibição na proliferação em 54%.
Observou-se comportamento semelhante quando se testou a atividade de EAC
frente à mesma linhagem celular. Contudo, a atividade antiproliferativa detectada foi
menor, chegando a valores em torno de 63% na máxima concentração testada (1,00
mg/mL). EAR não ultrapassou 25% de inibição da proliferação celular até a máxima
concentração testada (1,00 mg/mL). A atividade antiproliferativa apresentou alta
correlação com a quantidade de compostos fenólicos presentes nos extratos (r =
0,8410), e baixa correlação com a quantidade de açúcares totais (r = 0,1543).
Figura 13. Atividade antiproliferativa dos extratos aquosos do caule, folha e raiz de M.
megalantha frente à linhagem tumoral HeLa. Os valores são expressos como a média ± desvio
a,b,c
padrão (n=3).
Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre as concentrações de
x, y, z
um mesmo extrato;
Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma
concentração de cada extrato.
4.2.4 Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M. megalantha
frente a outras linhagens celulares tumorais.
Levando-se em consideração a capacidade antiproliferativa que EAF
mostrou frente à linhagem tumoral HeLa, foram realizados ensaios antiproliferativos
frente a outras linhagens celulares tumorais humanas, tais como: PC-3, PANC-1,
HL-60 e 786-0. Na figura 14, pode-se observar que as células tumorais mostraram-
RESULTADOS
56
se sensíveis ao EAF de forma dose-dependente. Entretanto, cada linhagem tumoral
apresentou uma sensibilidade diferente ao extrato.
Dentre as células testadas, a linhagem HL-60 foi a mais sensível ao EAF. O
extrato foi capaz de inibir cerca de 60% da proliferação desta linhagem celular na
concentração de 1,0 mg/mL, enquanto que para as demais linhagens este
percentual não ultrapassou 50% de inibição até a máxima concentração testada (1,0
mg/mL). No entanto, vale salientar um fato interessante. Quando se utilizou baixas
concentrações de EAF, as demais linhagens celulares avaliadas apresentaram uma
maior sensibilidade a este extrato do que a HL-60. Por exemplo, EAF conseguiu
inibir em torno de 35% a proliferação das linhagens 786-0 e PANC-1 e em 22% a
proliferação de PC-3, utilizando-se a concentração de 0,25 mg/mL, enquanto que
nessa mesma concentração, a proliferação de HL-60 foi comprometida em apenas
19%.
Apesar dos dados obtidos com estas linhagens tumorais terem sido
interessantes, vale lembrar que EAF quando testado frente à linhagem tumoral HeLa
(ver figura 13), inibiu em 80% a proliferação desta linhagem na máxima
concentração testada de 1,0 mg/mL. Sendo assim, esta linhagem celular foi
escolhida para realização dos experimentos subseqüentes e para tais utilizou-se a
concentração do IC50 (0,50 mg/mL).
Figura 14. Atividade antiproliferativa do extrato aquoso da folha de M. megalantha frente a
quatro linhagens celulares tumorais. Os valores são expressos como a média ± desvio padrão
a,b,c
x, y, z
(n=3).
Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre os tipos celular
Letras
distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre a mesma concentração de cada linhagem
celular.
RESULTADOS
57
4.2.5 Análises morfológicas das células HeLa na presença do extrato aquoso
da folha de M. megalantha
As células da linhagem HeLa foram plaqueadas sobre lamínulas de vidro e
estimuladas a se proliferarem na ausência (controle) ou presença de 0,50 mg/mL de
EAF, sendo mantidas nessas condições por 24 horas. Após este período, as células
foram fotografadas em microscópio de luz e processadas para serem preparadas
para a visualização em microscopia eletrônica de varredura.
O aspecto das células HeLa (sem a presença de EAF) avaliado por
microscopia óptica pode ser observado na figura 15A. As células se apresentaram
com morfologia fusiforme e totalmente aderidas ao substrato. Em contraste, as
células tratadas com EAF apresentaram uma redução da adesividade celular e,
morfologicamente, passaram a apresentar um aspecto arredondado e aparente
redução do volume celular, dando indícios de que estariam entrando em morte
celular (figura 15B).
Figura 15. Microfotografias das células HeLa visualizadas em microscópio de contraste de
fase. As fotos foram obtidas após 24h de exposição continua ao EAF. A – Células HeLa controle.
Ampliação de 4x. No canto superior direito, ampliação de 20x. B – Células Hela tratadas com EAF
(0,50 mg/mL). Ampliação de 4x. No canto superior direito, ampliação de 20x
Na Figura 16A e B encontra-se ilustrado o aspecto das células HeLa quando
observadas através de microscopia eletrônica de varredura (MEV). As células
controle (figura 16A) mostraram aspecto fusiforme, com uma distribuição pouco
homogênea em relação ao tamanho, além de apresentarem várias projeções de
membrana (filopódios e lamelipódios) evidenciando motilidade celular.
RESULTADOS
58
Na figura 16B observa-se as células da linhagem HeLa sobre o efeito do
EAF. É possível observar a morfologia globosa das células, com diminuição da
adesão e espraiamento das células, evidenciado pelos espaços existentes entre os
elementos celulares e pela pouca presença das projeções de superfície. Há
presença de poucas e tímidas projeções de membrana tipo filopódios e lamelipódios.
Notam-se, também, as estruturas denominadas “ruffles” na membrana celular, que
são comumente encontradas em macrófagos ativados, que sugerem sofrimento
celular.
A
B
Figura 16. Eletrofotomicrografia das células HeLa. As fotos foram obtidas a partir de microscópio
de varredura. As setas verdes evidenciam filopódios, as brancas, os lamelipódios e as vermelhas, os
“ruffles”. A – HeLa, ampliação de 1360x. B – HeLa com EAF, ampliação de 1360x
RESULTADOS
59
4.2.6 Fragmentação nuclear nas células HeLa causada pelo extrato aquoso da
folha de M. megalantha.
Até o dado momento, os resultados antiproliferativos obtidos com as células
HeLa, indicam que o EAF induz a morte celular destas células. Um dos eventos
típicos da morte celular por apoptose é a fragmentação do núcleo. Com o intuito de
investigar possíveis fragmentações nucleares, as células foram incubadas sob
lamínulas na ausência ou presença de EAF (0,5 mg/mL) por 24 horas, fixadas com
paraformaldeído e coradas com DAPI, um marcador nuclear, e então visualizadas
em um microscópio de fluorescência. De acordo com a figura 17A, pode-se observar
que as células HeLa controle, apresentaram núcleo intacto, arredondado e sem
fragmentação nuclear. Já as células HeLa submetidas a tratamento com EAF
apresentaram fragmentação nuclear significante (indicada pelas setas brancas na
figura 17B), indicando que este extrato induz a morte das células HeLa pela via da
apoptose.
RESULTADOS
60
.
Figura 17. Imagens de microscopia de fluorescência das células HeLa coradas com DAPI. As
fotografias foram obtidas em de microscópio de fluorescência. As setas brancas evidenciam
fragmentação nuclear e condensação de cromatina. A – HeLa, ampliação de 40x. B – HeLa com EAF,
ampliação de 40x.
RESULTADOS
61
4.2.7 Detecção e quantificação de células apoptóticas induzidas pelo extrato
aquoso da folha de M. megalantha
Para a identificação e quantificação de células da linhagem HeLa em
apoptose, após o tratamento com EAF (0,50 mg/mL) por 24 horas, foram realizadas
análises por citometria de fluxo. Para tal, as células foram marcadas com anexina VFITC e/ou iodeto de propídio e depois submetidas às análises. Na figura 18 pode-se
observar a influência de EAF sob as células HeLa. Para cada resultado de
citometria, têm-se quatro quadrantes. No quadrante I cada ponto representa uma
célula que não está em processo apoptótico, ou seja, células viáveis marcadas
negativamente para iodeto de propídio e anexina-V. No quadrante II encontram-se
as células marcadas somente com anexina-V, representando as células em
apoptose inicial. Já no quadrante III estão representadas as células marcadas
apenas com iodeto de propídio, representando células que estão passando por
processo de necrose. Por último, no quadrante IV, observam-se as células que
estão em apoptose tardia (marcadas com anexina V-FITC e iodeto de propídio).
Na figura 18A observa-se o resultado da citometria para as células HeLa na
ausência de EAF (grupo controle). Nesta situação, pode-se perceber que 98,5% das
células não estão em processo apoptótico. Na figura 18B têm-se os dados de
quando as células HeLa foram tratadas com EAF 0,50 mg/mL. Pode-se perceber
que na presença de EAF o número de células viáveis foi de apenas 70,84%,
enquanto que o número de células marcadas positivamente para anexina V-FITC foi
de 27,10%, o que indica que a atividade antiproliferativa de EAF acontece pela
indução de apoptose nas células HeLa.
Devido à indicação de que EAF induz apoptose, as células foram incubadas
com o extrato na presença de 20 mM do inibidor geral de caspases (Z-VAD-FMK) e
após 24 horas, foram analisadas por citometria de fluxo. Na figura 18C pode-se
observar que o inibidor não influenciou o percentual de células marcadas
positivamente para anexina V (células em apoptose inicial), indicando que EAF pode
estar promovendo a morte celular por vias independentes de caspases.
RESULTADOS
62
Figura 18. Marcação das células HeLa com anexina V-FITC e iodeto de propídio. As células
HeLa foram tratadas com EAF 0,50 mg/mL por 24 horas. Os dados foram obtidos por citometria de
fluxo A – Citometria de fluxo das células controle. B – Citometria de fluxo das células com EAF 0,50
mg/mL. C – Citometria de fluxo das células com EAF 0,50 mg/mL na presença de 20 mM do inibidor
geral de caspase (Z-VAD-FMK).
4.2.8 Efeito do extrato aquoso da folha de M. megalantha na expressão de
proteínas relacionadas com a apoptose das células HeLa.
Para confirmação do efeito apoptótico de EAF por ativação da via
independente de caspase, foi realizado um western blot, onde foi analisada a
influência de EAF sobre os níveis da caspase-3. Além disso, outros westerns foram
realizados para visualização do comportamento de proteínas-chave envolvidas em
eventos de morte celular: Bcl-2 e Bax. Assim, as células HeLa foram cultivadas em
placas estéreis de 100 mm e estimuladas a se proliferarem na ausência (controle) ou
presença de EAF por diferentes tempos (6, 12, 18 e 24 horas). Após os tempos
determinados, as células foram submetidas à extração protéica total, como descrito
na seção de métodos. Nas figuras 19A e 19B, pode-se observar que a análise do
western blot revela que o tratamento das células HeLa com EAF não altera
significativamente a expressão de Bcl-2 e Bax, com exceção para Bax no tratamento
de 6 horas. Além disso, não foi observada a presença da caspase-3 ativa (dado não
mostrado), uma vez que o anticorpo utilizado era específico para a caspase-3
clivada (ativa). Este resultado reafirma que EAF induz a via de morte por apoptose
das células HeLa por uma via independente de caspase.
Estes resultados fizeram com que se fosse investigada uma via de morte
celular por apoptose independente de caspase, pela qual EAF poderia agir. Uma
RESULTADOS
63
proteína amplamente descrita em processos de apoptose independente de caspase
é a AIF (fator indutor de apoptose), motivo pelo qual foi escolhida para ser alvo de
estudo.
Quando se analisa as figuras 19A e 19B, pode-se observar que a presença
de AIF na região citosólica começa a ser evidenciada após 6h de exposição ao EAF
e que sua presença, nesta região, continua aumentando de forma tempodependente até o período de tratamento de 18h. Apesar da presença de AIF ainda
ser detectada após 24 horas de tratamento, é evidente um decréscimo significativo
em sua quantidade nesta região celular.
Os dados aqui obtidos pelas análises de citometria de fluxo e de western blot
indicam que EAF induz a morte celular de HeLa por apoptose de forma
independente de caspases e que a liberação de AIF parece ser o principal
mecanismo pelo qual este EAF induz a morte celular das células HeLa.
Figura 19. Efeitos de EAF na expressão de proteínas envolvidas na morte celular. Quantidades
iguais de proteína (50 µg) do lisado celular total foram submetidas à análise por western blot para
detecção de β-actina, Bax, Bcl-2 e 50 ug de proteínas citosólicas foram submetidas à análise por
western blot para detecção de AIF (A). O gráfico da expressão relativa das proteínas (B) foi obtido
como descrito em Métodos na seção 3.2.3.7.
DISCUSSÃO
64
5 DISCUSSÃO
As plantas parecem ter sido usadas como remédios desde o principio da
existência do homem, talvez até mesmo por ancestrais da espécie humana
(SIMÕES et al, 1986). Além disso, elas são usadas por outras espécies
contemporâneas para este fim como chipanzés e cachorros domésticos.
Farmacologicamente, a explicação para tal se dá devido à diversidade de
metabolitos primários (proteínas, carboidratos e lipídeos) e secundários (como
compostos fenólicos, terpenóides, óleos essenciais e alcalóides) que são
sintetizados pelos vegetais (BALADRIN et al., 1985; BALADRIN, 1993; DI STASI,
1995).
São estes os metabólitos responsáveis pelas mais diversas atividades
farmacológicas dos vegetais. E desde muito cedo já se tinha um conhecimento de
que as porções vegetativas das plantas apresentavam eficácia medicinal diferente.
Este fato inicialmente observado por aqueles que manipulavam as plantas para fins
medicinais foi explicado no decorrer do tempo com o avanço das técnicas de
isolamento, purificação e caracterização estrutural de moléculas encontradas em
seres vivos, inclusive vegetais e atualmente esse fato é explicado devido à presença
dos metabolitos em diferentes concentrações nas diferentes partes dos vegetais
(SANTOS, 2000).
Tendo isto em mente, neste trabalho a planta Marsdenia megalantha foi
separada em três porções: caule, folha e raiz e a partir destas foram obtidos três
extratos aquosos, denominados respectivamente de EAC, EAF e EAR. Optou-se
por extratos aquosos porque a estrutura do laboratório onde foram realizados os
experimentos está adaptada para estes, e também, porque há relatos que mostram
extratos aquosos de espécies do gênero Masdenia apresentando atividade
antitumoral (HAYASHI et al., 1981; WANG et al., 2006).
Os extratos obtidos foram analisados quanto ao seu teor de carboidratos e
de proteínas. Com relação a estas, não foi detectável a sua presença pela
metodologia utilizada. Não existem proteínas solúveis em água em M. megalantha?
Acredita-se que sim e que provavelmente a metodologia de obtenção dos extratos
não favoreceu a extração destas biomoléculas. Com relação à quantidade de
polissacarídeos, verificou-se que varia entre os extratos e é maior no EAC. A
especialização de tecidos e órgão vegetais como armazenadores de carboidratos é
DISCUSSÃO
65
bastante conhecida e exemplos presentes no cotidiano das pessoas são fáceis de
elencar, como cenoura, cana-de-açúcar e batata doce.
Seria o caule de M.
megalantha um órgão de armazenamento de polissacarídeos solúveis em água? Os
dados na literatura são escassos com relação às mais diversas características,
inclusive morfofisiológicas, do gênero Marsdenia e, conseqüentemente, da M.
megalantha, portanto, usar este argumento para explicar o resultado encontrado
seria pura especulação. Espera-se que com o avanço dos estudos de outros grupos
de pesquisa, referentes à espécie M. megalantha, se possa ter mais dados que
ajudem a explicar os resultados obtidos neste trabalho.
Outro metabólito analisado no presente trabalho foram os compostos
fenólicos.
Verificou-se que EAF apresentou aproximadamente o dobro da
concentração deste constituinte em relação à EAR e EAC. Folhas são
frequentemente alvo de predadores além de estarem expostas diretamente a
radiação solar. Os compostos fenólicos são uma das principais ferramentas de
defesa utilizadas pelos vegetais contra a herbivoria, ataques parasitários e raios
ultravioletas (CARRAPIÇO, 1998; SANTOS, 1998), o que explicaria este mais alto
teor de compostos fenólicos em EAF.
Atualmente, muitos trabalhos científicos baseiam-se na busca de compostos
naturais que apresentem algum potencial farmacológico e, no reino vegetal, vários
extratos e compostos já foram relatados por apresentarem propriedades,
principalmente, antioxidante e antiproliferativa (GOTOH et al., 2004; OZEN;
DEMIRTAS; AKSIT, 2011). Assim os extratos de M. megalantha foram submetidos a
ensaios in vitro para a avaliação de suas possíveis atividades antioxidante,
anticoagulante e antiproliferativa.
O teste da capacidade antioxidante total (CAT) avalia a habilidade que uma
amostra tem em doar elétrons, ou seja, se oxidarem e assim neutralizar espécies
reativas, como EROs. Os dados obtidos mostraram que todos os extratos
apresentaram esta atividade e que EAF foi o mais potente. Tanto polissacarídeos
como compostos fenólicos poderiam ser os responsáveis por esta atividade devido
principalmente a sua capacidade redox, o que os permite atuar como agentes
redutores (AGUIRRE et al., 2009; CHANG; HSU; CHEN, 2010; FEJES et al., 2000;
KARDOŠOVÁ; MACHOVA, 2006; LIN et al., 2009; LUO et al., 2010; YANG et al.,
2007). Contudo quando se realizou análises de correlação entre o CAT e a
quantidade destes compostos nos extratos, foi observada uma forte correlação (r =
DISCUSSÃO
66
0,9966) entre os compostos fenólicos e os valores do CAT. Já com relação aos
açúcares este fato não foi observado (r = -0,3279). Estes dados de correlação
mostram que os compostos fenólicos são os principais responsáveis pela atividade
antioxidante dos extratos observada no teste de CAT.
O ensaio do poder redutor também avalia a capacidade da amostra em doar
elétrons. Neste ensaio, EAF apresentou a melhor atividade antioxidante frente aos
demais extratos, no entanto esta diferença de atividade foi menos pronunciada do
que a observada no CAT.
Apesar do CAT e do ensaio do poder redutor avaliarem a capacidade de
uma amostra em doar elétrons, estes testes são realizados em condições de reação
diferentes, o que afeta a capacidade da amostra em atuar como agente redutor.
Desta forma pode-se obter resultados discrepantes entre estes dois testes, mesmo
utilizando amostras iguais, como ocorreu para o EAC, que apresentou uma atividade
bem mais pronunciada no segundo teste. Corroboram com esta hipótese os dados
apresentados por Costa e colaboradores, que trabalhando com extratos de onze
espécies de algas marinhas verificou que aquele obtido da alga Gracilaria caudata
apresentava maior atividade no CAT, mostrando um valor quase duas vezes maior a
aqueles obtidos com as demais algas. Entretanto, sua atividade no teste do poder
redutor foi menor do que aquela observada para o extrato de outras sete algas
(COSTA et al., 2010).
Os dados observados com EAF também apontam para hipótese de que este
extrato apresenta os mesmos compostos fenólicos encontrados em EAC, haja visto
que estes extratos apresentaram atividades semelhantes no teste do poder redutor.
Além disso, EAF parece apresentar outros compostos fenólicos que não estão
presentes, pelo menos na mesma concentração, em EAC, o que explicaria a maior
atividade no CAT exibida por EAF. Contudo, isto são apenas hipóteses que
precisam ser comprovadas pela identificação dos diferentes tipos de compostos
fenólicos encontrados nos extratos aquosos de M. megalantha.
Um agente antioxidante pode atuar não somente como doador de elétrons,
mas também, como sequestrador de substâncias reativas. Um dos grupos de
agentes antioxidante mais procurado é aquele que tem a capacidade de sequestrar
o radical hidroxila, uma vez que este radical é extremamente reativo e danoso. O
radical hidroxila pode, por exemplo, subtrair átomos de hidrogênio de grupos tióis de
moléculas biológicas e formar radicais sulfidrilas, que por sua vez são capazes de se
DISCUSSÃO
67
combinar com o oxigênio e gerar radicais oxisulfidrilas, capazes de danificar
severamente outras moléculas biológicas (SUDHAKAR, 2008; VALKO et al., 2007).
Os resultados obtidos pelos extratos de M. megalantha no teste de sequestro do
radical hidroxila não foram animadores. No entanto, é possível que existam
moléculas nos extratos capazes de seqüestrar o radical hidroxila, mas que se
encontram em pequenas quantidades, e que por isso não tiveram sua atividade
detectada. Espera-se que no futuro com a aplicação de passos de separação e
purificação dos compostos bioativos encontrados nestes extratos, se possa
comprovar ou não esta hipótese.
Outra maneira de se prevenir os danos ocasionados pelo radical hidroxila é
suprimindo a sua formação, por exemplo, através do sequestro do ânion superóxido
(QI et al., 2005a). A reatividade do ânion superóxido é muito baixa e seus efeitos
biológicos estão associados ao seu efeito indireto na produção do mais reativo dos
EROs, o radical hidroxila (VALKO et al., 2007). Portanto, sequestrando-se o ânion
superóxido, indiretamente evita-se os danos ocasionados pelo radical hidroxila.
A atividade seqüestradora do ânion superóxido foi detectada em EAF e EAC.
Todavia, EAF apresentou uma capacidade em seqüestrar esse radical em cerca de
80% na concentração de 0,8 mg/mL, enquanto EAC, na mesma concentração,
mostrou uma atividade de apenas 10%. Além disso, EAC não apresentou atividade
nas concentrações entre 0,1 e 0,6 mg/mL. O coeficiente de correlação entre a
quantidade de compostos fenólicos e esta atividade foi determinado e o resultado
mostrou um r = 0,9502, já quando se comparou com a quantidade de açúcares totais
observou-se um r = -0,0997. Apesar dos ensaios antioxidantes de vários trabalhos
da literatura, realizados com polissacarídeos ácidos ou neutros obtidos de espécies
vegetais, mostrarem que estes compostos apresentam capacidade de seqüestrar o
radical superóxido (LIN et al., 2009), neste trabalho está evidente que estas
biomoléculas não conferem aos extratos de folha e caule esta atividade. Pelo
contrário, dada a correlação estabelecida entre compostos fenólicos e sequestro do
superóxido, pode-se deduzir que são estas biomoléculas as responsáveis pela
atividade observada.
Quelação é a formação de um complexo envolvendo íons metálicos, no qual
o íon metálico está associado com um doador de elétrons denominado de ligante
(FLORA, 2009; FLORA; PACHAURI, 2010). A atividade de quelação de íons ferro é
uma propriedade bastante interessante para um extrato ou composto, uma vez que
DISCUSSÃO
68
íons de ferro livre podem participar da reação de Fenton gerando radicais hidroxila
altamente reativos (JOMOVA et al., 2010).
Os resultados da capacidade de quelação de íons ferro pelos extratos de M.
megalantha revelaram que EAC, EAF e EAR apresentaram atividade quelante
(figura 12). No entanto, mais uma vez EAF apresentou melhores resultados quando
comparado aos demais extratos. Não foram observadas correlações fortes entre a
atividade quelante dos extratos e seus constituintes polissacarídicos ou fenólicos (r =
0,4991 e r = 0,5904, respectivamente).
O que indica a presença de outras
moléculas que também estariam atuando como antioxidantes por serem quelantes
de metal, estudos futuros poderão comprovar esta hipótese.
A literatura disponível sobre estudos que comparem extratos obtidos de
diferentes tecidos vegetais que englobem em único trabalho as porções caule, folha
e raiz são muito escassas, tornando-se assim muito difícil se estabelecer uma
comparação ou relação entre os resultados encontrados nesse trabalho e os
resultados existentes na literatura. No entanto, vale ressaltar que extratos aquosos
obtidos de caule, folha e/ou raiz em artigos diferentes mostram que os extratos
obtidos a partir de M. megalantha apresentam considerável capacidade antioxidante.
Além disso, nestes trabalhos, os autores associam a atividade observada,
principalmente, aos compostos fenólicos representados em suas diversas formas
(AIYEGORO, 2009; CHEN, 2007; DORMAN, 2003; FEJES, 2000; JIMOH,
ADEDAPO, AFOLAYAN, 2010; OZEN; DEMIRTAS; AKSIT, 2011; SREELATHA;
PADMA, 2009; ZENG, 2011).
Os resultados obtidos para a atividade antioxidante avaliada para os extratos
aquosos do caule, folha e raiz de M. megalantha indicam que estes extratos
apresentam diferentes atividades antioxidantes em diferentes sistemas de avaliação.
Além disso, o conteúdo de compostos fenólicos e carboidratos, bem como as
atividades antioxidantes variaram de acordo com o tecido do qual os extratos foram
obtidos. Uma correlação moderada entre a quantidade de compostos fenólicos e a
atividade antioxidante de alguns testes indica que estes compostos contribuem
significativamente na capacidade antioxidante dos extratos aquosos de M.
megalantha. Entretanto, outras substâncias antioxidantes podem desempenhar
papel importante na capacidade antioxidante de plantas.
No presente estudo também se investigou o potencial dos extratos aquosos
de M. megalantha em alterar a proliferação das células da linhagem tumoral do colo
DISCUSSÃO
69
do útero humano (HeLa). O câncer cervical é um grave problema de saúde pública.
Em todo o mundo, a cada ano, em torno de 500.000 mulheres apresentam esse tipo
de câncer e quase 274.000 destas morrem acometidas dessa doença (WHO, 2009).
É também considerado o segundo tipo mais comum de câncer entre as mulheres e o
tipo mais comum em mulheres de países subdesenvolvidos e em desenvolvimento
(WHO, 2010).
As células da linhagem HeLa, quando cultivadas na presença dos extratos
de M. megalantha, apresentaram uma diminuição na sua proliferação (figura 13).
Todos os extratos apresentaram uma atividade dose-dependente, sendo que o EAF
teve maior destaque, chegando a inibir em torno de 80% da proliferação celular, na
concentração de 1,0 mg/mL. Não houve correlação entre o efeito antiproliferativo
dos extratos e seus conteúdos de açúcares totais (r = 0,1543). Porém, quando se
observa o conteúdo de compostos fenólicos encontra-se uma forte correlação
positiva entre estes dois parâmetros avaliados (r = 0,8410). Os compostos fenólicos
presentes em extratos vem recentemente sendo indicados como agentes
antiproliferativos, como mostrou o trabalho de Chon e colaboradores (2009). Neste
trabalho os autores observaram que houve uma elevada correlação entre a
quantidade de compostos fenólicos presentes nos extratos e as atividades avaliadas
(CHON et al., 2009).
O EAF também se mostrou efetivo contra outras linhagens tumorais (PC-3,
PANC-1, HL-60 e 786-0). Contudo, o seu efeito antiproliferativo frente a células
destas linhagens não foi maior do que aquele observado com as células HeLa. Estes
dados indicam que o efeito antiproliferativo de EAF também é dependente do tipo
celular. Parece que esta atuação seletiva em diferentes linhagens de células
tumorais possa ser uma característica de extratos obtidos de plantas. Gotoh e
colaboradores, em 2004, obtiveram extratos da raiz e folha de Rhinacanthus nasutus
e observaram que esses extratos, quando submetidos frente a linhagens tumorais,
inibiram a proliferação das células HeLa, PC-3 e T24 de forma diferenciada (GOTOH
et al., 2004). Resultado semelhante foi observado por Cheng-Yun, em 2008, quando
trabalhando com um extrato aquoso da folha de Cordyceps militaris observou que
este apresentava um efeito antiproliferativo diferenciado frente a diferentes linhagens
tumorais de mama (MCF-7 e MDA-MB-231), sendo maior sobre a linhagem MDAMB-231 (CHENG-YUN, 2008).
DISCUSSÃO
70
Tendo em vista o efeito antiproliferativo que EAF exerceu sobre as células
HeLa, pôde-se deduzir que alguma via de morte celular estava sendo ativada. E
para que esse processo fosse melhor compreendido foram realizados outros
ensaios.
A morte celular pode ser classificada de acordo com a aparência
morfológica,
critérios
enzimológicos,
aspectos
funcionais
ou
características
imunológicas celular. A análise da morfologia celular é uma ferramenta rápida e
importante na diferenciação dos diferentes tipos de morte celular: apoptose,
necrose, autofagia, dentre outros (KROEMER, 2009; MELINO, 2001).
A análise das alterações morfológicas de células da linhagem HeLa, por
diferentes tipos de microscopias, após estas serem submetidas ao EAF indica que
este extrato tem seu efeito na morte celular via ativação da apoptose (figuras 15, 16
e 17). Apesar destes resultados apresentarem fortes indícios de que a via apoptótica
estava sendo ativada, outros ensaios para análise de caracteres moleculares foram
necessários para o respaldo dos resultados obtidos por microscopia.
Para confirmar se EAF estava sendo responsável pela apoptose de células
da linhagem celular HeLa, estas foram incubadas com anexina V-FITC e iodeto de
propídio, na presença ou não do extrato, e analisadas por citometria de fluxo. O
ensaio com anexina V avalia a passagem de fosfolipídios da face interna para a face
externa da membrana plasmática, um evento tipicamente associado com apoptose
(SHU-JING WU et al., 2004).
Os dados da citometria confirmaram que EAF induz morte celular por induzir
apoptose. A análise da citometria de células da linhagem HeLa, na presença de EAF
e do inibidor geral de caspase (Z-VAD-FMK), bem como a análise de “Western blot”
mostraram que EAF não promoveu a ativação de caspases (figuras 18 e 19). Além
disso, EAF não alterou os níveis de Bcl-2. Contudo, o nível de Bax aumentou seis
horas após a exposição ao EAF, diminuindo posteriormente, o que indica uma
alteração mitocondrial. Estes dados levaram a se descartar a via extrínseca de
ativação da apoptose e direcionar os estudos para a via intrínseca mitocondrial.
Análises sistemáticas revelam que a mitocôndria libera para o citoplasma
todas as proteínas solúveis presentes no espaço intermembranar quando há
formação de poros na sua membrana externa. Várias dessas proteínas apresentam
atividade pró-apoptótica. No entanto, dentre essas proteínas, apenas o fator indutor
de apoptose (AIF) atua em uma via independente de caspase (KROEMER, 2007;
DISCUSSÃO
71
PATTERSON et al., 2000). Sendo assim, por Western blot, essa proteína foi
analisada nas células da linhagem HeLa tratadas com EAF. De acordo com a figura
19, pode-se perceber que houve um aumento na quantidade de AIF na fração
citosólica de forma tempo-dependente.
Sendo assim, pode-se deduzir que EAF atua nas células da linhagem HeLa
induzindo morte celular por apoptose através de uma via independente de caspases,
ao ativar a via intrínseca mitocondrial e promover a liberação do AIF. Uma vez
liberado o AIF transloca-se para o núcleo onde induz fragmentação de DNA e
condensação de cromatina, e, consequentemente, as demais características
apoptóticas.
CONCLUSÃO
72
6 CONCLUSÃO
Os extratos aquosos do caule, folha e raiz obtidos de M. megalantha
apresentaram diferentes quantidades de carboidratos e compostos fenólicos, sendo
que a maior quantidade do primeiro foi encontrada em EAC e do segundo em EAF;
Os extratos apresentaram elevada capacidade redutora, pelo ensaio do
CAT, sendo o EAF o extrato com maior efeito. Além disso, EAF apresentou a melhor
atividade antioxidante frente aos demais extratos, quer doando elétrons, quelando
ou sequestrando radicais superóxido;
Nenhum extrato foi capaz de sequestrar o radical hidroxila e também não
apresentaram atividade anticoagulante frente aos ensaios de PT e aPTT;
Os extratos de M. megalantha, em especial EAF, mostraram alto potencial
antiproliferativo frente a linhagem celular tumoral de cólon uterino (HeLa);
EAF induz a morte das células pela ativação de apoptose por uma via
independente de caspase, ao ativar a via intrínseca mitocondrial e promover a
liberação do AIF.
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