UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS BIOATIVOS
ABRAHÃO ALVES DE OLIVEIRA FILHO
PARTICIPAÇÃO DA VIA DO ÓXIDO NÍTRICO E DO
CÁLCIO NO VASORRELAXAMENTO INDUZIDO PELO
FLAVONOIDE 5,7,4’-TRIMETOXIFLAVONA (TMF) EM
ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR DE RATO
João Pessoa
2012
ABRAHÃO ALVES DE OLIVEIRA FILHO
PARTICIPAÇÃO DA VIA DO ÓXIDO NÍTRICO E DO
CÁLCIO NO VASORRELAXAMENTO INDUZIDO PELO
FLAVONOIDE 5,7,4’-TRIMETOXIFLAVONA (TMF) EM
ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR DE RATO
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-graduação em Produtos
Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro
de Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Paraíba, como parte dos
requisitos para a obtenção do título de
MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E
SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de
concentração: FARMACOLOGIA
Orientador: Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros
João Pessoa
2012
O48p
Oliveira Filho, Abrahão Alves de.
Participação da via do óxido nítrico e do cálcio no vasorrelaxamento induzido
pelo flavonoide 5,7,4-trimetoxiflavona (TMF) em artéria mesentérica superior de
rato/ Abrahão Alves de Oliveira Filho. - - João Pessoa: [s.n.], 2012.
110f. : il.
Orientador: Isac Almeida de Medeiros.
Dissertação (Mestrado)-UFPB/CCS.
1. Produtos naturais. 2. Praxelis clematidea. 3. Cálcio. 4. Artéria mesentérica. 5.
Vasorrelaxamento. 6. Óxido nítrico.
UFPB/BC
CDU: 547.9(043)
ABRAHÃO ALVES DE OLIVEIRA FILHO
PARTICIPAÇÃO DA VIA DO ÓXIDO NÍTRICO E DO
CÁLCIO NO VASORRELAXAMENTO INDUZIDO PELO
FLAVONOIDE 5,7,4’-TRIMETOXIFLAVONA (TMF) EM
ARTÉRIA MESENTÉRICA SUPERIOR DE RATO
Aprovado em ____/____/____
Banca examinadora
_________________________________________________
Prof. Dr. Isac Almeida de Medeiros
(Universidade Federal da Paraíba)
Orientador
_________________________________________________
Profª. Drª. Sandra Rodrigues Mascarenhas
(Universidade Federal da Paraíba)
Examinadora Interna
_________________________________________________
Prof. Dr. Márcio Roberto Viana dos Santos
(Universidade Federal de Sergipe)
Examinador Externo
Dedicatória
Dedico esta conquista às pessoas mais importantes da minha vida:
Aos meus pais, Raquel e Abrahão, pelo
amor, carinho, apoio e dedicação fornecida ao
longo de toda a minha vida, buscando sempre o
melhor para a minha carreira profissional.
Aos meus irmãos, Vitor e Vinícius, pela
amizade e apoio incondicionais, meus eternos
companheiros de jornada.
Ao meu tio, Normando, pelo exemplo de
coragem, profissionalismo e dedicação, que me
incentivou a lutar sempre em busca do melhor.
A minha namorada, Heloísa, pelo amor,
companhia e compreensão, que foram essenciais
para que eu conquistasse esta grande vitória. Com
certeza sem ter você ao meu lado, eu não estaria
concluindo este trabalho.
Agradecimentos
A Deus, por ter me concedido a oportunidade de viver e desfrutar a
minha linda família e amigos. Obrigado Senhor por estar sempre ao meu lado nos
momentos que mais precisei e por mais esta vitória em minha vida.
Ao meu orientador, Prof. Isac Almeida de Medeiros, pela oportunidade,
orientação e confiança em mim depositada.
Ao Prof. José Maria Barbosa Filho e a sua ex-aluna de doutorado, a
Profª. Gabriela Lemos de Azevedo Maia, que não mediram esforços para
tornar possível a realização deste trabalho, disponibilizando-me, sem empecilho,
o flavonoide, que foi o foco do meu mestrado.
Aos professores Sandra Mascarenhas e Márcio Roberto, por terem
aceitado participar da banca de defesa do meu mestrado, contribuindo
significativamente para o meu trabalho.
À equipe do Laboratório de Farmacologia Cardiovascular: Aurylenne
Carlos, Bruna Priscilla, Fabíola Furtado, Islânia Araújo, Jaciclene, José George,
Josimara, Juliane, Kívia, Lays, Leônidas, Marden, Maria Angélica, Maria do
Carmo, Maria do Socorro, Melissa Luciano, Mônica Almeida, Natália Tabosa,
Priscila Maria, Priscila Crispiniano, Thais Josy, Thais Porto, Thyago Queiroz e
Valéria Assis, e aos professores Robson Veras, Valdir Braga e Darizy Flávia; por
toda a ajuda, pela partilha de conhecimentos e companheirismo durante todo
este tempo.
Aos meus eternos amigos do peito e “equipe de apoio”: Carminha,
Fabíola, Natália, Thyago e Raline, que nunca me negaram uma ajuda ou uma
palavra de conforto, mesmo quando eu ligava várias vezes, com toda a minha
insegurança, para discutir os mesmos resultados e chamava todo mundo para
escutar os meus demorados ensaios de defesa. Com certeza, sem vocês do meu
lado, esse mestrado não teria sido o mesmo.
À Thais Josy, minha grande companheira de experimentos, com quem
tive o privilégio de dividir, com muita alegria, dois importantes momentos da
minha vida: o meu primeiro ano de iniciação científica e o meu segundo ano de
mestrado. Durante todo este tempo, sempre percebi que ali do meu lado existia
não só uma amiga, mas também um exemplo de profissional competente e
decidida em alcançar sempre o sucesso.
À Kivia Sales, que caminhou ao meu lado durante estes dois anos,
torcendo sempre pela minha vitória e me ajudando não só na parte experimental,
mas também nos momentos turbulentos da pesquisa, com palavras de conforto e
amizade.
À Lays, minha aluna de iniciação científica, que me acompanhou na
realização deste trabalho, dividindo os momentos de estudo, descontração e
realização dos experimentos.
À Aldeídia de Oliveira, por todos os ensinamentos transmitidos,
amizade e torcida, que foram indispensáveis para a realização do meu mestrado.
À Islânia, pela amizade, força e disposição em ajudar, sempre quando
necessário.
À Profª Inês, que mesmo nos bastidores, me incentivou sempre a
caminhar na linha da pesquisa e buscar o melhor para a minha carreira
profissional.
À minha turma do Mestrado, em especial: Paula, Fagner, Felipe,
Viviane, Jacqueline, Ítalo, Patrícia, Hellane, Juliana Carreiro, Juliana
Moura, Gregório, Dayenne, Ana Paula, Otemberg, Jéssica, Madalena,
Jeane, Ricardo, Rafaela e Sara; que dividiram comigo alguns dos momentos
mais especiais na minha vida, como os estudos durante as disciplinas e as
comemorações após cada sucesso no mestrado. Com certeza, desta turma sairão
excelentes pesquisadores.
À Valéria, Milena e George, meus companheiros da Farmacologia
Cardiovascular, por toda a ajuda dedicada durante estes dois anos.
À Tatiana de Oliveira Apolinário, minha prima do coração, que mesmo
distante, contribuiu para a realização desta vitória.
Aos meus amigos da Fitoquímica, Viviane Medeiros, Marcelo, Ana
Silvia, Jaqueline, Ana Lúcia, Daysiane, Fábio, Isis e Thaísa, que sempre me
receberam em seus laboratórios, independente das circunstâncias, com muita
alegria e descontração.
À Anne Dayse e Natália Alcântara, que dividiram comigo as várias
fases do meu crescimento intelectual, estando sempre ao meu lado para dar
força, coragem e me incentivar a concluir este trabalho da melhor forma
possível.
Aos meus amigos de graduação, Eduardo, Camilla, Carol Lianza e
Diogo, que sempre torceram pelo meu sucesso e, até hoje, se fazem presentes,
independente dos diferentes caminhos escolhidos.
À Juliana Ramos e Luana, pela amizade e estímulo que me deram
durante toda essa jornada.
Ao companheiro Crispim
Duarte, que sempre desempenhou suas
obrigações de uma maneira exemplar, nunca medindo esforços em auxiliar a todos
que precisaram da sua ajuda.
As funcionárias Mônica Rodrigues e Dona Maria, com quem tive o prazer
de dividir, sempre com muita alegria, vários inícios de manhãs dos meus dias; e
aos funcionários Luiz Cordeiro e Adriano Cordeiro, por todo o trabalho,
proporcionando nosso melhor bem-estar.
A todos os professores do mestrado, pelos ensinamentos transmitidos
durante as disciplinas.
À Coordenação e aos funcionários do Programa de Pós-graduação em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, pela competência, seriedade e apoio.
Ao CNPq, CAPES, LTF e UFPB pelo apoio financeiro e estrutural para o
desenvolvimento deste estudo.
“Nas grandes batalhas da vida, o primeiro passo para a vitória é o desejo de
vencer.”
(Mahatma Gandhi)
Resumo e Abstract
RESUMO
OLIVEIRA FILHO, A. A. Participação da via do óxido nítrico e do cálcio no
vasorrelaxamento induzido pelo flavonoide 5,7,4’-trimetoxiflavona (TMF) em
artéria mesentérica superior de rato. 2012. 11p. Dissertação (Mestrado em
Farmacologia de Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos), Centro de Ciências da
Saúde, Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, 2012.
Os efeitos farmacológicos do extrato etanólico (EPC), fase clorofórmica (FPC) e
5,7,4’-trimetoxiflavona (TMF) provenientes de Praxelis clematidea, sobre anéis de
artéria mesentérica superior de ratos, foram estudados. Experimentos de tensão
isométrica revelaram que EPC e FPC (0,001–1000 µg/mL) promoveram relaxamento
dependente de concentração em anéis mesentéricos, com endotélio funcional (CE50
= 27,2 ± 6,4 µg/mL; 41,9 ± 11,8 µg/mL, respectivamente, n=7), e estes efeitos foram
atenuados após a remoção do endotélio vascular (CE50 = 141,9 ± 19,4 µg/mL, 167,0
± 30,6 µg/mL, respectivamente, n=7), sugerindo que ambos possuem metabólitos
secundários vasorrelaxantes. O TMF (10-12 a 10-3 M), composto majoritário isolado
de FPC, promoveu um relaxamento em anéis com endotélio intacto (pD2= 5,44±0,12,
n=6), de maneira dependente de concentração, com potência semelhante ao efeito
da quercetina, o flavonóide mais abundante no reino vegetal (pD2= 5,71±0,16, n=6).
Após a remoção do endotélio funcional a curva concentração-resposta para o TMF
foi deslocada para a direita, com uma diminuição da potência, porém sem alteração
no efeito máximo (pD2 = 4,50 ± 0,10, n=6). O relaxamento do flavonóide não foi
modificado pela pré-incubação de indometacina (10 µM). Entretanto, foi atenuado
após a pré-incubação de L-NAME (100 µM; pD2 = 4,52 ± 0,08, n=5), PTIO (300 µM;
pD2 = 4,62±0,09, n=5) e ODQ (10 µM; pD2 = 4,36 ± 0,11, n=5), e foi revertido em
preparações com endotélio funcional pré-incubadas com L-arginina (1mM) mais LNAME (100 µM) (pD2 = 5,85 ± 0,14, n=5). Demonstrando o não envolvimento dos
metabólitos da COX e a participação da via NOS/NO/CGs no relaxamento produzido
por TMF. A presença de KCl 20 mM (pD2 = 4,62 ± 0,08, n = 5) e TEA (3 mM;
pD2 = 4,28 ± 0,10, n=5), atenuou a resposta produzida por TMF, apenas em anéis
com endotélio vascular, demonstrando que este composto produz relaxamento por
meio ativação de canais para K+, dependente do endotélio. Além disso, a utilização
da Glibenclamida (10 µM) não modificou o efeito do TMF em anéis com endotélio
funcional, porém a pré-incubação de 4-aminopiridina (1 mM; pD2 = 4,7 ± 0,08, n = 5),
e TEA (1 mM; pD2 = 4,48 ± 0,04, n=5) atenuaram a potência da resposta
vasorrelaxante do flavonóide, sugerindo o envolvimento dos canais para K+ do tipo
Kv e BKca. TMF promoveu relaxamento em anéis mesentéricos pré-contraídos com
KCl 60 mM e inibiu a vasoconstrição induzida pelo CaCl2 de maneira dependente de
concentração. O efeito máximo de TMF foi atenuado com a pré-incubação de
nifedipino (1 µM; Emáx = 56,0 ± 7,9%, n=5), indicando que a vasodilatação induzida
pelo flavonóide está relacionada com a inibição do influxo de Ca 2+ via Cav tipo L. Em
conclusão, estes resultados sugerem que o EPC, a FPC e o TMF induzem efeito
vasorrelaxante em anéis mesentéricos, e que a resposta produzida pelo flavonóide
envolve a via NOS/NO/CGs, com consequente ativação de canais para K+, e a
inibição do influxo de Ca2+ via canais para Cav tipo-L.
Palavras-chave: Praxelis clematidea, 5,7,4’-trimetoxiflavona, artéria mesentérica,
vasorrelaxamento, óxido nítrico, cálcio
ABSTRACT
OLIVEIRA FILHO, A. A. Participation of the nitric oxide and calcium pathway in
the vasorelaxant effect induced by flavonoid 5,7,4’-trimethoxyflavone (TMF) in
rat superior mesenteric artery. 2012. 11p. Dissertation (Master in Pharmacology of
Natural Products and Bioactive Synthetic), Centre for Health Sciences, Federal
University of Paraíba, João Pessoa, 2012.
The pharmacological effects of ethanol extract (EPC), chloroform phase (FPC) and
5,7,4'-trimethoxyflavone (TMF) from Praxelis clematidea on superior mesenteric
artery rings of rats, were studied. Isometric tension experiments revealed that EPC
and FPC (0.001 to 1000 µg/mL) promoted concentration-dependent relaxation in
mesenteric rings with functional endothelium (EC50 = 27.2 ± 6.4 µg/mL, 41.9 ± 11.8
µg/mL, respectively, n = 7), and these effects were attenuated after removal of the
vascular endothelium (EC50 = 141.9 ± 19.4 µg/mL,167.0 ± 30.6 µg/mL, respectively,
n = 7), suggesting that both are vasorelaxants secondary metabolites. The TMF
(10-12 to 10-3 M), composed mostly isolated FPC, promoted a relaxation in rings with
intact endothelium (pD2 = 5.44 ± 0.12, n = 6), concentration dependent manner, with
power similar to the effect of quercetin, a flavonoid abundant in the plant kingdom
(pD2 = 5.71 ± 0.16, n = 6). After removal of functional endothelium the concentrationresponse curve for the TMF was shifted to the right, with a decrease in potency, but
no change in maximal effect (pD2 = 4.50 ± 0.10, n = 6). The relaxation of the
flavonoid was not modified by pre-incubation of indomethacin (10 µM). However, it
was attenuated after pre-incubation of L-NAME (100 µM, pD2 = 4.52 ± 0.08, n = 5),
PTIO (300 µM, pD2 = 4.62 ± 0.09, n = 5 ) and ODQ (10 µM, pD2 = 4.36 ± 0.11, n = 5)
and was reversed in preparations with functional endothelium pre-incubated with Larginine (1 mM) plus L-NAME (100 µM) (pD2 = 5.85 ± 0.14, n = 5). Demonstrating
the non-involvement of COX metabolites and participation of the NOS/NO/CGs
pathway in the relaxation produced by TMF. The presence of 20 mM KCl (pD 2 = 4.62
± 0.08, n = 5) and TEA (3 mM; pD2 = 4.28 ± 0.10, n = 5) attenuated the response
produced by TMF only in rings with endothelium, demonstrating that this compound
produces relaxation through activation of K+ channels to endothelium-dependent. In
addition, the use of glibenclamide (10 µM) did not modify the effect of TMF on rings
with functional endothelium, but the pre-incubation of 4-aminopyridine (1 mM; pD2 =
4.7 ± 0.08, n = 5) and TEA (1 mM; pD2 = 4.48 ± 0.04, n = 5) attenuated the potency
of the flavonoid vasorrelaxant response, suggesting the involvement of the K+
channels to Kv and BKCa type. TMF relaxations in mesenteric rings pre-contracted
with 60 mM KCl and inhibited the vasoconstriction induced by CaCl2 concentration
dependent manner. The maximum effect of TMF was mitigated by pre-incubation of
nifedipine (1 µM, Emáx = 56.0 ± 7.9%, n = 5), indicating that the flavonoid-induced
vasodilation is related to the inhibition of the influx of Ca2+ via L-type Cav. In
conclusion, these results suggest that the EPC, the FPC and TMF inducing effect
vasorrelaxante in mesenteric rings, and that the response produced by the flavonoid
involves NOS/NO/CGs pathway, with consequent activation of channels for K+, and
inhibition of the influx Ca2+ channels via L-type Cav.
Keywords:
Praxelis clematidea, 5,7,4'-trimethoxyflavone,
vasorelaxation, nitric oxide, calcium
mesenteric
artery,
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática do mecanismo de contração na célula
muscular lisa vascular................................................................................................. 26
Figura 2 – Representação esquemática do mecanismo de relaxamento da célula
muscular lisa vascular................................................................................................. 28
Figura 3 - Foto de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson..............
30
Figura 4 - Estrutura química do flavonoide 5,7,4’-trimetoxiflavona ............................. 31
Figura 5 - Sistema de cubas e aquisição de dados de tensão isométrica para órgão
isolado.......................................................................................................................... 40
Figura 6 - Representação da verificação da viabilidade do órgão e da integridade
do endotélio vascular.................................................................................................... 41
Figura 7 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
dos efeitos de EPC (0,001 - 1000 µg/mL), FPC (0,001 - 1000 µg/mL) e TMF (10-12 –
10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos
com FEN (1 µM). A) Anéis com endotélio intacto; B) Anéis sem
endotélio....................................................................................................................... 43
Figura 8 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
dos efeitos de quercetina (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato, com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN
(1 µM)........................................................................................................................... 44
Figura 9 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
da participação dos metabólitos do ácido araquidônico no efeito induzido por TMF
em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional,
pré-contraídos com FEN (1µM).................................................................................... 45
Figura 10 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
da participação da NOS no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (1 µM).................................................................................................................
46
Figura 11 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
do envolvimento do NO no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (1 µM).................................................................................................................. 47
Figura 12 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
da participação da CGs efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (1 µM)................................................................................................................... 48
Figura 13 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
da participação dos canais para K+ no efeito induzido por TMF em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional, pré-contraídos com
FEN (1 µM).................................................................................................................. 49
Figura 14 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
da dos subtipos de canais para potássio no efeito induzido por TMF em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional, pré-contraídos
com FEN (1 µM).......................................................................................................... 50
Figura 15 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
da ativação direta dos canais para K+ no efeito induzido por TMF em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional, précontraídoscom FEN (1 µM)........................................................................................... 52
Figura 16 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
dos efeitos de TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem
endotélio funcional, pré-contraídos com solução despolarizante (KCl 60 mM).........
53
Figura 17 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
dos efeitos de TMF sobre as contrações induzidas por concentrações cumulativas
de CaCl2 (10-6 – 3 x 10-2) em meio despolarizante (KCl 60 mM) nominalmente sem
cálcio............................................................................................................................. 54
Figura 18 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação
do efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
sem endotélio funcional, pré-encubados com NIF (1 µM)............................................ 55
Figura 19 - Registros originais das respostas de EPC (0,01 – 1000 µg/mL) em
anéis pré-contraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua
remoção (B).................................................................................................................. 57
Figura 20 - Registros originais das respostas de FPC (0,01 – 1000 µg/mL) em anéis
pré-contraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção
(B)................................................................................................................................. 59
Figura 21 - Registros originais das resposta de TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis précontraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua
remoção (B).................................................................................................................. 61
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Composição da solução de Tyrode para artéria mesentérica ..................
37
Quadro 2 - Composição da solução de Tyrode livre de cálcio ....................................
37
Quadro 3 - Composição da solução de Tyrode com KCl a 20 mM .............................
37
Quadro 4 - Composição da solução de Tyrode com KCl a 60 mM .............................
38
Quadro 5 - Composição da solução de Tyrode com KCl a 60 mM nominalmente
sem cálcio.....................................................................................................................
38
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por EPC
(0,01 – 1000 µg/mL) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos com
endotélio intacto (●) ou endotélio ausente (○), pré-contraídos com FEN (1 µM)........... 58
Gráfico 2 – Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por FPC
(0,01 – 1000 µg/mL) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos com
endotélio intacto (●) ou endotélio ausente (○), pré-contraídos com FEN (1 µM)........... 60
Gráfico 3 - Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por TMF
(10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos com
endotélio intacto (●) ou endotélio ausente (○), pré-contraídos com FEN (1 µM)........... 62
Gráfico 4 - Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por TMF
(10-12 – 10-3 M) (●), e Quercetina (10-12 – 10-3 M) (▼) em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, pré-contraídos com
FEN (1 µM).................................................................................................................... 63
Gráfico 5 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por
TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com
endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de
indometacina (10 µM) (▼)............................................................................................. 64
Gráfico 6 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por
TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com
endotélio intacto, na ausência (●) e na presença de L-NAME (100 µM) (▼) ou (□) Larginina (1 mM) + L-NAME (100 µM), pré-contraídos com FEN (1 µM)....................... 65
Gráfico 7 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por
TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com
endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de
PTIO (300 µM) (▼)........................................................................................................ 66
Gráfico 8 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por
TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com
endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de
ODQ (10 µM) (▼).......................................................................................................... 67
Gráfico 9 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por
TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com
endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de
20 mM KCl (▼) (A) e na presença de TEA (3 mM) (♦) (B). ......................................... 68
Gráfico 10 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,
com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na
presença de glibenclamida (▼)..................................................................................... 69
Gráfico 11 -. Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,
com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na
presença de TEA (▼).................................................................................................... 70
Gráfico 12 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,
com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na
presença de 4-AP (▼)................................................................................................... 71
Gráfico 13 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,
sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (○) e na
presença de 20 mM KCl ( ) (A) e na presença de TEA (3 mM) ( ) (B)................... 72
Gráfico 14 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF (10-12 – 10-3 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,
sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (○) ou na
presença de 60 mM de KCl ( ).................................................................................... 73
Gráfico 15 - Curvas cumulativa para CaCl2 na presença de concentrações isoladas
de TMF, em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,sem endotélio
funcional......................................................................................................................... 74
Gráfico 16 - Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM) na ausência (○) e na presença de
nifedipino ( )................................................................................................................. 75
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AC
Adenilil ciclase
ACh
Acetilcolina
Akt
Proteína cinase B
AMPc
Monofosfato de adenosina cíclico
BKCa
Canal para potássio sensível ao cálcio de grande condutância
BAY K8644
CAM
S-(-)-1,4-diidro-2,6-dimetil-5-nitro-4-[2-(trifluorometil)fenil]-3Ácidopiridinecarboxilíco éster metílico
Calmodulina
Cav
Canais para cálcio sensível à voltagem
CaVL
Canais para cálcio sensível à voltagem tipo L
Ca2+
Cálcio
([Ca2+]i)
Concentração de cálcio intracelular
CE50
Concentração que promove 50% do efeito máximo de uma substância
CMLV
Célula muscular lisa vascular
CGs
Ciclase de guanilil solúvel
COX
Ciclooxigenase
DC
Débito cardíaco
EDHF
Fator hiperpolarizante derivado do endotélio
EDTA
Ácido etileno-diamino-tetracético
Emax
Efeito máximo
EPC
Extrato etanólico de Praxelis clematidea
e.p.m.
Erro padrão da média
eNOS
Enzima sintase de NO endotélial
ET1
Endotelina 1
FC
Frequência cardíaca
FEN
Fenilefrina
FPC
Fase clorofórmica de Praxelis clematidea
GMPc
Monofosfato de guanosina ciclíco
IP3
1,4,5-trisfosfato de inositol
K+
Potássio
KV
Canal para potássio sensível à voltagem
KATP
Canal para potássio sensível à voltagem
Kca
Canal para potássio sensível ao cálcio
L-NAME
NG-Nitro-L-arginina methil ester
MLCK
Cinase da cadeia leve da miosina
MLC20
Cadeia leve de miosina
N
Número de experimentos realizados
NOS
Enzima sintase de NO
NO
Óxido nítrico
NIF
Nifedipino
PGI2
Prostaciclinas
PA
Pressão arterial
pD2
Logaritmo negativo do valor de CE50
PKA
Proteína cinase A
PKC
Proteína cinase C
PKG
Proteína cinase G
PLC
Fosfolipase C
PTIO
2-fenil-4,4,5,5-tetrametilimidazolina-1-oxil-3-óxido
ROC
Canal de cálcio operado por receptores
RVPT
Resistência vascular periférica total
SERCA
Retículo endosarcoplasmático
SOC
Canal de cálcio operado por estoques
TEA
Tetraetilamônio
TMF
5,7,4’-trimetoxiflavona
TXA2
Tromboxano A2
VS
Volume sistólico
Observação: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não
constam nesta relação, encontram-se descritas no texto ou são convenções
adotadas internacionalmente.
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO.............................................................................................. 24
2
OBJETIVOS..................................................................................................
33
2.1
Gerais...........................................................................................................
33
2.2
Específicos.................................................................................................... 33
3
MATERIAL ...................................................................................................
35
3.1
Animais.........................................................................................................
35
3.2
Drogas e reagentes......................................................................................
35
3.3
Obtenção e preparação das drogas teste..................................................... 36
3.4
Soluções fisiológicas..................................................................................... 36
4
MÉTODOS..................................................................................................... 40
4.1
Preparação dos anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato......... 40
4.2
Protocolos experimentais utilizando anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato............................................................................................... 41
4.2.1
Verificação do efeito de EPC ou FPC ou TMF em anéis de artéria
mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN .................................. 42
4.2.2
Comparação do efeito de TMF e quercetina em anéis de artéria
mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN................................... 44
4.2.3
Investigação do mecanismo vasorrelaxante de TMF em anéis de artéria
mesentérica com endotélio vascular.............................................................. 45
4.2.3.1
Verificação da participação dos metabólitos da via do ácido araquidônico
no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato............................................................................................... 45
4.2.3.2
Verificação da participação da NOS no efeito induzido por TMF em anéis
de artéria mesentérica superior isolada de rato............................................. 46
4.2.3.3
Verificação do envolvimento do óxido nítrico no efeito induzido por TMF
em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato............................. 47
4.2.3.4
Verificação da participação da CGs no efeito induzido por TMF em anéis
de artéria mesentérica superior isolada de rato............................................. 48
4.2.3.5
Verificação da participação de canais para potássio (K+) no efeito induzido
por TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de rato............................ 48
4.2.3.6
Verificação da participação dos subtipos de canais para K + no efeito
induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de rato.............. 50
4.2.4
Investigação do mecanismo vasorrelaxante de TMF em anéis de artéria
mesentérica sem endotélio vascular.............................................................. 51
4.2.4.1
Verificação da ativação dos canais para K+ no efeito induzido pelo TMF
em anéis de artéria mesentérica isolada de rato........................................... 51
4.2.4.2
Verificação do efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato pré-contraídos com solução despolarizante de 60 mM de
KCl................................................................................................................. 52
4.2.4.3
Verificação do efeito de TMF sobre as concentrações induzidas por CaCl 2
em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato............................. 53
4.2.4.4
Verificação do efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato pré-encubados com um bloqueador de Cav tipo L................ 54
4.3
Análise estatística.......................................................................................... 55
5
RESULTADOS.............................................................................................. 57
5.1
Efeito de EPC, FPC e TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de
rato pré-contraídos com FEN........................................................................ 57
5.2
Comparação do efeito de TMF e quercetina em anéis de artéria
mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN.................................. 62
5.3
Efeitos de TMF em anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional..
5.3.1
Participação dos metabólitos da via do ácido araquidônico na resposta
vasorrelaxante induzida pelo TMF em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato................................................................................ 63
5.3.2
Participação da enzina NOS na resposta vasorrelaxante induzida pelo
TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.................... 64
5.3.3
Participação do NO na resposta vasorrelaxante induzida pelo TMF em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.................................. 65
5.3.4
Participação da CGs na resposta vasorrelaxante induzida pelo TMF em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.................................. 66
5.3.5
Participação dos canais para K+ na resposta vasorrelaxante induzida pelo
TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato.................... 67
63
5.3.6
Participação dos subtipos de canais para K+ no efeito induzido por TMF 69
em anéis de artéria mesentérica isolada de rato..........................................
5.4
Efeitos de TMF em anéis de artéria mesentérica sem endotélio funcional..
5.4.1
Ativação dos canais para K+ no efeito induzido pelo TMF em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato................................................. 71
5.4.2
Efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
pré-contraídos com solução despolarizante de 60 mM de KCl.................... 73
5.4.3
Efeito de TMF sobre as concentrações induzidas por CaCl2 em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato................................................. 74
5.4.4
Efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
pré-encubados com um bloqueador de Cav tipo L........................................ 75
6
DISCUSSÃO................................................................................................. 77
7
CONCLUSÃO...............................................................................................
90
8
PERSPECTIVAS..........................................................................................
92
REFERÊNCIAS...........................................................................................................
94
71
ANEXOS...................................................................................................................... 110
Introdução
24
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
1 INTRODUÇÃO
O sistema cardiovascular, o qual fornece e mantêm suficiente o fluxo
sanguíneo aos diversos tecidos do organismo de acordo com as suas necessidades
metabólicas, é o responsável pela regulação e manutenção da pressão arterial (PA),
uma das funções fisiológicas mais complexas do sistema biológico; necessitando da
ação
integrada
de
outros
sistemas
como
o
renal,
neural
e
endócrino
(CAMPAGNOLE-SANTOS; HAIBARA, 2001; LANFRACHI; SOMERS, 2002; INOUE
et al., 2006). Admite-se que alterações da PA, como as encontradas em várias
doenças cardiovasculares, resultariam da disfunção desses sistemas de controle
(IRIGOYEN et al., 2001).
A PA corresponde ao produto do débito cardíaco (DC) pela resistência
vascular periférica total (RVPT). O DC é definido como a quantidade de sangue
bombeado pelo coração a cada minuto, expresso como produto do volume sistólico
(VS, em mL) pela frequência cardíaca (FC, em batimentos/minuto). A RVPT por sua
vez, é determinada pelo tônus vascular e está diretamente envolvida no controle da
pressão arterial (OATES apud HARDMAN et al., 1996).
O tônus vascular das pequenas artérias e arteríolas, o qual é definido como
o estado de contratilidade das células musculares lisas vasculares (CMLV), é o
maior determinante da resistência ao fluxo sanguíneo na circulação (JACKSON,
2000) e consequentemente da pressão sanguínea sistêmica (CRIBBS, 2006).
Assim, o tônus vascular tem um importante papel na regulação da pressão arterial e
distribuição do fluxo sangüíneo entre os tecidos e órgãos do corpo (JACKSON,
2000). Estudos mostram que contratilidade das CMLV pode ser regulada pela
concentração de cálcio intracelular ([Ca2+]i), de modo que agentes vasodilatadores
exercem seus efeitos por diminuírem a [Ca2+]i. Já as substâncias vasoconstritoras
promovem seu efeito por elevarem a [Ca2+]i, bem como, aumentando a aparente
sensibilidade ao Ca2+ dos processos contráteis na célula muscular lisa (LEDOUX et
al., 2006).
O aumento da [Ca2+]i na CMLV pode ser alcançado por meio de ligação de
um agonista a um receptor que está acoplado à proteína G, estimulando a
25
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
mobilização do Ca2+ dos estoques intracelulares e permitindo o influxo de Ca2+ do
fluido extracelular. Assim, a ativação da fosfolipase C (PLC) e formação de 1,4,5trifosfato de inositol (IP3) medeiam primariamente a liberação do Ca2+ dos estoques
após uma ativação do receptor metabotrópico (BERRIDGE, 2003; VILLALBA et al.,
2007). No entanto, em vários vasos de resistência, a liberação sustentada da [Ca2+]i
é gerada por meio da entrada de Ca2+, induzida por agonista, através dos canais
voltagem dependentes (CaV): tipo-L sensíveis a diidropiridinas e tipo-T, como
também dos canais não ativados por voltagem (“non-voltage-gated”) que incluem os
canais de Ca2+ operados por estoques (SOC) e os canais de Ca 2+ operados por
receptor (ROC) (MCFADZEAN; GIBSON, 2002; VILLALBA et al., 2007).
A importância da entrada do cálcio pelos CaV do tipo-L nos miócitos
vasculares, sendo dominantes na maioria dos leitos vasculares, já foi comprovada
por vários estudos científicos (JACKSON, 2000). Os CaV do tipo-L são sensíveis a
1,4-diidropiridinas, uma ampla classe de fármacos, que tanto são ativadores (Bay K
8644), como bloqueadores (mimodipino, nisoldipino e nifedipino) do canal
(LACINOVÁ, 2005; NAVARRO-GONZALEZ et al., 2009). O nifedipino (NIF) age por
interferência alostérica no mecanismo básico de comporta do CaV do tipo-L, evitando
assim, o influxo de Ca2+ necessário para ativar a maquinaria contrátil da célula
(GODFRAIND, 1994; BROADLEY; PENSO, 2006).
Com a entrada de Ca2+, associado ao aumento da [Ca2+]i, há uma facilitação
da interação do complexo (Ca2+)4-CaM (calmodulina), que ao sofrer uma alteração
conformacional, ativa a cinase da cadeia leve da miosina (MLCK). Esta, por sua vez,
irá fosforilar a cadeia leve da miosina (MLC 20) favorecendo o deslizamento dos
filamentos de actina sobre os de miosina e gerando, consequentemente, a força de
contração do músculo liso (JOHNSON; SNYDER, 1995) (Figura 1).
26
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Agonistas
Canal de Ca2+ controlado por ligante
GPCR
Ca2+
Cav tipo L
Membrana
Plasmática
IP3
Ca2+
CaM
IP3R
Ca2+-CaM
Miosina
RS
Miosina-P
CONTRAÇÃO
Figura 1 - Representação esquemática do mecanismo de contração na célula muscular lisa
vascular via ligante. Fonte: RANG et al., 2007
O endotélio, que faz parte da camada íntima dos vasos sanguíneos, é o
maior regulador da homeostase vascular local, não apenas por regular a
permeabilidade vascular, mas também por controlar a contratilidade das CMLV e
com isso, o calibre dos vasos, de acordo com as demandas hemodinâmicas e
hormonais, mantendo, assim, a fluidez do sangue (BRUTSAERT, 2003; FÉLÉTOU;
VANHOUTTE, 2006). As células endoteliais executam estas funções pela
expressão, ativação e liberação de potentes substâncias (liberadas por nervos
autonômicos e sensoriais ou plaquetas), hormônios circulantes, autacoides e
citocinas, como também por estímulos físicos e químicos (mudanças na pressão,
estresse por cisalhamento e pH) (INAGAMI et al., 1995; FÉLÉTOU; VANHOUTTE,
2006).
Como exemplos de fatores vasoativos liberados pelo endotélio destacam-se:
os relaxantes, como por exemplo, o fator hiperpolarizante derivado do endotélio
(EDHF), as prostaciclinas (PGI2) e o óxido nítrico (NO), e os contracturantes, como
por exemplo, o tromboxano A2 (TXA2), o ânion superóxido (O2-.), a endotelina-1 (ET1)
e
a
angiotensina
II
(LÜSCHER;
VANHOUTTE,
1986;
VANHOUTTE, 1989; VANHOUTTE; FÉLÈTOU; TADDEI, 2005).
FURCHGOTT;
27
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Dentre os fatores relaxantes, o NO é uma importante molécula sinalizadora
implicada em diversos processos fisiopatológicos (SCATENA et al., 2010). Grande
parte das ações do NO é no sistema cardiovascular, onde este gás é continuamente
produzido pelas células endoteliais, a partir da conversão da L-arginina em NO pela
enzima sintase do óxido nítrico presente no endotélio (eNOS), em resposta a
estímulos mecânicos ou químicos, que podem agir por mobilização do Ca2+ ou por
outras proteínas como a proteína cinase B (Akt). O NO difunde-se da célula de
origem, passando facilmente através das membranas das células vizinhas,
regulando uma série de efeitos fisiológicos (GATH; RADI; AUGUSTO, 1994;
FÖRSTERMANN et al., 1995; MILLER; MEGSON, 2007).
Nas células do músculo liso vascular, o NO age ativando a enzima citosólica
ciclase de guanilil solúvel (GCs) ao se ligar ao grupo heme desta enzima, resultando
no aumento dos níveis do monofosfato de guanosina cíclico (GMPc) (MURAD, 1986;
LIU; HUANG, 2008). O segundo mensageiro GMPc ativa a proteína cinase
dependente de GMPc (PKG) (CARVAJAL et al., 2000). Isto leva, finalmente, à
redução dos níveis de Ca2+ intracelulares das células musculares lisas, diminuição
da sensibilidade do sistema contrátil para o Ca2+ (CARVAJAL et al., 2000),
desfosforilação da cadeia leve da miosina (WALDMAN; MURAD, 1987; CARVAJAL
et al., 2000), ativação bomba de Ca2+ do retículo endosarcoplasmático (SERCA);
ativando-a e acelerando a recaptação de Ca2+ para os estoques intracelulares
(CORNWELL et al., 1991); da bomba de cálcio da membrana plasmática (PMCA); do
trocador Na+/Ca2+, com posterior ativação e de canais para potássio sensíveis ao
ATP (KATP), canais para potássio sensíveis ao cálcio (KCa) (ARCHER et al., 1994),
canais para potássio sensíveis a voltagem (Kv) (IRVINE; FAVALORO; KEMPHARPER, 2003), culminando no relaxamento da célula muscular lisa vascular
(MILLER; MEGSON, 2007)(Figura 2).
28
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Figura 2 - Representação esquemática do mecanismo de relaxamento da célula muscular
lisa vascular via produção de NO. Fonte: FRANÇA-SILVA, 2010
A hiperpolarização dependente das células endoteliais também pode ser
mediada pelo fator hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF), caracterizado por
ativar canais de K+ e induzir hiperpolarização de membrana das células do músculo
liso vascular (CHEN; SUZUKI; WESTON, 1988; TAYLOR; WESTON, 1988;
GARLAND; MACPHERSON, 1992; MOMBOULI; VANHOUTTE, 1997). Além destes,
os metabólitos do ácido araquidônico, pela ação da ciclooxigenase, também induz
relaxamento dependente de endotélio (SINGER; PEACH, 1983) e independente de
NO (PFISTER; CAMPBELL, 1992). As prostaciclinas (PGI2) são formadas no
músculo liso vascular e no endotélio e seus efeitos são mediados pela formação de
AMPc
(MONCADA;
VANE,
1978;
VANE;
BUNTING;
MONCADA,
1982;
GRYGLEWSKI; BOTTING; VANE, 1988).
A compreensão dos mecanismos que regulam o tônus vascular é, portanto,
essencial para estabelecer novas estratégias para prevenção e tratamento de
doenças do sistema cardiovascular, que são as principais causas de morte no Brasil
e possuem como fator de risco a elevação da PA a partir de 115/75 mmHg de forma
29
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
linear, contínua e independente (VI Diretriz da Sociedade Brasileira de Hipertensão,
2010); sendo responsáveis por uma alta frequência de internações, ocasionando
custos médicos e socioeconômicos elevados (HIRANO; HIRANO; KANAIDE,2004;
MS, 2011).
Muitas alterações cardiovasculares, como hipertensão, angina e falência
cardíaca, são frequentemente tratadas com drogas vasodilatadoras, que atuam
diretamente no músculo liso vascular causando vasorrelaxamento, ou indiretamente,
por meio da estimulação da liberação de fatores vasorrelaxantes endógenos, ou
ainda por inibir a liberação de fatores vasoconstritores (GURNEY, 1994).
Aliar o conhecimento popular ao científico em busca de novos medicamentos
é um dos principais caminhos para o sucesso de pesquisas na área de plantas
medicinais, que tem por objetivo avaliar a atividade biológica de plantas e seus
constituintes químicos em vários sistemas, como por exemplo, o cardiovascular, com
o intuito de descobrir substâncias que possam ser potencialmente utilizadas na
terapêutica e/ou como ferramentas farmacológicas (DI STASI; HIRUMA-LIMA,
2002).
O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da
maior floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua
vocação para os produtos naturais. Este país possui a maior biodiversidade do
mundo, estimada em cerca de 20% do número total de espécies do planeta. Esse
imenso patrimônio genético, que nos países desenvolvidos encontra-se escasso,
tem na atualidade valor econômico – estratégico inestimável em várias atividades,
mas é no campo de novos medicamentos onde reside sua maior potencialidade
(ALCÂNTARA; YAMAGUCHI; VEIGA-JUNIOR, 2010).
Diante desta riquíssima flora, destaca-se a família Asteraceae, que é
composta por cerca de 1.100 gêneros e 25.000 espécies (EMERECIANO et al.,
2007). A América do Sul comporta cerca de 20% dos gêneros existentes. No Brasil,
são estimados aproximadamente 180 gêneros e 3.000 espécies distribuídas desde
as regiões mais frias e úmidas, como as serras do Sudeste e Sul, até as áreas secas
na região do semi-árido nordestino, sendo menos frequentes em formações
florestais (SOUSA, 2007).
Plantas dessa família são extensivamente estudadas quanto a sua
composição química e atividade sobre o sistema cardiovascular, como por exemplo,
30
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
a espécie Baccharis trimera DC (VERDI; BRIGHENTE; PIZZOLATTI, 2005). Dentre
outros constituintes químicos, os flavonoides têm grande destaque, sendo alocados
como importantes marcadores quimiotaxonômicos desta família (EMERENCIANO et
al., 2001).
Os flavonoides, metabólitos secundários que podem potencialmente interferir
em diferentes processos fisiopatológicos (PEREZ-VIZCAINO; DUARTE, 2010), são
dotados de uma variedade de atividades biológicas já relatadas na literatura
científica, como por exemplo: anti-hipertensiva (VILLAR et al.,2002), moduladora de
canais iônicos (FUSI et al., 2003, SATOH; NISHIDA, 2004) e vasorrelaxante, por
meio da produção de NO nas células endoteliais (REZENDE; CÔRTES; LEMOS,
2004).
A espécie Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson (Figura 3),
que possui como sinomínias: Eupatorium clematideum Griseb. e Eupatorium
urtifolium var. clematideum (Griseb.) Hieron ex. Kuntze; é uma planta da família
Asteraceae nativa da América do Sul. No Brasil, ela é encontrada principalmente nos
estados da Bahia, Alagoas, Pernambuco, Paraíba, Amazonas e Mato Grosso
(POLLOCK; SMITH, 2004). Esta espécie é pouco relatada na literatura, tanto do
ponto de vista dos estudos fitoquímicos, como de suas atividades biológicas.
Figura 3- Foto de Praxelis clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson
Fonte: MAIA, 2011
31
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Estudos, utilizando o extrato etanólico bruto das partes areas deste vegetal,
realizados no Laboratório de Fitoquímica da Universidade Federal da Paraíba,
culminaram no isolamento do 5,7,4’-trimetoxiflavona, um flavonoide do tipo flavona,
já isolado em espécies de outras famílias do Reino vegetal, mas pela primeira vez
isolado da espécie Praxelis clematidea (Figura 4) (MAIA, 2011).
Figura 4- Estrutura química do flavonoide 5,7,4’-trimetoxiflavona
Fonte: MAIA, 2011
Baseado nas importantes propriedades dos constituintes bioativos presentes
nas espécies da família Asteraceae, este trabalho buscou estudar a espécie Praxelis
clematidea (Griseb.) R. M. King & H. Robinson, uma vez que a mesma não
apresenta estudos no sistema cardiovascular e acredita-se ser uma fonte de
promissoras atividades biológicas.
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Objetivos
33
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
2 OBJETIVOS
2.1 Geral
Avaliar o efeito induzido pelo extrato etanólico (EPC), fase clorofórmica
(FPC) e flavonoide 5,7,4´-trimetoxiflavona (TMF) de Praxelis clematidea em artéria
mesentérica superior isolada de rato, elucidando o possível mecanismo de ação
envolvido no efeito do flavonoide.
2.2 Específicos
• Comparar os efeitos farmacológicos induzidos por EPC, FPC e TMF em anéis
de artéria mesentérica superior isolada de ratos;
• Investigar o mecanismo de ação do efeito vascular de TMF, avaliando a
participação:
a)dos fatores vasoativos liberados pelo endotélio vascular;
b)dos canais para K+;
c) dos canais para Ca2+.
Material
35
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
3 MATERIAL
3.1 Animais
Foram utilizados em todos os experimentos ratos Wistar (Rattus novergicus),
pesando entre 250 – 300 g. Estes animais foram provenientes do Biotério Prof.
George Thomas, da Universidade Federal da Paraíba (UFPB), mantidos sob
condições controle de temperatura (21 ± 1 ºC) e ciclo claro-escuro de 12 horas (6 –
18 horas), com livre acesso à água e alimentação (ração Purina®). Todos os
experimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da UFPB,
com certidão nº 0204/11 (Anexo).
3.2 Drogas e reagentes
As ferramentas farmacológicas utilizadas foram: 1H-[1,2,4]oxadiazolo[4,3a]quinoxalin-1-ona (ODQ), 2-fenil-4,4,5,5-tetrametil-imidazolina-1-oxil-3-oxido (PTIO),
4-aminopiridina (4-AP), sulfato de atropina, indometacina (INDO), cloridrato de
acetilcolina (ACh), quercetina, cloridrato de L-(-)-fenilefrina (FEN), cloridrato de NGnitro-L-arginina-metil éster (L-NAME), glibenclamida (GLIB), cloridrato de L-arginina,
nifedipino (NIF), cloreto de tetraetilamônio (TEA), ácido tetraacético (N, N, N’,N’) bis
beta amino étil estér etilenoglicol (EGTA). Todos obtidos da Sigma-Aldrich Brasil
Ltda (São Paulo-SP, Brasil).
Todas as substâncias foram dissolvidas em água destilada, exceto a GLIB e
ODQ que foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO), além de nifedipino e PTIO
que foram dissolvidos em etanol absoluto e diluídos em água destilada, de modo a
serem obtidas as concentrações desejadas. As soluções foram mantidas de 0 a 4 °C
e somente retiradas no momento do experimento. Vale ressaltar que os veículos
utilizados não ultrapassaram 1% na concentração final, nesta concentração foram
desprovidos de efeito biológico.
36
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
3.3 Obtenção e preparação das drogas teste
As partes aéreas de Praxelis clematidea R.M. King & Robinson foram
coletadas no município de Santa Rita, na Lagoa do Paturi, no estado da Paraíba, em
maio de 2008 e identificada pela Profª. Drª. Maria de Fátima Agra. Uma exsicata da
espécie, sob código M. F. Agra et al. 6894 (JPB), está depositada no Herbário Prof.
Lauro Pires Xavier (CCEN/UFPB).
A obtenção do extrato etanólico bruto (EPC), da fase clorofórmica (FPC), e
do flavonoide 5,7,4´-trimetoxiflavona (TMF) foi realizada de acordo com o
procedimento previamente descrito por Maia (2011).
O extrato, a fase e o flavonoide de Praxelis clematidea foram cedidos pela
equipe do professor Doutor José Maria Barbosa Filho do Laboratório de Fitoquímica
da Universidade Federal da Paraíba. Para a realização dos ensaios farmacológicos,
as substâncias em estudo foram solubilizadas em cremofor e diluídas em água
destilada. A concentração de cremofor não ultrapassou 0,018% v/v, concentração
que não produz efeito sobre os parâmetros avaliados (dados obtidos em
experimentos anteriores em nosso laboratório).
3.4 Soluções fisiológicas
Para a preparação das soluções nutritivas foram utilizadas as seguintes
substâncias: cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio
(CaCl2), cloreto de magnésio
(MgCl2), glicose (C6H12O6), bicarbonato de sódio
(NaHCO3) e fosfato de sódio (NaH2PO4). Todos estes sais foram obtidos da
SIGMA®.
37
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Sais
Concentração (mM)
NaCl
158,3
KCl
4,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Quadro 1 – Composição da solução de Tyrode para artéria mesentérica
Fonte: TANAKA et al., 1999
Sais
Concentração (mM)
NaCl
158,3
KCl
4,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
EGTA
1,0
Quadro 2 – Composição da solução de Tyrode livre de cálcio
Fonte: adaptada de TANAKA et al., 1999
Nas soluções de Tyrode 20 ou 60 mM de KCl, houve uma substituição
equimolar do Na+ pelo K+, ajustando isosmoticamente as soluções, conforme os
quadros abaixo:
Sais
Concentração (mM)
NaCl
142,3
KCl
20,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Quadro 3 – Composição da solução de Tyrode com KCl a 20 mM
Fonte: adaptada de TANAKA et al., 1999
38
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Sais
Concentração (mM)
NaCl
102,3
KCl
60,0
CaCl2
2,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Quadro 4 – Composição da solução de Tyrode com KCl a 60 mM
Fonte: adaptada de TANAKA et al., 1999
Sais
Concentração (mM)
NaCl
102,3
KCl
60,0
MgCl2
1,05
NaHCO3
10,0
NaH2PO4
0,42
Glicose
5,6
Quadro 5 – Composição da solução de Tyrode com KCl a 60 mM nominalmente sem cálcio
Fonte: adaptada de TANAKA et al., 1999
Métodos
40
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4 MÉTODOS
4.1 Preparação dos anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Os ratos foram eutanasiados, em seguida, após ter sido identificada, a
artéria mesentérica superior foi retirada e seccionada em anéis de 1-2 mm. A
remoção do endotélio foi realizada por atrito mecânico entre as paredes internas do
vaso e uma haste de metal (COX et al., 1989). Os anéis livres de tecido conjuntivo e
adiposo foram colocados num sistema de banho para órgãos isolados, em cubas
contendo 10 mL de solução de Tyrode (TANAKA et al., 1999), a 37 ºC e gaseificadas
com uma mistura carbogênica (95% de O2 e 5% de CO2) para prover um pH
relativamente constante de 7,2 - 7,4 (TEIXEIRA; PRIVIERO; WEBB, 2005) . Os
anéis foram suspensos por linhas de algodão fixadas a um transdutor de força
(MLT020, ADInstruments, Austrália), que estava acoplado a um sistema de
aquisição (ML870/P com LabChart versão 7.0, ADInstruments, Austrália) para o
registro das tensões isométricas (Figura 5). Cada anel foi submetido a uma tensão
constante de 0,75 g por um período de estabilização de 60 minutos. Durante este
tempo, o meio nutritivo (solução Tyrode) foi trocado a cada 15 minutos para prevenir
a produção de metabólitos indesejáveis (ALTURA; ALTURA, 1970).
Figura 5 - Sistema de cubas e aquisição de dados de tensão isométrica para órgão isolado
Fonte: QUIEROZ, 2011
41
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2 Protocolos experimentais utilizando anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato
Para a realização de todos os protocolos experimentais, após um período de
estabilização de 60 minutos, foi obtida uma contração com fenilefrina (FEN) 10 µM,
um agonista dos receptores α1 adrenérgicos (BYLUND, 1992; BÜSCHER et al.,
1999), com a finalidade de verificar a viabilidade do órgão. No componente tônico
desta contração, foi adicionado um agonista não seletivo dos receptores
muscarínicos, acetilcolina (ACh) 10 µM com o intuito de avaliar a integridade do
endotélio vascular (FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980). Os anéis que apresentaram
relaxamento superior a 90% sobre a pré-contração com FEN, foram considerados
anéis com endotélio funcional (Figura 6A), já os anéis com relaxamentos inferiores a
10% foram considerados anéis sem endotélio vascular (Figura 6B) (TOLVANEN et
al., 1998).
ACh (10 µM)
ACh
A)
(10
Lavagem
B)
µM)
Lavagem
FEN (10 µM)
FEN (10 µM)
Figura 6- Representação da verificação da viabilidade do órgão e da integridade do endotélio
vascular. A) Presença do endotélio e B) Ausência do endotélio funcional
42
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.1 Verificação do efeito de EPC ou FPC ou TMF em anéis de artéria
mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN
Após a verificação da viabilidade do órgão e da presença ou ausência do
endotélio, como descrito no item 4.1.2, as preparações foram submetidas a um
processo de estabilização, por aproximadamente 30 minutos, e uma segunda
contração de FEN (1 M) foi induzida. No componente tônico desta segunda
contração, concentrações crescentes de EPC ou FPC (0,001 - 1000 µg/mL, para
ambos) ou TMF (10-12 – 10-3 M) foram adicionadas à preparação, de maneira
cumulativa, para a obtenção de uma curva concentração-resposta. O efeito
vasorrelaxante de EPC, FPC e TMF foi avaliado em anéis com o endotélio intacto e
anéis desprovidos de endotélio funcional (Figura 7). A resposta foi expressa como
porcentagem de relaxamento em relação à contração produzida pela FEN. A
potência e eficácia do vasorrelaxamento dos compostos foram avaliadas por meio
dos valores de CE50 ou pD2 e Emáx, respectivamente.
43
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
EPC ou FPC
(0,001 – 1000 µg/mL)
ou
TMF (10-12 – 10-3 M)
ACh (10 µM)
A
Anéis com endotélio
?
Lavagem
?
Tensão (g)
FEN (10 µM)
B
FEN (1 µM)
Tempo (s)
B
EPC ou FPC
(0,001 – 1000 µg/mL)
ou
TMF (10-12 – 10-3 M)
Anéis sem endotélio
ACh (10 µM)
Lavagem
?
?
Tensão (g)
FEN (10 µM)
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 7- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação dos efeitos de EPC
-12
-3
(0,001 - 1000 µg/mL), FPC (0,001 - 1000 µg/mL) e TMF (10 – 10 M) em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato, pré-contraídos com FEN (1 µM). A) Anéis com endotélio intacto;
B) Anéis sem endotélio
44
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.2 Comparação do efeito de TMF e quercetina em anéis de artéria
mesentérica isolada de rato pré-contraídos com FEN
Após a verificação da presença do endotélio, seguida de um processo de
estabilização, aproximadamente 30 minutos, foi induzida uma segunda contração de
FEN (1 M). No componente tônico desta segunda contração, concentrações
crescentes de quercetina (10-12 – 10-3 M), o flavonóide mais abundante nas plantas e
mais estudado pela literatura científica (PEREZ-VIZCAINO et al., 2010), foram
adicionadas à preparação, de maneira cumulativa, para a obtenção de uma curva
concentração-resposta (Figura 8). A resposta foi expressa como porcentagem de
relaxamento em relação à contração produzida pela FEN. A potência e eficácia do
vasorrelaxamento da substância foram avaliadas por meio dos valores de pD2 e
Emáx, respectivamente.
QUERCETINA
(10-12 – 10-3 M)
?
?
Tensão (g)
30 min
Tempo (s)
FEN (1 µM)
Figura 8- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação dos efeitos de
-12
-3
quercetina (10 – 10 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato, com endotélio
intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM).
45
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.3 Investigação do mecanismo vasorrelaxante de TMF em anéis de artéria
mesentérica com endotélio vascular
4.2.3.1 Verificação da participação dos metabólitos da via do ácido
araquidônico no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato
Após a verificação da integridade do endotélio vascular, as preparações
foram previamente incubadas com indometacina (10 µM), um inibidor não seletivo da
enzima ciclooxigenase (COX) (CLARK; FUCHS, 1997). Após 30 minutos induziu-se
uma contração com FEN (1 µM) e na fase tônica desta contração adicionou-se à
cuba TMF (10-12 – 10-3 M) cumulativamente (Figura 9). A potência e a eficácia
vasorrelaxante do TMF foram avaliadas por meio de comparação dos valores de pD 2
e Emáx, respectivamente, na presença e na ausência de indometacina.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
Indometacina
(10 µM)
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 9- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação dos
metabólitos do ácido araquidônico no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de rato com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
46
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.3.2 Verificação da participação da NOS no efeito induzido por TMF em anéis
de artéria mesentérica superior isolada de rato
Após a verificação da presença do endotélio vascular, as preparações foram
pré-incubadas separadamente com L-NAME (100 µM), um inibidor competitivo da
enzima NOS, e L-arginina (1 mM), um substrato para a NOS, mais o L-NAME (100
µM) (MONCADA; PALMER; HIGGS, 1993).
Após trinta minutos de incubação
induziu-se uma contração com FEN (1 µM), na fase tônica e sustentada desta
contração adicionou-se cumulativamente TMF (10-12 – 10-3 M) para obtenção de uma
curva concentração-resposta. As respostas obtidas foram comparadas com a curva
controle (Figura 10). A potência e a eficácia vasorrelaxante do TMF foram avaliadas
por meio dos valores de pD2 e Emáx, respectivamente, na presença e na ausência de
L-NAME ou L-arginina + L-NAME .
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
L-NAME (100 µM)
ou
L- arginina (1 mM) + L-NAME(100 µM)
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 10- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação da
NOS no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
47
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.3.3 Verificação do envolvimento do óxido nítrico no efeito induzido por TMF
em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Após a observação da integridade do endotélio vascular, as preparações
foram pré-incubadas com PTIO (300 µM), um seqüestrador de NO (IKEDA et al.,
1997). Após 30 minutos, as preparações foram submetidas a uma segunda
contração com FEN (1 µM) e no componente tônico desta contração, adicionava-se
TMF (10-12 – 10-3 M) cumulativamente (Figura 11). A potência e a eficácia do efeito
vasorrelaxante do TMF foram avaliadas por meio de comparação dos valores de pD 2
e Emáx, respectivamente, na presença ou na ausência PTIO.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
PTIO (300 µM)
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 11- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação do envolvimento do
NO no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato com
endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
48
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.3.4 Verificação da participação da CGs no efeito induzido por TMF em anéis
de artéria mesentérica superior isolada de rato
Após a observação da integridade do endotélio vascular, as preparações
foram pré-incubadas com ODQ (10 µM), um inibidor específico da CGS (CERONI,
2007). Decorridos 30 minutos, as preparações foram submetidas a uma segunda
contração com FEN (1 µM) e no componente tônico desta contração adcionou-se
TMF (10-12 – 10-3 M)
cumulativamente (Figura 12). A potência e a eficácia
vasorrelaxante do TMF foram avaliadas por meio de comparação dos valores de pD2
e Emáx, respectivamente, na presença e na ausência de ODQ.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
ODQ (10 µM)
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 12- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação da
CGs efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato com endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
4.2.3.5 Verificação da participação de canais para potássio (K+) no efeito
induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de rato
Para avaliar a participação dos canais para K + no efeito induzido pelo TMF,
utilizou-se uma solução Tyrode modificada com 20 mM de KCl. Isto porque 20 mM
49
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
de K+ externo são suficientes para impedir parcialmente o efluxo de K+, e atenuar
vasorrelaxamentos mediados pela abertura de canais de K+ (CAMPBELL; HARDER,
1996; CLARK; FUCHS, 1997). E com o mesmo propósito, utilizou-se a ferramenta
farmacológica TEA (3 mM), que nesta concentração atua como um bloqueador
inespecífico de canais para K+ (ROCHA; BENDHACK, 2009; SILVA et al., 2011).
Após a verificação da presença do endotélio funcional, como descrito no
item 4.1.2, a solução de Tyrode foi trocada por uma solução despolarizante de
Tyrode com 20 mM de KCl ou foi adicionado o bloqueador (TEA 3 mM). Após 30
minutos foi induzida uma nova contração com FEN (1 M) e, em seguida, uma curva
concentração-resposta cumulativa para TMF (10-12 – 10-3 M) foi obtida (Figura 13). A
potência e eficácia do vasorrelaxamento de TMF foram avaliadas por meio dos
valores de pD2 e Emáx, respectivamente.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
30 min
FEN (1 µM)
Tensão (g)
KCl 20 mM ou
TEA (3 mM)
?
Tempo (s)
Figura 13- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da participação dos
+
canais para K no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
50
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.3.6 Verificação da participação dos subtipos de canais para K+ no efeito
induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de rato
Após a verificação da presença do endotélio funcional, as preparações foram
incubadas separadamente com 10 M de glibenclamida, um bloqueador seletivo de
canais para K+ sensíveis ao ATP (KATP) (OHRNBERGER; KHAN; MEISHERI, 1993;
FAROUQUE; OMAR; MEREDITH, 2003); 1 mM de 4-AP, um bloqueador seletivo de
canais para K+ sensíveis a voltagem (Kv) (BERG, 2002); e 1 mM de TEA, que nesta
concentração atua como um bloqueador dos canais para K+ sensíveis a cálcio de
grande condutância (BKca) (WHITE et al., 2002; SILVA et al., 2011). Após 30
minutos, foi induzida uma nova contração tônica com FEN (1 M) e, em seguida,
uma curva concentração-resposta para o TMF (10-12 – 10-3 M) foi obtida (Figura 14).
A potência e eficácia do vasorrelaxamento de TMF foram avaliadas por meio dos
valores de pD2 e Emáx, respectivamente.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
GLIB (10 M) ou
4- AP (1 mM) ou
TEA (1 mM)
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 14- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação dos subtipos de
canais para potássio no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de
rato com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
51
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
4.2.4 Investigação do mecanismo vasorrelaxante de TMF em anéis de artéria
mesentérica sem endotélio vascular
4.2.4.1 Verificação da ativação dos canais para K+ no efeito induzido pelo TMF
em anéis de artéria mesentérica isolada de rato
Com o intuito de evidenciar se o flavonoide em estudo induz relaxamento por
ativação direta de canais para K+ na célula muscular lisa vascular, utilizou-se uma
solução Tyrode modificada com 20 mM de KCl, condição que promove o bloquei
parcial do efluxo de K+ , atenuando os vasorrelaxamentos mediados pela abertura
de canais de K+ (CAMPBELL; HARDER, 1996; CLARK; FUCHS, 1997). E com o
mesmo propósito, utilizou-se a ferramenta farmacológica TEA (3 mM), que nesta
concentração atua como um bloqueador inespecífico de canais para K + (ROCHA et
al., 2009).
Após a verificação da ausência do endotélio funcional, como descrito no item
4.1.2, a solução de Tyrode foi trocada por uma solução despolarizante de Tyrode
com 20 mM de KCl ou foi adicionado o bloqueador (TEA 3 mM). Após 30 minutos foi
induzida uma nova contração com FEN (1 M) e, em seguida, uma curva
concentração-resposta cumulativa para TMF (10-12 – 10-3 M) foi obtida (Figura 15). A
potência e eficácia do vasorrelaxamento de TMF foram avaliadas por meio dos
valores de pD2 e Emáx, respectivamente.
52
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
FEN (1 µM)
KCl 20 mM ou
TEA (3 mM)
Tempo (s)
Figura 15- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação da ativação direta
+
dos canais para K no efeito induzido por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de
rato sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM).
4.2.4.2 Verificação do efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato pré-contraídos com solução despolarizante de 60 mM de KCl
Para investigar a resposta vasorrelaxante de TMF sobre a contração
induzida por um agente contracturante eletroquímico, foi utilizado uma solução com
60 mM de KCl, que promove uma despolarização da membrana plasmática, levando
à
ativação
dos
canais
para
Ca2+
dependentes
de
voltagem
(CaV)
e,
consequentemente, à contração do músculo liso vascular (CHEN; REMBOLD, 1995;
KRAVTSOV et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2006).
Após a verificação da remoção do endotélio funcional (ver 4.1.2), e um
período de estabilização de aproximadamente 30 minutos, a solução de Tyrode
normal foi substituída por uma solução de Tyrode com 60 mM de KCl. No
componente tônico da contração promovida por este agente, foram adicionadas
concentrações crescentes de TMF (10-12 – 10-3 M) de maneira cumulativa, para
obtenção de uma curva concentração-resposta (Figura 16). A potência e eficácia do
vasorrelaxamento de TMF foram avaliadas por meio dos valores de pD2 e Emáx,
respectivamente.
53
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
?
?
30 min
Tensão (g)
KCl 60 mM
Tempo (s)
Figura 16 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação dos efeitos de
TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional, pré-contraídos
com solução despolarizante (KCl 60 mM).
4.2.4.3 Verificação do efeito de TMF sobre as concentrações induzidas por
CaCl2 em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Os experimentos foram realizados em anéis sem endotélio funcional. Nas
condições basais de tônus, o Tyrode foi substituído pela solução despolarizante com
60 mM de KCl (contração de referência). As preparações foram lavadas com solução
Tyrode livre de Ca2+ e nela mantidas por 15 minutos. Em seguida, os anéis foram
expostos a solução despolarizante com 60 mM de KCl nominalmente sem Ca2+ por
15 minutos, e uma curva concentração-resposta cumulativa foi obtida pela adição
cumulativa de CaCl2 (10-6 - 3 x 10-2) ao meio. O processo foi novamente repetido,
sendo que concentrações isoladas do TMF (10-6, 10-5, 10-4 e 10-3 M) foram incubadas
as preparações juntamente com a solução despolarizante de KCl 60 mM
nominalmente sem Ca2+ e uma nova curva concentração resposta ao CaCl2 (10-6 – 3
x 10-2 M) foi obtida (Figura 17). Os resultados foram analisados comparando-se os
efeitos máximos (Emáx) obtidos das curvas com CaCl2 na ausência (controle) e na
presença das diferentes concentrações dos compostos.
54
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
TMF
EDP
ou FDP
ACh (10 M)
Lavagem
FEN
(10 M)
KCl 60 mM
Lavagem
Lavagem
+
Lavagem
KCl 60 mM
nominalmente
sem Ca2+
KCl 60 mM
nominalmente
sem Ca2+
(15 min.)
(15 min.)
Tyrode
nominalmente
sem Ca2+
?
CaCl2
(10-6 – 3.10-2 M)
60 mM
Tyrode
nominalmente
sem Ca2+
CaCl2
(10-6 – 3.10-2 M)
Tensão (g)
(15 min.)
KCl
(15 min.)
Tempo (s)
Figura 17 - Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação dos efeitos de
-6
-2
TMF sobre as contrações induzidas por concentrações cumulativas de CaCl2 (10 – 3 x 10 ) em meio
despolarizante (KCl 60 mM) nominalmente sem cálcio.
4.2.4.4 Verificação do efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato pré-encubados com um bloqueador de Cav tipo L
Após a verificação da ausência do endotélio vascular, as preparações foram
previamente incubadas com NIF (1 µM), um bloqueador dos Cav do tipo L (TSANG
et al., 2003; SOFOLA; ADEGUNLOYE; KNILL, 2003; MISFELDT et al., 2010). Após
30 minutos induziu-se uma contração com FEN (1 µM) e na fase tônica desta
contração adicionou-se à cuba TMF (10-12 – 10-3 M) cumulativamente (Figura 18). A
potência vasorelaxante do TMF foi avalida por meio de comparação dos valores de
pD2 e Emax na presença e na ausência de NIF.
55
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
TMF
(10-12 – 10-3 M)
30 min
Tensão (g)
NIF (1 M)
?
?
FEN (1 µM)
Tempo (s)
Figura 18- Representação esquemática do protocolo experimental para avaliação do efeito induzido
por TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato sem endotélio funcional, préencubados com NIF (1 µM).
4.3 Análise estatística
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média (e.p.m).
As diferenças entre as médias foram consideradas significantes quando o p < 0,05.
As comparações estatísticas entre duas variáveis foram realizadas por meio da
utilização do teste t de Student não pareado.
Nas curvas concentração-resposta, os valores de Emáx (efeito máximo
produzido por uma substância em porcentagem de relaxamento e de contração),
CE50 (concentração de uma substância responsável por 50% do Emáx) e de pD2
(logaritmo negativo da CE50) foram obtidas por regressão não linear.
Os dados foram analisados e plotados no programa estatístico GraphPad
Prism 5.0®.
Resultados
57
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
5 RESULTADOS
5.1 Efeito de EPC, FPC e TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de rato
pré-contraídos com FEN
Em anéis pré-contraídos com FEN (1 μM) (duração de 40 minutos), a adição
cumulativa do EPC (0,001 – 1000 µg/mL) promoveu um vasorrelaxamento, em anéis
com endotélio intacto (Emáx = 101,3 ± 1,8%; CE50 = 27,2 ± 6,4 µg/mL; n = 7), de
maneira dependente de concentração. Após a remoção do endotélio funcional a
curva concentração-resposta para o EPC foi deslocada para a direita, com uma
diminuição significativa na potência, porém sem alteração no efeito máximo (Emáx =
104,1 ± 1,8%; CE50 = 141,9 ± 19,4 µg/mL, n = 7, p < 0,05) (Gráfico 1).
A)
B)
Figura 19- Registros originais representativos das respostas de EPC (0,01 – 1000 µg/mL) em anéis
pré-contraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção (B)
58
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
0
% Relaxamento
20
Endotélio Presente (FEN 1 M)
Endotélio Ausente (FEN 1 M)
40
60
80
100
-3
-2
-1
0
1
2
3
Log [EPC]g/mL
Gráfico 1 – Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por EPC (0,01 – 1000
µg/mL) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos com endotélio intacto (●) ou
endotélio ausente (○), pré-contraídos com FEN (1 µM), (n=7). Os valores foram expressos como
média  e.p.m.
A adição cumulativa de FPC (0,001 – 1000 µg/mL) em anéis de artéria
mesentérica, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 μM), promoveu
um vasorrelaxamento de maneira dependente de concentração (Emáx = 105,4 ±
4,8%; CE50 = 41,9 ± 11,8 µg/mL; e n = 7). Após a remoção do endotélio funcional
também ocorreu uma diminuição significativa na potência do efeito induzido pela
FPC, porém sem alteração no efeito máximo (Emáx = 106,5 ± 4,4%; CE50 = 167,0 ±
30,6 µg/mL, n = 7, p < 0,05) (Gráfico 2). Interessantemente, FPC apresentou a
mesma potência farmacológica e magnitude de efeito máximo quando comparado
com EPC, tanto em anéis com endotélio funcional (Emáx = 101,3 ± 1,8%; CE50 = 27,2
± 6,4 µg/mL; n = 7), quanto com anéis sem endotélio funcional (Emáx = 104,1 ± 1,8%;
CE50 = 141,9 ± 19,4 µg/mL, n = 7).
59
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
A)
B)
Figura 20- Registros originais representativos das respostas de FPC (0,01 – 1000 µg/mL) em anéis
pré-contraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção (B)
60
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
0
% Relaxamento
20
Endotélio Presente (FEN 1 M)
Endotélio Ausente (FEN 1 M)
40
60
80
100
-3
-2
-1
0
1
2
3
Log [FPC]g/mL
Gráfico 2 – Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por FPC (0,01 – 1000
µg/mL) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos com endotélio intacto (●) ou
endotélio ausente (○), pré-contraídos com FEN (1 µM), (n=7). Os valores foram expressos como
média  e.p.m.
Como observa-se no Gráfico 3, a adição cumulativa do flavonoide TMF (1012
– 10-3 M), em anéis pré-contraídos com FEN (1 μM) (duração de 40 - 45 minutos),
promoveu um vasorrelaxamento em anéis com endotélio intacto (Emáx = 100,8 ±
2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n = 6), de maneira dependente de concentração. Após a
remoção do endotélio funcional a curva concentração-resposta para o TMF foi
deslocada para a direita, com uma diminuição da potência, porém sem alteração no
efeito máximo (Emáx = 102,5 ± 4,9%; pD2 = 4,50 ± 0,10, n = 6, p < 0,05).
61
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
A)
-12
-3
Figura 21- Registros originais representativos das respostas de TMF (10 – 10 M) em anéis précontraídos com FEN (1 µM) com o endotélio intacto (A) ou após sua remoção (B)
62
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
0
% Relaxamento
20
Endotélio Presente (FEN 1 M)
Endotélio Ausente (FEN 1 M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
-3
Gráfico 3 – Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por TMF (10 – 10 M)
em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos com endotélio intacto (●) ou endotélio
ausente (○), pré-contraídos com FEN (1 µM), (n=6). Os valores foram expressos como média  e.p.m.
O tempo necessário para que fossem obtidas as respostas máximas para
cada uma das concentrações, para EPC e FPC, foi de 10 minutos, e para o TMF foi
de 8 minutos. Desta forma, em todos os experimentos o tempo total de relaxamento
máximo foi, aproximadamente, 80 minutos. Após a aplicação da última concentração
das substâncias, seguida de lavagens sucessivas durante 40 minutos, os anéis
responderam a uma nova adição de FEN (1 μM), com magnitude semelhante à
observada durante a investigação da viabilidade do endotélio vascular (Figura 19,
20, 21).
5.2 Comparação do efeito de TMF e quercetina em anéis de artéria mesentérica
isolada de rato pré-contraídos com FEN
A adição cumulativa de quercetina (10-12 – 10-3 M), em anéis com endotélio
funcional pré-contraídos com FEN (1 μM), promoveu um vasorrelaxamento de
maneira dependente de concentração (Emáx = 98,2 ± 3,2%; pD2 = 5,71 ± 0,16, n =
6), sem apresentar diferença em relação à potência e ao efeito máximo, quando
63
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
comparado com o vasorrelaxamento induzido por TMF em anéis com endotélio
intacto (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n = 6) (Gráfico 4).
0
% Relaxamento
20
Flavona (FEN 1 M)
Quercetina (FEN 1 M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[Flavonoide]M
-12
-3
Gráfico 4 – Curvas concentração-resposta para o efeito relaxante induzido por TMF (10 – 10 M)
-12
-3
(●), e Quercetina (10 – 10 M) (▼) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com
endotélio intacto, pré-contraídos com FEN (1 µM), (n=6). Os valores foram expressos como média 
e.p.m.
5.3 Efeitos de TMF em anéis de artéria mesentérica com endotélio funcional
5.3.1 Participação dos metabólitos da via do ácido araquidônico na resposta
vasorrelaxante induzida pelo TMF em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato
Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), o pré-incubação por 30 minutos com
indometacina (10 µM), um inibidor não seletivo da enzima COX (CLARK; FUCHS,
1997), não alterou o vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do
64
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
flavonoide TMF, de maneira significante, (Emáx = 98,2 ± 5,3%; e pD2 = 5,51 ± 0,16, n
= 5), quando comparado com o controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n
= 6) (Gráfico 5).
0
20
% Relaxamento
FEN 1 M (Endotélio Presente)
FEN + indometacina (10 M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
-3
Gráfico 5 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 – 10
M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, pré-contraídos
com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de indometacina (10 µM) (▼), (n = 6 e 5,
respectivamente). Os valores foram expressos como média  e.p.m.
5.3.2 Participação da enzina NOS na resposta vasorrelaxante induzida pelo
TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Anéis com endotélio funcional foram incubados com L-NAME, um inibidor da
NOS (MONCADA; PALMER; HIGGS, 1993), por 30 minutos. Após este
procedimento, a curva de vasorrelaxamento do TMF foi deslocada para direita, sem
redução significante, do efeito máximo (Emáx = 91,1 ± 3,6%), mas com uma
diminuição da potência (pD2 = 4,52 ± 0,08, n = 5, p < 0,05), quando comparado ao
controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44
±
0,12, n = 6) (Gráfico 6).
Interessantemente, a potência farmacológica e a magnitude do efeito máximo
65
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
quando se utilizou L-NAME foi semelhante aos valores com anéis sem endotélio
funcional (Emáx = 102,5 ± 4,9%; pD2 = 4,50 ± 0,10, n = 6).
A adição concomitante de L-arginina (1 mM) e L-NAME (100 µM) reverteu a
resposta inibitória do L-NAME (100 µM)
nas preparações mesentéricas
(Emáx = 110,2 ± 5,7%; e pD2 = 5,85 ± 0,14, n = 5), não apresentando diferença
significativa quando comparada ao grupo controle (Gráfico 6).
0
% Relaxamento
FEN 1 M (Endotélio Presente)
20
FEN + L-NAME (100 M)
40
FEN + L-Arginina (1mM) +
L-NAME(100M)
60
80
100
120
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
-3
Gráfico 6 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 – 10
M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, na ausência (●) e
na presença de L-NAME (100 µM) (▼) ou (□) L-arginina (1 mM) + L-NAME (100 µM), pré-contraídos
com FEN (1 µM), (n = 6, 5 e 5, respectivamente). Os valores foram expressos como média  e.p.m.
5.3.3 Participação do NO na resposta vasorrelaxante induzida pelo TMF em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), a pré-incubação por 30 minutos com
PTIO (300 µM), um sequestrador de NO (IKEDA et al., 1997), promoveu uma
atenuação do vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do flavonoide, sem
alteração significativa no efeito máximo (Emáx = 100,3 ± 4,9%; e pD2 = 4,62 ± 0,09, n
66
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
= 5, p < 0,05), quando comparado ao controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ±
0,12, n = 6) (Gráfico 7).
0
20
% Relaxamento
FEN 1 M (Endotélio Presente)
FEN + PTIO (300 M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
-3
Gráfico 7 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 – 10
M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, pré-contraídos
com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de PTIO (300 µM) (▼), (n = 6 e 5, respectivamente).
Os valores foram expressos como média  e.p.m.
5.3.4 Participação da CGs na resposta vasorrelaxante induzida pelo TMF em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Na presença de ODQ (10 µM), um inibidor da enzima CGs (CERONI et al.,
2007), 30 minutos antes da pré-contração com FEN (1 µM), o efeito
vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do TMF em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional foi atenuado
significantemente, apresentando um deslocamento da curva para a direita sem
diminuição do efeito máximo (Emáx = 97,3 ± 6,1%; e pD2 = 4,36 ± 0,11, n = 5,
p<
0,05), quando comparado com o controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12,
n = 6) (Gráfico 8).
67
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
0
% Relaxamento
20
FEN 1 M (Endotélio Presente)
FEN + ODQ(10 M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
-3
Gráfico 8 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 – 10
M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, pré-contraídos
com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de ODQ (10 µM) (▼),(n = 6 e 5, respectivamente).
Os valores foram expressos como média  e.p.m.
5.3.5 Participação dos canais para K+ na resposta vasorrelaxante induzida pelo
TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), a pré-incubação por 30 minutos com uma
solução Tyrode modificada com 20 mM de KCl promoveu uma atenuação do
vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do flavonoide TMF, de maneira
significante, sem alteração significativa no efeito máximo (Emáx = 93,8 ± 5,8%; e
pD2 = 4,62 ± 0,08, n = 5, p < 0,05), quando comparado com o controle (Emáx = 100,8
± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n = 6) (Gráfico 9A). O mesmo perfil foi observado com a
pré-incubação por 30 minutos com a ferramenta farmacológica TEA (3 mM), que
nesta concentração atua como um bloqueador não - seletivo de canais para K+
(ROCHA; BENDHACK, 2009; SILVA et al., 2011) (Emáx = 109,0 ± 9,0%; e
pD2 = 4,28± 0,10, n = 5, p < 0,05), (Gráfico 9B).
68
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
A)
0
% Relaxamento
20
FEN 1 M (Endotélio Presente)
FEN + KCl 20mM
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
B)
0
FEN 1 M (Endotélio Presente)
% Relaxamento
20
FEN + TEA (3mM)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
-3
Gráfico 9 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 – 10
M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, pré-contraídos
com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de 20 mM KCl (▼) (A) e na presença de TEA (3 mM)
(♦) (B), (n = 6, 5 e 5, respectivamente). Os valores foram expressos como média  e.p.m.
69
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
5.3.6 Participação dos subtipos de canais para potássio no efeito induzido por
TMF em anéis de artéria mesentérica isolada de rato
Como se pode observar no Gráfico 10, em anéis de artéria mesentérica
superior isolada de ratos, com endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), a
pré-incubação por 30 minutos com 10 M de glibenclamida, um bloqueador seletivo
de canais KATP (OHRNBERGER; KHAN; MEISHERI, 1993), não alterou o
vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do flavonoide TMF, de maneira
significante, (Emáx = 92,3 ± 3,0%; e pD2 = 5,6 ± 0,16, n = 5), quando comparado com
o controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n = 6).
0
FEN 1 M (Endotélio Presente)
% Relaxamento
20
FEN + glibenclamida (10M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
Gráfico 10 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 –
-3
10 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, précontraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de glibenclamida (▼),(n = 6 e 5,
respectivamente). Os valores foram expressos como média  e.p.m.
70
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
A pré-incubação por 30 minutos com 1 mM de TEA, um bloqueador dos
canais BKca (WHITE et al., 2002; SILVA et al., 2011), em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de ratos pré-contraídos com FEN (1 µM), promoveu
uma atenuação do vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do flavonoide
TMF, de maneira significante, sem alteração significativa no efeito máximo
(Emáx = 96,0 ± 2,1%; e pD2 = 4,48 ± 0,04, n = 5, p < 0,05), quando comparado com o
controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n = 6) (Gráfico 11).
0
FEN 1 M (Endotélio Presente)
% Relaxamento
20
FEN + TEA (1mM)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
Gráfico 11 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 –
-3
10 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, précontraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de TEA (▼),(n = 6 e 5, respectivamente).
Os valores foram expressos como média  e.p.m. *p<0,05 versus controle.
Já em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), a pré-incubação por 30 minutos com 1
mM de 4-AP, um bloqueador seletivo de canais Kv (BERG, 2002), promoveu uma
atenuação do vasorrelaxamento induzido pela adição cumulativa do flavonoide TMF,
de
maneira
significante,
sem
alteração
significativa
no
efeito
máximo
(Emáx = 95,6 ± 8,6%; e pD2 = 4,7 ± 0,08, n = 5, p < 0,05), quando comparado com o
controle (Emáx = 100,8 ± 2,6%; pD2 = 5,44 ± 0,12, n = 6) (Gráfico 12).
71
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
0
FEN 1 M (Endotélio Presente)
% Relaxamento
20
FEN + 4-AP (1mM)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
Gráfico 12 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 –
-3
10 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, com endotélio intacto, précontraídos com FEN (1 µM) na ausência (●) e na presença de 4-AP (▼),(n = 6 e 5, respectivamente).
Os valores foram expressos como média  e.p.m
5.4 Efeitos de TMF em anéis de artéria mesentérica sem endotélio funcional
5.4.1 Ativação dos canais para K+ no efeito induzido pelo TMF em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato
Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), a pré-incubação por 30 minutos tanto
com uma solução Tyrode modificada com 20 mM de KCl (Emáx = 100,8 ± 0,9%; e
pD2 = 4,29 ± 0,08, n = 5) (Gráfico 13 A), quanto com a ferramenta farmacológica
TEA (3 mM) (Emáx = 103,1 ± 3,9%; e pD2 = 4,26 ± 0,10, n = 5), não alteraram a
resposta vasorrelaxante promovida pela adição cumulativa de TMF, quando
comparado com o controle (Emáx = 102,5 ± 4,8%; e pD2 = 4,50 ± 0,10, n = 6) (Gráfico
13 B).
72
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
A)
0
% Relaxamento
20
FEN 1 M (Endotélio Ausente)
40
FEN + KCl 20mM
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
B)
0
FEN 1 M (Endotélio Ausente)
% Relaxamento
20
FEN + TEA (3mM)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
Gráfico 13 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 –
-3
10 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio funcional, précontraídos com FEN (1 µM) na ausência (○) e na presença de 20 mM KCl ( ) (A) e na presença de
TEA (3 mM) ( ) (B), (n = 6, 5 e 5, respectivamente). Os valores foram expressos como média 
e.p.m.
73
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
5.4.2 Efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
pré-contraídos com solução despolarizante de 60 mM de KCl
Em anéis de artéria mesentérica, com endotélio funcional removido, précontraídos com uma solução despolarizante de KCl 60 mM, a adição cumulativa de
TMF (10-12 – 10-3 M) promoveu uma resposta vasorrelaxante dependente de
concentração (Emáx = 100,0 ± 1,2%; pD2 = 4,29 ± 0,06 e n = 5), com efeito máximo e
potência estatisticamente semelhantes ao obtido com contrações induzidas com
FEN (Emáx = 102,5 ± 4,9%; pD2 = 4,50 ± 0,10 e n = 6) (Gráfico 14).
0
% Relaxamento
20
FEN 1 M (Endotélio Ausente)
KCl 60mM (Endotélio Ausente)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
-12
Gráfico 14 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF (10 –
-3
10 M) em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio funcional, précontraídos com FEN (1 µM) na ausência (○) ou na presença de 60 mM de KCl (
), (n = 6 e 5,
respectivamente). Os valores foram expressos como média  e.p.m.
74
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
5.4.3 Efeito de TMF sobre as concentrações induzidas por CaCl2 em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato
O TMF nas concentrações de 10-6, 10-5,10-4 ou 10-3 M inibiu de maneira
dependente de concentração as contração induzidas por CaCl 2 (10-6, 3 x 10- 6, 10-5,
3 x 10-5, 10-4, 3 x 10-4, 10-3, 3 x 10-3, 10-2 M e 3 x 10-2) em solução despolarizante
nominalmente sem Ca+2. Os níveis percentuais máximo de contração induzida por
CaCl2 na presença das concentrações utilizadas de TMF foram as seguintes: (E máx =
98,0 ± 1,5 %; Emáx = 77,3 ± 6,6%; Emáx = 26,4 ± 6,0%; Emáx = 15,7 ± 5,4%,
respectivamente). A redução das contrações de CaCl2 pelas concentrações de TMF
foi de maneira dependente de concentração (Gráfico 15).
% CONTRAÇÃO
100
CONTROLE
Emáx = 100,0%
75
TMF 10-6 M
Emáx = 98,0  1,5%
50
TMF 10-5 M
Emáx = 77,3  6,6%*
25
TMF 10-4 M
Emáx = 26,4  6,0%*
0
-6
-5
-4
-3
-2
-1
TMF 10-3 M
Emáx = 15,7  5,4%*
Log [CaCl2] M
Gráfico 15 – Curvas cumulativa para CaCl2 na presença de concentrações isoladas de TMF, em
anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos,sem endotélio funcional. Os valores foram
expressos como média  e.p.m de 6 experimentos por concentração. *p<0,05 versus controle.
75
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
5.4.4 Efeito de TMF em anéis de artéria mesentérica superior isolada de rato
pré-encubados com um bloqueador de Cav tipo L
Em anéis de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio
funcional, pré-contraídos com FEN (1 µM), a pré-incubação por 30 minutos com NIF
(1 µM), um bloqueador dos Cav tipo L (SOFOLA; ADEGUNLOYE; KNILL, 2003;
MISFELDT et al., 2010), promoveu uma diminuição significativa no efeito máximo
induzido pela adição cumulativa do flavonoide TMF (Emáx = 56,0 ± 7,9%; e
pD2 = 4,82 ± 0,25, n = 5, p < 0,05), quando comparado com o controle
(Emáx = 102,5 ± 4,9%; pD2 = 4,50 ± 0,10 e n = 6) (Gráfico 16).
0
FEN 1 M (Endotélio Ausente)
% Relaxamento
20
FEN + NIF (1M)
40
60
80
100
-12 -11 -10
-9
-8
-7
-6
-5
-4
-3
Log[5,7,4'-trimetoxiflavona]M
Gráfico 16 – Curvas concentração-resposta para o efeito vasorrelaxante induzido por TMF em anéis
de artéria mesentérica superior isolada de ratos, sem endotélio funcional, pré-contraídos com FEN (1
µM) na ausência (○) e na presença de NIF ( ), (n = 6 e 5, respectivamente). Os valores foram
expressos como média  e.p.m.
Discussão
77
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
6 DISCUSSÃO
O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar os efeitos do
extrato etanólico (EPC), fase clorofórmica (FPC) e flavonoide 5,7,4´-trimetoxiflavona
(TMF) oriundos da espécie vegetal Praxelis clematidea, em anéis de artéria
mesentérica superior de ratos, elucidando os possíveis mecanismos de ação
envolvidos na resposta do TMF, metabólito secundário majoritário isolado e
identificado da espécie vegetal, utilizando abordagem metodológica in vitro.
Com a realização deste estudo, pode-se evidenciar que o EPC, a FPC e o
TMF apresentam atividade vasorrelaxante. Além disso, constatou-se que o
flavonoide produz um efeito em anéis com endotélio vascular, o qual envolve a via
NOS/NO/CGs, com conseqüente ativação de canais para K+; e em anéis sem
endotélio vascular, que envolve o bloqueio dos Ca v presentes na membrana da
célula muscular lisa.
Durante a triagem farmacológica preliminar de EPC e FPC obtidos de Praxelis
clematidea, verificou-se que EPC foi capaz de relaxar anéis de artéria mesentérica
pré-contraídos com FEN, tanto na presença quanto na ausência do endotélio
vascular (Gráfico 1), sugerindo que as partes aéreas da espécie em estudo possuem
metabólitos secundários, com efeito, vasorrelaxante. Com o objetivo de verificar se
esta resposta estaria relacionado aos constituintes químicos presentes na fase, que
obteve melhor rendimento no estudo fitoquímico da planta, buscou-se avaliar o efeito
de FPC. Esta fase clorofórmica apresentou um vasorrelaxamento, em anéis com e
sem endotélio funcional, com potência farmacológica e mesma magnitude de efeito
máximo do EPC (Gráfico 2), sugerindo assim, que os metabólitos presentes na fase
podem ser os responsáveis pelo efeito vasodilatador do extrato.
Em seguida, a fim de evidenciar se o flavonoide TMF seria o possível
responsável pela atividade relaxante sobre anéis de artéria mesentérica de ratos
promovida pelo extrato e fase obtidos de Praxelis clematidea, passou-se a investigar
o efeito deste composto majoritário isolado da FPC.
Por meio de estudos iniciais, observou - se que TMF induziu um
vasorrelaxamento dependente de concentração em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de ratos, com endotélio intacto, pré-contraídos com FEN, um agonista 1-
78
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
adrenérgico (BÜSCHER et al., 1999) (Gráfico 3). Comparando o perfil das curvas dos
efeitos induzidos por EPC, FPC e TMF, observa-se que o composto isolado apresentou
uma similaridade na resposta em relação ao extrato e a fase, sugerindo assim que o
flavonoide em estudo é um dos principais responsáveis pela resposta vasorrelaxante das
substâncias oriundas de Praxelis clematidea.
Estudos anteriores realizados por Tep-Areenan et al. (2010), foi constatado a
atividade vasorrelaxante induzida pelo TMF em anéis de aorta de rato, que envolveu dois
mecanismos distintos: um dependente e outro independente do endotélio vascular. Além
disso, os autores verificaram que a via NOS/NO/CGs, o aumento do efluxo de K+ e
inibição do influxo de Ca2+ participam deste efeito produzido pelo flavonoide. No entanto,
nenhum estudo investigando o efeito de TMF em outro tecido vascular havia sido
realizado.
É importante salientar que as respostas farmacológicas obtidas após
administração de determinadas substâncias podem variar devido a vários fatores, como
por exemplo, a especificidade desta por determinado sítio de ação, a densidade da
molécula–alvo sobre a qual age a substância, como também o tecido em qual a
molécula–alvo se encontre. Em relação às diferenças entre tecidos, os leitos vasculares
são distintos no que diz respeito à fisiologia, a densidade, ao tipo de receptores que
expressam, bem como a maneira que responde as várias substâncias (BYLUND, 1994;
GURNEY, 1994; INSEL, 1996; VANHEEL; VAN DE VOORDE, 2000; COX, 2002).
Exemplo destas diferenças foi observado em artéria coronária de cobaia que não
demonstrou relaxamento em resposta as prostaciclinas (KILPATRICK; COCKS, 1994).
Além disto, foi também observado que alguns antagonistas de canais para Ca2+ são mais
seletivos para determinados tecidos, como, por exemplo, o verapamil (cardioseletivo) e as
diiidropiridinas (capazes de relaxar o músculo liso vascular) (GURNEY, 1994).
Outro exemplo de variações na resposta farmacológica de acordo com o tecido
foi observado em artéria mesentérica e aorta, onde ambas responderam diferentemente a
serotonina e estas diferenças estavam relacionadas aos subtipos ou densidade dos
receptores para serotonina (ADEGUNLOYE; SOFOLA, 1997). O estudo realizado por
Sasaki et al. (2010), também relatou uma variação entre o efeito vasorrelaxante induzido
pelos metabólitos secundários da Caesalpinia sappan, ao utilizar metodologias in vitro
com aorta e mesentérica de ratos, fato justificado devido à divergência na participação
dos EDHF´s, como por exemplo, o NO, no mecanismo relaxante envolvido nestes dos
79
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
modelos vasculares. Desta forma, estes dados da literatura em conjunto fundamentam a
importância do estudo do TMF em outro tecido vascular, utilizando neste caso, artéria
mesentérica isolada de rato.
O efeito de flavonoides sobre a musculatura lisa vascular é objeto de pesquisa há
muitos anos. Vários estudos já demonstraram os diferentes mecanismos de ação
envolvidos no efeito relaxante destes metabólitos secundários em diferentes órgãos,
como exemplo, os estudos com a quercetina, considerado o flavonoide mais abundante
nas plantas e mais estudado pela literatura científica, que foi capaz de relaxar a
musculatura lisa vascular de artéria mesentérica e aorta isolados de ratos
normotensos (PEREZ-VIZCAINO et al., 2010). Com base nesta informação, buscou-se
comparar a potência do TMF e da quercetina em anéis de artéria mesentérica de rato.
Nestas condições, pode-se observar que o composto objeto desta pesquisa apresentou
uma similaridade na resposta vasorrelaxante, não apresentando diferença estatística nos
valores de pD2 e Emáx, quando comparado com a quercetina (Gráfico 4). Este resultado
evidencia a importância do estudo de TMF sobre artéria mesentérica isolada de rato,
desvendando o mecanismo de ação farmacológica envolvido neste efeito.
Vários trabalhos têm mostrado o importante papel desempenhado pelo endotélio
no controle do tônus vascular e pressão sangüínea (VANHEEL; VAN DE VOORDE.
2000), assim como, a participação do mesmo nos relaxamentos induzidos por uma
variedade de substâncias químicas, endógenas e exógenas (FURCHGOTT; ZAWADZKI,
1980; COHEN ; VANHOUTTE, 1995; CHAUHAN et al, 2003). As células endoteliais, em
resposta a uma variedade de estímulos fisiológicos tais como a bradicinina, acetilcolina,
histamina, substância P, estresse de cisalhamento, entre outros, liberam substâncias
vasodilatadoras, incluindo: as prostaciclinas, o NO e o EDHF (MONCADA; VANE,
1978; FURCHGOTT; ZAWADZKI, 1980; FÉLÉTOU; VANHOUTTE, 1988, VANHEEL
VAN DE VOORDE, 2000; MATOBA et al., 2002; KOZA et al., 2007; FORSTERMAN;
SESSA, 2011). Diante destes dados, passou-se a investigar a influência do endotélio
funcional na resposta vasorrelaxante induzida por TMF. Para tanto, foram realizados
experimentos com preparações pré-contraídas com FEN (1M), em que o endotélio foi
mecanicamente removido e comparamos a resposta relaxante deste flavonoide na
presença e na ausência do endotélio.
Nas condições citadas acima, a curva concentração-resposta induzida por
concentrações crescentes de TMF, em anéis de artéria mesentérica sem endotélio
80
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
funcional, foi deslocada significativamente para direita, sem alterações em seu valor de
efeito máximo (Gráfico 3), sugerindo que mediadores vasoativos liberados pelo endotélio
vascular parecem favorecer o efeito vasorrelaxante induzido por TMF. Além disto, pôdese constatar que este efeito envolve dois mecanismos básicos, um dependente do
endotélio vascular e outro independente do mesmo.
Com o objetivo de identificar qual fator derivado do endotélio vascular estaria
favorecendo a resposta vasodilatadora do TMF, realizaram-se experimentos
utilizando diversas ferramentas farmacológicas a fim de se descobrir quais os fatores
vasoativos endoteliais estavam envolvidos no efeito induzido pelo flavonoide.
A COX é uma enzima que catalisa a reação de metabolismo do ácido
araquidônico em metabólitos, dentre eles a PGI 2 que é um potente vasodilatador
derivado do endotélio vascular importante para a regulação do tônus muscular
(MONCADA; VANE, 1978; SHULZ; TRIGGLE, 1994). A PGI2 formada no endotélio
vascular se difunde até o as células musculares onde promove a ativação de
receptores IP, que estão acoplados a proteína Gs (COLEMAN et al., 1994), levando
à ativação da enzima adenilil ciclase (AC) levando a um aumento dos níveis de
monofosfato cíclico de adenosina (AMPc) no citosol. O aumento do AMPc ativa a
proteína cinase dependente de AMPc (PKA). Esta proteína quando ativada promove
fosforilações da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA), aumentado
a recaptação de cálcio do citosol para os estoques, promovendo a abertura de
canais para potássio, o fechamento de canais para cálcio na membrana e a inibição
da cinase da cadeia leve de miosina (MLCK). Estas sequências de fosforilações
levam à diminuição das concentrações de cálcio na célula muscular acarretando em
uma diminuição do tônus (FROLICH, 1990).
Para avaliar a influência da COX na resposta relaxante induzida por TMF,
realizou-se experimentos na presença de indometacina (10 µM), um inibidor não
seletivo desta enzima (CLARK; FUCHS, 1997). Nestas condições, a resposta
vasorrelaxante do flavonoide não sofreu alteração na potência e nem no efeito
máximo, quando comparado com o controle (Gráfico 5), sugerindo assim, que os
metabólitos da via do ácido araquidônico não participam desta resposta. Este dado
corrobora com os resultados obtidos por Tep-Areenan et al. (2010) em aorta de rato.
Outra via muito importante para o vasorrelaxamento e consequente regulação
do tônus vascular é a que envolve a produção do NO, considerado o principal fator
81
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
relaxante em muitos dos leitos vasculares (MAYER et al., 1999). O NO é um gás
lipossolúvel produzido pelas células endoteliais por ação da NOS e do complexo
cálcio/calmodulina (BREDT; SNYDER, 1990; BUSSE; MÜLSCH, 1990; MONCADA;
PALMER; HIGGS, 1991). A biossíntese do NO catalisada pela enzima NOS envolve
duas etapas de oxidação da L-arginina para L-citrulina, este mecanismo proposto
envolve uma hidroxilação inicial da L-arginina, levando a formação de NG-Hidroxi-Larginina, que pode também agir como substrato para NOS. Em seguida, ocorre uma
segunda hidroxilação no intermediário formado, usando um elétron do NADPH e
formando a L-citrulina e NO (GRIFFTH; STUEHR, 1995; MARLETTA, 1993; ABUSOUD et al., 1997; FORSTERMANN; SESSA, 2011).
Baseados na importância do NO no controle da homeostase vascular
realizou-se protocolos experimentais afim de verificar a participação da via Larginia/NO no vasorrelaxamento induzido por TMF. Para isto, utilizou-se o L-NAME
um inibidor não seletivo da NOS (ARNAL et al., 1993), e na presença desta
ferramenta farmacológica a resposta relaxante do flavonoide foi atenuada de
maneira significante, em relação ao controle, apresentando semelhança na potência
relaxante encontrada com a remoção do endotélio vascular (Gráfico 6), sugerindo o
envolvimento da NOS nesta resposta.
A concentração intracelular de L-arginina, substrato endógeno para a NOS,
pode ser um fator limitante da produção de NO (MONCADA; PALMER; HIGGS,
1993; CASEY et al., 2000). A presença de uma alta concentração de L-arginina no
meio (1000 vezes maior do que a de L-NAME) favorece a ligação do substrato ao
sítio da enzima, revertendo a inibição causada pelo L-NAME, sendo, um forte
indicativo do envolvimento da via L-arginina/NO nestas respostas. Com base nestes
dados, realizou-se o protocolo experimental com o pré-tratamento de L-arginina mais
L-NAME e nestas condições ocorreu uma reversão total do efeito inibitório do LNAME em preparações com anéis mesentéricos (Gráfico 6). Desta forma, estes
resultados reforçam o possível envolvimento da NOS na resposta relaxante induzida
por TMF.
Para confirmar se o NO seria o mediador responsável pela resposta
relaxante, dependente de endotélio vascular, induzida por TMF, utilizou-se o PTIO
(300 µM), um seuqestrador deste gás na célula (IKEDA et al., 1997). Nestas
condições, a resposta relaxante do flavonoide foi atenuada, nas mesmas proporções
82
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
observadas nas preparações pré-incubadas com L-NAME, reafirmando assim, a
participação deste gás como fator relaxante derivado do endotélio vascular
responsável por parte do efeito vasorrelaxante induzido pelo TMF (Gráfico 7).
É bem relatado na literatura que o NO, após sua formação pelas células
endoteliais, difunde-se para o músculo liso adjacente, devido suas características
lipossolúveis, e neste local ativa a CGs, enzima que é responsável por catalisar a
conversão de GTP em GMPc, resultando em um relaxamento da musculatura lisa
vascular por meio de um mecanismo mediado pela PKG. A PKG realiza fosforilações
intracelulares que promovem a uma diminuição dos níveis de Ca 2+ no interior da
célula muscular lisa, a inativação da MLCK e abertura de canais de K+ na membrana
plasmática, e esses processos juntos levam ao vasorrelaxamento (SABRANE et al.,
2003; MULLERSHAUSEN et al., 2003).
Para avaliar a participação da via de sinalização que envolve a ativação da
CGs, um importante alvo do NO, realizou-se experimentos na presença de ODQ (10
µM), um inibidor seletivo desta enzima (CERONI et al., 2007). Nestas condições o
vasorrelaxamento de TMF foi atenuado de maneira significante (Gráfico 8),
sugerindo o envolvimento da enzima CGs na resposta relaxante induzida pelo
flavonoide em anéis de artéria mesentérica de ratos, e confirmando o envolvimento
da via NO/CGs no efeito induzido por TMF, dados estes que estão de acordo com os
resultados obtidos, anteriormente, por Tep-Areenan et al. (2010) em estudo com
aorta de rato.
O papel dos canais de K+ no vasorrelaxamento induzido pela via do NO tem
sido extensivamente investigado em vasos de resistência (BOLOTINA et al., 1994;
MISTRY; GARLAND, 1998). Os canais para K+ pertencem a uma grande família de
proteínas integrais de membrana que têm um papel importante em processos
fisiológicos, desde a liberação de neurotransmissores, até a regulação do tônus
vascular (GHATTA et al., 2006). Estes canais são determinantes da pressão sanguínea
e do tônus vascular, estado contrátil das células musculares lisas presente na parede dos
vasos sanguíneos, pois eles ajudam a controlar o potencial de membrana no repouso,
bem como regulam o volume celular (LEDOUX et al., 2006). Os canais para K+ agem
como agentes hiperpolarizantes e promovem uma retroalimentação negativa na
excitação, de maneira que muitos são ativados pela despolarização de membrana
83
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
(Kv) e/ou aumento do Ca2+ citoplasmático, a exemplo dos Kca (THORNELOE;
NELSON, 2005).
Drogas vasodilatadoras, cujos mecanismos são dependentes de canais para
K+, têm uma redução de seus efeitos quando expostos a soluções com alta
concentração de K+, pelo fato de que esse aumento do K+ extracelular atenua o
gradiente deste íon através da membrana, tornando assim, a ativação destes canais
ineficaz (KHAN; HIGDON; MEISHERI, 1998; MENEZES et al., 2007). A principal
conseqüência do aumento da concentração extracelular de K+ (de 4 a 20 mm) é a
redução do gradiente eletroquímico para o efluxo deste íon. Sob esta condição
experimental, substâncias que abrem canais de K+, portanto, envolvidos na
vasodilatação, tem seu efeito atenuado (MISTRY et al., 1998; NELSON; QUAYLE,
1995; ADARAMOYE; MEDEIROS, 2009)
Para verificar se a via NO/CGs/PKG envolvida na resposta induzida pelo TMF
estaria ativando os canais K+ e deste modo, gerando vasorrelaxamento, utilizou-se
preparações incubadas com KCl 20 mM, condição em que promove bloqueio parcial do
efluxo de K+ por deslocar o potencial de equilíbrio do K+ (em torno de – 84 mV para -52
mV) para valores mais próximos do potencial de membrana no repouso dos miócitos (em
torno -60 a -40 mV) e atenuando desta forma relaxamentos mediados por abertura de
canais para K+ (GURNEY, 1994; CLARK; FUCHS, 1997). O aumento da [K+]
extracelular (de 4 para 20 mM) alterou significantemente o vasorrelaxamento
induzido por TMF, em anéis com endotélio funcional (Gráfico 9A), sugerindo que a
resposta relaxante induzida pelo flavonoide, provavelmente, envolve a participação
destes canais.
No intuito de reforçar que os canais para K+ tem participação no efeito
vasorrelaxante induzido por TMF, realizou-se experimentos na presença de TEA (3
mM), que nesta concentração é responsável por bloquear de maneira não seletiva
os canais para K+ (ROCHA; BENDHACK, 2009; SILVA et al., 2011). Nestas
condições experimentais, observou-se que o relaxamento produzido pelo flavonoide
foi significantemente atenuado (Gráfico 9B), corroborando assim, com a hipótese da
participação dos canais para K+ na resposta vasorrelaxante promovida pelo
composto em estudo, verificada no resultado observado com 20 mM de KCl.
Como o uso de KCl 20 mM ou TEA (3mM) não indicam o subtipo de canal
envolvido na resposta mediada pelo TMF, seguiu-se a investigação sobre quais tipos
84
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
de canais para K+ estariam envolvidos no mecanismo relaxante. Sabe-se que, na
artéria mesentérica são expressos dentre outros canais para K +, os KCa, os KATP, e
os KV (IUPHAR, 2002; HADDY; VANHOUTTE; FELETOU, 2006).
Dados da literatura relatam que a PKG hiperpolariza a membrana através da
ativação dos canais KATP em coronárias de humanos e em artéria mesentérica de
coelho, nesta última causando vasorrelaxamento (ARCHER et al., 1994). Estes
canais fecham-se com o aumento da concentração intracelular de ATP, entretanto
também são regulados por outras vias de transdução de sinal (JACKSON, 2000).
Para verificar se a ativação dos canais KATP está envolvida na resposta
induzida pelo TMF, gerando vasorrelaxamento, utilizou-se a glibenclamida (10 µM),
um inibidor seletivo para estes canais (OHRNBERGER; KHAN; MEISHERI,1993;
FAROUQUE; OMAR; MEREDITH, 2003). Após a realização deste protocolo
experimental, observou-se que a presença de glibenclamida não alterou a curva
concentração-resposta induzida pelo flavonóide, apontando assim, que os canais
KATP não participam da resposta vasorrelaxante induzida pelo TMF em anéis de
artéria mesentérica superior isolada de rato pré-contraídos com FEN.
Outro importante canal para K+, presente na mesentérica de rato, é o BKCa.
Este canal é ativado por voltagem ou em resposta ao aumento da concentração
citosólica de cálcio. A abertura deste canal tem como objetivo interromper, por
feedback negativo, a despolarização em eventos contráteis, desempenhando assim
grande importância no controle do tônus vascular (ASANO; MASUZAWA-ITO;
MATSUDA, 1993; BRAYDEN, 2002; CAI; GONG; PAN, 2007; JACKSON, 2000).
Estudos prévios indicam que o NO ativa os BKCa por meio da PKG, por modulação
direta, ou pela combinação destes dois mecanismos (ROBERTSON et al., 1993;
BOLOTINA et al., 1994; GEORGE; SHIBATA, 1995; PENG; HOIDAL; FARRUKH,
1996; ZHOU et al., 1996; SANSOM et al., 1997).
Com o objetivo de investigar se BKCa estaria envolvido na resposta
vasodilatadora de TMF, utilizou-se preparações incubadas com TEA, que pode atuar
como um bloqueador dos canais para K+ sensíveis a cálcio de grande condutância,
na concentração de 1 mM (Kd = 0,29mM) (LANGTON et al., 1991; WALLNER;
MEERA; TORO, 1999; WHITE et al., 2002; SILVA et al.; 2011). Na presença desta
ferramenta farmacológica, observou-se uma atenuação no efeito vasorrelaxante
85
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
produzido pelo flavonóide (Gráfico 11), apontando para uma possível participação
dos BKCa na ação induzida pelo composto e corroborando com os relatos anteriores.
Além dos KATP e BKCa, um outro tipo de canal expresso nas células
musculares lisas são os canais para K+ sensíveis à voltagem (KV), ativados por
despolarização celular e que apresentam importante papel na determinação do
tônus muscular e regulação do potencial de membrana (JACKSON, 2000; DORA;
GARLAND, 2001; XU et al., 1999; YU; CATTERALL, 2004). Relatos mostram que na
hipertensão crônica, onde a disponibilidade de NO é diminuída, estes canais
encontram-se inibidos, sugerindo dessa forma a atuação do NO na modulação dos
mesmos (YUAN et al., 1996; IRVINE; FAVALORO; KEMP-HARPER, 2003,
JACKSON, 2005; VANHOUTTE; FÉLÉTOU; TADDEI, 2005)
Para avaliar a participação dos KV no efeito induzido por TMF em artéria
mesentérica superior isolada de rato com endotélio funcional utilizou-se o 4-AP (1
mM), um bloqueador seletivo para KV (BERG, 2002), nestas condições observou-se
uma atenuação no efeito vasorrelaxamento induzido pelo flavonóide, sugerindo a
participação destes canais na resposta vasodilatadora.
Desta forma, os resultados até então obtidos em anéis de artéria mesentérica
com endotélio funcional permitem concluir que o efeito de TMF envolve a ativação
da enzima eNOS,
com conseqüente participação da via NOS/NO/CGs e
envolvimento dos canais BKca e Kv, produzindo assim, o relaxamento da musculatura
lisa vascular.
Como parte do efeito do flavonoide se dá de forma independente do endotélio
funcional, resolveu-se então investigar o mecanismo vasorrelaxante do TMF sobre o
músculo liso vascular.
Uma importante via de sinalização celular, que pode ser ativada para promover
vasorrelaxamento, é a ativação de canais para K+ diretamente no músculo liso vascular,
independente do endotélio vascular, promovendo assim, o aumento do efluxo deste íon,
com conseqüente hiperpolarização (NELSON et al., 1995). Baseado nesta informação
buscou-se investigar se o TMF estaria promovendo seu efeito por este mecanismo de
ação, para isto, realizou-se protocolos com anéis artérias mesentéricas isolada de ratos
sem endotélio funcional pré-incubados com 20 mM de KCl ou TEA (3mM), e nestas
condições experimentais, não ocorreu alteração significativa nem na potência e nem no
efeito máximo na resposta vasorrelaxante induzida pelo flavonoide (Gráfico 13A e B),
86
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
sugerindo assim, que a ativação dos canais para K+ envolvida na resposta vasorrelaxante
do flavonoide é dependente da presença do endotélio vascular.
Como em todas as células musculares, a musculatura lisa vascular utiliza
Ca2+ como um mecanismo de acionamento no processo de contração. O influxo de
Ca2+ através de CaV da membrana plasmática e liberação de cálcio dos estoques
intracelulares são as principais fontes para a ativação do mecanismo da contração
(JACKSON, 2000). No músculo liso, independente da via de sinalização envolvida
no processo de contração, uma redução dos níveis de Ca2+ intracelular leva ao
relaxamento (NELSON; QUAYLE, 1995).
É bem descrito na literatura que o aumento na concentração de potássio
extracelular induz uma despolarização de membrana, promovendo a abertura de
CaV, levando a um aumento do influxo de Ca2+ na célula gerando uma contração
(REMBOLD, 1996). Este fenômeno pode ser observado quando se eleva a
concentração externa de potássio com uma solução despolarizante com elevado
potássio (60 mM de KCl).
Com a finalidade de verificar a resposta do flavonoide frente às contrações
geradas por diferentes estímulos, passou-se a avaliar o efeito do TMF em preparações
pré-contraídas com solução despolarizante de KCl 60 mM. Em experimentos realizados
nestas condições, o composto em estudo promoveu um relaxamento dependente de
concentração nos anéis de artéria mesentérica superior de ratos, sugerindo que o
flavonoide possui efeito em contrações induzida tanto por um agonista adrenérgico
como por um agente despolarizante, caracterizando assim, uma ação inespecífica
que envolve um passo comum na via de sinalização celular dos agentes
contracturantes empregados, o aumento citosólico dos níveis de cálcio (GALICIA et
al., 2008).
Existem várias evidências que um grande número de substâncias derivadas de
plantas medicinais, inclusive a substância objeto deste estudo em experimentos com
aorta de rato, altere a mobilização Ca2+ nas células musculares lisas (OLIVEIRA et al.,
2006; ADARAMOYE et al., 2009; TEP-AREENAN et al., 2010). Além disso, como o tônus
induzido por solução despolarizante com alta concentração de K+ é mediado, dentre
outros mecanismos, pelos Cav (KARAKI; OZAKI; HORI, 1997) e TMF se mostrou capaz
de induzir relaxamento nestas condições, é sugestivo que o flavonoide pode modificar o
87
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
influxo de cálcio por estes canais em artéria mesentérica de rato, diminuindo assim, a
entrada deste íon na célula muscular lisa.
Baseados em tais relatos, buscou-se observar se o efeito vasorrelaxante induzido
por TMF estava relacionado à inibição do influxo de Ca2+ via Cav. Para verificar essa
hipótese investigou-se o efeito do flavonoide frente às contrações induzidas por
CaCl2, em meio despolarizante nominalmente sem cálcio. Este protocolo
experimental fundamenta-se no fato de que as contrações induzidas por CaCl2 são
geradas, quase que exclusivamente, pelo influxo de Ca 2+, já que a despolarização
promovida por concentrações elevadas de K+ extracelular induz a abertura dos Cav
(RATZ; BERG, 2006). Nestas condições, TMF atenuou significativamente as
contrações induzidas por CaCl2, de maneira dependente de concentração (Gráfico
15). Estes resultados sugerem que o efeito vasorrelaxante induzido pelo flavonoide
pode ser devido a uma possível influência sobre os Ca v, resultando em uma
diminuição do influxo de Ca2+ no músculo liso de artéria mesentérica superior isolada
de rato, levando a vasodilatação.
A superfamília dos Cav é constituída por pelo menos 10 membros
distribuídos em muitos tecidos. Nas CMLV dois tipos principais são expressos, os
Cav1 (tipo-L) e os Cav3 (tipo-T). Os primeiros que são caracterizados pela
sensibilidade a diidropiridinas, uma classe de drogas usadas clinicamente no
tratamento da hipertensão por bloquear seletivamente os Ca v (NELSON et al.,
1990). Os canais sensíveis a diidropiridinas, localizados nos vasos sanguíneos, são
referidos como Cav 1.2 e considerados os mais expressos nestas células, exercendo
um papel relevante na regulação da resistência vascular e, consequentemente, na
pressão sanguínea (CATERRAL et al., 2005; KEEF; HUME; ZHONG, 2001).
Para confirmar o envolvimento dos Cav na resposta vasodilatadora induzida
por TMF, analisou-se seu efeito anéis de artéria mesentérica, sem endotélio
funcional, pré-incubados com nifedipino (1 µM), um bloqueador dos canais de Ca v
tipo L (SOFOLA; ADEGUNLOYE; KNILL, 2003; MISFELDT et al., 2010). Nesta
situação, observou-se uma diminuição considerável do efeito induzido pelo
flavonoide, quando comparado com os anéis controles (Gráfico 16), corroborando
assim, com a hipótese da participação da inibição do influxo de Ca2+ pelos Cav tipo
L, no vasorrelaxamento induzido por TMF.
88
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
Desse modo, os resultados obtidos sugerem que a Praxelis clematidea
apresenta-se como uma promissora espécie vegetal, possuindo metabólitos secundários
com atividade vasorrelaxante, sendo o TMF, composto isolado em maior quantidade da
planta, o possível responsável por este efeito em anéis de artéria mesentérica superior
isolada de rato. Além disso, observa-se que a resposta relaxante da musculatura lisa
vascular induzida pelo flavonóide envolve duas vias de sinalização, uma dependente do
endotélio funcional; por meio da via NOS/NO/CGs e ativação dos canais BKCa, e KV; e
uma independente do endotélio; através, pelo menos em parte, da inibição do influxo de
Ca2+ via canais Cav nas células musculares lisas. No entanto, tornam-se necessárias
investigações futuras, a fim de se desvendar o completo mecanismo de ação do TMF
sobre a musculatura lisa vascular.
Conclusão
90
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
7 CONCLUSÕES
Em conclusão, estes resultados, obtidos utilizando metodologias in vitro,
demonstram que:
1) EPC, FPC e TMF produzem vasorrelaxamento em anéis de artéria
mesentérica superior isolada de rato, com perfil farmacológico similar.
2) O efeito vasorrelaxante do TMF envolve a ativação da via NOS/NO/CGs e
conseqüente ativação dos canais para K+;
3) O bloqueio do influxo de cálcio, por meio dos canais de Ca v do tipo-L,
participa do efeito induzido pelo TMF.
Perspectivas
92
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
8
PERSPECTIVAS
 Realizar dosagem de NO utilizando técnicas de citometria de fluxo, para
corroborar com os resultados apresentados, mostrando a participação deste
gás no efeito induzido pelo TMF;
 Avaliar a ação de TMF sobre a mobilização do Ca2+ intracelular das células
musculares lisas vasculares;
 Avaliar o efeito do TMF sobre os Cav utilizando técnicas eletrofisiológicas;
 Investigar os efeitos de TMF in vivo sobre pressão arterial e freqüência
cardíaca em ratos normotensos e hipertensos procurando elucidar os
possíveis mecanismos implicados nestes efeitos.
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94
OLIVEIRA-FILHO, A. A.
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