ALINE PEREIRA OLIVEIRA
Influência de medicações intracanal utilizadas em procedimentos
endodônticos regenerativos na sobrevivência de células
da papila apical in vitro
São Paulo
2014
ALINE PEREIRA OLIVEIRA
Influência de medicações intracanal utilizadas em procedimentos
endodônticos regenerativos na sobrevivência de células
da papila apical in vitro
Versão Corrigida
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia da Universidade de São
Paulo, para obter o título de Mestre, pelo
Programa
de
Pós-Graduação
em
Odontologia.
Área de Concentração: Endodontia
Orientador: Prof. Dr. Celso Luiz Caldeira
São Paulo
2014
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou
eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.
Catalogação-na-Publicação
Serviço de Documentação Odontológica
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo
Oliveira, Aline Pereira.
Influência de medicações intracanal utilizadas em procedimentos endodônticos
regenerativos na sobrevivência de células da papila apical in vitro/ Aline Pereira
Oliveira ; orientador Celso Luiz Caldeira. -- São Paulo, 2014.
91 p. : fig.; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) -- Programa de Pós-Graduação em Odontologia. Área
de Concentração: Endodontia. -- Faculdade de Odontologia da Universidade de
São Paulo.
Versão corrigida
1. Medicação endodôntica intracanal. 2. Sobrevivência celular. 3. Papila
dentária. I. Caldeira, Celso Luiz. II. Título.
Oliveira AP. Influência de medicações intracanal utilizadas em procedimentos
endodônticos regenerativos na sobrevivência de células da papila apical in vitro.
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo
para obtenção do título de Mestre em Odontologia.
Aprovado em:
/
/2015
Banca Examinadora
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Instituição: ________________________Julgamento: ______________________
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Instituição: ________________________Julgamento: ______________________
Prof(a). Dr(a).______________________________________________________
Instituição: ________________________Julgamento: ______________________
Aos meus pais Sônia e José, de quem recebi
um amor imensurável e incondicional, os principais
responsáveis pelos princípios e valores que adquiri!
Ao meu marido Renan pelo amor, companheirismo,
paciência e apoio em todos os momentos.
Ao meu filho Lucas, ainda em meu ventre,
o meu maior tesouro. Amor infinito.
AGRADECIMENTOS
A Deus, por sempre iluminar o meu caminho e me conduzir de maneira brilhante
sem me desamparar se quer por um momento;
Aos meus pais, Sônia e José, que sempre me incentivaram e apoiaram em todos os
momentos da minha vida com muito amor, carinho e dedicação. Amo vocês
infinitamente;
Ao meu marido Renan, grande amor da minha vida, pelo amor, paciência, apoio em
tantos momentos difíceis;
Ao meu irmão Alisson, meu grande amigo, com quem compartilho momentos alegres
e tristes, o meu grande incentivador sempre, afinal sou seu presente de aniversário
de sete anos! À minha cunhada Patrícia e aos meus sobrinhos Giovanna e Lorenzo
sempre tão presentes;
Ao meu irmão Alex, sempre sereno e muito objetivo, qualidade esta que sempre
almejo e que ele exerce com tanta facilidade, obrigada pelos conselhos muito sábios
e válidos sempre. À minha cunhada Gilmara pela amizade e sobrinha Isabella, pelo
intenso carinho;
Às minhas tias Suzana, Lola e Maria, sempre muito preocupadas com o meu bem
estar e com meu nome sempre presente em suas orações;
Às minhas grandes amigas Amanda, Laís, Nágila e Ana Laura, amizades que vou
levar para o resto da vida, vocês foram essenciais, fundamentais para que eu
conseguisse chegar até aqui, sempre presentes, seja com uma frase de incentivo,
uma gíria paraense, uma história engraçada, um desabafo ou até mesmo um abraço
acolhedor. Amo vocês do fundo do coração!
Aos meus amigos pós graduandos e estagiários Alexandre, Elaine, Vitor, Cléber,
Laila, Márcia, Edgar, Alessandra, Valéria e Leonardo, pela convivência e apoio
sempre;
Ao meu orientador professor Dr. Celso Luiz Caldeira pela oportunidade de trabalhar
contigo, pela assistência, conhecimentos concedidos e pela amizade;
À minha co-orientadora professora Dr(a). Carla Renata Sipert por todo o empenho
neste trabalho desde o início, por quem fui treinada no laboratório de cultura celular
e com quem adquiri todo o conhecimento nesta linha de pesquisa, a qual me
apaixonei.
Ao professor Dr. Giulio Gavini, pelas aulas e seminários que contribuíram de
maneira relevante na confecção desta dissertação, assim como por todo o
conhecimento em Endodontia direcionado;
Ao professor Dr. Manoel Eduardo de Lima Machado pelos anos de convivência na
graduação no período noturno e por conceder a primeira oportunidade de ministrar
uma aula em minha cidade natal Catanduva;
À professora Dr(a). Márcia Martins Marques, por permitir o uso de seu laboratório e
contribuir com seu conhecimento, fundamental para a conclusão de minha pesquisa;
À turma do Laboratório de pesquisa Básica do Departamento de Dentística:
funcionária Débora e todos os alunos: Renata, Rejane, Sueli, Sttela, Sttelinha, Fabi,
Paula, Ana Clara, Gabriela e Mari pela companhia e pela troca de conhecimentos
para aprimorar esta pesquisa;
Aos funcionários do Departamento de Dentística: Selma, sempre muito solícita, Aldo
e Arnaldo (Paixão) sempre muito alegres, bem humorados e muito prestativos;
Às funcionárias da biblioteca: Glauci, Vânia e Cláudia pela eficiência e por toda a
paciência;
Ao Marcos (xerox) sempre muito prestativo e eficiente.
"As palavras só têm sentido se nos ajudam a ver o mundo melhor.
Aprendemos palavras para melhorar os olhos."
"Há muitas pessoas de visão perfeita que nada vêem...
O ato de ver não é coisa natural.
Precisa ser aprendido!"
Rubem Alves
RESUMO
Oliveira AP. Influência de medicações intracanal utilizadas em procedimentos
endodônticos regenerativos na sobrevivência de células da papila apical in vitro
[dissertação]. São Paulo: Universidade de São Paulo, Faculdade de Odontologia;
2014. Versão Corrigida.
Procedimentos
endodônticos
regenerativos
proporcionaram
mudanças
no
tratamento de pacientes com dentes imaturos e periodontite apical possibilitando
desenvolvimento radicular completo e menor incidência de fratura dental.
Medicações intracanal são utilizadas para a realização da desinfecção; entretanto, o
efeito delas sobre às células da papila apical é pouco elucidado. Adicionalmente,
pouco se conhece a respeito do efeito destas substâncias sobre células previamente
submetidas à condição pró- inflamatória. O objetivo deste estudo foi avaliar a
citotoxicidade
de
medicações
intracanal
empregadas
em
procedimentos
regenerativos em Endodontia sobre células de papila humana em cultura em
condição fisiológica e ativada. Cultura de células foi estabelecida a partir da papila
apical removida de um terceiro molar imaturo extraído. As substâncias estudadas
foram a pasta tripla antibiótica modificada: ciprofloxacina, metronidazol e
cefalosporina (1:1:1); CFC: ciprofloxacina, metronidazol e hidróxido de cálcio (1:1:2)
e CFC modificado: ciprofloxacina, metronidazol e hidróxido de cálcio (2:2:1). Parte
das células foram estimuladas previamente por ácido lipoteicóico (LTA) de
Enterococcus faecalis por 7 dias. Após plaqueamento, células foram expostas a
concentrações crescentes das medicações por 1, 3, 5 e 7 dias. Foram avaliados
viabilidade celular por meio de brometo de 3-(4,5-dimetiliazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio
(MTT) e liberação de óxido nítrico (NO) pelo método de Griess. A análise estatística
foi realizada por meio de análise de variância a 1 critério (ANOVA) seguida de pós
teste de Tukey, com nível de significância de 5%. O CFC modificado foi a medicação
que demonstrou menor efeito citotóxico sobre a viabilidade celular nos tempos
experimentais
estudados,
o
CFC
promoveu
queda
da
viabilidade
celular
especialmente após 7 dias de contato. A pasta tripla antibiótica modificada resultou
em comprometimento importante da viabilidade podendo ser considerada a mais
citotóxica. A ativação celular por LTA resultou em níveis aumentados de atividade
mitocondrial para todas as medicações sendo mais evidente nos períodos
experimentais mais longos. A ativação celular também contribuiu para níveis maiores
de óxido nítrico. Conclui-se que o efeito citotóxico das medicações testadas é
dependente de sua concentração, tempo de contato e condição celular, sendo a
pasta tripla antibiótica modificada a mais citotóxica em concentrações elevadas
podendo implicar clinicamente na diminuição da viabilidade das células da papila
apical podendo diminuir o sucesso dos procedimentos regenerativos.
Palavras chave: Sobrevivência celular. Papila dentária. Endodontia.
ABSTRACT
Oliveira AP. Influence of intracanal medications used in regenerative endodontic
procedures on survival of apical papilla cells in vitro [thesis]. São Paulo: Universidade
de São Paulo, Faculdade de Odontologia; 2014. Versão Corrigida.
Regenerative Endodontic procedures have provided changes in treatment of patients
with immature teeth and apical periodontitis enabling full root development and lower
incidence of dental fracture. Intracanal dressings are used for disinfection; however,
their effect on apical papilla cells is poorly elucidated. Additionally, the effect of these
substances on cells previously subjected to proinflammatory condition is still
unknown. The aim of this study was to evaluate the cytotoxicity of intracanal
dressings used in Endodontics regenerative procedures on cultured human apical
papilla cells at physiologic and activated condition. Cell culture was established from
the apical papilla removed from an extracted immature third molar. The substances
studied were triple antibiotic modified paste: ciprofloxacin, metronidazole and
cephalosporin (1:1:1); CFC: ciprofloxacin, metronidazole and calcium hydroxide
(1:1:2) and modified CFC: ciprofloxacin , metronidazole
and calcium hydroxide
(2:2:1). Part of the cells was stimulated previously with lipotheichoic acid (LTA) of
Enterococcus faecalis por 7 days. Once plated, cells were exposed to increasing
concentration of the medications for 1, 3, 5 and 7 days. Cell viability was evaluated
by means of 3-bromide (4.5-dimetiliazol-2-yl) -2.5-difeniltetraze (MTT) and Nitric
Oxide (NO) release was assessed by the Griess method. The statistical analysis was
done through analysis of variance with 1 criteria (ANOVA) followed by Tukey test with
5% of significance level. Modified CFC was the medication that demonstrated the
less cytotoxic effect on cell viabilityat the experimental periods studied while CFC
promoted significant decrease on cell viability specially after 7 days of contact. The
modified triple antibiotic paste resulted in important alteration of cell viability being
considered the most citotoxic. Cellular activation by LTA resulted in increased levels
of mitochondrial activity for all medications being more evident at the longer
experimental periods. Cellular activation also contributed to higher levels of nitric
oxide release. In conclusion, the cytotoxic effect of the tested medications is
dependent on concentration, time of contact and cellular condition, being the triple
antibiotic modified paste the most cytotoxic in high concentrations leading clinically in
the decreased of the cells viability of the apical papilla, decreasing the success of
regenerative procedures.
Keywords: Cell survival. Dental papila. Endodontics.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ADA
American Dental Association – Associação Dental Americana
Ca(OH)2
hidróxido de cálcio
BSP
bone sialoprotein
CEM
mistura enriquecida de cálcio
CFC
ciprofloxacina - flagyl – hidróxido de cálcio
cm2
centímetros quadrados
CO2
dióxido de carbono
DMEM
Dulbecco `s Modified Eagle`s Medium – Meio de Eagle
modificado por Dulbecco
DMSO
dimetilsulfóxido
DMP-1
dentin matrix protein- 1
DPSCs
células da polpa dental
DNA
deoxyribonucleic acid – ácido desoxirribonucleico
EDTA
ácido etilenodiaminotetraacético
et al.
e colaboradores
E. faecalis
Enterococcus faecalis
FOUSP
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo
iNOS
Inducible nitric oxide synthase – síntase de óxido nítrico induzido
IRM
material restaurador intermediário
LPS
lipopolissacarídeo
LTA
Lipoteichoic acid – ácido lipoteicóico
MOD
CFC modificado
MTA
Mineral Trioxide Aggregate – Agregado de trióxido mineral
MTAD
tiossulfato 3%, ácido cítrico 4,25% e detergente Polisorbato
0,5%
MTT
3-bromide
(4.5-dimetiliazol-2-yl)
-2.5-difeniltetrazólio
–
3-
(brometo de 4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolio
NADPH
fosfato denucleotídeo adenina nicotinamida
nm
namômetros
NaNO2
nitrito de sódio
NaOCl
hipoclorito de sódio
NED
cloreto de N-(1-naftilenodiamino)
NF-kB
factor nuclear kappa B – fator nuclear kappa B
NK
células natural Killer
NO
nitric oxide – óxido nítrico
NO2 -
nitrito
NOS
nitric oxide synthase- óxido nítrico sintase
PAMPs
padrões moleculares associados a patógenos
PBS
Phosphate Buffered Saline- Tampão fosfato salina
PRP
plasma rico em plaquetas
pH
potencial hidrogeniônico
RNA
Ribonucleic Acid – ácido ribonucleico
REPs
regenerative
endodontic
procedures
-procedimentos
endodônticos regenerativos
ROS
Reactive Oxygen Species – espécies reativas de oxigênio
SBF
soro bovino fetal
SCAPs
células da papila apical
TA
temperatura ambiente
TAP mod
pasta tripla antibiótica modificada
TLR
Toll-like receptor – receptor do tipo Toll
TGF
Transforming
Growth
Factor
–
Fator
de
crescimento
transformador
TN-α
fator de necrose tumoral
TRE
regenerative
endodontic
therapy-
terapia
endodôntica
regenerativa
VBNC
viable but nonculturable - viável mas não cultivável
VEGF
Vascular Endotelial Growth Factor – Fator de crescimento
vascular endotelial
µg
micrograma
μM
micromolar
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 18
2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................ 21
2.1 TERAPIA ENDODÔNTICA REGENERATIVA............................................ 21
2.2 TÉCNICAS EMPREGADAS ....................................................................... 24
2.2.1 Descontaminação passiva .................................................................... 24
2.2.2 Substâncias químicas ........................................................................... 25
2.2.3 Medicações intracanal .......................................................................... 26
2.2.4 Número de sessões............................................................................... 30
2.2.5. Scaffold- coágulo sanguíneo .............................................................. 31
2.2.6 Selamento .............................................................................................. 32
2.3 CITOTOXICIDADE DAS MEDICAÇÕES SOBRE
CÉLULAS DA PAPILA APICAL ................................................................. 33
2.4 CONDIÇÃO PRÓ-INFLAMATÓRIA ............................................................ 36
3 PROPOSIÇÃO .............................................................................................. 40
4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................. 41
4.1 ASPECTOS ÉTICOS.................................................................................. 41
4.2 COLETA DO TECIDO E ESTABELECIMENTO
CULTURA PRIMÁRIA ................................................................................ 41
4.3 PREPARO DOS MEDICAMENTOS ........................................................... 42
4.4 CONDICIONAMENTO DOS MEIOS DE CULTIVO
E DILUIÇÃO SERIADA .............................................................................. 43
4.5 PLAQUEAMENTO E ESTIMULAÇÃO DAS CÉLULAS DE PAPILA
APICAL COM AS MEDICAÇÕES INTRACANAL ...................................... 44
4.6 GRUPOS EXPERIMENTAIS ...................................................................... 44
4.7 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE POR MTT .............................................. 45
4.8 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO .............................................................. .46
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ............................................................................ 46
5 RESULTADOS .............................................................................................. 47
5.1 CITOTOXICIDADE DAS MEDICAÇÕES SOBRE
CÉLULAS DA PAPILA APICAL ................................................................. 47
5.2 PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO POR CÉLULAS DA PAPILA APICAL
EM CONTATO COM AS MEDICAÇÕES INTRACANAL ........................... 56
6 DISCUSSÃO ................................................................................................. 65
7 CONCLUSÕES ............................................................................................. 74
REFERÊNCIAS ............................................................................................... 75
ANEXOS .......................................................................................................... 89
.
18
1 INTRODUÇÃO
O trauma dentário, considerado um problema de saúde pública mundial, é o
grande responsável por lesões à estrutura do periodonto e polpa que podem
provocar danos a função do sistema estomatognático e estética, além de causar
problemas psicológicos ao paciente.
As principais alterações pulpares decorrentes do traumatismo referem-se à
mortificação pulpar, calcificação e reabsorção radicular. A necrose é a mais
frequente e a faixa etária prevalente é composta por jovens em desenvolvimento.
Sendo assim, a formação radicular pode ser comprometida se houver algum dano à
papila apical. A formação radicular decorre de estímulos provindos da bainha
epitelial de Hertwig sobre odontoblastos viáveis de um dente com rizogênese
incompleta (Zeichener et al., 2003). Agressões ao tecido pulpar em dentes em
desenvolvimento ocasionam interrupção da formação radicular e consequente
condição anatômica desfavorável para a funcionalidade e para o tratamento
endodôntico convencional. Portanto, preconizam- se tratamentos com indução do
coágulo que visem o aumento da espessura radicular até o fechamento da abertura
apical, por meio da prevenção de invasão microbiana ou eliminação de infecção
existente (Whittle, 2000).
O tratamento de dentes imaturos com periodontite apical sempre foi um
grande desafio na Odontologia. Resultantes de cárie ou trauma, o comprometimento
pulpar leva à interrupção do desenvolvimento radicular deixando suas paredes
radiculares finas e frágeis, com ápice aberto e susceptíveis à fratura.
O tratamento Endodôntico convencional se baseia em procedimentos que têm
como objetivo eliminar a infecção existente e prevenir a invasão microbiana, com
trocas constantes de hidróxido de cálcio para posterior formação de uma barreira
calcificada (apicificação). No entanto, para formação da barreira apical, são
necessárias múltiplas trocas prolongando o tempo de tratamento que pode levar à
alteração de propriedades mecânicas da dentina, deixando as paredes do canal
susceptíveis à fratura, além da barreira ter consistência porosa e não contínua. O
canal fica susceptível à reinfecção por ser coberto por um selamento temporário e
pelo longo tempo de tratamento.
19
Além dessa técnica, outros métodos têm sido descritos como a barreira apical
artificial de Agregado de Trióxido Mineral (MTA) para facilitar a posterior obturação
do canal radicular. Esta técnica, que surgiu como alternativa à técnica clássica de
apicificação, tem como principal vantagem o fato de ser realizada em poucas
sessões permitindo a breve finalização do tratamento.
A desvantagem de ambos tratamentos mencionados é que nenhum deles
resulta em espessamento das paredes radiculares e no desenvolvimento contínuo
da raiz. Estes fatores são de grande importância, uma vez que 60% de todos os
dentes tratados endodonticamente com rizogênese incompleta sofrem fraturas
radiculares (Trope; Ray, 1992).
A terapia endodôntica regenerativa (TRE)
definida pela Associação
Americana de Endodontia como procedimentos com base biológica designados a
reparar danos estruturais, incluindo dentina e estruturas radiculares, bem como
células do complexo dentina-polpa, fornece um tratamento alternativo com princípios
da medicina regenerativa e da engenharia tecidual.
Para o sucesso dos procedimentos endodônticos regenerativos (REPs) são
necessários três fatores importantes: a desinfecção do canal radicular, uma matriz
para a condução da proliferação celular e um bom selamento do acesso coronário. É
fundamental que os microrganismos no interior dos canais radiculares sejam
reduzidos ao mínimo por meio de substâncias irrigadoras e medicação intracanal ao
mesmo tempo em que as células da papila sobrevivam ao tratamento antisséptico.
O protocolo introduzido por Banchs e Trope (2004) envolve o uso de uma
medicação intracanal utilizada para realizar a antissepsia do canal radicular e a
indução de sangramento para criar uma matriz: o coágulo, para o crescimento
interno de tecido novo vital no espaço do canal radicular. Células-tronco
provenientes de remanescentes vitais pulpares, da papila apical e do ligamento
periodontal têm sido sugeridos como os responsáveis pela formação do tecido
(Huang et al., 2008). Os resultados clínicos dos procedimentos endodônticos
regenerativos são favoráveis, incluindo aumento da espessura e extensão radicular
e remissão do quadro clínico infeccioso.
Vários relatos de caso e alguns estudos clínicos demonstraram resultados
promissores dessa terapia em dentes com rizogênese incompleta, diferindo entre os
20
protocolos a medicação intracanal utilizada, substâncias irrigadoras, dentre outros. É
de grande importância avaliar não somente a eficácia antimicrobiana dessas
medicações, mas também a citotoxicidade das pastas sobre as células da papila
apical.
Há estudos in vitro que avaliam a citotoxicidade de substâncias sobre células
de papila analisando o efeito das medicações sobre células em condição de
homeostasia (Ruparel et al., 2012; Chuensombat et al., 2013). Entretanto, em
quadros de periodontite apical em dentes com rizogênese incompleta, as células da
papila que eventualmente tenham sobrevivido se encontram em um ambiente próinflamatório resultante da presença de microrganismos na cavidade pulpar e de
mediadores inflamatórios liberados por células da polpa, da própria papila ou dos
tecidos periapicais. Sendo assim, este estudo avaliará a susceptibilidade de células
de papila apical a medicações intracanal previamente submetidas a condição próinflamatória.
As pastas medicamentosas utilizadas para os REPs geralmente incluem
antibióticos (como cefalosporina, minociclina, ciprofloxacino e metronidazol) e
antimicrobianos (como o hidróxido de Cálcio). Os primeiros utilizados rotineiramente
em quadros de dentes com formação completa e infecção persistente (Masiero et
al., 2010) e os segundos em situações para indução de mineralização, na inativação
de endotoxina ou hidrólise do LPS (Mohammadi; Dummer, 2011, Safavi; Nichols,
1993).
A associação de ambas parece promissora como medicação intracanal em
dentes imaturos e principalmente na assepsia dos canais que serão submetidos ao
procedimento regenerativo.
Diante do exposto, tendo em vista a constante busca pela medicação
intracanal mais apropriada, capaz de promover antissepsia e apresentar baixa
citotoxicidade, há que se estudar o efeito desses materiais em condição próinflamatória, assim como avaliar materiais que possam ser promissores como
medicação intracanal em dentes imaturos com periodontite apical. Neste contexto,
há que se testar o efeito de materiais que associados possam somar ou
potencializar características físicas, químicas e biológicas fundamentais na
Endodontia regenerativa.
21
2 REVISÃO DE LITERATURA
Dentro da Endodontia a terapia regenerativa vem como uma alternativa de
tratamento que permite que dentes imaturos com periodontite apical sofram aumento
de espessura de paredes e do seu comprimento diminuindo a incidência de fratura e
perda do elemento dental, assunto de grande relevância que merece ser explorado.
2.1 TERAPIA ENDODÔNTICA REGENERATIVA
A terapia regenerativa surgiu como uma alternativa promissora com dois
conceitos que se enquadram no tratamento de dentes não vitais (Bansal; Bansal,
2011). O primeiro refere-se à regeneração pulpar, no qual se estuda o
desenvolvimento de novo tecido pulpar in vitro a partir de células indiferenciadas
estimuladas por fatores de crescimento, com o objetivo de regenerar o tecido pulpar
perdido (Zhang; Yelick, 2010; Neha et al., 2011; Bansal; Bansal, 2011). O segundo
conceito pode ser definido como a invaginação de células indiferenciadas da região
apical de dentes de pacientes jovens com ápice aberto (Zhang; Yelick, 2010).
Acredita-se que essas células indiferenciadas possam sobreviver à necrose pulpar,
mesmo na presença de infecção perirradicular (Huang et al., 2008).
Este conceito iniciou em pesquisas das décadas de 50 e 60 com um enfoque
diferente da atualidade. Os estudos abordavam dentes reimplantados ou
transplantados em que eram avaliados a revascularização do compartimento
radicular contendo tecido pulpar isquêmico e puderam observar a ocorrência de
revascularização desse tecido após 48 horas por meio de um fenômeno chamado
embebição plasmática (Hale, 1954; Myers; Flanagan, 1958; Pafford, 1956). NygaardOstby (1961) em estudo histológico em cães observou que após a desinfecção do
canal radicular, a presença de sangramento com a formação do coágulo sanguíneo
foi essencial para a formação de tecido conjuntivo fibroso no canal vazio. Esses
estudos foram relevantes para que a partir do ano 2000, a terapia endodôntica
regenerativa (TRE) pudesse ser estudada como uma alternativa à apicificação.
22
A revascularização com continuação do desenvolvimento radicular e
deposição de tecido duro no canal radicular é observada muitas vezes quando um
dente é reimplantado após a avulsão (Cvek, 1992) no qual ocorre disputa pelo
espaço pulpar entre o tecido apical e os microrganismos (Ohman, 1965). Os fatores
importantes para isso ocorrer são: o tempo extraoral e o nível de maturação
radicular. Quanto menor o tempo exposto fora da boca, menores as chances de
contaminação, tendo melhores chances das células se manterem vitais, quanto
maior a largura do forame, maiores as chances de ocorrer o restabelecimento do
feixe vásculo-nervoso (Skoglund; Trontad, 1981).
Banchs e Trope (2004) introduziram um protocolo de revascularização como
uma alternativa promissora, baseando-se nas idéias precursoras sobre a
importância do coágulo retratado por Ostby e no restabelecimento da vascularização
que ocorre no reimplante dentário após a avulsão. Concluíram que o mesmo poderia
ocorrer criando um ambiente favorável: se o canal for efetivamente desinfetado, uma
matriz para o crescimento do tecido novo for formada e o acesso coronário
efetivamente selado para prevenção de uma reinfecção.
Nesta nova proposta de tratamento, Banchs e Trope (2004), em dente com
extensa lesão periapical, utilizaram substâncias irrigadoras e uma pasta composta
por três antibióticos para a realização da desinfecção e estimulação do reparo apical
e em uma segunda sessão estimularam o sangramento, aguardaram a formação de
um coágulo e o dente foi selado; observou-se que após 24 meses houve o
desenvolvimento radicular completo e ausência da lesão periapical. Embora a
origem do tecido formado dentro do canal radicular não fosse conhecida, eles
acreditavam nos benefícios trazidos pelo procedimento que permitem aumento da
espessura das paredes radiculares e do comprimento radicular. Trata-se ainda de
ser uma técnica simples, que não exige altos custos e é realizada com materiais
facilmente disponibilizados na rotina clínica (Murray et al., 2007).
Wang et al. (2010) avaliaram por meio de análise histológica o tipo de tecido
formado após procedimentos endodônticos regenerativos em cães e concluíram que
o espaço pulpar é formado por tecido duro semelhante a cemento, somente em um
caso foi observado tecido pulpar parcialmente vital, porém são necessários mais
estudos histológicos para avaliação do tecido formado. Gomes-Filho et al., 2013
também observaram formação de cemento na cavidade pulpar de dentes
23
previamente infectados. Pelo fato de não estar claro o tipo de tecido formado, o
termo usado para tais procedimentos é muito discutido. Os termos mais utilizados
são: regeneração, revitalização e revascularização. O termo revascularização
descreve o restabelecimento de suprimento vascular com o tecido pulpar existente
em dentes permanentes imaturos (Simon et al., 2007), Revitalização descreve o
crescimento de tecido que pode não ser semelhante ao tecido perdido (Wang et al.,
2010) e terapia endodôntica regenerativa se refere ao restabelecimento de
estruturas que sofreram danos, incluindo dentina e estruturas radiculares, bem como
células do complexo dentino-pulpar (Murray et al., 2007).
Trope escolheu o termo revascularização, não por ser um termo preciso, mas
por não saber a natureza do tecido formado e por ter a certeza que esse tecido tem
um suprimento sanguíneo, portanto afirma ser vascularizado (Trope, 2010), porém
mais recentemente sugeriu que o termo revitalização seria mais apropriado por
descrever um tecido vital não específico formado no canal radicular (Lenzi; Trope,
2012).
O termo geração tecidual guiada ou induzida e regeneração foi sugerido por
Huang e Lin (2008) que discordam do termo revascularização.
Hargreaves et al. (2008) deixaram de usar o termo revascularização para o
uso de procedimentos endodônticos regenerativos, justificando que o objetivo do
tratamento é regenerar o complexo dentina polpa com propriedades funcionais que
são capazes de dar suporte a continuação do desenvolvimento radicular, enquanto
soluciona a periodontite apical.
Portanto não há um consenso a respeito do termo utilizado, o que
futuramente deverá ser padronizado pela Associação Americana de Endodontia, que
em suas publicações nomeia os protocolos como procedimentos endodônticos
regenerativos.
Há algumas sugestões na literatura em relação ao mecanismo de ação da
TRE. Sugere-se que células pulpares vitais possam sobreviver na porção apical da
raiz, as quais podem proliferar sobre a matriz formada: coágulo dentro do canal
radicular e se diferenciar em odontoblastos sob estímulo das células dos restos
epiteliais de Mallassez (Banchs; Trope, 2004). A segunda possibilidade sugere que
células mesenquimais indiferenciadas podem ser abundantes no tecido pulpar
24
necrótico de dentes com rizogênese incompleta, as quais podem se aderir às
paredes radiculares internas e se diferenciar em odontoblastos que secretariam
dentina nesta região (Gronthos et al., 2002). Outra possibilidade poderia ser
atribuída à presença de células mesenquimais indiferenciadas no ligamento
periodontal, as quais podem proliferar na porção apical e se diferenciar em
cementoblastos e depositar tecido mineralizado nas paredes dentinárias (Lieberman;
Trowbridge, 1983). E por último poderia ser atribuído às células mesenquimais
indiferenciadas remanescentes da papila apical, polpa dentária, ligamento
periodontal e osso alveolar, as quais quando estimuladas com um instrumento além
da extensão do canal radicular por possuírem alta capacidade proliferativa, podem
formar tecido mineralizado dentro do canal radicular (Lovelace et al., 2011).
2.2 TÉCNICAS EMPREGADAS
É
de fundamental
importância para o
sucesso
dos procedimentos
endodônticos regenerativos a presença da tríade: células tronco, “scaffolds” que
provêm um suporte para a organização, proliferação, diferenciação e vascularização
celular e os fatores de crescimento que atuam como moléculas sinalizadoras (AAE,
2013).
As técnicas empregadas: uma ou mais sessões, tipo de irrigante, pasta
antibiótica, barreira colocada no espaço pulpar e os períodos de retorno variam, mas
todos seguem os princípios da desinfecção do canal radicular, criação de um
ambiente para o crescimento das células tronco e a inserção de um selamento
coronário (Law, 2012).
2.2.1 Descontaminação passiva
A antissepsia é um passo fundamental no tratamento endodôntico, para ser
realizada é necessária a utilização de substâncias químicas auxiliares e
instrumentação mecânica (Bystrom; Sundqvist, 1981). Porém, para dentes imaturos
25
a remoção de microrganismos por meios mecânicos é limitada devido à fina
espessura das paredes dentinárias fazendo com que a limpeza seja obtida por meio
de irrigação e medicação intracanal (Zhang; Yelick, 2010).
2.2.2 Substâncias químicas
O hipoclorito de sódio é a mais utilizada mundialmente (Clarkson; Moule,
1998). De acordo com a literatura, o NAOCl apresenta propriedades antimicrobianas
contra os principais patógenos endodônticos (Bystrom; Sudqvist, 1985) e pode ser
utilizado em várias concentrações: 0,5 a 6%.
A clorexidina também é utilizada nas concentrações de 2 e 0,12%, apesar das
propriedades
antimicrobianas
satisfatórias,
estas
substâncias
não
são
biocompatíveis, podendo inviabilizar as células-tronco presentes no tecido pulpar
impedindo as mesmas de se aderirem à superfície dentinária intraradicular (Ring et
al., 2008).
Na grande maioria dos casos relatados foram utilizadas concentrações
elevadas de hipoclorito de sódio. Reynolds et al. (2009), Shin et al. (2009) e Nagata
et al. (2014a,b) utilizaram hipoclorito de sódio a 6% associado a soro e clorexidina
2%, Iwaya et al. (2001); Cotti et al. (2008) e Iwaya et al. (2011), utilizaram NaOCl
5% associado a peróxido de hidrogênio 3%. Banchs e Trope (2004), Petrino (2007) e
Petrino et al. (2010) utilizaram NaOCl 5,25% associado a clorexidina 0,12%. Jung et
al. (2008), Ding et al. (2009), Chen et al. (2012), Nosrat et al. (2011); Torabinejad e
Turman (2011) e Nosrat et al. (2012), utilizaram somente NaOCl 5,25% na grande
maioria de seus casos. Chueh e Huang (2006), Jung et al. (2008), Chueh et al.
(2009), Cehreli et al. (2011), Lenzi e Trope (2012) e Jeeruphan et al. (2012)
utilizaram NaOCl 2,5%. Shah et al. (2008) utilizaram NaOCl 2,5% associado
peróxido de hidrogênio 3%. Thibodeau e Trope (2007) e Thibodeau (2009) utilizaram
NaOCl 1,25%. Thomson e Kahler (2010) fizeram uso de NaOCl 1% com auxílio de
ultrassom.
Além do uso de substâncias químicas auxiliares, faz-se necessário também o
uso de agentes quelantes para a remoção da smear layer sendo os mais comuns o
ácido etilenodiaminotetraacético (EDTA), o ácido cítrico e MTAD®. Essa última é
26
composta por solução de tiossulfato 3%, ácido cítrico 4,25% e o detergente
polisorbato 0,5%, utilizada por Torabinejad et al. (2003). O EDTA é capaz de liberar
vários fatores de crescimento presentes na matriz dentinária (Graham et al., 2006),
portanto é indicado seu uso pela American Association of Endodontics (AAE, 2013).
2.2.3 Medicações intracanal
Este estudo tem estreita relação com esse tópico, já que se propôs a avaliar
algumas medicações intracanal em relação à citotoxicidade sobre células da papila
apical. As medicações utilizadas devem ter efeito antibacteriano suficiente para
eliminar os agentes agressores, no entanto não podem comprometer a viabilidade
destas células (Law, 2013).
A infecção de dentes com rizogênse incompleta foi pouco estudada até o
momento, entretanto parece ser bastante semelhante à de dentes completamente
formados, ou seja, com presença principal de anaeróbios estritos produtores de
pigmento negro e poucos anaeróbios facultativos (Baumotte et al., 2011).
Considerando a importância da redução microbiana e do perfil polimicrobiano das
infecções de canais radiculares, agentes antimicrobianos com amplo espectro de
ação ou uma combinação deles se faz necessário para o alcance desse objetivo. O
protocolo descrito por Hoshino et al. (1996), adotado por Banchs e Trope (2004),
combina ciprofloxacina, metronidazol e minociclina em uma pasta sendo 100 µg/mL
de cada componente, a qual demonstrou atuar melhor dessa forma do que quando
cada componente foi utilizado separadamente, eliminando bactérias presentes
mesmo nas camadas mais profundas de dentina infectada (Hoshino et al., 1996;
Sato et al., 1993).
A partir destes resultados, estudos e casos clínicos sobre procedimentos
endodônticos regenerativos passaram a empregar esta pasta antibiótica como
“padrão-ouro” de medicação intracanal, visando conseguir o controle da infecção no
interior do sistema de canais radiculares que permita a proliferação de um novo
tecido e que possa dar continuidade ao desenvolvimento radicular. Os componentes
podem ser manipulados na forma líquida, pó ou em pasta, na proporção 1:1:1.
27
Quando na forma de pó, são diluídos em água destilada, anestésico ou
propilenoglicol.
A ciprofloxacina é um antibiótico de segunda geração, do grupo das
quinolonas que atua nas bactérias gram negativas e gram positivas. Em geral os
anaeróbios são menos susceptíveis, tem mecanismo de ação decorrente do bloqueio
da função da DNA-girase, resultando em alto efeito bactericida sobre amplo espectro
de microrganismos na fase proliferativa e vegetativa. A sua associação a outro
antibiótico pode ter efeitos aditivos ao combate de alguns microrganismos (Anvisa,
2014a).
O metronidazol é um fármaco da família dos nitro-5-imidazóis que apresenta
espectro de atividade antimicrobiana que abrange exclusivamente microrganismos
anaeróbios estritos (cocos gram-positivos, bacilos gram-negativos, bacilos grampositivos), após a entrada na célula, por difusão passiva, o antimicrobiano é ativado
por um processo de redução. O grupo nitro da droga atua como receptor de elétrons,
levando à liberação de compostos tóxicos e radicais livres que atuam no DNA,
inativando-o e impedindo a síntese proteica das bactérias (Conselho Federal de
Farmácia, 2014).
A minociclina é um fármaco da família das tetraciclinas, antimicrobianos
primariamente bacteriostáticos quando em concentrações terapêuticas. Apresentam
amplo espectro de ação, incluindo bactérias gram-positivas, gram-negativas
aeróbias e anaeróbias, espiroquetas, riquétsias, micoplasma, clamídias e alguns
protozoários. As tetraciclinas entram na célula por difusão, em um processo
dependente de gasto de energia. Ligam-se, de maneira reversível, à porção 30S do
ribossoma, bloqueando a ligação do RNA transportador, impedindo a síntese
protéica (Anvisa, 2014b).
Além dos estudos in vitro; a ação antimicrobiana desta pasta composta por
antibióticos tem sido relatada in vivo em estudos com cães (Windley et al., 2005;
Wang et al., 2010) e estudos clínicos (Petrino, 2007; Jung et al., 2008; Shah et al.,
2008; Ding et al., 2009; Reynolds et al., 2009; Kim et al., 2010; Petrino et al., 2010;
Thomson; Kahler, 2010; Nosrat et al., 2011; Torabinejad; Turman, 2011; Jeeruphan
et al., 2012; Lenzi; Trope, 2012; Nosrat et al., 2012).
28
Apesar de se mostrar eficiente, esta pasta apresenta alguns efeitos colaterais
como a possibilidade de escurecimento da coroa dental devido à presença da
minociclina (Kim et al., 2010), um derivado semi-sintético da tetraciclina que é eficaz
contra bactérias gram- positivas e gram- negativas (Windley et al., 2005). Por isso foi
proposto a sua substituição pela cefalosporina, ou somente sua remoção ou o uso
de adesivos dentinários para diminuir o contato com a superfície dentinária. Assim
como Thibodeau e Trope (2007) e Thibodeau (2009) fizeram em seus estudos,
adicionaram a cefalosporina e obtiveram resultados semelhantes. As cefalosporinas
são antimicrobianos ß-lactâmicos de amplo espectro, as indicadas para este
tratamento são as de segunda geração, mais eficazes contra gram-negativas, atuam
na parede celular do microrganismo (Anvisa, 2014c).
O desenvolvimento da resistência microbiana é outro fator relevante sobre a
utilização da pasta antibiótica, porém não há estudos que comprovem que esta
pasta selecione microorganismos resistentes. Sugere-se apenas que a utilização
dessa pode também diminuir a probabilidade do desenvolvimento de cepas
bacterianas resistentes (Mohammadi; Abbott, 2009). Além das dificuldades
encontradas para a efetiva remoção da pasta e a preocupação de resíduos dela
serem citotóxicos para a viabilidade das células da papila apical, Berkhoff et al.
(2014) mostraram que mesmo com o auxílio de diferentes técnicas de irrigação,
menos de 20% da pasta tripla antibiótica foi removida, diferente da remoção do
hidróxido de cálcio que foi de 85%, isso se deve a grande penetração da primeira
pasta às paredes dentinárias.
Considerando
as
limitações
da
pasta
composta
por
antibióticos,
pesquisadores começaram a testar alternativas de medicações com propriedades
antimicrobianas efetivas. O hidróxido de cálcio utilizado tradicionalmente nos casos
de apicificação (Cvek, 1972) e muito utilizado na rotina endodôntica como
medicação intracanal devido à sua propriedade antimicrobiana (Chueh; Huang,
2006) tem sido utilizado nos procedimentos endodônticos regenerativos, sendo
observado sucesso clínico e radiográfico. O hidróxido de cálcio é capaz de
solubilizar moléculas bioativas, inclusive fatores de crescimento da matriz de dentina
humana como TGF-β1, que por sua vez podem estimular células indiferenciadas a
se diferenciar em células semelhantes a odontoblastos e estes produzirem tecido
mineralizado (Graham et al., 2006). Além disso o hidróxido de cálcio pode não
29
interferir na sobrevivência de células da bainha epitelial de Hertwig (Shimizu et al.,
2013); embora, outro estudo enfatizou que esta medicação prejudicaria qualquer
remanescente viável e os restos epiteliais de Malassez (Banchs; Trope, 2004).
Em contato com o tecido o hidróxido de cálcio promove necrose por
coagulação (Holland, 1971), ao promover necrose, o hidróxido de cálcio transformase em carbonato de cálcio, cujos grânulos, em um primeiro momento atuam como
núcleos de calcificação distrófica a margem da densa deposição de fibras reticulares
(Holland, 1971), a partir da qual as células se diferenciam e formam a barreira
mineralizada (Pereira, 2004). Em princípio, essa necrose inicial ao invés de atuar
como um obstáculo parece ser fundamental para o processo de reparo (Pereira,
2004).
Relatos de casos recentes obtiveram sucesso na revascularização pulpar
utilizando pastas à base de hidróxido de cálcio (Chueh; Huang, 2006; Cotti et al.,
2008; Chueh et al., 2009; Cehreli et al., 2011; Iwaya et al., 2011; Neha et al., 2011;
Chen et al., 2012; Nosrat et al., 2013; Soares et al., 2013; Nagata et al., 2014a,b).
Bose et al. (2009), em suas análises mostraram que tanto o hidróxido de
cálcio quanto a pasta tripla antibiótica foram eficazes em auxiliar o aumento da
espessura e comprimento de raízes.
Porém, Cotti et al (2008) e Chen et al (2012) observaram em alguns casos a
calcificação parcial ou total decorrentes do uso do hidróxido de cálcio como
medicação intracanal, o que poderiam prejudicar uma intervenção posterior caso
fosse necessário.
Shah et al. (2008), Chueh e Huang (2006) e Bose et al. (2009) utilizaram o
formocresol como medicação intracanal, o que está em desuso nos trabalhos atuais.
Shah et al. (2008) relataram desenvolvimento radicular completo após 6 meses.
Chueh e Huang (2006) observaram o desenvolvimento radicular completo em um
período que variou de 7 meses a cinco anos com aumento da espessura das
paredes dentinárias. Porém, Bose et al. (2009) não observaram aumento da
espessura e comprimento das raízes.
Outras medicações também são utilizadas como a amoxicilina associada ao
clavulanato (Augmentin®, GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC). Nosrat et
30
al. (2013) utilizaram a pasta como medicação intracanal e observaram resolução da
lesão periapical e desenvolvimento radicular completo após 17 meses. A amoxicilina
inibe a síntese da parede celular bacteriana a partir da ligação a um ou mais sítios
das proteínas ligadoras de penicilinas e o ácido clavulânico liga-se de forma
irreversível a belactamases, inibindo essas enzimas bacterianas que destroem a
amoxicilina; com isso, expande-se o espectro de ação antimicrobiano da penicilina,
abrangendo bactérias antes resistentes à amoxicilina, por produzirem belactamases
(Anvisa, 2014d). No entanto, o uso desta medicação ainda não foi alvo de muitas
publicações.
A pasta antibiótica somente composta por ciprofloxacina e metronidazol
também é utilizada. Iwaya et al. (2001) obtiveram bons resultados com
desenvolvimento radicular completo e maturação apical após 30 meses.
Outras medicações utilizadas nos procedimentos endodônticos regenerativos
são: CFC composto por ciprofloxacino (1), metronidazol (1) e hidróxido de cálcio (2)
e uma modificação do CFC composto por ciprofloxacino (2), metronidazol (2) e
hidróxido de cálcio (1). Essas medicações foram incluídas no estudo juntamente
com a pasta tripla modificada.
Essas medicações são muito utilizadas em
infecções endodônticas
persistentes no tratamento endodôntico convencional (Takeut et al., 1997; LageMarques; Antoniazzi, 2000; Masiero et al., 2010) e podem ser promissoras nos
procedimentos endodônticos regenerativos, pois combina antibióticos citados
anteriormente com alto potencial antimicrobiano ao hidróxido de cálcio também com
inúmeras propriedades relatadas, que associados podem ter efeitos ainda melhores.
2.2.4 Número de sessões
A necessidade do uso de uma medicação intracanal para a desinfecção é
consenso na literatura, com exceção de Shin et al. (2009) que realizaram o
tratamento em uma única sessão, somente utilizando substâncias químicas para
realização da antissepsia. Os autores relataram sucesso no caso com término do
desenvolvimento radicular e espessamento das paredes dentinárias após 19 meses.
31
2.2.5 Scaffolfd- coágulo sanguíneo
Essencial, o coágulo sanguíneo atua como suporte para a organização
celular, proliferação, diferenciação e vascularização (Bohl et al., 1998). A maioria
dos protocolos propostos na literatura envolve a manipulação dos tecidos
periapicais, com o objetivo de promover o sangramento para induzir a formação de
um coágulo sanguíneo no espaço do canal radicular (Banchs; Trope, 2004; Chueh;
Huang, 2006; Petrino, 2007; Thibodeau; Trope, 2007; Cotti et al., 2008; Jung et al.,
2008; Shah et al., 2008; Ding et al., 2009; Reynolds et al., 2009; Shin et al., 2009;
Thibodeau, 2009; Kim et al., 2010; Petrino et al., 2010; Thomson; Kahler, 2010;
Cehreli et al., 2011; Nosrat et al., 2011; Chen et al., 2012; Jeeruphan et al., 2012;
Lenzi; Trope, 2012; Nosrat et al., 2012; Soares et al., 2013; Nagata et al., 2014a,b).
O coágulo ainda contribui para a migração de células indiferenciadas da papila
apical ou do ligamento periodontal que atuarão na deposição de tecido mineralizado
nas paredes internas do canal radicular. A relevância da presença do coágulo tem
sido sugerida por alguns estudos que relataram a expressão de marcadores
específicos de células indiferenciadas em coletas de sangue do canal radicular
durante procedimentos endodônticos regenerativos (Lovelace et al., 2011),
sugerindo que o estímulo aos tecidos apicais e a formação do coágulo podem
transportar células indiferenciadas para o espaço do canal.
O Plasma Rico em Plaquetas (PRP) tem sido sugerido como um “scaffold”
para os procedimentos endodônticos regenerativos, Torabinejad e Turman (2011)
relataram sucesso após quase seis meses de tratamento com desenvolvimento de
tecido mineralizado completo. Também é uma alternativa para os casos em que não
se obtêm sangramento ao estimular o tecido apical. Relata-se que o PRP apresenta
fatores de crescimento, produz agentes anti-inflamatórios, inicia a vascularização,
induz diferenciação celular, controla a resposta inflamatória local e melhora o reparo
por tecido mole e duro, entretanto traz como desvantagens a necessidade de coleta
de sangue de pacientes jovens, aquisição de equipamentos especiais e aumento do
custo do tratamento (Torabinejad; Turman, 2011).
32
Há também outros tipos de “scaffolds” biodegradáveis ou permanentes
disponíveis como colágeno, ácido hialurônico ou sintéticos como o ácido poliglicólico
ou hidroxiapatita (Gotlieb et al., 2008; Chandrahasa et al., 2011). Petrino et al.
(2010) estimularam o sangramento para a formação do coágulo e sobre ele
inseriram uma membrana colágena (CollaPlug, Zimmer Dental, Carlsbad, CA) e
Jung et al. (2008) (Collatape, Sulzer Dental Inc, Plainsboro, NJ) em um dos seus
casos relatou que a presença da membrana facilita a inserção posteriormente do
MTA.
Por outro lado, há relatos de casos clínicos de tratamento sem o estímulo do
sangramento para a formação do coágulo que relatam sucesso como término do
desenvolvimento radicular (Chueh; Huang, 2006).
2.2.6 Selamento
O selamento é o último passo da terapia e deverá ser feito utilizando uma
substância biocompatível capaz de selar adequadamente o terço cervical do canal
radicular, mesmo na presença de umidade. O material mais utilizado tem sido o
Agregado Trióxido Mineral (MTA) devido a sua ótima capacidade seladora,
impedindo a recontaminação do canal radicular e biocompatibilidade. A maioria dos
relatos demonstraram sucesso quando utilizaram o MTA como selamento (Banchs;
Trope, 2004; Petrino, 2007; Thibodeau; Trope, 2007; Cotti et al., 2008; Jung et al.,
2008; Ding et al., 2009; Reynolds et al., 2009; Shin et al., 2009; Thibodeau, 2009;
Kim et al., 2010; Petrino et al., 2010; Thomson; Kahler, 2010; Cehreli et al., 2011;
Torabinejad; Turman, 2011; Chen et al., 2012; Jeeruphan et al., 2012; Lenzi; Trope,
2012; Nosrat et al., 2012).
Nosrat et al. (2011) utilizaram uma mistura enriquecida de cálcio (CEM), uma
substância que tem características de selamento e biocompatibilidade semelhantes
ao MTA, é capaz de promover a formação de hidroxiapatita, induzir diferenciação de
células- tronco e induzir a formação de tecido mineralizado (Asgary et al., 2009).
Iwaya et al. (2001) e Jung et al. (2008) utilizaram cimento de ionômero de
vidro, e o primeiro complementou com resina composta, assim como todos os que
33
utilizaram o MTA. Chueh e Huang (2006) utilizaram como selamento materiais
restauradores provisórios temporários seguidos de ionômero de vidro ou amálgama
nos casos relatados. Jung et al. (2008) e Iwaya et al. (2011) em alguns dos seus
relatos, após o desenvolvimento radicular completo, realizaram a obturação do dente
com guta percha e selamento com resina composta.
2.3 CITOTOXICIDADE DAS MEDICAÇÕES SOBRE CÉLULAS DA PAPILA APICAL
Em 2011, um estudo mostrou que um número substancial de células tronco
mesenquimais indiferenciadas estão presentes dentro do sistema de canais
radiculares após os procedimentos endodônticos regenerativos (Lovelace et al.,
2011). Esta descoberta foi muito importante, pois os protocolos de tratamento
previamente usados na terapia endodôntica regenerativa tinham como objetivo a
máxima desinfecção sem considerar o impacto delas sobre as células tronco
(Diogenes et al., 2014). A interação entre células tronco, “scaffolds” e fatores de
crescimento são conhecimentos da Endodontia regenerativa contemporânea e
princípios da bioengenharia (Langer; Vacanti, 1993).
Por
representar
um
dos
pilares
dos
procedimentos
endodônticos
regenerativos, uma série de estudos avaliando o efeito da desinfecção do canal
radicular sobre as células tronco tem sido conduzido. Estes estudos têm contribuído
para que a Associação Americana de Endodontia recomende os protocolos de
tratamento ideais para a Endodontia regenerativa (Law, 2013).
As pesquisas têm sido cruciais para fornecer evidências para modificações de
protocolos de tratamento que visem aumentar os resultados favoráveis longe das
armadilhas comuns dos protocolos usados atualmente (Diogenes et al., 2014).
Muitos estudos têm mostrado a eficácia bacteriana das pastas, mas poucos
estudos descrevem a sua biocompatibilidade e o insucesso em alguns casos
relatados pode ser devido à alta concentração utilizada clinicamente que pode ser
tóxica aos tecidos (Gomes- Filho et al., 2012).
34
Ruparel et al. (2012) em estudo in vitro avaliaram algumas medicações
intracanal utilizadas em procedimentos endodônticos regenerativos como a pasta
trilpla antibiótica (TAP) composta por ciprofloxacino , metronidazol e minociclina
(1:1:1), a pasta dupla composta somente por ciprofloxacino e metronidazol (1:1)
(DAP), a pasta tripla antibiótica modificada composta por ciprofloxacino ,
metronidazol e cefalosporina (1:1:1) (TAP modificado), a combinação de amoxicilina
com ácido clavulânico (1:1) e o hidróxido de cálcio (Ultracal®XS, Ultradent, South
Jordan, UT). Foi estabelecida cultura de células-tronco da papila apical a partir de
terceiros molares com rizogênese incompleta. A medicação foi colocada sobre
insertos com poros de 1 μm sobre os poços com as células aderidas de forma que
as medicações não entrassem em contato direto com as células. Foram empregadas
diluições de 100 mg/mL a 0,01 mg/mL. As placas foram incubadas por 3 dias, as
células-tronco viáveis foram contadas por um método de coloração com azul de
Trypan. Observaram que com todas as medicações, exceto o hidróxido de cálcio,
houve um decréscimo da viabilidade celular com o aumento da concentração a partir
de 1, 10 e 100 mg/mL. Nas concentrações mais baixas (0,01 e 0,1 mg/mL) não
houve alteração na viabilidade. Com a pasta de hidróxido de cálcio não houve morte
celular nas concentrações testadas e sim proliferação celular na concentração de 1
mg/mL. Neste estudo, não foi utilizada a concentração que corresponde ao emprego
na rotina clínica (1000mg/mL), pois cristais da droga permaneceram não
solubilizados comprometendo o ensaio. Concluíram por meio do estudo que o
hidróxido de cálcio mostrou indução de proliferação sobre as células-tronco na
concentração de 1 mg/mL. Com os outros medicamentos utilizados houve um
decréscimo da viabilidade com o aumento da concentração, ressaltando que os
medicamentos utilizados nesses procedimentos devem ser cuidadosamente
selecionados
e
empregados
em
concentrações
que
demonstrem
eficácia
antibacteriana porém sem comprometimento à viabilidade celular.
Chuensombat et al. (2013) em estudo in vitro realizaram o cultivo celular de
células da polpa e células da papila apical. As medicações utilizadas foram
componentes da pasta tripla antibiótica empregados isoladamente ou em
associação. A partir de uma concentração de 50 µg/mL em água destilada, foi feita
uma diluição seriada para a obtenção das concentrações de 25; 6,25; 1,56; 0,39;
0,097 e 0,024 μg/mL com meio de cultura. O mesmo foi feito para as substâncias
35
isoladas. Os tempos experimentais foram de 1, 3, 5 e 7 dias e o teste utilizado foi o
MTT. Os resultados mostraram que na menor concentração a viabilidade celular foi a
mais alta e na maior a mais baixa em todos os períodos. No sétimo dia, a viabilidade
diminuiu em 90% quando estimuladas por 25; 6,25 e 1,56 μg/mL. Quando
compararam as drogas em associação ou usadas isoladamente observaram que a
associação dos antimicrobianos desempenhou maior citotoxicidade do que os
antibióticos separamente. A minociclina e o ciprofloxacino tiveram menos do que
90% de viabilidade celular nas três maiores concentrações e o metronidazol em
todas as concentrações demonstrou efeito menor sobre a viabilidade celular. Já para
a avaliação da eficácia antimicrobiana, amostras bacterianas foram coletadas de 20
dentes necrosados, aliquotadas e espalhadas sobre ágar em placas petri contendo
25 ou 0,39 µg/mL da pasta com os antibióticos isoladamente ou em associação
durante 7 dias. Os autores concluíram que 25 µg/mL da pasta tripla antibiótica
erradicaram todas as bactérias isoladas. Na concentração de 0,39 µg/mL da pasta
tripla ou na concentração de 25 µg/mL das drogas isoladas, o número de bactérias
foi significativamente reduzido, mas sem eliminação completa.
Phumpatrakom e Srisuwan (2014) em estudo in vitro avaliaram células
extraídas da polpa dental e da papila apical a partir de terceiros molares. Avaliaram
a proliferação celular por meio do ensaio MTT dos dois tipos de células depois do
tratamento com 1 mg/mL e 0,39 µg/mL da pasta tri-antibiótica por 7 dias. Os autores
compararam ainda a capacidade de diferenciação odontogênica e osteogênica na
presença da medicação por meio de detecção de deposição de cálcio e pela
detecção da expressão gênica de marcadores de mineralização. Ambas populações
celulares não sobreviveram após o contato com a medicação a 1 mg/mL. Nos dois
grupos de células houve diferença estatisticamente significante com o grupo controle
na concentração de 0,39 µg/mL, demonstrando uma queda da viabilidade celular em
contato com baixa concentração da medicação. A presença da medicação na
concentração de 0,39 µg/mL não interferiu na capacidade de diferenciação celular
de ambas populações.
Althumairy et al. (2014) em estudo in vitro produziram discos de dentina
humana a partir de terceiros molares extraídos sendo estes submetidos a contato
com soluções irrigadoras e com as medicações: pasta tripla antibiótica contendo
ciprofloxacino, metronidazol e minociclina (1:1:1), pasta com dois antibióticos:
36
ciprofloxacino, metronidazol (1:1) nas concentrações de 1 mg/mL e 1000 mg/mL e
pasta à base de hidróxido de cálcio na forma comercial Ultracal®XS (Ultradent, South
Jordan, UT). Foram utilizadas células da papila apical (SCAPs) juntamente com os
discos de dentina inseridos em poços de placas de 24 poços juntamente com fatores
de crescimento adicionados às células funcionando como um “scaffold”. Para o
grupo controle, os discos submetidos ao contato com os medicamentos não foram
adicionados à matriz com as células. O tempo experimental utilizado foi de 7 dias.
Para determinação da viabilidade celular, o método escolhido foi CellTiter-Glo®
luminescence assay (Promega, Madison, WI). Concluíram que as pastas antibióticas
na concentração de 1000 mg/mL por 7 dias resultaram na morte das células
cultivadas em dentina condicionada, enquanto na concentração de 1 mg/mL, ambas
medicações mostraram nenhum efeito na sobrevivência das células da papila apical
quando comparados com o grupo controle. O hidróxido de cálcio resultou em
aumento significativo da sobrevivência e proliferação das células quando
comparadas com o controle e com as pastas antibióticas. No tempo experimental de
28 dias, os resultados foram semelhantes aos obtidos com 7 dias com a
concentração de 1 mg/mL para ambas medicações e com 1000mg/ mL o hidróxido
de cálcio resultou aumento da sobrevivência e proliferação celular.
2.4 CONDIÇÃO PRÓ-INFLAMATÓRIA
Todos os trabalhos relacionados à citotoxicidade de medicações intracanal
sobre células da papila apical ocorrem em um ambiente em que as células
cultivadas estão em condição fisiológica, ou seja, sem qualquer ativação prévia ao
contato com a medicação testada. Como sabemos, os procedimentos endodônticos
regenerativos são indicados para pacientes com dentes com polpa necrosada e com
rizogênese incompleta, condição que é resultante de um processo inflamatório e
colonizado por microrganismos. A importância de microrganismos na etiopatogenia
da doença periapical já vem sendo amplamente elucidada pela literatura (Kakehashi
et al., 1965; Moller et al., 2004; Siqueira Jr; Roças, 2008). Mais de 40 espécies
bacterianas já foram isoladas de canais radiculares de dentes com necrose pulpar
(Zoletti et al., 2006; Roças; Siqueira Jr, 2008; Ricucci; Siqueira Jr, 2010).
37
O ácido lopoteicóico (LTA) de Enterococcus faecalis, uma molécula anfifílica
ancorada à parede celular bacteriana e está associado a processos inflamatórios, é
um fator de baixa virulência presente na parede celular de bactérias Gram positivas
(Hahn et al., 1991).
Geralmente
presente
em
infecções
persistentes,
a
prevalência
de
Enterococcus faecalis está relacionada às lesões periapicais que não regridem após
a antissepsia realizada durante o tratamento endodôntico (Kaufman et al., 2005;
Sedglay et al., 2006; Williams et al., 2006; Zoletti et al., 2006; Roças; Siqueira Jr,
2008). É encontrado na cavidade oral em locais como o dorso da língua, sulco
gengival, canais radiculares e também na saliva (Sedglay et al., 2004, 2006).
Em ambientes desfavoráveis, E. faecalis pode assumir um estado
denominado VBNC (viable but nonculturable- viável mas não cultivável), estratégia
de sobrevivência que o mantém metabolicamente ativo até que condições favoráveis
possam ser restabelecidas (Signoretto et al., 2000). E. faecalis é uma bactéria Gram
positiva e seu LTA é considerado um fator de virulência importante (Signoretto et al.,
2000; Bruserud et al., 2004; Kayaoglu; Orstavik, 2004; Sipert, 2007; Baik et al.,
2008). Foi escolhido neste estudo, devido à sua importância nos processos
patológicos em Endodontia.
Diante de uma invasão microbiana, a imunidade inata é a primeira linha de
defesa do hospedeiro. Trata-se de um conjunto de mecanismos de defesa celulares
e bioquímicos existentes antes que um processo infeccioso se instale. São
componentes do sistema imunológico natural as barreiras físicas e químicas como o
epitélio e substâncias antibacterianas, células fagocitárias como neutrófilos e
macrófagos, células natural Killer (NK), proteínas do sangue e citocinas. Quando os
microrganismos escapam à imunidade natural, invadindo e replicando-se nas células
do hospedeiro, são necessários mecanismos mais poderosos e especializados para
a defesa contra esses patógenos. A imunidade adquirida apresenta alto teor de
especificidade para distinguir moléculas, característica de memória desenvolvendo
novas respostas a um mesmo microrganismo com mais rapidez. Os principais
componentes da imunidade adquirida são os linfócitos e seus produtos, os
anticorpos (Abbas et al., 2012a).
38
O sistema imune, na presença do patógeno, aumenta a produção de fatores
inflamatórios (Tsai et al., 2005) e os fibroblastos são capazes de reconhecer
subprodutos bacterianos e responder com a produção de mediadores da inflamação
(Yamaji et al., 1995).
O óxido nítrico tem recebido muita atenção desde a descoberta de suas
funções no final dos anos 80. Apesar da alta reatividade e meia vida curta variando
entre 3 e 60 segundos, rapidamente é destruído pelo oxigênio, sendo que sua
oxidação produz nitrito e nitrato (Kiechele; Malinski, 1993). É um gás solúvel e foi
identificado primeiramente pela sua ação no relaxamento muscular, causando
vasodilatação. A síntese de NO se realiza por ação de uma enzima, a óxido nítrico
sintase (NOS) a partir da oxidação do aminoácido L-arginina, que produz NO e Lcitrulina, sendo necessária a presença de dois co-fatores, o oxigênio e o fosfato
denucleotídeo adenina nicotinamida (NADPH) (Fouad, 2002). O NO é uma molécula
mensageira intracelular (Bredt et al., 1990) com importantes funções cardiovascular,
neurológica e imune (Nathan, 1992).
De acordo com o local, a quantidade produzida e os alvos no ambiente, o NO
pode produzir diferentes efeitos. Pequena quantidade de NO produzida pelo
endotélio vascular regula o relaxamento muscular e protege contra a adesão de
leucócitos e plaquetas nas paredes do vaso sanguíneo. Essa propriedade pode ser
considerada protetora e anti-inflamatória. Grande quantidade de NO liberada pelas
células em resposta a citocinas pode destruir o tecido hospedeiro e diminuir
discretamente a resposta celular (Fouad, 2002). O NO possui um papel nas
respostas imunes não específicas, atuando com um agente tóxico em infecções
(Carmignani et al., 2000). É possível confirmar que um dos primeiros atuantes em
potencial da resposta inflamatória é o NO (Clancy; Abramson, 1995).
A presença desses mediadores inflamatórios e citocinas produzidas em
condição pró inflamatória levam a crer que haverá uma alteração entre o padrão de
resposta celular diante das medicações que podem diferir do ambiente fisiológico,
alterando dessa forma os níveis de citotoxicidade.
Portanto, este trabalho é de grande relevância para que se conheça as
diferenças de comportamento das células da papila apical sob estímulo das
39
medicações em condição fisiológica e pró-inflamatória e ainda observar a influência
destas sobre as células e sua interação na duas condições quanto a produção de
NO.
40
3 PROPOSIÇÃO
É de fundamental importância o conhecimento da citotoxicidade das
medicações intracanal sobre células da papila apical, diante disso os objetivos do
estudo foram traçados.
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar in vitro a citotoxicidade de medicações intracanal utilizadas em
procedimentos endodônticos regenerativos sobre células de papila apical humana.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Avaliar a influência do subproduto bacteriano, ácido lipoteicóico
(LTA) de Enterococcus faecalis, na viabilidade de células da papila
apical submetidas às medicações intracanal pasta tripla antibiótica
modificada, CFC e CFC modificado.
 Avaliar a produção de óxido nítrico por células da papila apical
humana quando estimuladas pelas medicações supracitadas
condicionadas ou não por LTA de Enterococcus faecalis.
41
4 MATERIAL E MÉTODOS
A metodologia foi realizada e subdividida nas etapas abaixo.
4.1 ASPECTOS ÉTICOS
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Humana da
Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo – FOUSP, parecer
569.110 CAAE 26843914.0.0000.0075 (Anexo A).
4.2 COLETA DO TECIDO E ESTABELECIMENTO DA CULTURA PRIMÁRIA
Foi utilizado 1 dente recentemente extraído (terceiro molar hígido com
rizogênese incompleta) de um paciente adulto livre de doenças sistêmicas da Clínica
Odontológica da Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo. A
doação do dente foi feita por meio de formulário específico previamente aprovado
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia da Universidade de
São Paulo (Anexo B). O espécime foi transportado em Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium (DMEM) (Gibco, Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) até o
Laboratório de Pesquisas Básicas do Departamento de Dentística para seu
processamento. Sob condições assépticas, o dente teve primeiramente todo o tecido
gengival e periodontal removido. Com o auxílio de uma pinça, a papila apical foi
destacada do tecido pulpar seguindo o protocolo de Sonoyama et al. (2006).
Os tecidos coletados foram fragmentados até que se consiguisse espécimes
de 1 mm de espessura aproximadamente. Após a fragmentação, foi feita uma
centrifugação de 200 x g/5min/temperatura ambiente (TA), os sobrenadantes foram
descartados e os fragmentos foram ressuspensos em meio de cultura fresco: DMEM
suplementado com 10% de soro bovino fetal (SBF), 100 µg/mL de penicilina,100
µg/mL de estreptomicina e 0,5 mg/mL de anfotericina B (todos os reagentes
42
provenientes de Gibco, Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) e
transferidos para frascos de cultivo celular de 25 cm2 de área cultivável e mantidos
em incubadora a 37OC com 5% de CO2 e 100% de umidade. As culturas foram
mantidas neste primeiro frasco até que as células alcançassem subconfluência, ou
seja, quando 70% da área cultivável do frasco estava coberto por células, com
trocas de meio a cada 2-3 dias. A expansão foi realizada da seguinte forma: a
camada celular foi lavada com PBS (1X, Tampão Salina-Fosfato pH= 7,2; LGC
Biotecnologia) e para a remoção das células aderidas ao fundo do frasco foi utilizada
solução de tripsina (1mL) a 0,25% contendo ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)
1mM (Invitrogen/Gibco), por 3 minutos a 37OC. A tripsina foi inativada utilizando-se
meio de cultura contendo SBF e as células em suspensão foram transferidas para
tubos de ensaio de 15 mL e centrifugadas a 200 x g/5min/TA. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado de células ressuspenso em 1 mL de meio de cultura
fresco. Alíquotas dessa suspensão de células foram distribuídas em frascos de 25
cm2 contendo 3 mL de meio de cultivo. Os frascos foram novamente mantidos em
estufa a 37OC com 5% de CO2 e 100% de umidade. Cada procedimento de
subcultura deu origem a uma nova passagem das linhagens celulares. A utilização
das células ocorreu a partir da quarta passagem. Foram seguidos os protocolos para
a cultura de fibroblastos conforme literatura (Sipert, 2007; Morandini et al., 2010;
Sipert et al., 2010; Morandini et al., 2011). Os experimentos de cultura de células
foram realizados no Laboratório de Pesquisas Básicas do Departamento de
Dentística da FOUSP em colaboração com a Prof a Dra Márcia Martins Marques e
Profa Dra Carla Renata Sipert.
4.3 PREPARO DOS MEDICAMENTOS
As substâncias testadas foram: (A) TAP mod, componentes da pasta tripla
antibiótica modificada contendo metronidazol, ciprofloxacino e cefalosporina (1:1:1);
(B) CFC, composto por metronidazol, ciprofloxacino e hidróxido de cálcio (1:1:2); e
(C) uma modificação do CFC composto por metronidazol, ciprofloxacino e hidróxido
de cálcio (2:2:1). Os medicamentos foram manipulados na forma de pó pela
Farmácia Fórmula & Ação- SP.
43
4.4 CONDICIONAMENTO DOS MEIOS DE CULTIVO E DILUIÇÃO SERIADA
As medicações foram reconstituídas em DMEM 10% SBF na concentração de
1mg/mL e incubados a 37oC por 24 horas. As soluções foram esterilizadas com
filtros de 0,22μm e submetidas a diluição seriada de ¼ resultando, portanto, em
concentrações de 250; 62,5; 15,62; 3,9 e 0,97 µg/mL (Figura 4.1).
Figura 4.1 – Diluição seriada das medicações intracanal testadas
44
4.5 PLAQUEAMENTO E ESTIMULAÇÃO DAS CÉLULAS DE PAPILA APICAL COM
AS MEDICAÇÕES INTRACANAL
Previamente ao plaqueamento, parte das células foram ativadas com LTA de
Enterococcus faecalis (Sigma-Aldrich, L4015) na concentração de 1 µg/mL durante 7
dias com trocas do meio de cultura com LTA a cada dois dias.
Células ativadas ou não foram distribuídas em placas de 24 e 96 poços para a
coleta do sobrenadante para avaliação da dosagem de óxido nítrico e para análise
da viabilidade celular por meio ensaio de MTT numa quantidade de 5 x 10 4 e 1,25 x
104 células por poço, respectivamente e complementadas com meio de cultura. Após
24 horas, foi adicionado meio somente ou contendo medicação nos volumes de
100μL para placas de 96 poços e 500 μL para placas de 24 poços pelos períodos
experimentais de 1, 3, 5 e 7 dias.
4.6 GRUPOS EXPERIMENTAIS
Para a realização do estudo foram estabelecidos 8 grupos experimentais
distribuídos conforme quadro 4.1.
45
Grupo Experimental
Condição
Célula
da Medicações
Intracanal
Tipo
de
meio
cultura
Controle DMEM
Fisiológica
DMEM 10% SBF
Controle LTA
Ativada
DMEM 10% SBF
MOD
Fisiológica
CFC modificado
de
DMEM 10% SBF +
MOD
MOD LTA
Ativada
CFC modificado
DMEM 10% SBF +
MOD
CFC
Fisiológica
CFC
DMEM 10% SBF +
CFC
CFC LTA
Ativada
CFC
DMEM 10% SBF +
CFC
TAP mod
Fisiológica
TAP mod
DMEM 10% SBF +
TAP mod
TAP mod
Ativada
TAP mod
DMEM + 10% SBF +
TAP mod
Quadro 4.1 – Distribuição dos grupos experimentais
4.7 ANÁLISE DA CITOTOXICIDADE POR MTT
A citotoxicidade das medicações sobre células da papila apical ativadas ou
não por LTA foi avaliada por meio de ensaio de MTT [brometo de 3-(4,5-dimetiliazol2-il)-2,5-difeniltetrazólio]. Esse teste quantifica a conversão do MTT, que é solúvel
em água, em um formazan insolúvel. Após cada período experimental, o meio de
cultura foi substituído por solução de MTT a 5 mg/mL em PBS. Após os tempos
experimentais descritos, os poços foram aspirados e 10µL de solução de MTT foram
adicionados aos poços (placas de 96 poços) seguidos de 90µL de DMEM 10% a
cada poço. As células foram incubadas a 37°C por 4 h protegidas da luz. O MTT foi
então descartado e 100 µL de solução de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma Aldrich)
adicionado a tampão glicina na proporção(4:1) foi colocado em cada poço. A placa
foi incubada em mesa agitadora durante 30 min para dissolver os cristais de
46
formazan que coraram as mitocôndrias. O valor da densidade óptica foi medido por
espectrofotômetro Synergy HT Biotek® (Biotek®, Instruments, Inc. Winooski,
Vemont, EUA) no comprimento de onda de 562nm. O metabolismo celular é
considerado diretamente proporcional à quantidade de formazan formado.
4.8 DOSAGEM DE ÓXIDO NÍTRICO
Para determinação da liberação de óxido nítrico no sobrenadante das células,
a produção de nitrito (NO2-) foi mensurada pelo Método de Griess (Nathan, 1992).
Os sobrenadantes foram colhidos e inseridos em tubos de microcentrífuga
previamente nomeados. Alíquotas de 50 µL de sobrenadante celular em triplicata
foram distribuídas em placas de 96 poços. As medicações diluídas em DMEM foram
utilizadas como branco para os sobrenadantes correspondentes. Posteriormente foi
adicionado 25 µL de sulfanilamida a 1% em ácido fosfórico 5% com incubação da TA
por 10 min protegidos da luz. Em seguida, 25 µL de naftiletilenodiamino
Dihidroclorídrico (NED) a 0,1% em água destilada foi adicionado aos poços. Após
nova incubação a TA por 10 min protegidos da luz, a absorbância foi medida em
comprimento de onda de 550 nm em um espectrofotômetro de placas Synergy HT
Biotek® (Biotek®, Instruments, Inc. Winooski, Vemont, EUA). Como parâmetro para
a quantificação foi utilizada curva padrão preparada a partir de diluição seriada de ½
de NaNO2 a 200 µM.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando-se o programa GraphPad Prism
5.0. As diferenças estatisticamente significantes foram determinadas por meio da
análise de variância a 1 critério (ANOVA) seguida do pós teste de Tukey para o
ensaios do MTT e método de Griess, com nível de significância de 5%.
47
5 RESULTADOS
Os resultados abaixo foram subdivididos quanto a citotoxicidade das
medicações sobre células da papila apical pelo ensaio do MTT e pela produção de
óxido nítrico pelo médodo de Griess.
5.1 CITOTOXICIDADE DAS MEDICAÇÕES SOBRE CÉLULAS DA PAPILA APICAL
A viabilidade celular foi analisada nos tempos experimentais de 1, 3, 5 e 7
dias (Figura 5.1: A – D).
A figura 5.1 A ilustra a viabilidade celular frente ao contato com a pasta tripla
antibiótica modificada durante um dia. A viabilidade celular foi significativamente
alterada no grupo em condição fisiológica a partir de 62 μg/mL enquanto que este
fenômeno é observado a partir de 250 μg/mL em células ativadas. Importante
ressaltar que a redução de viabilidade celular no grupo em condição fisiológica
chegou a 50% quando em contato com a medicação nas concentrações de 250 e
1000 µg/mL (Figura 5.1 A).
A figura 5.1 B se refere aos grupos que receberam condicionamento com a
pasta tripla antibiótica modificada por 3 dias. Na condição fisiológica (DMEM), a
viabilidade celular é significativamente afetada a partir de 15,62 µg/mL em
comparação com o respectivo controle resultando em valores de p<0,01 para 15,62
μg/mL e p<0,001 para as as concentrações de 62,5; 250 e 1000 µg/mL. Nas células
ativadas, percebe-se que a viabilidade celular foi significativamente afetada nas
concentrações de 62,5 μg/mL (p<0,01), 250 e 1000 µg/mL (p< 0,001) em relação ao
controle.
A figura 5.1 C se refere aos grupos que receberam condicionamento com a
pasta
tripla
antibiótica
por
5
dias.
Em
ambas
situações,
observa-se
comprometimento significativo da viabilidade celular nas três maiores concentrações
da medicação em comparação com os respectivos controles. Todavia, neste período
experimental observa-se significativo aumento dos valores de densidade óptica para
48
todas as condições experimentais do grupo de células ativadas em comparação com
seus respectivos pares em células em condição fisiológica.
A figura 5.1 D ilustra os resultados obtidos a partir da análise do período
experimental de 7 dias. No grupo de células em condição fisiológica, a concentração
de 1000 µg/mL aparece como a única a comprometer a viabilidade celular de forma
estatisticamente significativa (p<0,001) em relação ao controle. No entanto, em
células ativadas, a partir de 62 µg/mL a pasta triantibiótica resultou em redução da
viabilidade celular significativa em relação ao seu controle. Como observado no
grupo
experimental
de
5
dias,
a
ativação
celular
resultou
em
valores
significativamente maiores de atividade mitocondrial em todas as concentrações de
medicação em comparação com seus respectivos pares em células não ativadas
previamente.
49
A
B
C
D
Figura 5.1 – Viabilidade de células da papila apical após exposição por 1 (A), 3 (B), 5 (C) e 7 dias (D)
à TAP modificada nas concentrações indicadas ou com meio somente (0) em condição
fisiológica (DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA). Resultados
representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças estatisticamente
significativas indicadas por * (p<0,05), ** ( p<0,01) e *** (p<0,001) em comparação com
grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre as mesmas concentrações em
diferentes condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas pelo símbolo (#), (##)
e (###) para diferenças de p<0,05; p<0,01 e p<0,001, respectivamente
50
A figura 5.2 (A-D) ilustra os resultados do ensaio MTT para células em contato
com CFC modificado.
A figura 5.2 A se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 1 dia. Em condição fisiológica, a de 15,62 μg/mL resultou em
aumento significativo dos dados de atividade mitocondrial em relação ao controle.
Em células ativadas, aumento similar é observado na concentração de 250 µg/mL se
comparada ao grupo controle e às demais concentrações.
A figura 5.2 B se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 3 dias. Em condição fisiológica, novamente observa-se aumento
da atividade mitocondrial na concentração de 15,62 µg/mL sendo quase 50% maior
que o respectivo controle (p<0,001). No grupo de células ativada, observa-se
diferentemente que a viabilidade celular foi significativamente diminuída quando das
células em contato com a medicação a 1000 µg/mL em comparação ao respectivo
controle (p<0,05). Neste período experimental observa-se atividade mitocondrial
superior em células ativadas em comparação com seus pares em condição
fisiológica para o grupo sem medicação, para as três menores concentrações de
medicação e ainda para 1000 µg/mL.
A figura 5.2 C se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 5 dias. Mais uma vez, observa-se aumento da atividade
mitocondrial na concentração de 15,62 µg /mL em células em condição fisiológica
em comparação com seu respectivo controle. Todavia, não se observa alteração
entre as condições a que foram submetidas células ativadas. A medicação na
concentração de 250 µg/mL foi a única condição que resultou em valores maiores
em células ativadas do que em comparação com a resposta obtida pelas
substâncias em células em condição fisiológica.
A figura 5.2 D se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 7 dias. A medicação não foi capaz de alterar significativamente
a atividade mitocondrial das células em condição fisiológica. Entretanto, observa-se
alteração significativa destes resultados em células ativadas. Aumento desta
atividade pode ser observado com 15,62 μg/mL e redução com 1000 μg/mL. Todas
as condições experimentais a que foram submetidas células ativadas resultaram em
51
valores de densidade óptica significativamente superiores aos seus pares em células
em condição fisiológica.
A
B
C
D
Figura 5.2 – Viabilidade de células da papila apical após exposição por 1 (A), 3 (B), 5 (C) e 7 dias (D)
ao CFC modificado nas concentrações indicadas ou com meio somente (0) em condição
fisiológica (DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA). Resultados
representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças estatisticamente
significativas indicadas por * (p<0,05), ** (p<0,01) e *** (p<0,001) em diferentes
condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas pelo símbolo (#), (##) e (###)
para diferenças comparação com grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre
as mesmas concentrações em de p<0,05; p<0,01 e p<0,001, respectivamente
52
A figura 5.3 (A-D) ilustra os resultados do ensaio MTT para células em contato
com CFC.
A figura 5.3 (A-D) ilustra os resultados obtidos pelo contato das células com a
medicação CFC. A figura 5.3 A se refere aos grupos que receberam
condicionamento com o CFC por 1 dia. Observa-se aumento dos valores de
densidade óptica para a concentração de 0,97 μg/mL em células em condição
fisiológica e na concentração de 3,9 μg/mL em células ativadas, ambos os casos em
comparação com seus respectivos controles.
A figura 5.3 B se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC por 3 dias. Neste período experimental não se observa alteração da atividade
mitocondrial de células em condição fisiológica em contato com a mediação. No
entanto, para as células ativadas, observa-se aumento significativo desta atividade
na concentração de 0,97 μg/mL (p<0,01) e diminuição significativa na concentração
de 1000 μg/mL (p<0,001). Nas concentrações de 0,97; 15,62 e 62,5 μg/mL, observase maior atividade celular nos grupos ativados em relação aos seus pares em
condição fisiológica.
A figura 5.3 C se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC por 5 dias. Em condição fisiológica, as células sofreram perda de atividade
quando em contato com as três concentrações maiores de medicação em relação ao
controle, fenômeno este não observado em células ativadas. Estas, por sua vez,
resultaram em maiores níveis de atividade mitocondrial quando em contato com a
medicação em suas cinco maiores concentrações em comparação com os
respectivos pares em situação fisiológica.
A figura 5.3 D se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC por 7 dias. No grupo de células não ativadas previamente, observa-se
alteração significativa da viabilidade na concentração de 1000 μg/mL (p<0,01). No
grupo de células ativadas, observa-se padrão semelhante com queda significativa
dos valores de atividade para 1000 μg/mL, porém observa-se aumento deste
parâmetro para a concentração de 15,62 μg/mL em comparação com o respectivo
controle ativado. Mais uma vez observa-se valores significativamente superiores
para as células ativadas em comparação com os respectivos pares em condição
fisiológica para todas as condições neste período experimental.
53
A
B
C
D
###
Figura 5.3 – Viabilidade de células da papila apical após exposição por 1 (A), 3 (B), 5 (C) e 7 dias (D)
ao CFC nas concentrações indicadas ou com meio somente (0) em condição fisiológica
(DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA). Resultados
representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças estatisticamente
significativas indicadas por * (p<0,05), ** ( p<0,01) e *** (p<0,001) em comparação com
grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre as mesmas concentrações em
diferentes condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas pelo símbolo (#), (##)
e (###) para diferenças de p<0,05; p<0,01 e p<0,001, respectivamente
54
Pelo fato da concentração de 1000 μg/mL tratar-se daquela mais próxima da
condição empregada clinicamente, ela foi escolhida para o estabelecimento de uma
comparação entre todos os tempos experimentais: 1,3, 5 e 7 dias (Figura 5.4 A-C).
A figura 5.4 A representa o resultado obtido pelas células em contato com a
pasta tripla antibiótica na concentração de 1 mg/mL. Nesta medicação observa-se
padrão compatível com citotoxicidade em todos os tempos experimentais para
ambas condições celulares (fisiológica e ativada).
O CFC modificado (Figura 5.4 B) apresentou padrão compatível com redução
de viabilidade apenas no período experimental de 7 dias em células ativadas.
O CFC (Figura 5.4 C) apresentou alteração da viabilidade celular nos
períodos experimentais de 3, 5 e 7 dias para ambas condições celulares (fisiológica
e ativada).
55
Figura 5.4 – Viabilidade de células da papila apical após exposição de 1, 3, 5 e 7 dias à 1mg/mL ou
meio somente (0) à TAP modificada (A), ao CFC modificado (B) e ao CFC (C), em
condição fisiológica (DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA).
Resultados representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças
estatisticamente significativas indicadas por por * (p<0,05), ** (p<0,01) e *** (p<0,001)
em comparação com grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre as mesmas
concentrações em diferentes condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas
pelo símbolo (#), (##) e (###) para diferenças de p<0,05; p<0,01 e p<0,001,
respectivamente
56
5.2 PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO POR CÉLULAS DE PAPILA APICAL EM
CONTATO COM AS MEDICAÇÕES INTRACANAL
A produção de NO foi analisada nos tempos experimentais de 1, 3, 5 e 7 dias
(Figura 5.5 A-D) por meio da detecção de traços de nitrito no sobrenadante celular.
A figura 5.5 A se refere aos grupos que receberam condicionamento com a
pasta tripla antibiótica durante 1 dia. Observa-se que a medicação induziu
quantidades significativas de NO em comparação com os respectivos controles, com
exceção da concentração de 3,9 μg/mL.
A figura 5.5 B se refere aos grupos que receberam condicionamento com a
pasta tripla antibiótica durante 3 dias. De maneira semelhante, percebe-se que o
contato com a medicação induziu quantidades significativas de NO em comparação
aos respectivos controles, com exceção da concentração de 3,9 μg/mL em células
em condição fisiológica. Adicionalmente, observa-se níveis significativamente
inferiores de NO na concentração de 0,97 μg/mL e maiores na concentração de 15,
62 μg/mL produzidos por células ativadas em comparação com seus pares em
condição fisiológica.
A figura 5.5 C se refere aos grupos que receberam condicionamento com a
pasta tripla antibiótica modificada durante 5 dias. Novamente observa-se indução
importante de NO pela medicação intracanal com exceção da concentração de 250
μg/mL em ambas condições de atividade celular. Os níveis de NO induzidos pela
pasta a 0,97 μg/mL foram menores em células ativadas enquanto que aqueles
induzidos pelas substâncias a 3,9 e 15,62 μg/mL foram significativamente superiores
aos níveis produzidos por células em condição fisiológica.
A figura 5.5 D se refere aos grupos que receberam condicionamento com a
pasta tripla antibiótica modificada durante 7 dias. Neste período experimental,
observa-se produção importante de NO nos grupos controle tanto para células em
condição fisiológica como para células ativadas. Nas primeiras, observa-se que a
medicação induziu aumento importante de NO na concentração de 0,97 μg/mL,
porém houve diminuição significativa deste mediador para todas as demais
concentrações. No grupo de células ativadas, a produção de NO foi maior para 3,9 e
57
15,62 μg/mL e menor para o controle, 0,97 e 62,5 μg/mL do que aquela detectada no
grupo em condição fisiológica.
58
A
B
C
D
Figura 5.5 – Produção de NO por células da papila apical após exposição por 1 (A), 3 (B), 5 (C) e 7
dias (D) ao TAP modificado nas concentrações indicadas ou com meio somente (0) em
condição fisiológica (DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA).
Resultados representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças
estatisticamente significativas indicadas por * (p<0,05), ** ( p<0,01) e *** (p<0,001) em
comparação com grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre as mesmas
concentrações em diferentes condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas
pelo símbolo (#), (##) e (###) para diferenças de p<0,05; p<0,01 e p<0,001,
respectivamente
59
A figura 5.6 (A-D) ilustra a produção de NO induzida pela medicação CFC
modificado.
Na figura 5.6 A, observam-se os grupos que receberam condicionamento com
o CFC modificado por 1 dia. No grupo de células em condição fisiológica, a única
concentração que induziu quantidades significativas de NO foi 62,5 μg/mL (p<0,001).
Para as células ativadas, observa-se aumento significativo deste mediador nas
concentrações de 3,9; (p<0,05) 15,62 (p<0,001); 62,5 (p<0,001) e 1000 μg/mL
(p<0,05). Comparativamente, células ativadas produziram níveis significativamente
maiores de NO apenas com a medicação a 1000 μg/mL em comparação com
células em condição fisiológica.
A figura 5.6 B se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 3 dias. A produção de NO foi significativamente induzida por
células em condição fisiológica nas concentrações de 0,97 μg/mL (p<0,001), 62,5
μg/mL (p<0,001) e 250 μg/mL (p<0,05). Em células ativadas, os níveis de NO das
concentrações: 3,9; 15,62 e 62,5 μg/mL foram superiores que os níveis do
respectivo controle (p<0,05; p<0,001; p<0,001). Na comparação entre as condições
celulares, células ativadas em contato com a medicação na concentração de 0,97
μg/mL produziram menor quantidade de NO que a mesma concentração do grupo
em condição fisiológica.
A figura 5.6 C se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 5 dias. Indução significativa de NO pode ser observada para
células em condição fisiológica em contato com a medicação nas concentrações de
0,97; 62,5 e 250 μg/mL (p<0,001). Para células ativadas, foram significativos os
níveis induzidos pelas concentrações 3,9; 15,62; 62,5; 250 e 1000 μg/mL em relação
ao respectivo controle (p<0,001). Na comparação entre os grupos observam-se
valores significativamente mais altos nas concentrações de 15,62 μg/mL (p<0,01) e
1000 μg/mL (p<0,001) para o grupo de células ativadas. Por outro lado, para a
concentração de 250 μg/mL houve maior produção no grupo fisiológico do que no
ativado (p<0,05).
A figura 5.6 D se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC modificado por 7 dias. Novamente, observa-se produção importante de NO em
ambos grupos controle sendo a medicação capaz de reduzir estes valores para as
60
células em condição fisiológica de forma significativa para a concentração de 1000
ug/mL. O fenômeno contrário é observado no grupo ativado no qual observa-se
aumento de quase duas vezes em comparação com seu respectivo controle
(p<0,001). Na comparação entre os grupos, essa diferença foi de 4 vezes mais em
relação à produção da célula em condição fisiológica (p<0,001).
61
A
B
C
D
Figura 5.6 – Produção de NO por células da papila apical após exposição por 1 (A), 3 (B), 5 (C) e 7
dias (D) ao CFC modificado nas concentrações indicadas ou com meio somente (0) em
condição fisiológica (DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA).
Resultados representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças
estatisticamente significativas indicadas por * (p<0,05), ** ( p<0,01) e *** (p<0,001) em
comparação com grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre as mesmas
concentrações em diferentes condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas
pelo símbolo (#), (##) e (###) para diferenças de p<0,05; p<0,01 e p<0,001,
respectivamente
62
A figura 5.7 (A-D) ilustra a produção de NO induzida por CFC.
Na figura 5.7 A, observa-se esta produção no tempo experimental de 1 dia.
Em condição fisiológica, células produziram NO em níveis significativos quando em
contato com a medicação nas concentrações de 0,97 (p<0,01), 62,5 (p<0,001); 250
(p<0,001) e 1000 μg/mL (p<0,05) quando comparados ao controle. Em células
ativadas, observa-se este aumento para 0,97 μg/mL (p<0,05);15,62 μg/mL (p<0,01);
62,5 μg/mL (p<0,001); 250 μg/mL (p<0,001) e 1000 μg/mL (p<0,001). Na
comparação entre os grupos, apenas a concentração de 1000 µg/mL foi capaz de
induzir níveis maiores de NO em comparação com células em condição fisiológica.
A figura 5.7 B se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC por 3 dias. Novamente, observa-se a indução de NO pela medicação nas
concentrações de 0,97 μg/mL (p<0,01), 62,5 μg/mL (p< 0,001) e 250 μg/mL
(p<0,001) e 1000 μg/mL (p<0,05). Células ativadas, por sua vez, apresentaram
aumento da produção de NO em todas as concentrações de medicação, exceto 0,97
ug/mL obedecendo a um padrão concentração-dependente. Na comparação entre
os grupos, observa-se padrão antagônico uma vez que a concentração de 250
μg/mL resultou em produção maior para células não ativadas (p<0,05) enquanto que
a concentração de 1000 μg/mL resultou em níveis significativamente aumentados
para as células ativadas(p<0,001).
A figura 5.7 C se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC por 5 dias. A produção de NO pode ser observada pela medicação nas
concentrações de 0,97 μg/mL (p<0,05), 62,5 e 250 μg/mL (p<0,001) em células em
situação fisiológica. Em células ativadas, observa-se aumento significativo para as
concentraçãos de 15, 62 (p<0,05), 250 (p<0,001) e 1000 μg/mL (p<0,001). No grupo
LTA, 15,62 μg/mL produziu quantidade inferior a 10 µM, 250 μg/mL superior a 10 µM
e 1000 μg/mL superior a 20 µM, quantidades bem superiores ao controle que foi
quase zero (p<0,05; p<0,001; p<0,001) respectivamente. Na comparação entre os
grupos, 1000 μg/mL do grupo LTA produziu quatro vezes a mais de NO que sua
respectiva concentração do grupo fisiológico.
A figura 5.7 D se refere aos grupos que receberam condicionamento com o
CFC por 7 dias. Em células não estimuladas, apenas a concentração de 250 μg/mL
foi capaz de induzir produção significativa de NO (p<0,01) enquanto que em células
63
ativadas, este aumento pode ser visualizado nesta concentração (p<0,05) e também
em 1000 μg/mL (p<0,001). Na comparação entre os grupos, 1000 μg/mL do grupo
LTA observa-se mais que o dobro de NO que a mesma concentração do grupo
fisiológico.
64
A
B
C
D
***
*
Figura 5.7 – Produção de NO por células da papila apical após exposição por 1 (A), 3 (B), 5 (C) e 7
dias (D) ao CFC nas concentrações indicadas ou com meio somente (0) em condição
fisiológica (DMEM) e estimuladas previamente por LTA de E. faecalis (LTA). Resultados
representativos de um doador com ensaio em triplicata. Diferenças estatisticamente
significativas indicadas por * (p<0,05), ** (p<0,01) e *** (p<0,001) em comparação com
grupo não estimulado (0). Diferenças observadas entre as mesmas concentrações em
diferentes condições (fisiológica ou pró inflamatória) representadas pelo símbolo (#), (##)
e (###) para diferenças de p<0,05; p<0,01 e p<0,001, respectivamente
65
6 DISCUSSÃO
As mudanças no tratamento de pacientes com dentes imaturos com
periodontite apical previamente submetidos à cárie ou trauma proporcionaram novas
perspectivas como a continuação do desenvolvimento radicular que proporcionam
uma maior resistência a estes dentes, com diminuição da incidência de fratura ou
perda do elemento dental.
A desinfecção destes dentes é etapa fundamental do tratamento e para isso
são utilizadas medicações intracanal para reduzir a carga microbiana para promoção
de ambiente propício para o reparo tecidual. Abordagens clínicas recentes têm
sugerido que células-tronco supostamente presentes na papila apical sofreriam
indução de diferenciação em células como odontoblastos ou cementoblastos
levando à formação de tecido mineralizado com consequente aumento de espessura
e de comprimento radicular em dentes com rizogênese incompleta. Sendo assim a
medicação intracanal empregada na desinfecção da cavidade pulpar não pode ser
citotóxica às células remanescentes dos tecidos periapicais.
Os
testes
de
biocompatibilidade
e
citotoxicidade
são
essenciais
e
recomendados para os materiais que são utilizados na área da saúde. A American
Dental
Association
(ADA)
recomenda
uma
sequência
de
testes
de
biocompatibilidade para os materiais dentários (Craig, 1997). A sequência consiste
em testes iniciais, secundários e de uso. Nos testes iniciais são realizados ensaios in
vitro para a citotoxicidade e para mutagênese para os materiais dentários e seus
componentes.
A biocompatibilidade pode ser definida como a capacidade do material
realizar a função que foi proposto sem causar efeitos indesejáveis (Williams, 2003)
como reações alérgicas, inflamatórias ou tóxicas, quando em contato com tecidos
vivos ou fluidos orgânicos. A biocompatibilidade compreende as interações dos
tecidos e fluidos com um material. Quando o material é colocado em um tecido vivo
gerará algum tipo de resposta biológica. A citotoxicidade pode resultar em um amplo
espectro de efeitos, como alterações metabólicas e morte celular. Os testes de
citotoxicidade são a primeira etapa para se assegurar a biocompatibilidade de um
66
material (Wataha, 2001). Algumas maneiras de avaliar a citotoxicidade pode ser por
meio do ensaio de MTT, utilizado neste trabalho.
Outro fator de grande importância a ser considerado é a remoção das pastas,
pois resíduos antimicrobianos presentes no interior das paredes dentinárias podem
afetar a viabilidade celular após estimulação do sangramento e formação do coágulo
(Berkhoff et al., 2014).
Ruparel et al. (2012) em trabalho in vitro com células-tronco da papila apical
avaliaram a citotoxicidade de algumas medicações intracanal como a pasta tripla
antibiótica, pasta dupla, pasta tripla antibiótica modificada, amoxicilina associada ao
ácido clavulânico (Augmentin®) e de hidróxido de cálcio (Ultracal®XS, Ultradent,
South Jordan, UT) por meio de contagem de viabilidade com corante azul de Trypan.
Após 3 dias, foi observado decréscimo da viabilidade com o aumento da
concentração do medicamento para todas as pastas antibióticas. A pasta de
hidróxido de cálcio, na concentração de 1 mg/mL, induziu proliferação celular,
segundo os autores. Conclui-se que a pasta tripla antibiótica pode desempenhar
efeito citotóxico em um padrão concentração-dependente, diferentemente do
observado para o hidróxido de cálcio. Já Chuensombat et al. (2013) em estudo in
vitro com células da polpa e da papila apical utilizando ensaio de MTT, concluíram
que nas concentrações de 25; 6,25 e 1,56 μg/mL da pasta tripla antibiótica ocorreu
perda da viabilidade celular em torno de 90% no período experimental de sete dias.
Conclui-se, portanto, que baixas concentrações desta medicação apresentam alta
toxicidade celular in vitro. Phumpatrakom e Srisuwan (2014) em estudo in vitro com
células da polpa dental e da papila apical por meio de ensaio de MTT avaliaram a
citotoxicidade da pasta tripla antibiótica. Observou-se também padrão de resposta
concentração-dependente sendo que no período experimental de sete dias, a
viabilidade celular foi comprometida de forma importante quando células foram
mantidas em contato com 1 mg/mL sendo que mesmo na concentração de 0,39
µg/mL, houve diminuição da viabilidade quando comparada ao grupo controle.
Porém Althumairy et al. (2014), em estudo in vitro utilizaram o ensaio
CellTiter-Glo® luminescence assay (Promega, Madison, WI), um método que realiza
cultura em três dimensões em que a contagem das células é realizada com adição
de reagentes e a leitura por luminescência, utilizaram a mesma concentração no
mesmo período experimental (7 dias) com discos de dentina expostos à pasta tripla
67
antibiótica em cultura de células da papila apical, não foi observada diminuição na
viabilidade com 1mg/mL após 7 dias quando comparado ao grupo controle, porém
com 1000mg/mL houve morte de todas as células cultivadas. Já com hidróxido de
cálcio (Ultracal®XS, Ultradent, South Jordan, UT) ocorreu proliferação celular com 7
e 28 dias.
No presente estudo, diferentes formulações de medicação intracanal foram
testadas em contato com células de papila apical humana em condição fisiológica
(não ativadas) ou após ativação com LTA de Enterococcus faecalis. Neste trabalho,
considerando o efeito da pasta tripla antibiótica modificada sobre células em
ambiente fisiológico, no primeiro dia (Figura 5.1 A) já observou-se uma queda de
mais de 50% da viabilidade celular nas concentrações de 250 e 1000 µg/mL. No
terceiro dia (Figura 5.1 B) observou-se diminuição da viabilidade já a partir da
concentração de 15,62 µg/mL, sendo que no quinto e sétimo dias (Figura 5.1 C e D)
a queda da viabilidade foi observada nas maiores concentrações de medicação.
Portanto, observou-se que a citotoxicidade aumentou com o aumento da
concentração, contrastando com dados encontrados por Ruparel et al. (2012) em
que 100 µg/mL não apresentaram citotoxicidade. Nossos dados também diferem dos
achados de Chuensombat et al. (2013) que observaram 90% de redução de
viabilidade com 1,56 µg/mL por 7 dias, sendo que no presente trabalho, observou-se
manutenção da atividade mitocondrial com até 3,9 µg/mL por até 7 dias.
Phumpatrakom e Srisuwan (2014) também observaram diminuição da viabilidade
com 1 mg/mL, porém morte celular total com 7 dias, diferentemente do que
observou-se neste estudo em sete dias. Foi observada por estes autores
citotoxicidade importante já com 0,39 µg/mL, o que não observou-se no presente
estudo. Diferente de Althumairy et al. (2014) observou-se morte celular com a
concentração de 1mg/mL em todos os períodos experimentais, porém este ensaio
difere bastante do presente estudo.
Uma das razões que pode contribuir para a citotoxicidade da pasta tripla
antibiótica é o baixo pH da solução (4.0- 4.6), principalmente pela presença da
minociclina e do ciprofloxacino. A quebra dos íons de hidrogênio do grupo HCl
resulta em condição ácida que é uma condição desfavorável para a viabilidade
celular (Kobayashi et al., 2007).
68
As diferenças dos resultados obtidos pelo presente estudo em relação a
relatos prévios da literatura podem ocorrer devido às diferenças nas metodologias
empregadas: como as células utilizadas e os ensaios a que foram submetidas.
Ruparel el al. (2012) utilizaram células- tronco da papila apical e insertos transwell
para evitarem o contato direto das células com os medicamentos e o Ensaio foi Azul
de Trypan, Chuensombat et al. (2013) células da polpa ou papila apical e para
avaliação o MTT, Phumpatrakom e Srisuwan (2014) células da polpa dental e da
papila apical e também o MTT e Althumairy et al. (2014) células tronco da papila
apical, os medicamentos foram colocados diretamente sobre a dentina e o método
CellTiter-Glo® luminescence assay, cuja contagem é avaliada por luminescência. A
manipulação, preparo das medicações e as diferentes técnicas de viabilidade celular
são fatores que também podem gerar resultados distintos. Entretanto, parece haver
consenso entre os autores quanto à citotoxicidade promovida por altas
concentrações de medicações formuladas a base de antimicrobianos, ressaltando a
importância da utilização em concentrações pequenas e efetivas, além da atenção
especial na sua remoção.
O presente estudo avaliou também medicações utilizadas nos tratamentos
endodônticos convencionais com indicação para infecções persistentes. O CFC
modificado: ciprofloxacina, metronidazol e hidróxido de cálcio (2:2:1) e o CFC
composto pelas mesmas substâncias na proporção 1:1:2. Estas formulações
empregam dois componentes da pasta tripla antibiótica (TAP) adicionados de
hidróxido de cálcio, componente este que atualmente obtem resultados favoráveis
com relação à biocompatibilidade, por induzir proliferação celular em concentrações
nas quais outras substâncias apresentam citotoxicidade importante (Ruparel et al.,
2012; Althumairy et al., 2014). Quimicamente, o hidróxido de cálcio é uma base forte
com pH de aproximadamente 12,5 a 12,8; cuja ação principal é a dissociação iônica
dos íons (Ca2+) e hidroxila (OH-), levando à alcalinidade do meio conferindo à
substância atividade antibacteriana importante, além de inativação de endotoxinas
(Mohammadi; Dummer, 2011, Safavi e Nichols, 1993). O hidróxido de cálcio em
contato com o tecido exposto induz a formação de uma zona de necrose superficial,
que é saturada pelos íons cálcio, e assim parece estimular a formação de uma
barreira de tecido mineralizado (Farhad; Mohammadi, 2005; Mohammadi; Dummer,
2011).
69
Acredita-se que a associação destas substâncias resultaria em efeitos
antimicrobianos mais efetivos, além de um equilíbrio do pH. Como mencionado
anteriormente, os antimicrobianos apresentam pH baixo e o hidróxido de cálcio, pH
alto; sendo que ambas situações levam à necrose celular (Holland et al., 1999;
Mohammadi; Dummer, 2011), o que é muito controverso entre os autores, uma vez
que alguns autores o consideram biocompatível (Ji et al., 2010; Gomes-Filho et al.,
2012; Ruparel et al., 2012; Althumairy et al., 2014).
No grupo em que simulamos um ambiente em homeostasia, o CFC
modificado (2:2;1) apresentou baixos níveis de citotoxicidade em todos os tempos
experimentais. A viabilidade celular se manteve inalterada em todas as
concentrações, exceto na concentração de 15,62 μg/mL no primeiro, terceiro e
quinto dias em que houve proliferação celular (151%, 148,4%, 132.9%)
respectivamente (Figura 5.2 A, B e C). Estudos futuros precisariam demonstrar se
esta seria uma concentração suficiente para exercer a ação antimicrobiana
adequada. Com base no nosso conhecimento, esse foi o primeiro estudo a avaliar a
citotoxicidade deste medicamento, conclui-se que, nas condições experimentais
deste estudo, o CFC modificado não apresentou citotoxicidade em nenhuma
concentração quando em contato com células da papila apical, podendo ser
considerado
uma
substância
promissora
para
procedimentos
endodônticos
regenerativos, uma vez que seus componentes são conhecidos na rotina
endodôntica.
O grupo de células em condição fisiológica submetido ao CFC (1:1:2)
apresentou manutenção da viabilidade celular em todas as concentrações após 1 e
3 dias de contato (Figura 5.3 A e B DMEM), porém no quinto dia (Figura 5.3 C
DMEM) houve uma queda da viabilidade nas concentrações de 62,5; 250 e 1000
μg/mL de 36%, 37% e 45% respectivamente. Já no sétimo dia (Figura 5.3 D DMEM)
somente a concentração de 1000 μg/mL apresentou diminuição de viabilidade
celular, em torno de 30%.
A citotoxicidade observada para esta medicação pode ser considerada inferior
à observada para a pasta composta somente por antimicrobianos. Entretanto, os
padrões de citotoxicidade foram superiores aos observados para o CFC modificado.
A maior quantidade de hidróxido de cálcio na composição pode ter provocado
aumento no pH da substância, ou ainda a interação entre os componentes nestas
70
proporções pode ter resultado em efeito nocivo às células em comparação com o
CFC modificado.
Os estudos prévios da literatura que empregaram metodologias in vitro para a
análise da citotoxicidade de medicações avaliam o efeito das substâncias sobre
células em condição fisiológica, ou seja, que não foram submetidas previamente a
ativação por estímulos pró-inflamatórios (Ruparel et al., 2012; Chuensombat et al.,
2013; Althumairy et al., 2014; Phumpatrakom; Srisuwan, 2014). Entretanto, em
quadros de periodontite apical em dentes com rizogênese incompleta, as células da
papila potencialmente existentes se encontrariam em condição pró-inflamatória
resultante da presença de microrganismos na cavidade pulpar e de mediadores
inflamatórios liberados por células da polpa, da própria papila ou dos tecidos
periapicais. Sendo assim, este estudo também avaliou o efeito de medicações
intracanal em tal condição. Para indução do ambiente pró- inflamatório utilizou-se
ácido lipoteicóico (LTA) de Enterococcus faecalis, fator de virulência presente na
parede celular de bactérias Gram positivas (Hahn et al., 1991). O LTA é uma
molécula anfifílica ancorada à parede celular bacteriana e está associado a
processos inflamatórios. Entretanto, seu potencial imunoestimulatório é inferior ao do
lipopolissacarídeo (LPS), constituinte de bactérias Gram negativas. Sendo assim,
constituímos um ambiente de baixa virulência sobre células da papila apical por
meio da adição deste subproduto bacteriano na cultura previamente aos ensaios
propriamente ditos, uma vez que este subproduto foi capaz de alterar a produção
constitutiva de quimiocionas in vitro em células de ligamento periodontal e polpa
dental (Sipert et al., 2014).
A escolha de um componente da parede celular de microrganismos Grampositivos como estímulo nos pareceu importante, uma vez que as infecções da
cavidade oral são polimicrobianas e estes microrganismos podem ser encontrados
em grande frequência e quantidade. Enterococcus faecalis é comumente encontrado
em lesões periapicais persistentes e seu papel na indução da doença periapical
ainda não é claramente elucidado, por isso a importância da escolha pelo LTA
(Sedgley et al., 2006; Roças; Siqueira Jr, 2008). Especula-se que a resposta celular
a LTA seja desencadeada a partir da interação desta molécula com receptores de
imunidade inata (Toll-like receptor TLR2/ TLR6 (Jin et al., 2007), comumente
presentes em células residentes de tecidos conjuntivos (Morandini et al., 2013).
71
Ao submeter as células em contato com as medicações após ativação com
LTA, observa-se de maneira geral, o aumento da atividade mitocondrial
especialmente nos períodos experimentais mais longos. Esta diferença chega a ser
estatisticamente significativa em cinco dias (CFC e TAP mod) e em sete dias para as
três medicações testadas. A ativação celular resultou em perda de viabilidade em
comparação com o respectivo controle para CFC modificado (3 e 7 dias, figura 5.2
B, D LTA); CFC (3 dias) e para a pasta tripla antibiótica modificada (7 dias) em
concentrações de medicação que não haviam resultado em tais diferenças em
células em condição de homeostasia. Por outro lado, diminuições na viabilidade
observadas em condição fisiológicas foram completamente revertidas em células
ativadas (CFC 5 dias, figura 5.3 C LTA).
Na presença de patógenos que podem ser detectados por meio da ativação
celular pelo reconhecimento de padrões moleculares associados a microrganismos,
ocorre a indução da produção de mediadores inflamatórios (Yamaji et al., 1995; Tsai
et al., 2005). Os receptores tipo Toll (TLRs) reconhecem os subprodutos oriundos de
microrganismos que estimulam a imunidade inata e são conhecidos como padrões
moleculares associados a patógenos (PAMPs) e induzem a expressão de vários
mediadores da inflamação como citocinas e quimiocinas via ativação de Nuclear
Factor (NF)-κB, um fator de transcrição responsável pela expressão gênica de
citocinas pró-inflamatórias (Abbas et al., 2012a). O LTA é reconhecido por
receptores TLR2 que ativam a célula como resultado levando à expressão de
citocinas. Muitas citocinas são detectadas durante a inflamação, entre elas estão IL1α, IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α (fator de necrose tumoral) (Zehnder et al., 2003).
Uma vez eliminado o agente causador, as células passam a produzir citocinas com
perfil anti-inflamatório como TGF-β e IL-10 (Abbas et al., 2012b).
Piazzon et al. (2014) em estudo com a IL-10 observaram a ação antiinflamatória nos fagócitos, promoção de proliferação de células T de memória,
indução da diferenciação celular de linfócitos B e a secreção de anticorpos.
Citocinas como TGFβ1 e IL-10 regulam uma variedade de processos
biológicos, incluindo diferenciação, proliferação, reparação tecidual, inflamação e
defesa do hospedeiro, no entanto sua expressão aberrante pode induzir muitos tipos
de doenças auto-imunes e formação de tumores (Chang et al., 2014).
72
Neste estudo, observou-se aumento significativo da atividade mitocondrial de
células ativadas previamente com LTA, sugerindo, pela natureza do ensaio,
aumento de seu metabolismo ou proliferação. Com base nestas observações,
sugere-se que a ativação celular seguida da remoção do estímulo levou à produção
de TGF-β e IL-10 resultando em possível proliferação celular (Abbas et al., 2012b).
Apesar dos resultados terem demonstrado atividade mitocondrial superior das
células previamente ativadas, deve-se considerar que este estudo não avaliou
possíveis alterações fenotípicas e funcionais que podem tê-las afetado e que
possivelmente teriam significado biologicamente importante. A ocorrência destas
alterações deverá ser abordada em estudos futuros de nosso grupo.
O óxido nítrico é uma molécula mensageira intracelular (Bredt; Snyder, 1990)
de grande importância nos processos fisiológicos e patológicos e está envolvido no
controle
do
crescimento
celular,
diferenciação,
apoptose,
vasodilatação
e
neurotransmissão. Quando presente em altas concentrações, pode atuar como
potente molécula citotóxica desencadeando prejuízos aos tecidos (Fouad, 2002). A
indução da isoforma da enzima óxido nítrico sintase induzível (iNOS) pode inibir a
proliferação de fibroblastos e induzir a morte celular, o que contribui para o
desequilíbrio entre destruição e reparo tecidual (Kendall et al., 2002). Isso ocorre em
processos inflamatórios, em que há um aumento da síntese de NO, como
demonstrado em casos de pulpite (Di Nardo Di Maio et al., 2004). Quando presente
em pequenas quantidades, o NO presente no leito vascular regula o relaxamento
muscular e protege contra a adesão de leucócitos e plaquetas na parede do vaso
sanguíneo, podendo ser considerada uma molécula protetora e anti-inflamatória
(Fouad, 2002).
No presente estudo, podemos observar que as três medicações testadas
foram capazes de induzir a produção de NO por células de papila. A pasta tripla
antibiótica modificada resultou em produção mais significativa de NO por células
ativadas em concentrações menores da medicação. O CFC modificado induziu
níveis maiores deste mediador por células ativadas especialmente nos períodos
experimentais mais longos (Figura 5.6 C e D). De forma interessante, o CFC induziu
maiores níveis de NO em células não ativadas na concentração de 250 μg/mL
enquanto que células ativadas produziram níveis maiores na concentração de 1000
μg/mL (Figura 5.7).
73
Observou-se claramente uma maior influência desta medicação em condição
pró-inflamatória e uma relação de dependência entre produção de nitrito e o tempo
para ambos os grupos em todos os tempos experimentais.
Foi comum para todas as medicações empregadas o aumento da produção
de nitrito em determinadas concentrações com o passar do tempo. Com o uso da
pasta tripla antibiótica modificada essa relação foi observada em algumas
concentrações consideradas baixas e não foi observada grandes diferenças entre a
produção de nitrito entre os ambientes. Já com o CFC modificado houve aumento da
produção principalmente em ambiente pró inflamatório dessa medicação exposta a
maior concentração, mostrando uma maior interação desta medicação nesta
concentração neste ambiente nos dois últimos tempos experimentais. Com o CFC
em ambos ambientes houve maior produção de nitrito com o decorrer do tempo,
porém em ambiente inflamatório a produção teve relação diretamente proporcional
com o aumento da concentração.
Com base nos resultados obtidos a partir do presente estudo, podemos
sugerir que a medicação CFC modificado apresentou resultados mais favoráveis
com relação à viabilidade celular e produção de NO em comparação com CFC que
por sua vez se apresentou mais favorável que a pasta tripla antibiótica modificada. A
pasta pode ser preparada em uma concentração conhecida (ideal) ou com base em
sua consistência. Entretanto, pela conveniência do emprego de pastas cremosas
rotineiramente, é importante que se considere a toxicidade que altas concentrações
de substâncias antimicrobianas possam exercer às células da papila apical ou do
periodonto.
Neste trabalho, pode-se demonstrar ainda que o efeito de medicações
intracanal é dependente da concentração, do tempo de contato e da condição prévia
da célula presente no remanescente tecidual. Juntamente com outras evidências
científicas, é importante salientar a importância da concentração de medicação
empregada clinicamente uma vez que as mesmas são utilizadas por longos períodos
de tempo e são aplicadas sobre células previamente alteradas pela instalação de
processos inflamatórios de forma que somados, estes efeitos poderão resultar em
agressões ainda maiores para o tecido periapical podendo comprometer a qualidade
do tecido a ser formado na tentativa de indução de regeneração endodôntica.
74
7 CONCLUSÕES
Do presente estudo pode-se concluir:

O subproduto bacteriano, ácido lipoteicóico (LTA) de Enterococcus
faecalis, influenciou a atividade mitocondrial das células da papila apical
expostas à pasta tripla modificada, ao CFC e ao CFC modificado,
promovendo possível aumento do metabolismo ou proliferação celular em
relação ao ambiente fisiológico.

Dentre as medicações estudadas, o CFC modificado apresentou menor
efeito citotóxico sobre a viabilidade das células da papila apical nos tempos
experimentais estudados.

O
CFC
promoveu
diminuição
da
viabilidade
celular
na
sua
concentração maior em ambas condições celulares.

A pasta tripla antibiótica modificada em altas concentrações levou a
diminuição significativa da viabilidade em ambos ambientes e foi considerada
a mais citotóxica neste estudo.

As medicações CFC modificado, CFC e pasta tripla antibiótica
modificada induziram a produção de óxido nítrico em um padrão dependente
da condição celular, tempo de contato e concentração da medicação testada.
75
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ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
90
91
ANEXO B – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido/ Termo de Doação
A pesquisa de Título: “Influência de medicações intracanal utilizadas em procedimentos
endodônticos regenerativos na sobrevivência de células da papila apical in vitro” será realizada por
Aline Pereira Oliveira, CRO-SP 94055; sob orientação do Dr. Celso Luiz Caldeira, CRO-SP 40512,
será realizada na Faculdade de Odontologia da Universidade de São Paulo, sendo os procedimentos
clínicos realizados na Clínica Odontológica e os procedimentos laboratoriais no Laboratório de
Pesquisas Básicas do Departamento de Dentística da FOUSP.
A referida pesquisa tem como objetivo o estudo dos efeitos nocivos de medicações utilizadas em
Endodontia sobre células existentes em terceiros molares. A participação consiste na doação
voluntária do dente com indicação para extração, a mesma é opcional e dela você pode desistir a
qualquer momento, sem explicar os motivos e sem comprometer o tratamento na Faculdade de
Odontologia da Universidade de São Paulo.
Deste dente será removida a papila apical (tecido presente na raiz do dente) a partir da qual
será estabelecido cultura de células, que por sua vez serão utilizadas pelo pesquisador neste estudo.
Após a pesquisa o seu dente e a cultura de células estabelecidas a partir dele serão descartados em
lixo infectocontagioso.
Os riscos envolvidos serão inerentes a qualquer procedimento cirúrgico, como hemorragia, fratura de
maxila ou mandíbula, edema; porém todas as medidas necessárias para a realização do
procedimento serão devidamente tomadas, assim como uma avaliação prévia do seu estado de
saúde. Você não terá nenhum benefício direto, mas a doação do seu dente extraído poderá resultar
na aquisição de conhecimento científico acerca do potencial tóxico de medicamentos investigados
para uso em Endodontia Regenerativa, procedimento este que tem como principal objetivo prolongar
a sobrevida de dentes com formação da raiz interrompida e por conseguinte, melhorar a qualidade de
vida de pacientes acometidos por processos infecciosos durante a infância. As informações
fornecidas serão confidenciais, de conhecimento apenas dos pesquisadores responsáveis e apenas
para este estudo. Você não será identificado em nenhum momento, mesmo quando os resultados
desta pesquisa forem divulgados.
Se houver dúvidas sobre a ética da pesquisa entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa
da Faculdade de Odontologia (Av. Lineu Prestes 2227, 05508-000 São Paulo, telefone 30917960 ou
pelo e-mail: [email protected].
Após ter sido informado e ter minhas dúvidas suficientemente esclarecidas pelo pesquisador
concordo em participar de forma voluntária desta pesquisa, por meio da doação do dente extraído
nesta ocasião.
Nome: _________________________________________________________
Endereço:_____________________________________________________________________________________________
_________________________
RG:____________________________ Tel: ____________________________
São Paulo,
_________________________
Paciente
Pesquisador Responsável: Aline Pereira Oliveira
Endereço: Rua Afonso Celso, 1102 ap. 73 Bl. B
São Paulo- SP CEP: 04119-061 Telefone: (11) 983004118
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____________________
Pesquisador
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