UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS
BIOATIVOS
FILLIPE DE OLIVEIRA PEREIRA
INVESTIGAÇÃO DO MECANISMO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE
MONOTERPENOS FRENTE A CEPAS DE Trichophyton rubrum
João Pessoa – PB
2012
FILLIPE DE OLIVEIRA PEREIRA
INVESTIGAÇÃO DO MECANISMO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE
MONOTERPENOS FRENTE A CEPAS DE Trichophyton rubrum
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Paraíba, em cumprimento aos
requisitos necessários para a obtenção
do título de DOUTOR EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS.
Área de concentração: FARMACOLOGIA.
ORIENTADORA:
Prof.ª Dr.ª Edeltrudes de Oliveira Lima
João Pessoa – PB
2012
P436i
UFPB/BC
Pereira, Fillipe de Oliveira.
Investigação do mecanismo da atividade antifúngica de
monoterpenos frente a cepas de Trichophyton rubrum / Fillipe
de Oliveira Pereira.-- João Pessoa, 2012.
179f. : il.
Orientadora: Edeltrudes de Oliveira Lima
Tese (Doutorado) – UFPB/CCS
1. Produtos Naturais. 2. Monoterpenos. 3. Trichophyton
rubrum. 4. Ergosterol. 5. Antifúngico.
CDU: 547.9(043)
FILLIPE DE OLIVEIRA PEREIRA
INVESTIGAÇÃO DO MECANISMO DA ATIVIDADE ANTIFÚNGICA DE
MONOTERPENOS FRENTE A CEPAS DE Trichophyton rubrum
Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos do Centro de
Ciências da Saúde da Universidade
Federal da Paraíba, em cumprimento aos
requisitos necessários para a obtenção
do título de DOUTOR EM PRODUTOS
NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS.
Área de concentração: FARMACOLOGIA.
Aprovada em 31 de agosto de 2012
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________
Prof.ª Dr.ª Edeltrudes de Oliveira Lima
(Universidade Federal da Paraíba)
Orientadora
_____________________________________________
Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho
(Universidade Regional do Cariri)
Examinador externo
_____________________________________________
Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio
(Universidade Federal da Paraíba)
Examinador externo
_____________________________________________
Prof.ª Dr.ª Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz
(Universidade Federal da Paraíba)
Examinador interno
_____________________________________________
Prof.ª Dr.ª Bagnólia Araújo da Silva
(Universidade Federal da Paraíba)
Examinador interno
É melhor atirar-se em luta, em busca de dias melhores,
do que permanecer estático como os pobres de espírito,
que não lutaram, mas também não venceram.
Bob Marley
AGRADECIMENTOS
Dedico meus agradecimentos iniciais aos meus pais Fernando e Elza, são o
meu chão firme. Com certeza hoje somente estou aqui porque recebi amor, conforto
e toda a confiança que precisei.
Agradeço especialmente a minha família grande, minha irmã Charlene e irmão
Fernando por tudo que me proporcionaram durante este tempo todo, pela
compreensão e amizade.
À Prof.ª Dr.ª Edeltrudes de Oliveira Lima por todo o longo tempo em que foi
minha orientadora, uma pessoa que verdadeiramente é um exemplo de trabalho e
humildade. Esta parceria data de anos e espero que perdure por muito tempo ainda.
Agradeço aos professores que participaram da banca de qualificação e defesa
Prof.º Dr. Evandro Leite de Souza, Prof.ª Dr.ª Hilzeth de Luna Freire Pessôa, Prof.ª
Dr.ª Bagnólia Araújo da Silva, Prof.ª Dr.ª Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz,
Prof. Dr. Henrique Douglas Melo Coutinho e Prof. Dr. Fábio Correia Sampaio não
somente por terem aceito o nosso convite, mas principalmente pelas valiosas
contribuições e orientações.
À equipe do Laboratório de Micologia nominalmente Prof.ª Dr.ª Zélia B. V. S.
Pontes e Maria de Fátima F. P. Carvalho pelo espaço no Laboratório, pelo auxílio e
orientações.
Aos meus amigos e companheiros de bancada no Laboratório de Micologia:
Vinícius N. Trajano, Wylly A. Oliveira, Egberto S. Carmo, Patrícia P. R. Sousa, Igara
O. Lima, Catiana O. Lima, Kelly S. L. Mota, Felipe Q. S. Guerra e Janiere P. Sousa.
Agradeço pelo apoio na bancada, nas conversas, nas orientações e pelo trabalho
em equipe que sempre desenvolvemos.
Particularmente, faço um agradecimento especial a Juliana M. Mendes por ter
me acompanhado durante esses últimos anos e mesmo de tão longe continua me
auxiliando em tudo. Sem você o trabalho teria sido bem mais difícil.
A minha turma de doutorado, sempre juntos durante toda a pós em uma
convivência que vai além das salas de aula. Obrigado pelas discussões, pelas
conversas, pela qualidade das discussões nas aulas e orientações.
Aos professores do Programa de Pós-graduação em Produtos Naturais e
Sintéticos Bioativos (PgPNSB), em especial a Prof.ª Bagnólia A. da Silva, Prof.ª
Márcia R. Puivezam e Prof.ª Leônia M. Batista pela imensa capacidade técnica e
qualidade das aulas. Fazem o curso de Doutorado valer a pena.
Não poderia me esquecer de meus queridos amigos que mesmo de longe me
acompanharam e estão comigo até hoje. Agradeço e espero sempre corresponder
pela confiança e apoio que recebi de vocês.
Agradeço também a Wellington L. Navarro, pelo auxílio nas analises com o
espectrofotômetro, no extinto LTF (UFPB).
À Secretaria e Coordenação do PgPNSB, pela pronta disponibilidade em
auxiliar e orientar os alunos sempre que precisaram.
À Universidade Federal da Paraíba e ao PgPNSB pela oportunidade de fazer o
curso de Doutorado.
Ao CNPq e à CAPES pelo apoio financeiro para elaboração deste trabalho e
pelo suporte técnico-científico através da manutenção do periódico CAPES.
Muito obrigado!
Investigação do mecanismo da atividade antifúngica de monoterpenos frente a cepas de Trichophyton rubrum
PEREIRA, F. O. (2012)
Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, área de concentração: farmacologia,
Tese de Doutorado, CCS/UFPB
RESUMO
Trichophyton rubrum é o principal agente responsável por quadros crônicos de
dermatofitoses em unhas, nos pés, nas mãos, no tronco, pescoço e couro cabeludo,
com altos índices de resistência aos antifúngicos. A importância clínica e
epidemiológica dispensada às dermatofitoses impulsionam estudos que visam à
descoberta de novos agentes antifúngicos. Neste contexto, grande atenção vem
sendo dada aos produtos oriundos de plantas aromáticas, especialmente os óleos
essenciais e seus componentes. Entre estes, os monoterpenos se destacam por
possuírem amplo reconhecimento do seu poder antimicrobiano. Por isso, foi
investigada a atividade antifúngica dos monoterpenos citronelal, geraniol e citronelol
frente a 14 cepas de T. rubrum. Para tal, foi determinada a concentração inibitória
mínima (CIM) de cada produto, como também os seus efeitos sobre o crescimento
micelial (massa seca), a viabilidade (LogUFC/mL), a germinação de conídios e a
morfogênese de T. rubrum. A ação dos produtos sobre a parede celular fúngica
(ensaio com sorbitol) e sobre a membrana plasmática fúngica (perda de material
citoplasmático, complexação com ergosterol e síntese de ergosterol) também foi
investigada. Além disso, foi analisada a interferência sobre a infectividade de T.
rubrum (infecção in vitro em unhas). Entre os monoterpenos testados, geraniol e
citronelol foram os mais potentes, pois apresentaram menores valores de CIM.
Ensaios foram realizados com geraniol (CIM = 32 µg/mL e CIMx2 = 64 µg/mL) e
citronelol (CIM = 128 µg/mL e CIMx2 = 256 µg/mL), nos quais eles inibiram
significativamente o desenvolvimento micelial e a germinação dos conídios. Os
monoterpenos apresentaram efeito fungicida e provocaram alterações na
morfogênese formando hifas largas, curtas e tortuosas nas cepas ATCC1683 e
LM422. Com sorbitol, os valores de CIM desses monoterpenos aumentaram frente à
cepa ATCC1683, sugerindo ação sobre a parede celular fúngica. Os resultados dos
ensaios sobre a membrana plasmática mostraram que geraniol e citronelol
provocaram liberação de material intracelular, formaram complexos com o ergosterol
e diminuíram o conteúdo de ergosterol. Diante dos resultados, sugere-se que o
geraniol e citronelol atuam sobre a membrana de T. rubrum por um mecanismo que
parece envolver a complexação com o ergosterol e inibição de sua biossíntese,
afetando indiretamente a parede celular e ocasionando lise celular. Além do mais,
geraniol e citronelol, na CIM e CIMx2, também inibiram a infecção de T. rubrum em
fragmentos ungueais. Dessa maneira, os monoterpenos geraniol e citronelol se
apresentam como promissores agentes antifúngicos, com potencial aplicabilidade no
tratamento das dermatofitoses, em especial contra o agente T. rubrum.
Palavras-chave: Monoterpenos. Trichophyton rubrum. Ergosterol. Antifúngico.
Investigation of the mechanism of antifungal activity of monoterpenes against strains of Trichophyton rubrum
PEREIRA, F. O. (2012)
Pós-Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, área de concentração: farmacologia
Tese de Doutorado, CCS/UFPB
ABSTRACT
Trichophyton rubrum is the main responsible microorganism of chronic cases of
dermatophytosis on nails, feet, hands, torso, neck and scalp, with high rates of
resistance to antifungal agents. The clinical and epidemiological importance
concerned dermatophytosis encourage studies for searching of new antifungal
agents. In this context, attention has been drawn to the products from aromatic
plants, especially essential oils and their components. The monoterpenes stands out
due to widespread recognition of its antimicrobial activity. Therefore, it was
investigated the antifungal activity of the monoterpenes citronellal, geraniol and
citronellol against 14 strains of T. rubrum. For this, it was determined the minimum
inhibitory concentration (MIC) of each drug, as well as their effects on mycelial
growth (dry weight), the viability (logCFU/mL), conidial germination and
morphogenesis. The action of the drugs on the fungal cell wall (test with sorbitol) and
on the fungal cell membrane (release of cellular material, complex with ergosterol
and ergosterol synthesis) were also investigated. Moreover, it was analyzed the
interference on the infectivity of T. rubrum (in vitro nail infection). Among the tested
monoterpenes, geraniol and citronellol were the most potent, since they showed
lower MIC values. Assays were performed with geraniol (MIC = 32 µg/mL and MICx2
= 64 µg/mL) and citronellol (MIC = 128 µg/mL and MICx2 = 256 µg/mL), they
significantly inhibited the mycelial growth and conidial germination. The
monoterpenes showed fungicidal effect and caused caused abnormalities in
morphogenesis showing large, short and twisted hyphal in the strains ATCC1683 and
LM422. With sorbitol, the MIC values of these monoterpenes increased against the
strain ATCC1683, suggesting action on the fungal cell wall. The results of the assays
on the cell membrane showed that geraniol and citronellol released intracellular
material, formed complexes with the ergosterol and decreased content of ergosterol.
Therefore, the results suggest that that geraniol and citronellol act on the membrane
of T. rubrum by a mechanism that appears to involve a complex with ergosterol and
inhibition its biosynthesis, indirectly affecting the cell wall and causing cell lysis.
Moreover, geraniol and citronellol at MIC and MICx2 also prevented infection of T.
rubrum on nail fragments. Thus, the monoterpenes geraniol and citronellol are
presented as promising antifungal agents, with potential applicability in the treatment
of dermatophytosis, especially against the agent T. rubrum.
Keywords: Monoterpenes. Trichophyton rubrum. Ergosterol. Antifungal.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Tinea unguium causada por Trichophyton rubrum ................................ 16
Figura 2 – Tinea cruris causada por Trichophyton rubrum ..................................... 17
Figura 3 – Tinea pedis causada por Trichophyton rubrum ..................................... 18
Figura 4 – Tinea corporis causada por Trichophyton rubrum ................................. 18
Figura 5 – Esquema dos tipos de hifas constituindo o micélio fúngico .................. 19
Figura 6 – Elementos básicos da morfologia de fungos filamentosos ................... 20
Figura 7 – Características das colônias e da micromorfologia de Trichophyton
rubrum em ágar batata ......................................................................... 21
Figura 8 – Estrutura química de alguns compostos azólicos.................................. 24
Figura 9 – Estrutura química da terbinafina, uma alilamina.................................... 25
Figura 10 – Estrutura química da griseofulvina ...................................................... 26
Figura 11 – Estruturas químicas dos monoterpenos citronelal, geraniol e citronelol
............................................................................................................ 30
Figura 12 – Superfície celular fúngica com os elementos de sua parede .............. 32
Figura 13 – Estrutura química de um segmento de quitina .................................... 33
Figura 14 – Estrutura química de um segmento de β-glicano ................................ 34
Figura 15 – Estrutura química de esteróis de membrana plasmática ..................... 36
Figura 16 – Esquema da biossíntese de ergosterol ............................................... 37
Figura 17 – Percentual de massa micelial seca produzido por Trichophyton rubrum
ATCC 1683 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol,
geraniol e citronelol ............................................................................. 57
Figura 18 – Percentual de massa micelial seca produzido por Trichophyton rubrum
LM 422 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol
e citronelol ........................................................................................... 58
Figura 19 – Curvas de viabilidade das estruturas fúngicas de Trichophyton rubrum
ATCC 1683 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol,
geraniol e citronelol ............................................................................. 60
Figura 20 – Curvas de viabilidade das estruturas fúngicas de Trichophyton rubrum
LM 422 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol
e citronelol ........................................................................................... 61
Figura 21 – Percentual de conídios germinados de Trichophyton rubrum ATCC
1683 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e
citronelol .............................................................................................. 63
Figura 22 – Percentual de conídios germinados de Trichophyton rubrum LM 422
na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e
citronelol .............................................................................................. 64
Figura 23 – Micromorfologia de Trichophyton rubrum ATCC 1683 na ausência
(controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol ........... 67
Figura 24 – Taxa de material intracelular de Trichophyton rubrum ATCC 1683 com
absorção em 260 nm na ausência (controle) e na presença de
cetoconazol, geraniol e citronelol .......................................... ..............72
Figura 25 – Conteúdo de ergosterol produzido por massa úmida celular por
Trichophyton rubrum ATCC 1683 na presença de cetoconazol,
geraniol e citronelol ............................................................................. 76
Figura 26 – Estruturas químicas do geranil pirofosfato, geraniol e citronelol ......... 78
Figura 27 – Participação de geranil pirofosfato na síntese de esqualeno .............. 79
Figura 28 – Ensaio de infecção ex vivo mostrando o crescimento de cepas de
Trichophyton rubrum sobre fragmentos ungueais ............................... 83
Figura 29 – Proposta de mecanismo da atividade antifúngica de geraniol e
citronelol frente a Trichophyton rubrum ............................................... 85
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Concentração inibitória mínima de citronelal, geraniol, citronelol e
cetoconazol sobre cepas de Trichophyton rubrum ................................ 53
Tabela 2 – Concentração inibitória mínima de geraniol, citronelol e cetoconazol na
ausência e na presença de sorbitol sobre Trichophyton rubrum ATCC
1683 ...................................................................................................... 70
Tabela 3 – Concentração inibitória mínima de geraniol, citronelol, cetoconazol e
anfotericina B na ausência e na presença de ergosterol sobre
Trichophyton rubrum ATCC 1683.......................................................... 74
Tabela 4 – Interferência de geraniol, citronelol, e cetoconazol na infectividade de
Trichophyton rubrum ATCC 1683 sobre fragmentos ungueais de
voluntários ............................................................................................. 82
Tabela 5 – Interferência de geraniol, citronelol, e cetoconazol na infectividade de
Trichophyton rubrum LM 422 sobre fragmentos ungueais de voluntários
.............................................................................................................. 82
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ABD
Ágar batata dextrose
ASD
Ágar Sabouraud dextrose
ATCC
American Type Culture Collection
CCS
Centro de Ciências da Saúde
CG-EM
Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
CSD
Caldo Sabouraud Dextrose
DMSO
Dimetilsulfóxido
e.p.
Erro padrão
GDP
Difosfato de guanosina
GTP
Trifosfato de guanosina
HIV
Human immunodeficiency virus
KOH
Hidróxido de potássio
LM
Laboratório de Micologia
µg
Micrograma
µg/mL
Micrograma por mililitro
µm
Micrômetro
+
NADP
Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato oxidado
NADPH
Nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato reduzido
mm
Milímetro
NaCl
Cloreto de sódio
OMS
Organização Mundial de Saúde
%
Percentual
pH
Potencial hidrogeniônico
PM
Peso molecular
rpm
Rotações por minuto
UFC
Unidades formadoras de colônias
UFC/mL
Unidades formadoras de colônias por mililitro
LogUFC/mL
Logarítimo de unidades formadoras de colônias por mililitro
UFPB
Universidade Federal da Paraíba
UDP
Difosfato de uridina
UDP-glicose
Difosfato de uridina glicose
OBS.: Os termos não listados nesta relação se encontram descritos no texto.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 15
1.1 Trichophyton rubrum E AS DERMATOFITOSES ................................................ 15
1.2 TRATAMENTO DAS DERMATOFITOSES ......................................................... 22
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE PRODUTOS NATURAIS ....................................... 27
1.4 ALVOS CELULARES PARA INVESTIGAÇÃO ANTIFÚNGICA .......................... 31
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 39
2.1 OBJETIVO GERAL.............................................................................................. 39
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................... 39
3 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 42
3.1 LOCAL DA PESQUISA ....................................................................................... 42
3.2 ANTIFÚNGICOS E MONOTERPENOS .............................................................. 42
3.3 CEPAS FÚNGICAS ............................................................................................. 42
3.4 MEIOS DE CULTIVO .......................................................................................... 43
3.5 INÓCULO ............................................................................................................ 43
3.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM) ............... 43
3.7 EFEITOS SOBRE O CRESCIMENTO MICELIAL ............................................... 44
3.8 EFEITOS SOBRE A VIABILIDADE FÚNGICA .................................................... 45
3.9 EFEITOS SOBRE A GERMINAÇÃO DOS CONÍDIOS ....................................... 45
3.10 EFEITOS SOBRE A MORFOGÊNESE ............................................................. 46
3.11 AÇÃO DO PRODUTO NA PAREDE CELULAR ................................................ 46
3.11.1 Ensaio com sorbitol ........................................................................................ 46
3.12 AÇÃO DO PRODUTO NA MEMBRANA CELULAR .......................................... 47
3.12 1 Perda de material citoplasmático.................................................................... 47
3.12.2 Interação com o ergosterol ............................................................................. 47
3.12.3 Biossíntese do ergosterol ............................................................................... 48
3.13 INFECÇÃO EX VIVO......................................................................................... 49
3.13.1 Sujeitos........................................................................................................... 49
3.13.2 Infecção .......................................................................................................... 49
3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA ................................................................................... 50
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 51
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 87
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 89
APÊNDICE A – Termo de consentimento livre e esclarecido .................................. 110
ANEXO A – Certidão de aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa ................... 114
ANEXO B – Laudos de especificação técnica dos monoterpenos .......................... 115
ANEXO C – Artigos submetidos .............................................................................. 118
ANEXO D – Artigos publicados ............................................................................... 122
INTRODUÇÃO
Introdução | 15
1 INTRODUÇÃO
1.1 Trichophyton rubrum E AS DERMATOFITOSES
As dermatofitoses são infecções fúngicas em tecidos queratinizados como
unhas, cabelos e estrato córneo da pele, produzidas por fungos denominados
dermatófitos. A expressão dermatófitos é utilizada para designar um grupo de fungos
queratinofílicos, taxonomicamente relacionados, que ocasionam essas micoses.
Este grupo de fungos compreendem diversas espécies e variedades, agrupadas em
três gêneros: Epidermophyton, Microsporum e Trichophyton (SIMPANYA, 2000;
LACAZ et al., 2002).
No tocante à patogênese das dermatofitoses, é relatado que a infecção é
iniciada pela inoculação de conídos ou artroconídios – estruturas que podem
permanecer viáveis por anos no meio ambiente – sobre o tegumento. O sucesso
deste processo infeccioso está relacionado à capacidade dos fungos aderirem ao
tecido epitelial e superar os mecanismos de resistência do hospedeiro a exemplo da
própria barreira cutânea, pH da pele e presença de ácidos graxos fungistáticos. Para
isto, os fungos expressam adesinas na superfície dos conídios, mananos na parede
celular envolvidos na imunossupressão e produzem uma série de enzimas
hidrolíticas como nucleases, lipases, queratinases, serino e metaloproteinases que
auxiliam na captação de nutrientes (ESQUENAZI et al., 2004; JOUSSON et al.,
2004; MARTINEZ-ROSSI et al., 2008; VERMOUT et al., 2008).
Para que os fungos ocasionem doenças em seres humanos, eles precisam
alcançar o hospedeiro, aderir a tecidos específicos, resistir aos mecanismos do
sistema imune e proliferar a uma dada extensão do tecido, onde a doença é
revelada clinicamente (ODDS, 2000). Embora não façam parte da microbiota do
sistema tegumentar, os dermatófitos são particularmente bem adaptados aos sítios
de infecção porque eles utilizam queratina como fonte nutricional de carbono,
enxofre e nitrogênio, diferentemente de outros patógenos. As dermatofitoses são
geralmente cutâneas e restritas à camada córnea da pele, pois esses fungos
geralmente são incapazes de penetrar nas camadas do tegumento, em indivíduos
imunocompetentes (SIMPANYA, 2000; MARTINEZ-ROSSI et al., 2008).
O aspecto clínico das dermatofitoses é bastante variável e resulta dos efeitos
combinados da degradação da queratina e resposta inflamatória do hospedeiro à
Introdução | 16
infecção. As dermatofitoses podem ser classificadas de acordo com as localizações
anatômicas das lesões, utilizando a denominação tinea seguida do sítio anatômico
onde se localiza a infecção, também em latim (DEGREEF, 2008). T. rubrum é
considerado um dos principais agentes causadores de infecções cutâneas,
predominando nos casos clínicos de tinea ungium, tinea cruris, tinea pedis e tinea
corporis (SEEBACHER et al., 2008; AMEEN et al., 2010).
Tinea ungium é caracterizada pela invasão da lâmina ungueal por dermatófitos
(Figura 1). O comprometimento da unha pode ocorrer na forma subungueal distal,
próxima ou lateral e superficial branca; todas essas formas podem evoluir para
distrofia total ou parcial da unha. As unhas dos pés e das mãos podem ser
infectadas, mas as unhas dos pés são mais frequentemente afetadas. T. rubrum
está envolvido na ampla maioria dos casos tinea unguium, principalmente em
indivíduos imunocomprometidos (PEREA et al., 2000; AMEEN et al., 2007).
Figura 1 – Tinea unguium causada por Trichophyton rubrum.
Fonte: DEGREEF (2008).
A: Distrofia total das unhas. B: Comprometimento subungueal distal e lateral.
Tinea cruris inclui infecções da genitália, região pubiana, região perineal e
perianal da pele (Figura 2). Os adultos são mais acometidos do que as crianças e os
homens são mais comumente acometidos em relação às mulheres. A infecção tem
Introdução | 17
distribuição mundial, embora seja prevalente em regiões de clima tropical (GUPTA et
al., 2003; DEGREEF, 2008).
Figura 2 – Tinea cruris causada por Trichophyton rubrum.
Fonte: MOYANO et al. (2010).
Tinea pedis é a infecção dermatofítica que envolve a pele da região plantar e as
regiões interdigitais dos pés (Figura 3). T. rubrum está frequentemente associado a
quadros crônicos, não inflamatórios, eritematosos e escamosos de tinea pedis.
Pessoas portadoras de diabetes tipo II e do vírus HIV são as mais acometidas em
todo o mundo. Além disso, certas profissões como mineiros, soldados e profissionais
de atividades recreativas ou atletas possuem maior risco de adquirir tinea pedis
(PEREA et al., 2000; DEGREEF, 2008).
Tinea corporis acomete a pele glabra, principalmente o tronco, ombros e braços
(Figura 4). As lesões se manifestam geralmente com aspecto anelar, sob a forma de
pequenos eritemas de contornos delimitados. As lesões podem ser únicas, mas
podem ser encontradas na forma de múltiplas lesões. As infecções provocadas por
T. rubrum são as mais prevalentes e podem se apresentar como lesões crônicas
não inflamatórias e bastante extensas (DAS et al., 2007; AMEEN et al., 2010).
Introdução | 18
Figura 3 – Tinea pedis causada por Trichophyton rubrum.
Fonte: COHEN; LEHMANN (2012).
Figura 4 – Tinea corporis causada por Trichophyton rubrum.
Fonte: DEGREEF (2008).
Introdução | 19
Assim como outros fungos filamentosos, T. rubrum possui um aparelho
reprodutivo cujos órgãos se diferenciam para desempenhar reprodução não sexual e
um aparelho de vida vegetativa que, em conjunto, são denominados de micélio
(Figura 5) (KAYSER, 2005).
Figura 5 – Esquema dos tipos de hifas constituindo o micélio fúngico.
Fonte: PEREIRA (2012).
O micélio é caracterizado como um conjunto de células que formam hifas
septadas – filamento fúngico ou um segmento do micélio filamentoso – encontrados
no interior ou na superfície do meio de crescimento, quando cultivados em
laboratório. O crescimento fúngico envolve transporte e assimilação de nutrientes,
seguido pela sua integração pelos componentes intracelulares que posteriormente
desencadeiam divisão celular e o consequente o aumento da biomassa fúngica
(LACAZ et al., 1998; WALKER; WHITE 2005). Portanto, a hifa constitui, em seu
conjunto, o micélio dos fungos. As hifas crescem a partir de seu ápice, formando
verdadeiras redes de ramificações como pode ser visualizados na figura 6.
Introdução | 20
Figura 6 – Elementos básicos da morfologia de fungos filamentosos.
Fonte: KAYSER, (2005).
A: Hifas septadas. B: Rede de hifas ramificadas.
Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso antropofílico e recentemente se
tornou o mais comum e amplamente distribuído dermatófito que acomete o homem.
T. rubrum é um fungo com uma taxa de crescimento lenta, tornando-se
completamente maduro em torno de 14 dias. Suas colônias são macias, brancas,
algumas vezes tornam-se roseadas no decorrer do seu envelhecimento, o reverso
da colônia pode se encontrar corado de vermelho ou amarelo (Figura 7A e B).
Possui escassos macroconídios, de tamanho variável e forma de charuto. Suas hifas
são hialinas, septadas com microconídios em forma de gota, com aproximadamente
2-3 por 3-5 µm, dispostos ao longo das hifas (Figura 7C) (GRÄSER et al., 2000).
A elevada prevalência de infecções micóticas superficiais tem demonstrado que
cerca de 25% da população mundial tem micoses superficiais, incluindo
dermatofitoses, tornando este tipo de infecção um dos mais comuns em todo o
mundo (HAVLICKOVA et al., 2008). Registros epidemiológicos relatam que T.
rubrum é um dos dermatófitos mais comumente isolados micoses superficiais, com
distribuição mundial e sendo responsável por cerca de 70% dos casos de
dermatofitoses em humanos. Trabalhos desenvolvidos por pesquisadores da
América do Sul e do Norte, além das regiões Norte e Central da Europa colocam
Introdução | 21
este micro-organismo como sendo um dos mais comumente isolado em casos de
dermatofitoses nessas regiões e com reconhecida resistência à terapêutica local
(HERNÁNDEZ-SALAZAR et al., 2007; HAVLICKOVA et al., 2008; SEEBACHER et
al., 2008).
Figura 7 – Características das colônias e da micromorfologia de Trichophyton
rubrum em ágar batata.
Fonte: PEREIRA, (2009).
A: micélio aéreo; B: micélio vegetativo; C: micromorfologia em microscopia óptica (aumento: 400x).
Nota: barra: 50 µm.
No Brasil, ele também continua sendo o dermatófito mais frequentemente
isolado em diversos sítios anatômicos (COSTA et al., 2002; AQUINO et al., 2003;
DAMÁZIO et al., 2007). Em João Pessoa-PB, especificamente, o T. rubrum foi a
Introdução | 22
espécie mais encontrada em diferentes formas clínicas da doença em estudos
desenvolvidos por Lima et al (1999). Neste estudo, do total de pessoas com
dermatofitose confirmada, T. rubrum foi o responsável por 50,8% dos casos, com
predomínio nos casos de tinea corporis (47%), e tinea capitis (31%).
Além das lesões cutâneas, também é descrito a ocorrência de processos
infecciosos mais profundos envolvendo T. rubrum. Geralmente, indivíduos com a
síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS – Acquired Immune Deficiency
Syndrome), uso prolongado de corticosteroides, de quimioterapia e drogas
imunossupressoras em transplantados são os mais acometidos (LILLIS et al., 2009;
LOWTHER et al., 2007; MARCONI et al., 2010).
1.2 TRATAMENTO DAS DERMATOFITOSES
As dermatofitoses podem ser tratadas topicamente, sistemicamente ou
associando-se ambas as formas de tratamento, a depender do perfil de sensibilidade
do fungo, do sítio acometido, da extensão da lesão, entre outros fatores. A terapia
tópica é indicada para os casos de suaves a moderados de tinea corporis, tinea
cruris, tinea pedis e tinea manuum (dermatofitose das mãos). A terapia oral deve ser
considerada para aqueles indivíduos com largas e extensas áreas de lesão, onde
normalmente apresentam uma gravidade não esperada ou persistente; também
podem ser utilizadas por pessoas que apresentaram complicações no uso tópico. A
associação das duas formas é usada geralmente para os casos ainda mais
complicados, crônicos ou para os portadores de tinea unguium e tinea capitis
(dermatofitose do couro cabeludo) (DEGREEF et al., 2006; GUPTA; COOPER,
2008; VAN MINNEBRUGGEN et al., 2010).
Atualmente ainda é escasso o número de agentes empregados no tratamento
das dermatofitoses. Novas classes de fármacos estão surgindo a exemplo dos
agentes inibidores de parede fúngica como as equinocandinas, porém são apenas
empregados em casos específicos de micoses sistêmicas causadas por fungos dos
gêneros Candida e Aspergillus, e outros fungos oportunistas e resistentes a agentes
de amplo espectro (FERA et al., 2009; CARRILLO-MUÑOZ et al., 2010). Alguns
agentes se destacam na utilização clínica para o tratamento das dermatofitoses,
entre os quais existem os derivados imidazólicos como cetoconazol, compostos
Introdução | 23
triazólicos a exemplo do itraconazol e fluconazol, além da terbinafina e da
griseofulvina (FERNÁNDEZ-TORRES et al., 2003).
Os antifúngicos azólicos são classificados como imidazólicos ou triazólicos. Os
primeiros possuem dois átomos de nitrogênio no anel azólico, enquanto que os
triazólicos possuem três (Figura 8). Eles possuem o mesmo mecanismo de ação e
espectro de ação, no entanto, os triazólicos são metabolizados mais lentamente e
exercem menos efeitos colaterais (ODDS et al., 2003). Esses fármacos atuam na
biossíntese do ergosterol, o principal esterol presente na membrana celular de todas
as células fúngicas. Eles são inibidores da 14-α-desmetilase, enzima que catalisa a
remoção oxidativa do grupo 14-α-metil do lanosterol durante a síntese do ergosterol.
Dessa forma, estes produtos induzem a depleção do ergosterol, com consequente
alteração da fluidez da membrana e inibição do crescimento fúngico (ODDS et al.,
2003; DENNING; HOPE, 2010).
O cetoconazol e outros compostos azólicos causam alguns efeitos colaterais
decorrentes de sua ação sobre vias enzimáticas que metabolizam esteroides no
hospedeiro. Assim, os efeitos indesejáveis envolvem a diminuição na síntese de
testosterona ou glicocorticoides e hepatotoxicidade ao fazer uso de terapias
prolongadas com azóis. Diante deste aspecto, é preciso ter precauções no seu uso
sistêmico a longo prazo no tratamento de micoses extensas ou de difícil tratamento
como as onicomicoses (GAUWERKY et al., 2009; VANDEPUTTE et al., 2012).
Uma nova geração de fármacos triazólicos foi desenvolvido porém com uso
restrito aos casos de infecções por fungos dos gêneros Candida, Aspergillus,
Fusarium e da ordem Mucorales, muita vezes resistentes aos triazólicos. São
exemplos dessa classe em uso clínico: o posaconazol e o voriconazol, embora
outros agentes já se encontram em fase final de desenvolvimento como o
ravuconazol, isavuconazol e albaconazol (WALSH et al., 2008; VANDEPUTTE et al.,
2012).
Introdução | 24
Figura 8 – Estrutura química de alguns compostos azólicos.
Fonte: LUPETTI et al. (2002).
A: Fluconazol (2-(2,4-difluorofenil)-1,3-bis(1,2,4-triazol-1-il)propan-2-ol). B: Itraconazol (2-butan-2-il-4[4-[4-[4-[[(2R,4S)-2-(2,4-diclorofenil)-2-(1,2,4-triazol-1-ilmetil)-1,3-dioxolan-4-il]metoxi]fenil]piperazin-1il]fenil]-1,2,4-triazol-3-one). C: cetoconazol (1-[4-[4-[[(2R,4S)-2-(2,4-diclorofenil)-2-(imidazol-1-ilmetil)1,3-dioxolan-4-il]metoxi]fenil]piperazin-1-il]etanone.
Introdução | 25
Os componentes da classe das alilaminas inibem a síntese de ergosterol, porém
por uma via diferente dos compostos azólicos. São inibidores reversíveis da
esqualeno epoxidase, uma enzima envolvida nas etapas iniciais da síntese de
esteróis. Em cepas susceptíveis, os efeitos para a membrana fúngica são
semelhantes aos azólicos. Em especial, a terbinafina (Figura 9) tem ampla
distribuição em tecidos adiposos, tecidos epiteliais e unhas devido a seu caráter
lipofílico. Por isso, é indicada no tratamento das dermatofitoses e candidíase
cutânea (ODDS et al., 2003; GHANNOUM et al., 2009; CARILLO-MUÑOZ et al.,
2010).
Figura 9 – Estrutura química da terbinafina, uma alilamina.
Fonte: ODDS et al. (2003).
Nota: nome da terbinafina pela IUPAC: ((E)-N,6,6-trimetil-N-(naftalen-1-ylmetil)hept-2-en-4-en-1aminehidrocloride).
A griseofulvina também possui eficácia comprovada principalmente para o
tratamento das dermatofitoses. Esse fármaco se distribui largamente pelos tecidos
queratinizados tais como a pele, pelos e unhas e, por isso, é utilizada no tratamento
de tineas da pele, couro cabeludo e unhas (LACAZ e al., 2002; GUPTA; RYDER,
2003). Sua indicação é direcionada na terapêutica de tinea capitis, tinea corporis e
tinea unguium além das demais formas clínicas resistentes às aplicações tópicas de
diferentes antifúngicos. A griseofulvina (Figura 10) interfere na estrutura e função
dos microtúbulos, inibindo a mitose das células durante sua reprodução. A
Introdução | 26
griseofulvina está associada a diversos efeitos indesejáveis com o seu uso no
tratamento de dermatofitoses, podendo-se destacar a moderada hepatotoxicidade
(GUPTA; COOPER, 2008; KAUR et al, 2008; GAUWERKY et al., 2009).
Figura 10 – Estrutura química da griseofulvina.
Fonte: ODDS et al. (2003).
Nota: nome da griseofulvina pela IUPAC:
benzofuran-2,4'-ciclohex-2-ene]-1',3-dione.
(2S,5'R)-7-chloro-3',4,6-trimetoxy-5'-metilespiro[1-
Embora pareça que o número de fármacos antifúngicos disponíveis no mercado
seja grande, eles estão agrupados em poucas classes químicas e, muitas vezes,
com espectro de ação restrito. Em contrapartida, a prevalência de infecções fúngicas
por leveduras ou por fungos filamentosos vem aumentando nas últimas décadas,
principalmente devido ao aumento de indivíduos imunocomprometidos como os
portadores do vírus HIV, que sofreram transplantes ou que estão em terapia
antineoplásica. Estas condições são associadas a maior utilização de agentes
antifúngicos, o que favorece o aparecimento de cepas resistentes. Assim como
outros micro-organismos, as células fúngicas possuem uma grande habilidade de
desenvolver resistência a compostos tóxicos (CIHLAR et al., 2002; KAPLAN et al.,
2002; MICELI et al., 2011).
O fenômeno de resistência pode ser entendido como uma seleção de cepas com
perfil genético modificado que resulta em menor sensibilidade destas cepas ao
Introdução | 27
agente antimicrobiano em questão (BOSSCHE, 1997). Esta resistência está
relacionada muitas vezes ao uso ou dose inadequada para o tratamento. Isto
contribui para o surgimento de falhas na eliminação do agente infeccioso, estimula o
crescimento de cepas resistentes e dificulta o tratamento da doença (ANDERSON,
2005; MARTINEZ-ROSSI et al., 2008).
Os fungos desenvolvem mecanismos de resistência aos efeitos fungistáticos e
fungicidas de todas as classes de fármacos, principalmente por três mecanismos
gerais: redução do acúmulo da droga no ambiente intracelular, diminuição da
afinidade da droga pelo seu alvo e modificações no seu metabolismo que reduzem
os efeitos danosos da droga. Muitas vezes, a associação de vários mecanismos está
envolvida nesta resposta do micro-organismo às drogas (ANDERSON, 2005;
VANDEPUTTE et al., 2012). Especificamente, T. rubrum tem desenvolvido
fenômenos de resistência aos agentes antifúngicos utilizados na clínica ou a outros
compostos tóxicos por mecanismos que envolvem principalmente modificações
moleculares nas enzimas alvo desses agentes, alta expressão de bombas de efluxo
(transportadores da família ABC) e outras proteínas responsivas ao estresse,
alteração na permeabilidade ou captação da droga. Os diversos mecanismos variam
de acordo com a cepa, a droga ou condições ambientais (DENISING et al., 2008;
PERES et al., 2010).
1.3 CONSIDERAÇÕES SOBRE PRODUTOS NATURAIS
Os produtos naturais são importantes instrumentos no desenvolvimento de
novas ferramentas terapêuticas e, neste ponto, as plantas medicinais e os produtos
derivados delas são reconhecidamente importantes para a pesquisa farmacológica e
o desenvolvimento de drogas (BRASIL, 2006). O uso de produtos naturais é
certamente uma das estratégias mais bem sucedidas na descoberta de novos
fármacos, envolvendo a participação das ciências biológicas, farmacêuticas,
médicas e a química (NEWMAN; CRAGG, 2007).
A Organização Mundial da Saúde (OMS) relata que muitas das drogas
consideradas básicas e essenciais são de origem vegetal e um significante número
é também obtido de precursores naturais. As plantas são fontes importantes de
moléculas biologicamente ativas que podem ser utilizadas não apenas como modelo
para a síntese e obtenção de novos fármacos, mas também como uma nova
Introdução | 28
possibilidade de intervenção terapêutica. Na área de agentes antimicrobianos, é
notável um comportamento crescente no número de drogas derivadas de produtos
naturais aprovados para uso clínico. E dessa forma, as plantas superiores se
constituem como uma das fontes mais importantes de novas substâncias utilizadas
com fins terapêuticos (WHO, 2002; NEWMAN; CRAGG, 2007; BRAZ FILHO, 2010).
Dada a importância das plantas medicinais como agentes terapêuticos, políticas
públicas foram construídas no Brasil na perspectiva de valorização do conhecimento
associado às plantas e melhoria do acesso da população aos medicamentos. Um
exemplo concreto disto foi a criação da Política Nacional e Práticas Integrativas e
Complementares no Sistema Único de Saúde (SUS) e da Política Nacional de
Plantas Medicinais e Fitoterápicos, publicadas em 2006. Estas políticas sinalizam a
importância de estudos voltados para a atividade biológica das plantas e seus
produtos almejando contribuir com novos agentes terapêuticos (BRASIL, 2006).
Na área de antimicrobianos, desde a antiguidade as plantas medicinais são
utilizadas para tratar doenças infecciosas que comumente acometem a população.
Entre as plantas empregadas com esta finalidade, as plantas aromáticas constituem
um grupo de vegetais proeminentes. Dentre os possíveis produtos extraídos destas
plantas, são os óleos essenciais que tem o maior uso popular no tratamento de
infecções em muitas partes do corpo como sistema respiratório, trato intestinal, trato
urinário e principalmente na pele (RIOS; RECIO, 2005; NUNES et al., 2006).
Historicamente, os óleos essenciais e os extratos de plantas há muito tempo têm
servido de base para diversas aplicações na medicina popular. No entanto, nos dias
atuais, seus principais usos são nas indústrias alimentícias (aromatizantes e
conservantes), de perfumes e farmacêuticas devido às suas ações bactericida,
fungicida, parasiticida, inseticida e virucida, entre outras propriedades biológicas
(NASCIMENTO et al., 2007; BAKKALI et al., 2008).
Os óleos essenciais são complexos de compostos voláteis caracterizados pelo
odor forte e são formados pelas plantas como metabólitos secundários, encontrados
em suas folhas, resinas, frutos, flores, troncos e outras partes (BURT, 2004). Esses
óleos são fitocomplexos que podem ser constituídos por até mais de 60
componentes individuais. Este fato pode interferir diretamente na sua maior ou
menor atividade biológica (LIMA et al., 2006). Diversas propriedades biológicas de
óleos essenciais já foram relatadas na literatura como atividade antineoplásica,
hipotensora,
antimicrobiana,
analgésica,
anti-inflamatória,
anticonvulsivante,
Introdução | 29
antioxidante, hipolipêmica e hipoglicemiante (EDRIS, 2007; BANSOD; RAI, 2008;
SUANARUNSAWAT et al., 2010; BIRADAR et al., 2010).
A
grande
maioria
dos
óleos
essenciais
é
constituída
de
derivados
fenilpropanoides ou de terpenos (VILLA et al., 1998; SIMÕES; SPITZER, 2004). Os
terpenos são compostos largamente distribuídos na natureza, constituindo uma
ampla variedade de compostos vegetais. São compostos hidrogenados de cadeias
carbônicas cíclicas ou alifáticas derivados do metabolismo secundário de plantas. A
origem biossintética dos esqueletos carbonados dos terpenos parte da condensação
de unidades de isopreno (C5) que, por sua vez, origina-se biossinteticamente do
ácido mevalônico (SIMÕES; SPITZER, 2007).
Os terpenos são classificados de acordo com suas unidades de átomos de
carbono em hemiterpenos (C5), monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15),
diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40). Os monoterpenos são os
mais representativos, geralmente encontrados na maioria dos óleos essenciais e
dotados de uma grande diversidade estrutural (BAKKALI et al., 2008). Estes
componentes são prevalentes em óleos essenciais de várias plantas como
Cymbopogon winterianus (BLANK et al., 2007; QUINTANS-JÚNIOR et al., 2008;
LERTSATITTHANAKORN et al., 2010) e diversas outras plantas aromáticas (RIOS;
RECIO, 2005).
Previamente, a composição do óleo essencial de C. winterianus analisada por
cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas, revelando o citronelal
(23,6%), geraniol (18,8%) e citronelol (11,7%) como seus componentes majoritários
(OLIVEIRA et al., 2011). Os componentes citronelal, geraniol e citronelol são
constituintes voláteis classificados como monoterpenos acíclicos formados pela
união de duas unidades de isopreno (SIKKEMA et al., 1995; BAKKALI et al., 2008).
Embora o citronelal (C10H18O), geraniol (C10H18O) e citronelol (C10H20O) apresentem
estruturas químicas semelhantes, são observadas sutis diferenças (Figura 11). O
geraniol é um monoterpeno com um grupo álcool e com duas duplas ligações. O
citronelol apenas difere do geraniol por apresentar uma dupla ligação em sua
estrutura. Por outro lado, o citronelal é semelhante ao citronelol, diferindo apenas
por ser um monoterpeno do tipo aldeído.
Algumas atividades biológicas são descritas para o citronelal, como a atividade
sedativa e antinociceptiva em camundongos (JÄGER et al., 1992; MELO et al.,
2010), antibacteriano (SATO et al., 2006) e repelente (KIM et al., 2005).
Introdução | 30
O produto referido como geraniol na literatura é uma mistura de dois isômeros
cis-trans, onde o isômero trans é chamado de geraniol e o cis é conhecido por nerol
(CHEN; VILJOEN, 2010). Pesquisadores têm mostrado que o geraniol é um agente
com proeminente ação repelente (BARNARD; XUE, 2004), inseticida (JEON et al.,
2009), antimicrobiano (SI et al., 2006; MARUYAMA et al., 2008) e antineoplásica
(POLO; DE BRAVO, 2006; WISEMAN et al., 2007).
Figura 11 – Estruturas químicas dos monoterpenos citronelal, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
A: citronelal (3,7-dimetiloct-6-enal); B: geraniol ((2E)-3,7-dimetilocta-2,6-dien-1-ol); C: citronelol (3,7dimetiloct-6-en-1-ol).
Introdução | 31
Citronelol ocorre naturalmente na forma de dois isômeros ópticos. O isômero R(+) é comumente encontrado em óleos essenciais de plantas, especialmente na
família Rutaceae. De forma oposta, o isômero S-(–) é menos comum e está presente
em óleos essenciais de C. winterianus e Pelargonium graveolens (DE SOUSA et al.,
2006; ZHUANG et al., 2009). Estão relatados na literatura alguns estudos com o
citronelol demonstrando sua aplicabilidade como repelente (MAIMONE; BARAN,
2007), antioxidante (SUN et al., 2005), antibacteriano (KUBO et al., 1993), larvicida
(HIERRO et al., 2004), anticonvulsivante (DE SOUSA et al., 2006) e induz a
formação de espécies reativas de oxigênio em células de raízes de trigo, resultando
em peroxidação lipídica e dano à membrana destas células (KAUR et al., 2011).
1.4 ALVOS CELULARES PARA INVESTIGAÇÃO ANTIFÚNGICA
Um dos maiores desafios no desenvolvimento de drogas antifúngicas reside nas
similaridades compartilhadas entre os fungos e o hospedeiro. Para desenvolver
novas drogas, é necessário ter em mente que um eficiente antifúngico deve atuar
com máxima especificidade nos fungos apresentando baixa toxicidade para o
hospedeiro (MARTINEZ-ROSSI et al., 2008). Dessa forma, alguns critérios devem
ser considerados na perspectiva de selecionar alvos para intervenção de novos
produtos antifúngicos. Primeiramente, eles precisam ser seletivos, ou seja, os alvos
devem ser únicos nos fungos ou suficientemente diferentes do hospedeiro.
Segundo, os alvos precisam necessariamente ser essenciais para o crescimento e
viabilidade dos fungos em estudo. E terceiro, os alvos devem ser bem
caracterizados, onde seu papel fisiológico e natureza bioquímica devem ser
compreendidos (CIHLAR et al., 2002). Com base nisso, duas importantes estruturas
fúngicas se apresentam como importantes alvos para detecção de fármacos
antifúngicos: a parede celular e a membrana plasmática.
A parede celular fúngica está envolvida com funções não compartilhadas com as
células dos mamíferos, pois são essenciais para os fungos e não estão presentes
em hospedeiros mamíferos e, consequentemente mostra-se como um alvo atrativo
para novos antifúngicos (DIDOMENICO, 1999). É uma estrutura dinâmica importante
para a viabilidade do organismo, cuja complexa estrutura serve para proporcionar à
célula uma resistência mecânica suficiente para resistir a alterações na pressão
osmótica imposta pelo ambiente. Ainda, ela confere a plasticidade adequada para
Introdução | 32
permitir o crescimento e divisão celular, mantém a forma e a integridade da célula
fúngica e permite sua interação com o ambiente (BOWMAN; FREE, 2006).
Alterações em sua organização ou interrupção funcional provocada por agentes
antifúngicos podem acarretar letalidade para os fungos, provavelmente com mínimos
efeitos indesejáveis ao hospedeiro.
A parede celular fúngica forma uma espessa e complexa rede fibrilar composta
por um complexo de biopolímeros, onde cada um mostra um importante papel na
sua funcionalidade. Nos fungos filamentosos, são compostas principalmente de
diferentes
polissacarídeos
(glicanos,
quitina,
mananos,
quitosana,
ácido
poliglicurônico ou celulose) que chegam a constituir 90% da parede celular,
juntamente com pequenas quantidades de proteínas e glicoproteínas (Figura 12)
(WESSELS, 1994; WALKER; WHITE 2005).
Figura 12 – Superfície celular fúngica com os elementos de sua parede.
Fonte: Adaptado de ELITRENNIKOFF (2001).
Introdução | 33
Os componentes microfibrilares unidos por ligações covalentes e pontes de
hidrogênio, são organizados na região central da parede celular como uma rede
incorporada dentro de uma matriz amorfa. O componente fibrilar confere
organização e rigidez à parede celular, enquanto a matriz amorfa funciona como um
componente mais fluido. Embora cada fungo apresente uma composição bioquímica
diferenciada, a estrutura básica é mantida em todas as espécies. Por exemplo, a
quitina e os β-glicanos se destacam como os principais componentes fibrilares da
parede celular fúngica (WESSELS, 1994; WALKER; WHITE 2005).
A quitina é um homopolímero constituído de resíduos de N-acetilglicosamina
unidos por ligações β (1-4) que forma longas cadeias lineares (Figura 13). É
sintetizada na face interna da membrana plasmática e transferida para a superfície
celular como microfibrilas que permanecem ancoradas à membrana por ligações de
hidrogênio. As enzimas responsáveis pela síntese de quitina (sintase de quitina) são
uma família de proteínas integrais de membrana com peso molecular de 100–130
kDa (RONCERO, 2002; BOWMAN; FREE, 2006). Em S. cerevisiae e C. albicans
estas enzimas foram melhor estudadas, onde três isoformas (Chs1, Chs2 e Chs3)
foram identificadas. Os genes que codificam a sintase de quitina e os sinais pelos
quais são ativados dependem de específicas condições ambientais, estágio do ciclo
celular e variam bastante entre as diversas espécies (SCHMIDT et al., 2002; LATGÉ,
2007).
Figura 13 – Estrutura química de um segmento de quitina.
Fonte: NELSON; COX (2011).
Introdução | 34
Os glicanos são os maiores componentes da parede celular, os quais estão
ligados à quitina por ligações β (1-4). Estes são homopolissacarídeos são
constituídos por longas cadeias lineares de resíduos de glicose unidas por ligações
β (1-3), embora algumas paredes contenham pontos de ramificação com ligações β
(1-6), conforme visualizado na figura 14. A síntese deste polímero também é
realizada por um complexo proteico transmembranar que usa UDP-glicose (difosfato
de uridina de glicose) intracelular como substrato para a formação das cadeias
lineares de glicose β (1-3) (DOUGLAS, 2001; LATGÉ, 2007).
O complexo sintase de β-1,3-glicano é formado por duas subunidades, uma
subunidade catalítica e outra subunidade regulatória. A subunidade catalítica (Fksp)
possui cerca de 16 hélices transmembranares e um domínio hidrofílico; este domínio
é encontrado na face citoplasmática da membrana, sendo essencial para a função
da β-1,3-glicano sintase (DOUGLAS, 2001). A subunidade reguladora é a Rho1p
GTPase que alterna entre o estado inativo ligado ao GDP (difosfato de guanosina) e
o ativo ligado ao GTP (trifosfato de guanosina), ativando a subunidade catalítica
(DEBONO; GORDEE, 1994; LESAGE; BUSSEY, 2006).
Figura 14 – Estrutura química de um segmento de β-glicano.
Fonte: Adaptado de CHAN et al. (2009).
Introdução | 35
É relatada também a presença de cadeias de mananos, os quais são polímeros
de unidades de manose unidas por ligações α (1-4). Paredes celulares de hifas
contêm geralmente menos unidades de mananos do que formas leveduriformes ou
unicelulares. Essas tais variações de composição são ainda observados quando
fungos dimórficos entram em transição para formar hifas a partir da estrutura
unicelular. (WALKER; WHITE 2005) Algumas proteínas são encontradas na parede
celular dos fungos, porém sem algum papel estrutural relatado. Algumas delas são
proteínas de excreção enquanto outras possuem um importante papel na formação
e manutenção dos polímeros de parede. Há relatos de seu envolvimento na
determinação antigênica ou propriedades de adesão aos tecidos do hospedeiro
(WALKER; WHITE 2005; BOWMAN et a., 2006; BOWMAN; FREE, 2006).
A membrana citoplasmática dos fungos atua como uma barreira semipermeável,
no transporte ativo e passivo dos materiais para dentro e para fora da célula, sendo
constituída basicamente de lipídios e proteínas, podendo ambos estar ligados a
açúcares formando, respectivamente, glicolipídios e glicoproteínas. A membrana
plasmática é essencial para a sobrevivência do fungo, visto que a ocorrência de
alterações na estrutura, função ou manutenção da membrana celular resulta
geralmente em letalidade (CIHLAR et al., 2002).
Uma típica membrana fúngica possui em sua composição lipídios do tipo
fosfolipídios, glicolipídios e esterois. O ergosterol é o principal esterol contido na
membrana celular fúngica, se destacando como um alvo celular de grande interesse,
pois não está presente nas células humanas cujo representante esteroide é o
colesterol (Figura 15) Sua função é modular a fluidez da membrana e evitar suas
alterações por flutuações nas condições ambientais. Além disto, os esteroides têm
um papel vital nos fungos, regulando o crescimento e proliferação celular (CZUB;
BAGINSKI, 2006; VANDEPUTTE et al., 2012).
Introdução | 36
Figura 15 – Estrutura química de esteróis de membrana plasmática.
Fonte: NELSON; COX (2011).
A: colesterol; B: ergosterol.
As células fúngicas e as células humanas utilizam a mesma via metabólica para
a síntese dos esterois de membrana até a formação do metabólito lanosterol, a partir
do qual as vias bioquímicas se divergem (Figura 16). Convergentemente, a síntese
destes esteróis envolve uma complexa rota de reações bioquímicas que envolvem
cerca de 20 enzimas, partindo do acetilCoA até a formação do esqualeno. O
esqualeno é uma molécula alifática com 30 átomos de carbono que é ciclizada para
a formação do lanosterol. O lanosterol, por usa vez, sofre múltiplas reações
bioquímicas para originar o colesterol e o ergosterol por vias metabólicas diferentes
(BERG et al., 2010; NELSON; COX, 2011).
Introdução | 37
A biossíntese de ergosterol em fungos envolve complexas vias metabólicas, que
podem diferir um pouco a depender da espécie e linhagem. Em termos gerais, é
bem descrito que o lanosterol sofre três sequenciais desmetilações nos carbonos C14, C-4α e C-4β formando o zimosterol, o qual é transformado em fecosterol. O
fecosterol sofre isomerização para formar episterol e, em seguida, o ergosterol,
conforme esquematizado na figura 16 (ALCAZAR-FOULI et al., 2008).
Figura 16 – Esquema da biossíntese de ergosterol.
Fonte: PEREIRA (2012).
Introdução | 38
Considerando
a
importância
clínica
e
epidemiológica
dispensada
às
dermatofitoses e as limitadas informações sobre os efeitos dos monoterpenos
citronelal, geraniol e citronelol sobre T. rubrum, o presente estudo se apresenta
bastante relevante. As investigações desenvolvidas neste estudo sugerem possíveis
mecanismos de ação antifúngica, além de confirmar seus efeitos inibitórios sobre T.
rubrum em um modelo in vitro de dermatofitose em unhas.
OBJETIVOS
Objetivos | 40
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar os possíveis mecanismos da atividade antifúngica dos monoterpenos
citronelal, geraniol e citronelol frente a cepas de T. rubrum.
2.2 Objetivos específicos
Neste estudo, foram realizados testes com os monoterpenos citronelal, geraniol
e citronelol frente a cepas de T. rubrum com os seguintes objetivos específicos:

Determinar a concentração inibitória mínima.

Avaliar os efeitos inibitórios sobre o crescimento micelial, a germinação dos
conídios, a viabilidade das estruturas fúngicas e morfogênese.

Investigar os efeitos sobre a parede celular e membrana plasmática.

Avaliar os efeitos inibitórios em um modelo in vitro de dermatofitose em unhas.
MATERIAL
E
MÉTODOS
Material e Métodos | 42
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 LOCAL DA PESQUISA
A pesquisa foi realizada no Laboratório de Micologia do Departamento de
Ciências Farmacêuticas, do Centro de Ciências da Saúde (CCS), da Universidade
Federal da Paraíba (UFPB).
3.2 ANTIFÚNGICOS E MONOTERPENOS
Os fármacos antifúngicos (cetoconazol e anfotericina B) e monoterpenos
(citronelal, geraniol, citronelol) foram adquiridos da Sigma-Aldrich® (Brasil). As
soluções foram preparadas no momento de execução dos testes, dissolvendo-os
primeiramente em 100 µL dimetilsulfóxido (DMSO) e utilizando água destilada
esterilizada em quantidade suficiente para 2 mL, obtendo a concentração inicial de
1024 µg/mL. A partir desta concentração, foram feitas diluições seriadas em razão
de dois até alcançar a concentração de 1 µg/mL. A concentração máxima de DMSO
utilizada nos ensaios foi de 0,5%.
3.3 CEPAS FÚNGICAS
Para os ensaios de atividade antifúngica, foram selecionadas 13 cepas de T.
rubrum obtidas da coleção do Laboratório de Micologia. Estas cepas foram
originadas de amostras biológicas de diversos sítios anatômicos, codificadas como:
LM 98 (isolada de pele), LM 130 (isolada de pele), LM 222 (isolada de unhas), LM
308 (isolada de unhas), LM 333 (isolada de unhas), LM 422 (isolada de pele), LM
582 (isolada de pele), LM 600 (isolada de pele), LM 640 (isolada de couro cabeludo),
LM 710 (isolada de couro cabeludo), LM 713 (isolada de pele), LM 720 (isolada de
pele) e LM 722 (isolada de pele). Uma cepa padrão da American Type Culture
Collection também foi utilizada (ATCC 1683) nos ensaios. Todas as cepas foram
mantidas em tubos de ensaio contendo ágar batata dextrose inclinado sob
refrigeração (8°C), no Laboratório de Micologia.
Material e Métodos | 43
3.4 MEIOS DE CULTIVO
Os meios de cultura utilizados nos ensaios para avaliação da atividade
antifúngica foram o meio sólido ágar Sabouraud dextrose (ASD) e o meio líquido
caldo Sabouraud dextrose (CSD) adquiridos da Difco ®. Para conservação das cepas
e preparação do inóculo foi utilizado o meio sólido ágar batata dextrose (ABD),
também adquirido da Difco®. Os meios de cultura foram solubilizados com água
destilada e esterilizados em autoclave, a 121°C, 1,0 atm por 15 minutos.
3.5 INÓCULO
Primeiramente os isolados foram cultivados em ágar batata a 28°C por 7 dias,
para induzir esporulação. As recentes colônias fúngicas foram cobertas com 10 mL
de solução salina estéril (NaCl 0,9%), e as suspensões feitas por suaves agitações
com auxílio de uma alça descartável. A mistura resultante de conídios e fragmentos
de hifas foi retirada e transferida para tubos de ensaio esterilizados. Cada
suspensão foi deixada em repouso por 3-5 minutos, tempo para que os fragmentos
de hifas se depositem no fundo, e o sobrenadante foi recolhido em tubos de ensaio
estéreis. Cada suspensão teve sua turbidez comparada e ajustada àquela
apresentada pelo tubo 0,5 da escala McFarland, a qual corresponde a um inóculo de
aproximadamente 106 unidades formadoras de colônias em 1 mL (106 UFC/mL). O
inóculo foi confirmado por meio do plaqueamento de 0,01 mL das suspensões em
placas com ASD. As placas foram incubadas a 28°C e examinadas diariamente para
a contagem das colônias, determinando as unidades formadoras de colônias em 1
mL (SANTOS et al., 2006; BARROS et al., 2006).
3.6 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA (CIM)
A determinação da CIM dos monoterpenos citronelal, geraniol e citronelol foi
realizada pela técnica de microdiluição, utilizando placas de microtitulação contendo
96 cavidades com fundo em forma de “U” (SANTOS; HAMDAN, 2005; PEREIRA et
al., 2011a). Em cada orifício da placa, foram adicionados 100 µL do meio líquido
CSD
duplamente
concentrado.
Posteriormente,
100
µL
da
solução
dos
monoterpenos foram dispensados nas cavidades da primeira linha da placa. Por
Material e Métodos | 44
meio de uma diluição seriada a uma razão de dois, foram obtidas concentrações de
1024 µg/mL até 1 µg/mL. Por fim, foram adicionados 10 µL do inóculo das cepasteste nas cavidades, onde cada coluna da placa referiu-se a uma cepa fúngica.
Um controle fúngico foi realizado substituindo as drogas-teste por água
destilada esterilizada. Para verificar a ausência de interferência nos resultados pelo
DMSO utilizado na preparação das soluções, foi feito um controle no qual foram
colocados nas cavidades 100 µL do CSD duplamente concentrado, 100 µL do
DMSO (0,5%) usada na solubilização dos produtos e 10 µL da suspensão. Um
controle de esterilidade também foi realizado, colocando-se 200 µL do CSD em um
orifício sem a suspensão dos fungos. As placas foram seladas e incubadas a 28°C
por até 5 dias para a realização da leitura. Paralelamente, foi realizado o mesmo
experimento com o antifúngico cetoconazol, representando um grupo de fármacos
utilizado na terapêutica clínica para casos de dermatofitoses.
Os valores de CIM foram determinados pela análise visual da inibição do
crescimento em cada cavidade, comparando os testes com o controle (ausência de
drogas). A CIM foi definida como a menor concentração capaz de inibir 100% o
crescimento fúngico observado nas cavidades. O experimento foi realizado em
triplicata (SANTOS; HAMDAN, 2005).
3.7 EFEITOS SOBRE O CRESCIMENTO MICELIAL
A análise da interferência de geraniol, citronelol e cetoconazol sobre o
crescimento micelial foi realizada pela determinação da massa micelial seca de T.
rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 (SHARMA; TRIPATHI, 2008; PEREIRA et
al., 2011a). Em um tubo de ensaio esterilizado foram adicionados 4,5 mL do CSD,
previamente acrescido da solução das drogas-teste nas respectivas CIM e CIMx2.
Em seguida, foram adicionados 0,5 mL do inóculo em cada tubo. No tubo controle
correspondente, o inóculo foi adicionado em CSD sem adição dos compostos
testados. Todo o sistema foi incubado a 28°C por um tempo total de 12 dias, quando
foi determinado o peso da massa micelial seca. Para isto, as culturas foram filtradas
utilizando papel de filtro esterilizado (porosidade: 11 µm) e lavadas com água
destilada esterilizada. O micélio retido no papel de filtro foi submetido à secagem em
estufa a 60°C por 10 minutos. Ao término, o papel de filtro contendo o micélio seco
foi pesado e o percentual de massa micelial seca produzida foi calculado,
Material e Métodos | 45
considerando o experimento controle como 100% de produção micelial. O
experimento foi realizado em triplicata.
3.8 EFEITOS SOBRE A VIABILIDADE FÚNGICA
O estudo de interferência de geraniol, citronelol e cetoconazol sobre a
viabilidade das cepas de T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 foi realizado
conforme descrito por Klepser et al. (1998). Em um tubo de ensaio esterilizado foram
adicionados 4,5 mL do CSD, previamente acrescido da solução das drogas-teste
nas respectivas CIM e CIMx2. Em seguida, foram adicionados 0,5 mL do inóculo em
cada tubo. No tubo controle correspondente, o inóculo foi adicionado em CSD sem
adição dos compostos testados. Todo o sistema foi incubado a 28°C por até 12 dias.
A cada 3 dias de exposição, uma alíquota de 100 µL dos tubos foi retirada e diluída
(1:10) em água destilada esterilizada. Com um alça calibrada e esterilizada, foi
inoculado uniformemente 10 µL dessa última diluição na superfície de placas de
Petri com ASD. As placas foram incubadas a 28°C e a contagem do número de
colônias foi realizada e expressa em logUFC/mL em função do tempo. O limite de
detecção das colônias foi 100 UFC/mL (2,0 LogUFC/mL). A atividade fungicida dos
produtos foi definida se ocorrer uma diminuição de >3 log em UFC/mL, resultando
em cerca de 99,9% de redução das UFC/mL, ao comparar os valores no tempo final
(dia 12) e inicial (dia 0). Uma atividade menor que esta, foi considerada fungistática.
O experimento foi realizado em duplicata.
3.9 EFEITOS SOBRE A GERMINAÇÃO DOS CONÍDIOS
As suspensões de T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 foram
analisadas em hemocitômetro (Inlab®: 0,10 mm; 0,0025 mm2) 1 e ajustadas a 106
conídios/mL. Em tubos de ensaio estéreis, 500 µL do CSD acrescido de geraniol,
citronelol e cetoconazol (CIM e CIMx2), foram homogeneamente misturadas com
500 µL da suspensão dos conídios fúngicos e imediatamente incubados a
temperatura de 28°C. Amostras dessa mistura foram tomadas após 24h para
análise. O número de conídios germinados e não germinados foi determinado em
cada grupo experimental, utilizando um hemocitômetro. O percentual de conídios
germinados foi calculado para cada grupo experimental. Um controle com ausência
Material e Métodos | 46
das drogas-teste foi utilizado. Todo o experimento foi feito em triplicata (LIU et al.,
2008; PEREIRA et al., 2011a).
3.10 EFEITOS SOBRE A MORFOGÊNESE
A análise dos efeitos provocados por geraniol, citronelol e cetoconazol na
morfogênese de T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 foi realizada com base
na técnica de microcultivos sobre lâminas (GUNJI et al., 1983; PEREIRA et al.,
2011a). Em placas de Petri (90 x 15mm) descartáveis e esterilizadas, foram vertidos
20 mL de ASD fundido ASD fundido e ajustado na temperatura de 35°C em banhomaria. Em seguida, foi adicionado um volume de cada droga-teste com o objetivo de
alcançar a concentração subinibitória CIM/2. Foi realizado um experimento controle
sem adição dos produtos ao ASD fundido.
Após solidificação do ASD acrescido das drogas-teste, cavidades foram feitas
no meio de cultivo utilizado cânulas de vidro esterilizadas. Com o auxílio de uma
alça descartável esterilizada, pequenos blocos deste meio foram transferidas para a
superfície de uma lâmina de microscopia esterilizada. Em seguida, dois fragmentos
do micélio das cepas recém-cultivadas em ABD foram dispostos sobre a superfície
dos blocos de ASD acrescido das drogas-teste, cobrindo-os com uma lamínula. As
lâminas foram incubadas em câmaras úmidas a temperatura ambiente (28°C) por
cinco dias. Após o período de incubação, 1 gota do corante azul de lactofenol
algodão foi adicionada no centro de uma lâmina e coberta com a lamínula do
microcultivo. As estruturas micromorfológicas na ausência e na presença das
drogas-teste foram examinadas em microscópio óptico comum, com aumento de
400x. O ensaio foi feito em duplicata e imagens representativas deste experimento
foram registradas.
3.11 AÇÃO DO PRODUTO NA PAREDE CELULAR
3.11.1 Ensaio com sorbitol
A determinação da CIM dos geraniol, citronelol e cetoconazol frente à cepa T.
rubrum ATCC 1683 na presença de sorbitol foi realizada por microdiluição, conforme
descrito anteriormente. Neste caso, foi utilizado o meio líquido CSD previamente
Material e Métodos | 47
adicionado de sorbitol (PM = 182,17) (VETEC Química Fina Ltda – Rio de
Janeiro/RJ), a 0,8 M. As placas foram incubadas a 28°C e a leitura realizada com 5 e
10 dias. Dessa maneira, foi possível comparar os valores de CIM dos produtos
frente à cepa de T. rubrum na ausência e presença de sorbitol a 0,8 M. Os ensaios
foram realizados em triplicata e o resultado expresso pela média geométrica dos
resultados (FROST et al., 1995; SOUZA et al., 2010).
3.12 AÇÃO DO PRODUTO NA MEMBRANA CELULAR
3.12.1 Perda de material citoplasmático
Uma amostra de 10 mL do inóculo fúngico de T. rubrum ATCC 1683 foi
adicionada em um tubo de ensaio esterilizado juntamente com geraniol, citronelol e
cetoconazol para alcançar uma concentração final de CIM e CIMx2 de cada drogateste. A mistura foi incubada à temperatura de 28°C e amostras de 3 mL foram
retiradas após 4h e 8h e submetidas à centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos. O
sobrenadante foi retirado e analisado em um UV-espectrofotômetro (Shimadzu) a
260 nm, para análise de sua absorbância. Uma solução etanólica de KOH (KOH
25% em etanol a 70%) a 80°C por 1 hora foi utilizada como composto lisante o qual
produziu 100% de lise celular. Um controle na ausência das drogas-teste foi
realizado. Um controle fúngico também foi realizado, no qual conteve apenas a
suspensão das cepas. A taxa (%) de material citoplasmático de T. rubrum ATCC
1683 com absorção em 260 nm foi calculado comparando-se com os valores obtidos
com o lisante. O experimento foi realizado em triplicata (LUNDE; KUBO, 2000;
ESCALANTE et al., 2008).
3.12.2 Interação com o ergosterol
A determinação da CIM de geraniol, citronelol e cetoconazol frente à cepa de
T. rubrum ATCC 1683 na presença de ergosterol exógeno, foi realizada por
microdiluição, conforme descrito anteriormente (ESCALANTE et al., 2008). Neste
caso, foi utilizado o meio líquido CSD previamente adicionado de 400 µg/mL de
ergosterol (Sigma-Aldrich®). Foi realizado o mesmo procedimento com a anfotericina
B, cujo mecanismo de ação envolve a interação com ergosterol da membrana, para
Material e Métodos | 48
servir como controle positivo dos resultados. As placas foram incubadas a 28°C por
5 dias para ser realizada a leitura. Os ensaios foram realizados em triplicata e o
resultado expresso pela média geométrica dos resultados. Dessa maneira, foi
possível comparar os valores de CIM dos produtos frente às cepas de T. rubrum na
ausência e presença de ergosterol exógeno.
3.12.3 Biossíntese de ergosterol
Para extração do conteúdo total dos esteróis das células de T. rubrum ATCC
1683, 1 mL do inóculo foi adicionado em 9 mL de meio de cultura CSD contendo
diferentes concentrações de geraniol, citronelol e cetoconazol (CIM e CIMx2). As
culturas foram incubadas por 5 dias a 28°C. Todo o sistema foi submetido à
centrifugação a 3000 rpm por 5 minutos e lavados uma vez com água destilada
esterilizada. O peso do pellet formado foi determinado para cálculos posteriores. Em
seguida, 3 mL de uma solução etanólica de KOH (KOH 25% em etanol 70%) foram
adicionados em cada pellet e agitado por 1 minuto em aparelho Vortex. O sistema foi
incubado em banho-maria a 80°C por 1 h e, para a obtenção de total de lise celular.
Após incubação, os tubos foram esfriados a temperatura ambiente. Os esteróis
foram extraídos por adição de 3 mL de n-heptano, seguida de vigorosa agitação em
Vortex por 3 minutos. Os tubos apresentaram duas camadas líquidas, sendo uma
aquosa situada ao fundo do tubo e a camada superior de n-heptano e compostos
lipofílicos. A camada de n-heptano foi transferida para um eppendorf e estocada sob
refrigeração por 24 horas. Uma alíquota de cada tubo foi analisada em um UVespectrofotômetro (Shimadzu) em 281,5 e 230 nm. O conteúdo de ergosterol foi
calculado como percentual de ergosterol por massa celular conforme descrito por
Arthington-Skaggs (1999), pelas seguintes equações 1 e 2:
% ergosterol +% 24(28)DHE = [A281,5/290) x F]
(1)
peso do pellet
% 24(28)DHE = [A230/518) x F]
peso do pellet
(2)
Material e Métodos | 49
Onde A281,5 e A230 são os valores de absorbância em 281,5 nm e 230 nm
respectivamente. 24(28)DHE é o metabólito intermediário 24(28) dehidroergosterol,
F é o fator de diluição em etanol absoluto e 290 e 518 são os valores de E (%/cm)
determinado
pelo
ergosterol
e
24(28)DHE
cristalinos,
respectivamente.
O
experimento foi realizado em triplicata (ARTHINGTON-SKAGGS, et al., 1999).
3.13 INFECÇÃO EX VIVO
3.13.1 Sujeitos
Este estudo foi inicialmente submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa em Seres Humanos (CCS/UFPB), com número de protocolo 0157/11
(Anexo A). O processo de coleta foi realizado no Laboratório de Micologia (CCSUFPB) e não conferiu nenhum risco ou dano potencial aos voluntários, pois foram
seguidos os procedimentos rotineiros de coleta de material biológico para análise em
laboratórios de micologia clínica (LACAZ et al., 2002). Neste estudo, utilizaram-se
fragmentos ungueais dos pés coletados de voluntários sadios sem micose aparente
nessas regiões, confirmado quando foram examinadas com KOH (30%) em
microscopia. Para isso, os materiais foram coletados de 10 voluntários, sendo dos
quais 5 homens e 5 mulheres, maiores de 18 anos.
3.13.2 Infecção
Os ensaios de infecção ex vivo foram realizados em triplicata, conforme
Takasuka (2000). Neste ensaio, foi possível analisar a capacidade de T. rubrum em
infectar os fragmentos ungueais como única fonte nutricional. Fragmentos dessas
unhas (1mm x 1mm) foram tratados com etanol a 70% por 15 minutos e secos a
temperatura ambiente. Em placas de microtitulação, uma alíquota de 5 µL da
suspensão de T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 foi inoculada sobre cada
fragmento por 1 h, seguida da adição de 200 µL de água destilada estéril (controle
negativo) ou acrescida de geraniol, citronelol e cetoconazol nas concentrações
CIMx2, CIM, CIM/2. Todo o sistema foi incubado por 5 dias para ser realizada a
leitura. A análise se baseou na observação do crescimento fúngico sobre os
Material e Métodos | 50
fragmentos ungueais usando microscopia óptica. O experimento foi realizado em
triplicata.
3.14 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores de CIM foram expressos pela média geométrica dos resultados. Os
resultados dos ensaios que avaliaram os efeitos das drogas-teste sobre o
crescimento micelial, a viabilidade fúngica, a germinação dos conídios, a liberação
de material citoplasmático e a biossíntese de ergosterol foram expressos como
média  erro padrão (e.p.). A avaliação estatística destes resultados empregando-se
o teste de Fischer para determinar diferenças significantes, quando um valor de
p<0,05. Todos os resultados foram analisados com o software GraphPad Prism
versão 5.0 para Windows, San Diego, CA, EUA.
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO
Resultados e discussão | 52
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Inicialmente, a CIM do citronelal, geraniol e citronelol foram determinadas pelo
método de microdiluição. Os seus respectivos valores, bem como os referentes ao
controle realizado com cetoconazol são apresentados tabela 1. Entre os produtos
testados, o citronelal foi aquele que apresentou menor poder antifúngico frente às
cepas de T. rubrum, justificados pelos maiores valores de CIM. Por outro lado, o
geraniol foi o componente mais potente entre os três monoterpenos testados, pois
conseguiu inibir o crescimento de 50% das cepas testadas na concentração de 32
µg/mL. O citronelol também apresentou potente atividade antifúngica, inibindo o
crescimento de 50% das cepas testadas na concentração de 64 µg/mL (Tabela 1).
O cetoconazol (controle positivo) exerceu efeitos inibitórios frente a todos os
fungos testados, inibindo 50% das cepas na concentração de 16 µg/mL. Quando
comparados aos resultados apresentados pelo geraniol, pode-se observar que esse
valor CIM do cetoconazol foi o mesmo para quatro das quatorze cepas testadas
frente ao geraniol (LM 39, LM 582, LM 710 e LM 713). Por outro lado, é interessante
destacar que o citronelol inibiu o crescimento da cepa LM 333 a um valor de CIM
inferior àquela apresentada pelo cetoconazol (8 µg/mL). Desse modo, fica evidente o
poder antifúngico destes monoterpenos frente às cepas de T. rubrum.
Além disso, os controles realizados mostraram ausência de inibição do
crescimento fúngico por DMSO, confirmando que o impedimento do crescimento foi
devido à presença dos produtos antifúngicos; foi detectado crescimento quando
todas as cepas foram cultivadas na ausência de drogas, confirmando a viabilidade
do inóculo fúngico. Um controle de esterilidade foi realizado no qual não foi
observado crescimento microbiano, confirmando-se que o CSD utilizado nos ensaios
não estava contaminado com micro-organismos.
O método de microdiluição escolhido para a determinação da CIM possui grande
reprodutibilidade e ainda se apresenta como uma forma simples e econômica de
avaliar a atividade antimicrobiana de produtos naturais. Este método tem sido
utilizado tanto para substâncias hidrossolúveis quanto lipossolúveis (SCORZONI et
al., 2007b; OSTROSKY, et al., 2008).
Resultados e discussão | 53
Tabela 1 – Concentração inibitória mínima de citronelal, geraniol, citronelol e
cetoconazol sobre cepas de Trichophyton rubrum.
Drogas-teste (µg/mL)
Cepas
Citronelal
Geraniol
Citronelol
Cetoconazol
ATCC1683
512
32
128
16
LM 98
1024
64
128
16
LM 130
512
64
64
64
LM 222
1024
64
32
32
LM 309
512
16
32
32
LM 333
256
32
8
16
LM 422
512
32
128
16
LM 582
512
16
64
32
LM 600
1024
32
32
32
LM 640
1024
250
128
16
LM 710
512
16
256
32
LM 713
1024
16
32
16
LM 720
1024
64
1024
16
LM 722
512
64
128
32
Fonte: PEREIRA (2012).
Resultados e discussão | 54
O Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) aprovou o documento M38A como método de referência para testes de diluição em caldo, incluindo
microdiluição, com vistas a testar a sensibilidade dos fungos filamentosos que
causam infecções invasivas como Aspergillus spp., Fusarium spp., Rhizopus
arrhizus, Pseudallescheria boydii e Sporothrix schenckii. No entanto, não é um
protocolo aplicado ao estudo com dermatófitos, devido às suas peculiaridades de
reprodução e condições de cultivo. Os dermatófitos tem crescimento mais lento e
normalmente são necessários 5 a 10 dias para que seja detectado seu crescimento
nas placas de microdiluição. Além disso, é necessária a utilização de meios de
cultivo que induzem conidiogênese a exemplo do ABD (SANTOS et al., 2006;
BARROS et al., 2006).
No entanto, Santos; Hamdan (2005) analisaram diversas condições de cultivo
com dermatófitos para serem aplicadas a testes de sensibilidade por microdiluição,
fornecendo valiosas contribuições para a comunidade científica. Estas informações
foram aplicadas neste estudo com algumas modificações, pois foram utilizados
produtos de origem natural com propriedades (viscosidade, volatilidade e
hidrofobicidade) que diferem daquelas apresentadas pelos antifúngicos empregados
na terapêutica (HADACEK; GREGER, 2000; NASCIMENTO et al., 2007; CASTRO;
LIMA, 2010).
Sartoratto et al. (2004) elencaram critérios para categorizar o poder
antimicrobiano de óleos essenciais com base no valor de CIM, onde óleos com CIM
≤ 500 μg/mL são considerados com forte atividade antimicrobiana, com 500 μg/mL >
CIM ≤ 1500 μg/mL possuem moderada atividade e CIM > 1500 μg/mL é considerado
com fraca atividade. Aplicando este referencial aos resultados deste estudo, pode-se
considerar que o geraniol e citronelol apresentaram forte atividade antifúngica frente
a T. rubrum. Em contrapartida, o citronelal apresentou uma moderada atividade
antifúngica. Desse modo, o geraniol e citronelol foram os monoterpenos
selecionados para serem utilizados nos ensaios subsequentes.
Além dessas diferenças quanto ao poder antimicrobiano de citronelal, geraniol, e
citronelol, é interessante destacar que são observadas diferenças nas estruturas
químicas entre os monoterpenos testados neste estudo (Figura 11). Entre os
monoterpenos testados, o citronelal é o único representante do tipo aldeído o qual
apresentou o menor poder antifúngico. Por outro lado, o geraniol e citronelol são
monoterpenos com um grupo álcool e que apresentaram maior poder antifúngico.
Resultados e discussão | 55
Embora sejam semelhantes do ponto de vista estrutural, é sugestivo inferir que estas
pequenas diferenças podem interferir na atividade antifúngica dessas moléculas.
Na literatura, são conhecidos vários monoterpenos do tipo álcool que
apresentam forte atividade antimicrobiana contra diversas espécies bacterianas e
fúngicas. Os componentes carvacrol, nerol, E-linalol, timol, 1,8-cineol, linalol,
eugenol, mentol e alfa-terpineol são importantes exemplos de monoterpenos alcoóis
com comprovado poder antimicrobiano (SHIN; LIM 2004; LIMA et al., 2005; SATO et
al., 2006; PARK et al., 2007; LEE et al., 2008; JIROVETZA et al., 2008; MESAARANGO et al., 2009; EBRAHIMABADI et al., 2010; HUSSAIN et al., 2010;
CARRASCO et al., 2012).
Alguns pesquisadores afirmam que a atividade de óleos essencial é atribuída
principalmente ao seu componente majoritário. Por exemplo, Prashar et al. (2003)
afirmam que a atividade antifúngica do óleo essencial de palmarosa (Cymbopogon
martinii) frente a Saccharomyces cerevisiae é atribuída ao conteúdo de geraniol –
componente majoritário deste óleo. No entanto os resultados deste estudo
demonstram que citronelal, componente majoritário do óleo essencial de C.
winterianus, foi o monoterpeno que apresentou menor potência antifúngica contra T.
rubrum.
Da mesma forma, Lee et al. (2008) verificaram que citronelal foi o componente
majoritário do óleo essencial de Eucalyptus citriodora e não exerceu atividade
antifúngica frente a fungos fitopatógenos como Phytophthora cactorum, Cryponectria
parasítica e Fusarium circinatum. O citronelal foi o componente majoritário do óleo
essencial de Leptospermum petersonii Bailey e que apresentou menor potência
frente a dermatófitos entre os componentes testados. Neste caso, o citronelal
exerceu moderada atividade antifúngica sobre Trichophyton mentagrophytes (PARK
et al., 2007).
Em contrapartida aos resultados deste estudo, é relatado que o citronelal
demonstrou atividade antifúngica frente a diferentes espécies fúngicas, em ensaios
realizados por microdiluição. Neste caso, é relatado que espécies fúngicas como
Candida krusei, C. parapsilosis, Aspergillus fumigatus, A. flavus e Rhizoctonia solani
foram sensíveis a citronelal, pois obteve-se valores de CIM entre 314,9 e 500 µg/mL
(MESA-ARANGO et al., 2009).
Na literatura, encontram-se relatos de que geraniol se mostrou ativo contra
cepas de Aspergillus spp, (MESA-ARANGO et al., 2009), Candida albicans e C.
Resultados e discussão | 56
parapsilosis (VAN ZYL et al., 2006; MARUYAMA et al., 2008) quando testados por
microdiluição. A atividade antifúngica de citronelol também é reconhecida em outros
estudos, nos quais foi ativo contra cepas de Aspergillus spp, Fusarium spp. e
Penicillium spp (AOUDOU et al., 2010), porém utilizou-se o método de difusão em
ágar.
Em um estudo desenvolvido por Shin; Lim (2004), o citronelol e o geraniol foram
avaliados por microdiluição quanto à sua atividade frente a uma única cepa de T.
rubrum, onde ambos os constituintes apresentaram atividade inibitória com valores
de CIM, respectivamente, 2000 e 1000 µg/mL. Neste mesmo estudo, o geraniol e
citronelol foram mais ativos contra a cepa de T. mentagrophytes. Ainda, os
resultados demonstram valores de CIM bem mais elevados que os apresentados
neste estudo.
Foram investigados os efeitos do geraniol, citronelol e cetoconazol sobre o
crescimento micelial, a viabilidade das estruturas fúngicas, a germinação de conídios
e a morfogênese de T. rubrum. Para isto, foram realizados ensaios que envolvem as
células fúngicas em sua totalidade, buscando estudar as interferências dos produtos
em diversas fases do desenvolvimento fúngico, sem necessariamente investigar
algum alvo celular específico. Foram escolhidas duas espécies fúngicas: LM 422 e
uma cepa padrão (ATCC 1683), pois apresentaram perfil de sensibilidade
semelhante.
O efeito de diferentes concentrações (CIM e CIMx2) das drogas-teste sobre o
crescimento micelial foram determinados pela quantificação da massa micelial seca
das cepas. Os resultados estão expressos em percentual de massa micelial seca
produzido e apresentados nas figuras 17 e 18. Com relação aos efeitos sobre T.
rubrum ATCC 1683, pode ser observado que todas as concentrações testadas dos
monoterpenos inibiram o desenvolvimento micelial normal da cepa (p<0,0001)
quando comparado com o controle, cujos efeitos são ainda mais evidentes na
presença de CIMx2 (Figura 17). O controle produziu um total médio de 46,4 mg de
massa micelial seca. Na CIM, os produtos inibiram a produção micelial apresentando
os seguintes valores percentuais: cetoconazol (88,47 ± 0,58), geraniol (66,38 ± 0,36)
e citronelol (88,26 ± 2,20). A análise dos resultados confirmou que apenas o
citronelol foi tão potente quanto o cetoconazol, tendo em vista que os resultados do
geraniol diferiram daqueles apresentados pelo cetoconazol (p<0,05). Entre os
produtos testados, apenas o geraniol inibiu a formação micelial independente da
Resultados e discussão | 57
concentração testada; o citronelol e o cetoconazol foram mais efetivos quando
testados na CIMx2 quando comparados aos resultados obtidos na CIM (p<0,05).
Figura 17 – Percentual de massa micelial seca produzido por Trichophyton rubrum
ATCC 1683 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e
citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL), ( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL),( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIMx2
(128 µg/mL).
(a) p<0,05 comparado ao controle. (b) p<0,05 comparado ao cetoconazol na respectiva concentração.
(c) p<0,05 comparado a CIM (teste de Fischer).
Com relação à cepa LM 422, os efeitos foram bastante semelhantes (Figura 18),
porém o controle produziu um total médio de 83,4 mg de massa micelial seca. Neste
caso, todas as concentrações testadas dos produtos também inibiram de forma
efetiva o desenvolvimento micelial normal da cepa, apresentando os seguintes
valores percentuais de inibição: cetoconazol (42,41 ± 0,05), geraniol (66,29 ± 0,01) e
Resultados e discussão | 58
citronelol (87,94 ± 0,21). A análise dos resultados confirmou que o geraniol e o
citronelol foram mais potentes do que o cetoconazol quando testados na CIM
(p<0,05); quando analisados na CIMx2, o geraniol obteve resultados semelhantes ao
cetoconazol. Entre os produtos testados, apenas o citronelol inibiu a formação
micelial independente da concentração testada; o geraniol e o cetoconazol foram
mais efetivos quando testados na CIMx2 quando comparados aos resultados obtidos
na CIM (p<0,05).
Figura 18 – Percentual de massa micelial seca produzido por Trichophyton rubrum
LM 422 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL), ( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL),( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIMx2
(128 µg/mL).
(a) p<0,05 comparado ao controle. (b) p<0,05 comparado ao cetoconazol na respectiva concentração.
(c) p<0,05 comparado a CIM (teste de Fischer).
Resultados e discussão | 59
Ao pesar o resíduo seco da massa fúngica em meio de cultura líquido, foi
possível verificar os efeitos inibitórios das drogas-teste sobre o crescimento
microbiano. Embora isto não reflita o total de células vivas, os resultados
demonstram que houve produção de material celular fúngico mesmo na presença
das drogas-teste. Portanto, é sugestivo que as concentrações testadas não exerçam
efeitos fungicidas nestas condições.
Pereira (2011a) e Pereira et al., (2011b) analisaram os efeitos inibitórios do
óleo essencial de C. winterianus (CIM e CIMx2) sobre a produção micelial de,
respectivamente, T. rubrum e T. mentagrophytes. Neste aspecto, o óleo essencial foi
mais potente quando comparado ao geraniol e citronelol isoladamente, inibindo
100% a produção de massa micelial. Semelhante aos resultados deste estudo foi
observado crescimento micelial (massa micelial seca) de Aspergillus niger, mesmo
quando foram testados os óleos essenciais de Thymus eriocalyx e Thymus x-porlock
nas CIM e CIMx2 (RASOOLI et al., 2006).
No caso das dermatofitoses, considera-se que a produção de estruturas como
hifas e fragmentos de hifas seja um fator importante porque são frequentemente
observadas em lesões tegumentares dentro das camadas epidérmicas da pele, fios
de cabelo circundantes e unhas. A produção de hifas e a consequente formação de
micélio são importantes porque as hifas penetram nas camadas mais profundas da
epiderme
e
se
desenvolvem
produzindo
ramificações
que
se
estendem
paralelamente às camadas de células. Isto ocorre porque o fungo precisa se manter
em um ambiente tecidual o qual está constantemente sendo descamado (KAUFMAN
et al., 2007; BURMESTER et al., 2011; BRAND, 2012).
Além disso, em um processo infeccioso, o crescimento longitudinal da hifa
facilita a penetração nas camadas mais internas da pele, enquanto o crescimento
lateral pode agravar os danos, que particularmente nos casos de dermatofitoses é
um evento clinicamente importante. As hifas também são fisicamente mais difíceis
de serem fagocitadas e podem induzir apoptose em macrófagos, caso as mesmas
são formadas no interior destas células após a fagocitose (ODDS et al., 2000;
CAMPOS, 2004). A penetração física por hifas e a sua atividade enzimática contribui
para o aparecimento de camadas espessas e caóticas nos sítios infecciosos do
tegumento, característica marcante das dermatofitoses (ZURITA; HAY, 1987;
GUPTA et al., 2003; ROMÁN et al., 2007).
Resultados e discussão | 60
A viabilidade das estruturas fúngicas foi analisada após determinados intervalos
de tempo de interação com as drogas-teste. Os resultados foram expressos como
curvas do logUFC/mL de T. rubrum ATCC 1683 (Figura 19) e T. rubrum LM 422
(Figura 20) durante um total de 12 dias. Como pode ser visualizado na figura 19,
geraniol e cetoconazol, nas concentrações CIM e CIMx2, apresentaram efeito
fungicida com 9 dias de interação frente a cepa T. rubrum ATCC 1683. No entanto,
citronelol apresentou efeito fungicida em 6 dias. O cetoconazol (CIM) e o geraniol
(CIM) exerceram efeito fungicida sobre T. rubrum LM 422 em 9 dias (figura 20);
geraniol (CIMx2) foi fungicida com 6 dias. Com citronelol na CIM e CIMx2 o efeito
fungicida, respectivamente, em 12 e 9 dias.
Figura 19 – Curvas de viabilidade das estruturas fúngicas de Trichophyton rubrum
ATCC 1683 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e
citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL),( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol
CIMx2 (128 µg/mL), (- - -) Limite de detecção.
Resultados e discussão | 61
Figura 20 – Curvas de viabilidade das estruturas fúngicas de Trichophyton rubrum
LM 422 na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL),( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol
CIMx2 (128 µg/mL), (- - -) Limite de detecção.
A análise das curvas de viabilidade das estruturas fúngicas, também conhecidas
por curvas de letalidade, auxiliam a analisar a capacidade de um composto de agir
sobre a viabilidade de um micro-organismo, verificando a rapidez de um efeito
fungicida ou a duração de um efeito fungistático. O comportamento fungicida de um
produto é caracterizado pela sua capacidade de impedir o crescimento de um fungo
em caldo, de tal modo que ele se torna incapaz de ser cultivado quando uma
amostra deste caldo de incubação é transferida para um meio de cultura adequado
ao seu crescimento (SMITH-PALMER et al., 1998).
Os efeitos fungicidas de concentrações maiores de geraniol e citronelol durante
o tempo foram detectados em menor espaço de tempo. Isto é um fato importante no
uso terapêutico de fármacos antimicrobianos, onde é interessante utilizar o menor
tempo
de
tratamento
possível.
A
atividade
fungicida
é
mais importante
Resultados e discussão | 62
particularmente em indivíduos imunocomprometidos (LIU et al., 2007; MONK;
GOFFEAU, 2008).
T. rubrum produz numerosos conídios assexuados os quais são considerados a
causa primária das infecções no hospedeiro. Ao penetrar na pele com auxílio de
uma área escoriada, os conídios podem germinar e se desenvolver até formar o
micélio, causando danos aos tecidos (ACHTERMAN; WHITE, 2012). A avaliação da
cinética de adesão e invasão de estruturas dermatofídicas na pele e em superfícies
ungueais vem sendo investigadas em vários estudos com Trichophyton spp. Estes
estudos mostram uma importante relação entre o tempo de adesão e o número de
conídios aderindo à superfície, seguida de germinação e invasão do estrato córneo
tegumentar pelas hifas formadas nas mais diversas direções (DUEK et al., 2004;
ESQUENAZI et al., 2004; VERMOUT et al., 2008).
Pensando nisto, foi avaliado quantitativamente o poder dos monoterpenos em
interferir na germinação dos conídios fúngicos das cepas de T. rubrum. O percentual
de conídios germinados de T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 na presença
e ausência (controle) dos produtos estão apresentados, respectivamente, nas
figuras 21 e 22. De modo geral, todas as drogas-teste na CIM exerceram forte poder
inibitório sobre o processo germinativo dos conídios de T. rubrum ATCC (p<0,0001),
embora os efeitos tenham sido mais proeminentes na CIMx2 (Figura 21). Na CIM, os
produtos apresentaram os seguintes valores percentuais de inibição da germinação:
cetoconazol (64,72 ± 4,72), geraniol (35,92 ± 3,66) e citronelol (54,19 ± 5,80). Na
CIM, o geraniol foi menos potente que o cetoconazol, porém na CIMx2 o geraniol foi
tão potente quanto o cetoconazol; de forma semelhante foi verificado em relação ao
citronelol. A análise dos resultados confirmou que o citronelol e o cetoconazol
inibiram a germinação dos conídios de forma semelhante nas duas concentrações
testadas. O geraniol foi mais efetivo quando testado na CIMx2 quando comparado
ao resultado obtido na CIM (p<0,05). Por outro lado, o citronelol e o cetoconazol não
apresentaram resultados diferentes quando testados na CIM e CIMx2.
Resultados e discussão | 63
Figura 21 – Percentual de conídios germinados de Trichophyton rubrum ATCC 1683
na ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL), ( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL),( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIMx2
(128 µg/mL).
(a) p<0,05 comparado ao controle. (b) p<0,05 comparado ao cetoconazol na respectiva concentração.
(c) p<0,05 comparado a CIM (teste de Fischer).
De forma semelhante, estes efeitos também estão presentes nos resultados com
T. rubrum LM 422 (Figura 22). Na CIM, os produtos apresentaram os seguintes
valores percentuais de inibição da germinação: cetoconazol (70,29 ± 0,29), geraniol
(57,64 ± 3,47) e citronelol (74,60 ± 3,18). Diferente do que ocorreu nos testes com a
cepa ATCC 1683, foi verificado que o geraniol e o citronelol apresentaram resultados
semelhantes aos do cetoconazol. Todas as drogas testadas foram mais efetivas na
CIMx2 quando comparadas aos resultados obtidos na CIM (p<0,05).
Resultados e discussão | 64
Figura 22 – Percentual de conídios germinados de Trichophyton rubrum LM 422 na
ausência (controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL), ( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL),( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIMx2
(128 µg/mL).
(a) p<0,05 comparado ao controle. (c) p<0,05 comparado a CIM (teste de Fischer).
Diversos eventos morfológicos são observados durante a germinação dos
conídios de T. rubrum os quais envolvem a passagem do conídio do estado latente
para o surgimento do tubo germinativo e consequente formação do micélio. Alguns
autores relatam que esse processo é acompanhado por duas transições
morfológicas: o intumescimento seguido da emergência do tubo germinativo, muitas
vezes induzidas por fatores extracelulares. O intumescimento geralmente acontece
em 3-4 h e continua até 9-10 h depois da indução da germinação. Ao final desta
etapa, ocorre a indução de um crescimento polarizado que resulta na formação de
uma célula germinada (LIU et al, 2007).
Pereira (2009) analisou diversos intervalos de tempo para acompanhar as
alterações morfológicas ocorridas nos conídios de T. rubrum. Neste estudo, foi
Resultados e discussão | 65
observado que a totalidade dos conídios estavam germinados em 24 h de cultivo,
por isso é um tempo de escolha adequado para analisar a interferência de produtos
antifúngicos sobre o processo de germinação dos conídios de T. rubrum. Outros
pesquisadores investigaram a ação de produtos naturais sobre a germinação de
conídios de diversas espécies fúngicas como Penicillium spp e Aspergillus spp.
Embora sejam espécies não dermatofíticas, o tempo de escolha de 24 h também foi
adequado às análises de inibição da germinação de conídios (CARMO et al., 2008;
SHARMA; TRIPATHI 2008; SOUSA et al., 2011). Pereira (2009) e Pereira et al.,
(2011b) analisaram os efeitos inibitórios do óleo essencial de C. winterianus (CIM e
CIMx2) sobre a germinação dos conídios de T. rubrum e T. mentagrophytes após 24
h de interação. O óleo também apresentou valores percentuais de inibição
significantes quando comparados ao controle, embora não tenham inibido 100% de
inibição da germinação. A totalidade da inibição somente ocorreu quando o óleo foi
testado a uma concentração oito vezes superior à CIM.
Considerando a importância dos conídios de T. rubrum na patogênese das
dermatofitoses, nossos resultados se mostram bastante relevantes porque é o
primeiro relato acerca da ação do geraniol e citronelol sobre a germinação desses
conídios. De fato, a inibição da germinação dos conídios se apresenta como um alvo
estratégico de grande importância terapêutica. Esta informação ganha ainda mais
destaque
porque
os
monoterpenos
apresentaram
resultados
similares
ao
cetoconazol, representante de uma classe de fármacos antifúngicos comumente
usados no tratamento dessas micoses.
A germinação de conídios e a formação micelial dependem da morfogênese
adequada do fungo. Portanto, a morfologia fúngica é um fator de grande importância
durante a invasão e a evasão das células do hospedeiro pelos fungos. As
interferências em sua morfogênese induzidas por agentes tóxicos tornam-se de
grande importância caso o objetivo seja inibir o crescimento, viabilidade ou virulência
fúngica (GUNJI et al., 1983; FROST et al., 1995).
As cepas T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 foram cultivadas em ASD
na presença e ausência dos produtos na CIM/2, com base na técnica de microcultivo
em lâmina. Esta técnica de cultivo em lâminas permite demonstrar no microscópio
óptico comum à morfologia dos fungos e suas alterações provocadas por diferentes
concentrações dos produtos. Essas alterações morfológicas foram analisadas por
Resultados e discussão | 66
microscopia óptica, como demonstrada no cultivo de T. rubrum ATCC 1683 (Figura
23).
Durante o desenvolvimento fúngico, as hifas vegetativas se diferenciam para
formar os conidióforos – hifas que dão origem aos conídios por reprodução
assexuada. As sequências de eventos nas células conidiogênicas que resultam em
um novo conídio são conhecidas genericamente como conidiogênese (GRASER et
al., 2000; SIMPANYA, 2000). O exame microscópico do experimento controle de
ambas as cepas demonstrou estruturas características de T. rubrum e não foi
observada a presença de macroconídios.
Por outro lado, todos os produtos testados induziram alterações morfológicas em
T. rubrum de forma uniforme em ambas as cepas, conforme ilustrado na figura 23. A
conidiogênese normal foi afetada apenas na presença de cetoconazol. Houve uma
diminuição no grau de conidiogênese provocadas por geraniol e citronelol, embora
os conídios tenham se apresentaram normalmente distribuídos ao longo dos
conidióforos; o cetoconazol inibiu a conidiogênese completamente. Assim como o
controle, não foram observados macroconídios em nenhum dos grupos teste. A
formação normal das hifas de T. rubrum foi visivelmente afetada na presença de
todos os produtos, tornando-se mais evidente na presença do cetoconazol. Hifas
largas ou curtas e tortuosas não são características da espécie em questão e,
portanto, foram induzidas pelos produtos teste.
Por outro lado, ficou evidente a produção de clamidoconídios por T. rubrum na
presença de cetoconazol e geraniol, fato não observado com citronelol. Os
clamidoconídios são estruturas produzidas por muitos fungos como Candida
albicans, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis e Histoplasma
capsulatum. Estas estruturas se apresentam normalmente como células vegetativas
de formato grande e citoplasma condensado, com paredes espessas e com variadas
formas. Ainda, são formadas a partir das hifas podendo ser terminais ou intercalares,
isolados ou contínuos (LACAZ et al., 1998; LIN; HEITMAN, 2005).
Os clamidoconídios são formados em respostas a estímulos ambientais em
condições ambientais adversas, não favoráveis ao desenvolvimento fúngico,
normalmente de acordo coma espécie fúngica. São relatados como indutores da
produção de clamidoconídios as alterações na osmolaridade, a luz, pH, temperatura,
a presença de drogas antifúngicas e estimulantes de plantas (COLE et al., 1991;
GOMPERTZ, et al., 2000; OHARA; TSUGE, 2004).
Resultados e discussão | 67
Na literatura, é relatado que T. rubrum é o agente responsável pela maioria dos
casos de dermatofitoses crônicas e recorrentes. Isto também pode estar relacionado
à sua capacidade de produzir clamidoconídios como um importante mecanismo de
defesa contra agentes fungitóxicos, como foi observado nos resultados deste estudo
(GHAHFAROKHI et al., 2004). Isto justifica a presença destas estruturas em
concentrações subinibitórias de alguns produtos antifúngicos, confirmando que as
drogas-teste são tóxicos ao fungo, afetando a formação do micélio.
Figura 23 – Micromorfologia de Trichophyton rubrum ATCC 1683 na ausência
(controle) e na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
A, ausência de produtos (controle), com presença de conídios, dispostos ao longo do conidióforo
(seta); B, cetoconazol (8 µg/mL), com clamidoconídios (seta), hifas curtas e tortuosas; C, geraniol (16
µg/mL), com hifas largas e tortuosas (seta); D, citronelol (64 µg/mL), com hifas curtas e tortuosas
(seta).
Nota: os resultados são representativos de dois experimentos. Barra = 100 µm (400x).
Resultados e discussão | 68
Estudos anteriores relatam importantes alterações morfológicas foram induzidas
por óleos essenciais e seus componentes sobre diversas espécies fúngicas como
Aspergillus
flavus,
A.
parasiticus,
A.
niger,
A.
fumigatus
e Trichophyton
mentagrophytes (CARMO et al., 2008; MOREIRA et al., 2010; SOUZA et al., 2010;
PEREIRA e t al., 2011b). Estudos realizados por Pereira et al. (2011a) revelaram
que o óleo essencial de C. winterianus foi capaz de induzir diversas alterações sobre
T. rubrum, semelhante ao que foi observado com os componentes majoritários deste
óleo como geraniol e citronelol.
É relatado na literatura que macromoléculas cuja função esteja relacionada ao
crescimento, sobrevivência, virulência ou morfogênese celular são apontadas como
promissores alvos para novos agentes antifúngicos (ODDS et al., 2003). Diante
disso, os resultados encontrados até o momento já se apresentam de grande
relevância, embora impulsione a investigar quais possíveis alvos celulares estão
envolvidos com estes eventos e como o geraniol e citronelol atuam sobre eles.
Alguns autores afirmam que drogas que interferem com a biossíntese da parede
celular frequentemente apresentam distintas alterações morfológicas (GUNJI et al.,
1983; FUKUSHIMA et al., 1993). A parede celular fúngica representa uma estrutura
dinâmica que protege os protoplastos fúngicos de choques osmóticos externos e
define o crescimento celular, a forma e as propriedades de comunicação celular. Em
fungos filamentosos, a formação da parede celular e sua organização estão
intimamente associadas ao processo de crescimento apical das hifas. Portanto, a
parede celular é de extrema importância para o crescimento e viabilidade dos fungos
(WALKER; WHITE 2005; BOWMAN; FREE, 2006).
Por isso, julgou-se necessário investigar a possível interferência dos produtos
sobre a parede celular fúngica de T. rubrum, utilizando o bioensaio com sorbitol. Os
ensaios de atividade antifúngica de geraniol e citronelol foram realizados utilizando a
cepa T. rubrum ATCC 1683, pois nos ensaios anteriores foi verificado que as duas
cepas (ATCC 1683 e LM 422) apresentaram resultados semelhantes. Este método
se baseia na medida dos danos que produtos com atividade antifúngica produzem
aos componentes da parede celular fúngica. Caso o produto atue sob a parede
celular do fungo, ele provocará lise de suas células quando na ausência de um
estabilizador osmótico, mas permitirá seu crescimento na presença desse suporte
osmótico. O sorbitol, neste caso, funciona como o estabilizador osmótico para
Resultados e discussão | 69
estabilizar os protoplastos de fungos, podendo-se comparar a CIM dos produtos
antifúngicos na ausência e presença de sorbitol.
De acordo com Frost et al. (1995) a proteção das células fúngicas com sorbitol
não é limitado à inibição da β-1,3-glicano sintase, tendo em vista que apresentaram
positivos resultados com sorbitol. Entretanto, também pode ser ampliada para
inibidores da síntese de outros polímeros ou de mecanismos celulares relacionados
à manutenção da parede celular. Afirmam, ainda, que este ensaio serve para a
busca de compostos que atuam diretamente na parede celular ou nos mecanismos
regulatórios que a mantém. Com isso, os produtos utilizados neste ensaio
demonstram de alguma forma interferir com a parede celular.
Frost et al. (1995) realizou o ensaio com sorbitol para testar diversos inibidores
de parede celular fúngica utilizando fungos da espécie Candida albicans nos tempos
de incubação de 2 e 7 dias. Tendo em vista que T. rubrum possui uma taxa de
crescimento diferente, optou-se em adaptar a técnica realizando as leituras com 5 e
10 dias de incubação.
Na tabela 2, estão expostas as CIM dos produtos em CSD acrescido com
sorbitol (0,8 M). Como pode ser visto, todos os produtos tiveram seus valores de
CIM aumentados na presença de sorbitol. A CIM do geraniol aumentou 64 vezes, a
do citronelol 32 vezes e a do cetoconazol aumentou 8 vezes. O controle com sorbitol
garantiu a viabilidade da cepa visto que foi capaz de crescer na presença do sorbitol
e ausência dos produtos. Estes resultados sugerem que os produtos testados atuam
sobre a parede celular de T. rubrum, pois foi necessária maior concentração dos
produtos
para
superar
a
proteção
osmótica
conferida
pelo
sorbitol.
Semelhantemente, Souza et al. (2010) avaliaram a ação dos óleos essenciais de
Origanum vulgare L. e Origanum majorana L. sobre Aspergillus flavus e confirmaram
que estes óleos atuam sobre a parede celular deste fungo.
Resultados e discussão | 70
Tabela 2 – Concentração inibitória mínima de geraniol, citronelol e cetoconazol na
ausência e na presença de sorbitol sobre Trichophyton rubrum ATCC 1683.
Sem sorbitol (1)
Com sorbitol (1)
Controle de
5 dias
10 dias
5 dias
10 dias
crescimento
Geraniol
32
64
2048
4096
+
Citronelol
128
256
4096
8192
+
Cetoconazol
16
16
128
128
+
Drogas-teste
Fonte: PEREIRA (2012).
Nota: O sorbitol está presente a 0,8 M.
(1) Concentração inibitória mínima expressa em µg/mL. (+) Presença de crescimento fúngico em
caldo Sabouraud dextrose acrescido de sorbitol e ausência de drogas.
A parede celular fúngica é formada por uma complexa rede de polissacarídeos,
sendo constituída principalmente de quitina e glicanos. Estes polímeros da parede
são sintetizados a partir de substratos intracelulares, por meio de reações
catalisadas por específicas enzimas presentes na membrana celular (BOWMAN;
FREE, 2006). Alterações em sua organização ou interrupção funcional provocadas
por agentes antifúngicos podem acarretar letalidade para os micro-organismos. Por
isso, é válida a pesquisa de novos agentes antifúngicos que inibam a síntese ou
manutenção da parede celular, interferindo na sua funcionalidade (CIHLAR et al.,
2002).
Atualmente são conhecidas algumas classes de fármacos com reconhecida
atividade sobre a parede celular, entre os quais, as polioxinas e nikkomicinas como
inibidores da síntese de quitina, embora com pouca perspectiva para o uso clínico
(GEORGOPAPADAKOU; TKACZ, 1995). A inibição da sintase de β-1,3-glicano leva
à desestabilização da parede celular e liberação dos componentes intracelulares,
resultando na lise da célula fúngica. Dois principais grupos de drogas são
conhecidos por inibirem a sintase de β-1,3-glicano: as papulacandinas e as
equinocandinas. As papulacandinas são derivados acetilados do dissacarídeo
galactose- β-1,4-glicose, a exemplo da papulacandina A, B e C, ativos contra
Resultados e discussão | 71
Candida spp. As equinocandinas são lipopeptídeos (hexapeptídeos clíclicos
acilados) com atividade antifúngica promissora; atualmente utilizadas para infecções
fúngicas
sistêmicas.
São
exemplos
de
equinocandinas
em
uso
clínico:
anidulafungina, caspofungina e micafungina (PANTÓN, 2008; SABLE et al., 2008;
VANDEPUTTE et al., 2012).
Por outro lado, é relatado na literatura que o mecanismo antimicrobiano de
terpenos está intimamente relacionado com seu caráter lipofílico. A hidrofobicidade
dessas moléculas as possibilita se particionarem nas membranas celulares dos
fungos e bactérias, aumentando sua fluidez e permeabilidade e prejudicando suas
funções (BURT, 2004; TROMBETTA et al., 2005; DI PASQUA et al., 2007; PADUCH
et al., 2007).
A ação de monoterpenos na membrana celular resulta na alteração do
transporte de íons. Isto desequilibra o balanço osmótico da membrana tornando
suas proteínas associadas ineficientes como ATPases e enzimas. Além disso, ao se
acumularem na membrana plasmática, estes compostos prejudicam as interações
dos lipídios com as proteínas de membrana ou atuam diretamente sobre regiões
hidrofóbicas destas proteínas. Em todo caso, isto pode levar à inibição do
crescimento microbiano, à morte ou lise celular (SIKKEMA et al., 1995;
TROMBETTA et al., 2005; DELLEAU et al., 2008; CHEN e VILJOEN, 2010).
Partindo do pressuposto que os terpenos podem atuar em nível de membrana
celular e que as enzimas envolvidas na manutenção da parede celular estão
presentes na membrana plasmática, julgou-se necessário analisar como o geraniol e
citronelol atuam em nível de membrana celular fúngica. Primeiramente, foi
necessário analisar se os componentes isolados eram capazes de ocasionar causar
danos à membrana celular de T. rubrum. Para isto, o ensaio de perda de material
citoplasmático foi realizado, colocando as células de T. rubrum ATCC 1683 em
interação com o geraniol e citronelol por 4 h e 8 h (Figura 24).
Os resultados mostram que todos os produtos induziram liberação de material
intracelular de forma significativa em relação ao controle (ausência de drogas), com
4 h de interação. Dentre os compostos testados, somente o geraniol foi mais potente
na concentração CIMx2 quando comparado aos resultados dos ensaios na CIM
(p<0,05). O citronelol apresentou resultados semelhantes ao cetoconazol na CIM e
CIMx2. Porém, o geraniol foi menos potente que o cetoconazol quando testado na
CIM, tanto na leitura feita com 4 h e quanto com 8 h de interação. Resultados
Resultados e discussão | 72
semelhantes foram observados por Pereira (2009) e Pereira et al., (2011b) ao
estudar os efeitos do óleo essencial de C. winterianus sobre, respectivamente, T.
rubrum e T. mentarophytes.
Figura 24 – Taxa de material citoplasmático de Trichophyton rubrum ATCC 1683
com absorção em 260 nm na ausência (controle) e na presença de cetoconazol,
geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL), ( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL),( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIMx2
(128 µg/mL).
(a) p<0,05 comparado ao controle no respectivo tempo. (b) p<0,05 comparado ao cetoconazol (CIM)
(teste de Fischer).
Resultados e discussão | 73
Com base nesta metodologia, os danos à membrana plasmática podem ser
evidenciados pela detecção de componentes intracelulares liberados para o meio
externo. Estes componentes celulares representam uma classe de componentes
liberados, primariamente nucleotídeos, os quais suas bases demonstram forte
absorção em comprimentos de onda de próximos a 260 nm (LUNDE; KUBO, 2000).
Com isto, estes resultados sugerem que os compostos atuam sobre a membrana
plasmática de T. rubrum, justificando a necessidade de melhor investigar que fatores
presentes na membrana estão envolvidos nesta atividade.
A membrana plasmática da célula fúngica é uma estrutura dinâmica constituída
basicamente de lipídios e proteínas. Os componentes lipídicos formam uma barreira
de permeabilidade enquanto que as proteínas, intercaladas aos lipídios, formam um
sistema seletivo de transporte de substâncias entre os ambientes intra e extracelular
ou funcionam como enzimas, a exemplo daquelas que sintetizam os componentes
da parede celular (WALKER; WHITE 2005; BERG et al., 2010).
Agentes antifúngicos podem interferir com a membrana plasmática atuando em
nível do ergosterol, ora por formação de complexos ora inibindo alguma das etapas
da sua biossíntese (CZUB; BAGINSKI, 2006; VANDEPUTTE et al., 2012). Portanto,
alguns protocolos experimentais foram desenvolvidos na perspectiva de elucidar
melhor a atividade do geraniol e citronelol na membrana celular fúngica.
Primeiramente, foi avaliado a capacidade dos compostos teste formarem
complexos com ergosterol. Na presença de ergosterol exógeno, os monoterpenos se
complexam a este e não se ligam ao ergosterol da membrana. Dessa maneira, a
CIM de geraniol e citronelol aumentará na presença do ergosterol exógeno, porque
será necessária maior concentração dos produtos no meio de crescimento para que
consigam interagir com ergosterol da membrana fúngica. Neste ensaio, utilizou-se
anfotericina B porque possui mecanismo de ação conhecido, no qual ocorre
interação com ergosterol da
membrana
para servir de
controle
positivo
(ESCALANTE et al., 2008).
Os resultados dos ensaios com ergosterol estão presentes na tabela 3. Como
pode ser visualizado, o geraniol foi o componente com maior capacidade de
complexação com o ergosterol visto que apresentou valor de CIM aumentado em
quatro vezes. Em contrapartida o citronelol aumentou em apenas duas vezes seu
valor de CIM. O cetoconazol não teve o valor de CIM alterado, pois seu mecanismo
de ação não envolve a complexação com o ergosterol. A anfotericina B se complexa
Resultados e discussão | 74
com ergosterol, pois teve um aumento de oito vezes no valor de sua CIM. Os
resultados sugerem que a ação do geraniol, mas não do citronelol, sobre a
membrana plasmática de T. rubrum envolve a ligação ao ergosterol.
Tabela 3 – Concentração inibitória mínima de geraniol, citronelol, cetoconazol e
anfotericina B na ausência e na presença de ergosterol sobre Trichophyton rubrum
ATCC 1683.
Drogas-teste
Ausência de ergosterol (1)
Presença de ergosterol (1)
Geraniol
32
128
Citronelol
128
256
Cetoconazol
16
16
Anfotericina B
2
16
Fonte: PEREIRA (2012).
Nota: O ergosterol está presente a 400 µg/mL.
(1) Concentração inibitória mínima expressa em µg/mL.
Alguns fármacos disponíveis para o uso clínico interagem diretamente com o
ergosterol, ocasionando danos à membrana celular fúngica a exemplo dos agentes
poliênicos como anfotericina B (MINNEBRUGGEN et al., 2010). Os polienos são
moléculas orgânicas anfipáticas que possuem 20-40 átomos de carbono formando o
anel macrolactônico. A sua propriedade anfipática permite que eles se liguem à
bicamada lipídica, complexando-se com o ergosterol, ocasionando a formação de
poros. A formação destes poros promove uma desestabilização da membrana
plasmática com o consequente extravasamento de íons K + e outras pequenas
substâncias inorgânicas do citoplasma, levando à lise celular (LEMKE et al., 2005).
Bard et al. (1988) descreveram em seus estudos que o geraniol foi capaz de alterar
a permeabilidade da membrana de C. albicans devido ao aumento no efluxo de K+
Resultados e discussão | 75
do ambiente intracelular. Semelhante à anfotericina B, a complexação do geraniol
com o ergosterol pode causar esta depleção de íons pela membrana plasmática e a
consequente lise celular, conforme foi evidenciado neste estudo.
A metodologia empregada neste se apresenta bastante útil para aferir a
possibilidade de interação entre os produtos testados e os esterois, nos estudos de
elucidação do mecanismo de ação antifúngico de novos produtos. O ensaio com
ergosterol exógeno vem sendo empregada nos estudos com produtos naturais por
diversos pesquisadores (ESCALANTE et al., 2008; SILVA JÚNIOR et al., 2010;
CARRASCO et al., 2012), no entanto não é relatado na literatura como um possível
mecanismo de ação de nenhum destes produtos.
Considerando o ergosterol um importante lipídio de membrana celular fúngica,
alterações na sua via biossíntética também podem ocasionar danos à célula fúngica,
impedindo seu crescimento de forma semelhante ao que ocorre quando estão
submetidos a compostos azólicos, a exemplo do cetoconazol (ARTHINGTONSKAGGS, 1999). Para analisar se os produtos interferem na síntese de ergosterol
pelas células de T. rubrum, foi preciso quantificar o conteúdo de esteróis produzidos
por essas cepas na presença de diferentes concentrações (CIM e CIMx2) de
geraniol, citronelol e cetoconazol. Para isto, foi necessário analisar a absorção dos
esteróis extraídos das culturas fúngicas nos comprimentos de onda de 230 e 281,5
nm. O ergosterol e um intermediário da via metabólica do ergosterol – 24(28)dehidroergosterol (DHE) – absorvem energia em 281,5 nm, enquanto somente o
DHE demonstra intensa absorção em 230 nm. As alterações nesse padrão de
absorção são indicativas de interferência na via sintética do ergosterol (MORAN et
al., 2007).
Na figura 25, encontram-se os valores percentuais de ergosterol produzido por
massa úmida celular por T. rubrum ATCC 1683 na presença de cetoconazol,
geraniol e citronelol na CIM e CIMx2. Como se pode perceber, geraniol e citronelol
foram capazes de inibir a produção esterol pelas células fúngicas de forma
significativa (p<0,05) quando comparado ao controle (ausência de drogas).
Numericamente, os valores percentuais do conteúdo de ergosterol por massa úmida
celular foram: Controle (0,0057 ± 0,0003), geraniol CIM (0,0027 ± 0,0003), geraniol
CIMx2 (0,0009 ± 0,0001), citronelol CIM (0,0027 ± 0,0007), citronelol CIMx2 (0,0020
± 0,0010), cetoconazol CIM (0,0037 ± 0,0007), cetoconazol CIMx2 (0,0027 ±
0,0007). O geraniol apresentou maior poder inibitório quando testado na CIMx2,
Resultados e discussão | 76
quando comparado aos resultados obtidos na CIM (p<0,05). Não foram detectadas
diferenças entre os resultados obtidos pelo citronelol, comparando-se as duas
concentrações testadas (CIM e CIMx2).
Figura 25 – Conteúdo de ergosterol produzido por massa úmida celular por
Trichophyton rubrum ATCC 1683 na presença de cetoconazol, geraniol e citronelol.
Fonte: PEREIRA (2012).
( ) Controle, ( ) Cetoconazol CIM (16 µg/mL), ( ) Cetoconazol CIMx2 (32 µg/mL), ( ) Geraniol
CIM (32 µg/mL), ( ) Geraniol CIMx2 (64 µg/mL),( ) Citronelol CIM (64 µg/mL), ( ) Citronelol CIMx2
(128 µg/mL).
(a) p<0,05 comparado ao controle. (b) p<0,05 comparado ao cetoconazol na respectiva concentração.
(c) p<0,05 comparado a CIMx2 (teste de Fischer).
O cetoconazol foi utilizado como controle neste experimento por ser um fármaco
que interfere na via biossintética do ergosterol, reduzindo sua produção pelas
células (ARTHINGTON-SKAGGS et al., 1999). O cetoconazol também inibiu
efetivamente a produção de ergosterol pelas células fúngicas (p<0,05) quando
comparado ao controle, com resultados semelhantes nas duas concentrações
testadas. É interessante evidenciar que o geraniol (CIM) inibiu a produção de
Resultados e discussão | 77
ergosterol de forma semelhante aos obtidos com o cetoconazol (CIM). Quando
testado na CIMx2, o geraniol foi mais potente que o cetoconazol (p<0,05). O
citronelol
conseguiu
resultados
semelhantes
ao
cetoconazol
nas
duas
concentrações testadas (CIM e CIMx2).
A qualificação do total de esteróis produzidos pelos fungos frente a agentes
inibidores vem sendo estudado por pesquisadores como uma forma de auxiliar nos
estudos de atividade antifúngica in vitro e ainda para correlacionar eficácia desta
metodologia e correlacionando com ensaios in vivo de modelos animais de micoses
(ARTHINGTON-SKAGGS et al., 1999; ARTHINGTON-SKAGGS et al., 2000).
Entretanto, ainda não é relatada na literatura a utilização desta metodologia na
elucidação do mecanismo de ação desses fitoconstituintes sobre T. rubrum, sendo
este o primeiro relato.
Os compostos azólicos compreendem uma classe de agentes antifúngicos, que
inibem a síntese de ergosterol por inibirem a 14-α-desmetilase. Esta enzima
pertence à família de enzimas do citocromo P450 (Cyp51) e catalisa a remoção
oxidativa do grupo metil no C-14 do lanosterol em fungos (ODDS et al., 2003). É
relatado também a possibilidade destes compostos também inibirem a 22 -Δdessaturase, enzima envolvida nas etapas posteriores à formação de episterol (VAN
MINNEBRUGGEN, et al., 2010). Em conjunto, isto conduz à depleção de ergosterol
e acúmulo de lanosterol e outros esteroides metilados, os quais são metabolizados a
compostos tóxicos incapazes de substituir funcionalmente o ergosterol como
principal componente de membrana. Em decorrência disto, os fungos tornam-se
incapazes de se desenvolver (CARRILLO-MUÑOZ et al., 2006).
Ao analisar a síntese de ergosterol com maiores detalhes, foi verificado que o
monoterpeno geraniol é estruturalmente semelhante ao geranil pirofosfato, um
intermediário essencial na síntese de ergosterol (Figura 26). O geranil pirofosfato é
produzido a partir da união de dimetilalil pirofosfato e ispentenil pirofosfato, uma
reação constituinte da sequencia de condensações com unidades de isopentenil
pirofosfato para formar o esqualeno, catalisada pela geranil transferase conforme
esquematizado na figura 27 (BERG et al., 2010; NELSON; COX, 2011).
Estas informações ganham mais destaque quando alguns estudos demonstam
que o farnesol inibe o crescimento das hifas e formação de biofilmes de C. albicans
e induz apoptose em Aspergillus nidulans (ALEM et al., 2006; HORNBY;
NICKERSON, 2004; RAMAGE et al., 2002). O farnesol é um isoprenóide (C15)
Resultados e discussão | 78
formado nas células a a partir da desfosforilação do farnesil pirofosfato que está
presente na via biossintética dos esteróis; uma relação semelhante à observada com
o geraniol e o geranil pirofosfato (Figura 27) (SEMIGHINI et al., 2006).
Bard et al. (1988) estudaram a ação de geraniol sobre C. albicans. Os autores
afirmam que a ação antifúngica do geraniol reside na sua habilidade de se
particionar nas membranas lipídicas, aumentando sua fluidez e alterando suas
propriedades. De fato, a diminuição do conteúdo de ergosterol interfere diretamente
nestas propriedades da membrana, tendo em vista que esteróis inseridos entre os
fosfolipídios moderam a fluidez das membranas.
Figura 26 – Estruturas químicas do geranil pirofosfato, geraniol e citronelol.
Fonte: Adaptado de NELSON; COX, (2011).
A: geranil pirofosfato; B: geraniol; C: citronelol.
Resultados e discussão | 79
Figura 27 – Participação de geranil pirofosfato na síntese de esqualeno.
Fonte: Adaptado de VOET et al. (2008).
Resultados e discussão | 80
Em decorrência disto, o funcionamento das enzimas ligadas à membrana,
incluindo as enzimas responsáveis pela síntese da parede celular, é prejudicado
provocando malformações na parede celular. Convergente aos resultados deste
estudo, é relatado na literatura que a atividade destas enzimas é também
dependente do conteúdo de ergosterol e da conformação nativa da membrana
plasmática fúngica (BOSSCHE, 1997; MARTINEZ-ROSSI, et al., 2008; VAN
MINNEBRUGGEN, et al., 2010).
Diante destes resultados, é bastante sugestivo que estudos que avaliem a
interação de geraniol e citronelol sobre T. rubrum sejam promissores. Pois, estas
drogas podem atuar concomitantemente em alvos celulares diferentes, onde se
espera que os efeitos antifúngicos se somem e contribuam conjuntamente para a
inibição do crescimento fúngico. Neste sentido, o uso do óleo essencial de C.
winterianus também pode se apresentar como promissor agente antifúngico tendo
em vista que é um produto natural rico em geraniol e citronelol, embora os
mecanismos da atividade antifúngica precisem ser melhor esclarecidos.
Os estudos de atividade antifúngica in vitro apresentados até esta etapa deste
estudo fornecem importantes informações sobre a potência e mecanismo da
atividade antifúngica do geraniol e citronelol. Embora não alcancem importantes
variáveis encontradas em um estudo in vivo, os estudos in vitro são essenciais para
justificar a continuidade das pesquisas com vistas a seus empregos clínicos
(CLEELAND; SQUIRES, 1991). Pensando nisto, foi aplicado o modelo ex vivo de
infecção em unhas por dermatófitos para investigar os efeitos de geraniol, citronelol
e cetoconazol sobre a patogenicidade de T. rubrum, ou seja, na habilidade das
cepas T. rubrum ATCC 1683 e T. rubrum LM 422 em infectar fragmentos de unhas
sadias na presença e ausência de drogas.
Os fragmentos de unha foram obtidos de diferentes voluntários do gênero
feminino e masculino, maiores de 18 anos. Inicialmente foi realizado o exame direto
dos fragmentos ungueais com KOH (30%) no qual não foi detectada a presença de
elementos fúngicos. A partir disto, foi analisada a capacidade de crescimento de
ambas as cepas sobre os fragmentos ungueais de cada voluntário para certificar-se
de que a metodologia empregada era exequível. Após isso, não foram observadas
diferenças nas taxas de crescimento das cepas de T. rubrum entre os fragmentos
ungueais, portanto, a escolha dos fragmentos para os ensaios foi independente de
sua origem clínica.
Resultados e discussão | 81
Com base nos resultados, os monoterpenos geraniol e citronelol inibiram o
crescimento da cepa T. rubrum ATCC 1683 até a CIM, conforme está exposto na
tabela 4. Com relação à cepa T. rubrum LM 422, os resultados foram semelhantes,
pois não foi observado crescimento fúngico até a CIM de cada uma das drogas-teste
(Tabela 5). O cetoconazol inibiu o crescimento de ambas as cepas sobre os
fragmentos ungueais semelhante ao que foi observado com os monoterpenos.
Os mecanismos que envolvem a patogênese das dermatofitoses são
complexos e não claramente compreendidos, por isso o entendimento desses
aspectos é considerado relevante para o desenvolvimento racional de estratégias
terapêuticas. A instalação do dermatófito e o desenvolvimento da doença envolve a
secreção de proteases, capacidade de adesão aos tecidos queratinizados,
regulação da expressão gênica durante o processo infeccioso e a imunomodulação
por fatores fúngicos (VERMOUT et al., 2008).
Neste sentido, a utilização adequada de um modelo de infecção ex vivo é
essencial para compreender esses mecanismos fisiopatológicos da dermatofitose e
direcionar os estudos de sensibilidade a agentes antifúngicos utilizando modelos
animais de dermatofitoses, na perspectiva de uma futura aplicação clínica. Vários
modelos vêm sendo utilizados para esta finalidade a exemplo do uso de
queratinócitos a partir do estrato córneo (SMIJS et al., 2007), folículos do couro
cabeludo (RASHID et al., 1996), fragmentos de pele (DUEK et al., 2004) e também
fragmentos ungueais (RASHID et al., 1995), escolhido para ser utilizado neste
estudo. Os resultados representativos dos três experimentos deste ensaio estão
ilustrados na figura 28.
O modelo de modelo de infecção ex vivo utilizando fragmentos ungueais vem
sendo utilizado por outros pesquisadores na perspectiva de simular as condições
encontradas em um sítio infeccioso de onicomicose, ocasionada por dermatófitos
(tinea unguium). Takasuka (2000) demonstrou em seus experimentos que os
conídios de T. rubrum podem germinar e crescerem in vitro usando fragmentos
ungueais como única fonte nutricional para seu crescimento, tornando esta técnica
viável para esta finalidade. Outros pesquisadores também avaliaram a atividade
antifúngica de agentes frente a cepas de T. rubrum obtendo resultados satisfatórios
na execução da técnica (OSBORNE et al., 2004; SCHALLER et al., 2009).
Resultados e discussão | 82
Tabela 4 – Interferência de geraniol, citronelol, e cetoconazol na infectividade de
Trichophyton rubrum ATCC 1683 sobre fragmentos ungueais de voluntários.
Concentração (µg/mL)
Geraniol
Citronelol
Cetoconazol
256
NT
-
NT
128
NT
-
NT
64
-
+
NT
32
-
NT
-
16
+
NT
-
8
NT
NT
+
Fonte: PEREIRA (2012).
(NT): não testado. (+) Presença de crescimento fúngico. (-) Ausência de crescimento fúngico.
Tabela 5 – Interferência de geraniol, citronelol, e cetoconazol na infectividade de
Trichophyton rubrum LM 422 sobre fragmentos ungueais de voluntários.
Concentração (µg/mL)
Geraniol
Citronelol
Cetoconazol
256
NT
-
NT
128
NT
-
NT
64
-
+
NT
32
-
NT
-
16
+
NT
-
8
NT
NT
+
Fonte: PEREIRA (2012).
(NT): não testado. (+) Presença de crescimento fúngico. (-) Ausência de crescimento fúngico.
Resultados e discussão | 83
Figura 28 – Ensaio de infecção ex vivo mostrando o crescimento de cepas de
Trichophyton rubrum sobre fragmentos ungueais.
Fonte: PEREIRA (2012).
A: fragmento ungueal sem adição de inóculo, a região negra (seta) é o fragmento ungueal. B: micélio
de T. rubrum LM 422 na ausência de drogas (seta). C: micélio de T. rubrum ATCC 1683 na ausência
de drogas (seta). D: micélio de T. rubrum LM 422 na presença de geraniol (16 µg/mL) (seta).
Nota: os resultados são representativos de três experimentos. Barras: 100 µm (400x).
Considerando que o cultivo de fungos em unhas pode ser um sistema bastante
útil para avaliar compostos antidermatófitos com vistas a uma possível aplicação
clínica, estes resultados se apresentam relevantes tendo em vista que todos os
monoterpenos testados inibiram o crescimento de T. rubrum em fragmentos
ungueais. Além disso, é interessante ressaltar que o geraniol e citronelol
demonstraram atividade antifúngica semelhante nas duas condições de cultivo: CSD
e fragmentos ungueais.
Resultados e discussão | 84
Nesta perspectiva, estudos clínicos utilizando estas drogas podem ser
desenvolvidos a partir de ensaios toxicológicos que garantam a devida segurança
quanto a dose, formulação e via de administração. Alguns estudos demonstram que
o geraniol e citronelol apresentaram baixa toxicidade em ensaios de toxicidade
aguda via oral e cutânea, utilizando ratos e coelhos respectivamente. Em estudos
por via oral, foi demonstrado que as drogas apresentaram dose letal para 50%
(DL50) dos animais em estudo maiores que 3000 mg/Kg. Por via dermal, o geraniol
apresentou DL50 >5000 mg/Kg e o citronelol apresentou DL 50 >2000 mg/Kg
(BELSITO et al., 2008; LAPCZYNSKI et al., 2008a; LAPCZYNSKI et al., 2008b).
Além disso, é relatado que o geraniol e o citronelol possuem baixo potencial de
penetração
na
pele in
vitro,
diminuindo
a
possibilidade
de indução
de
hipersensibilidade dessas drogas (GILPIN et al., 2010). Dessa forma, a aplicação
clínica do geraniol e citronelol pode ser desenvolvida por outros pesquisadores
utilizando as principais vias de administração empregadas atualmente no tratamento
das dermatofitoses como a via oral e tópica.
As investigações desenvolvidas nesta pesquisa contribuem para os estudos de
atividade antimicrobiana de produtos naturais, com ênfase na atividade de
monoterpenos contra T. rubrum, um importante agente das dermatofitoses. Sugerese que o mecanismo da atividade antifúngica do geraniol e do citronelol envolve a
parede celular e a membrana plasmática de T. rubrum. A ação de geraniol sobre a
membrana envolve a interação com o ergosterol da membrana e inibição de sua
biossíntese; o citronelol atua na membrana por inibição da biossíntese de ergosterol,
conforme esquematizado na figura 29. A formação de complexos com o ergosterol,
bem como a diminuição do seu conteúdo produzido interferem na integridade e
funcionalidade da membrana plasmática e, consequentemente, com a parede
celular.
Resultados e discussão | 85
Figura 29 – Proposta de mecanismo da atividade antifúngica de geraniol e citronelol
frente a Trichophyton rubrum.
Fonte: PEREIRA (2012).
Nota: O geraniol e citronelol atuam sobre a parede celular e inibem a biossíntese de ergosterol. O
geraniol forma complexos com o ergosterol.
Resultados e discussão | 86
O presente estudo traz perspectivas para futuros trabalhos que visam estudar
outros alvos presentes na membrana plasmática fúngica sensíveis à ação de
monoterpenos. Além disso, os resultados apresentados podem servir de guia para
futuros estudos in vivo utilizando outros sítios anatômicos de infecções por
dermatófitos como pele e couro cabeludo, buscando maior aplicabilidade clínica
destes produtos.
CONCLUSÕES
Conclusões | 88
5 CONCLUSÕES

O citronelal não possui moderada atividade antifúngica frente a T. rubrum.

O geraniol e o citronelol possuem forte atividade antifúngica frente a T. rubrum.

A atividade antifúngica de geraniol e citronelol está relacionada com a inibição
da produção micelial, da germinação de conídios, com a interferência na
viabilidade e morfogênese de T. rubrum.

O geraniol e o citronelol atuam sobre a parede celular de T. rubrum.

O geraniol atua sobre a membrana plasmática de T. rubrum formando
complexos com o ergosterol e inibindo a sua biossíntese.

O citronelol atua sobre a membrana plasmática de T. rubrum por inibir a
biossíntese de ergosterol.

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APÊNDICES
Apêndices | 111
APÊNDICE A – Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Prezado (a) Senhor (a)
Esta pesquisa é sobre a atividade antifúngica do óleo essencial da planta citronela,
sobre o fungo Trichophyton rubrum comum nas infecções de pele e unhas. A pesquisa está
sendo desenvolvida por Fillipe de Oliveira Pereira, aluno do Curso de Pós-graduação em
Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos da Universidade Federal da Paraíba, sob a orientação
da Profa Edeltrudes de Oliveira Lima.
Os objetivos do estudo são utilizar fragmentos de unhas e de fios de cabelos de
indivíduos saudáveis para analise em laboratório da atividade antifúngica dos produtos frente
ao fungo. Serão apenas coletados pequenos fragmentos de suas unhas dos pés, mãos ou dos
fios de cabelos, desde que estejam sadios ou sem micose aparente, por meio da coleta das
extremidades livres das unhas ou das extremidades dos fios. Com este estudo, pretendemos
contribuir com a comunidade científica adicionando informações sobre o poder antifúngico
destes produtos que pode ser útil no tratamento das dermatofitoses.
Solicitamos a sua colaboração para ceder alguns fragmentos de suas unhas ou de seus
fios de cabelo, como também sua autorização para apresentar os resultados deste estudo em
eventos científicos da área de saúde ou publicar em revista científica. Por ocasião da
publicação dos resultados, seu nome será mantido em sigilo. Informamos que essa pesquisa
não oferece riscos potenciais para a sua saúde.
Esclarecemos que sua participação no estudo é voluntária e, portanto, o(a) senhor(a)
não é obrigado(a) a fornecer as informações e/ou colaborar com as atividades solicitadas pelo
pesquisador.
Os pesquisadores estarão a sua disposição para qualquer esclarecimento que considere
necessário em qualquer etapa da pesquisa.
Tendo em vista que o termo de consentimento se encontra com mais de uma página, as
demais serão rubricadas pelo pesquisador responsável pela pesquisa e pelo sujeito.
Diante disso, declaro que fui devidamente esclarecido (a) e dou o meu consentimento
para participar da pesquisa e para publicação dos resultados. Estou ciente que receberei uma
cópia desse documento.
Apêndices | 112
______________________________________
Assinatura do Participante da Pesquisa
ou Responsável Legal
Espaço para impressão
dactiloscópica
______________________________________
Assinatura da Testemunha
Caso necessite de maiores informações sobre o presente estudo, favor ligar para o pesquisador:
Fillipe de Oliveira Pereira
Endereço (Setor de Trabalho): Laboratório de Micologia do Centro de Ciências da Saúde da
Universidade Federal da Paraíba. Fone: (83) 87566652/ 32336652
Comitê de Ética em Pesquisas do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal da
Paraíba. Campus I- Cidade Universitária – João Pessoa-PB. Fone: (83) 32167791.
Atenciosamente,
___________________________________________
Fillipe de Oliveira Pereira
ANEXOS
Anexo A | 114
ANEXO A – Certidão de aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa.
Anexo B | 115
ANEXO B – Laudos de especificação técnica dos monoterpenos.
Anexo B | 116
Anexo B | 117
Anexo C | 118
ANEXO C – Artigos submetidos.
Anexo C | 119
Anexo C | 120
Anexo C | 121
Anexo D | 122
ANEXO D – Artigos publicados.
Anexo C | 123
Anexo C | 124
Anexo C | 125
Anexo C | 126
Anexo C | 127
Anexo C | 128
Anexo C | 129
Anexo C | 130
Anexo C | 131
Anexo C | 132
Anexo C | 133
Anexo C | 134
Anexo C | 135
Anexo C | 136
Anexo C | 137
Anexo C | 138
Anexo C | 139
Anexo C | 140
Anexo C | 141
Anexo C | 142
Anexo C | 143
Anexo C | 144
Anexo C | 145
Anexo C | 146
Anexo C | 147
Anexo C | 148
Anexo C | 149
Anexo C | 150
Anexo C | 151
Anexo C | 152
Anexo C | 153
Anexo C | 154
Anexo C | 155
Anexo C | 156
Anexo C | 157
Anexo C | 158
Anexo C | 159
Anexo C | 160
Anexo C | 161
Anexo C | 162
Anexo C | 163
Anexo C | 164
Anexo C | 165
Anexo C | 166
Anexo C | 167
Anexo C | 168
Anexo C | 169
Anexo C | 170
Anexo C | 171
Anexo C | 172
Anexo C | 173
Anexo C | 174
Anexo C | 175
Anexo C | 176
Anexo C | 177
Anexo C | 178
Anexo C | 179