DETERMINAÇÃO DA INCORPORAÇÃO DOS FOTOSSENSIBILIZADORES EM
Trichophyton rubrum POR MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA
Rogério R. Ramos1, Mauricio S. Baptista2, Dora I. Kozusny-Andreani3,
Adjaci U. Fernandes4
1,3,4,
Universidade Camilo Castelo Branco / Instituto de Engenharia Biomédica, São José dos Campos/SP.
FIFE-FEF- Faculdades Integradas de Fernandópolis-Fundação Educacional de Fernandópolis/SP.
2,4
USP- IQ/Departamento, Departamento de Bioquímica, São Paulo/SP.
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[email protected] , [email protected] , [email protected] , [email protected]
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Resumo - O objetivo deste trabalho foi avaliar a incorporação dos fotossensibilizadores (Fs) em
Trichophyton rubrum (T. rubrum) por microscopia de fluorescência. Para excitação da fluorescência utilizouse luz com comprimeto de onda de 470nm e observou-se a emissão em 515nm. Os fotossensibilizadores
utilizados foram Pp IX, PpNetNA e Pp IX dissolvidos em dimetilsufóxido. Os resultados mostraram que os
fotossensibilizadores conseguiram ultrapassar a barreira celular do Trichophyton rubrum, visto que, os
compostos são visualizados no interior do fungo. Portanto, é sugerido um estudo com os
fotossensibilizadores para ação antifúngica para o tratamento deste fungo in vitro.
Palavras-chave: Fotossensibilizadores; Incorporação; Fluorescência.
Área do Conhecimento: Engenharia Biomédica
Introdução
As infecções causadas por Trichophyton
rubrum em humanos estão relacionadas a falha da
resposta imune do hospedeiro, ou a capacidade
do patógeno se evadir do sistema de defesa
permanecendo assim remanescente nas camadas
superficiais da pele (PERES et a., 2010). No
entanto, no processo de infecção, a parede do
dermatófito desempenha um papel essencial,
sendo, portanto, alvo de antifúngicos (BORGERS;
DEGREEF; CAUWENBERGH, 2005).
Atualmente existem vários Fs desenvolvidos
para PDT, mas pouco estudo sobre estrutura e
atividade fotodinâmica, o que torna o estudo da
estrutura e atividade de grande relevância no que
se refere à fotobiologia. Assim, o futuro da terapia
é altamente dependente no desenvolvimento de
fotossensibilizadores eficientes (SAVELLANO;
HASAN, 2003).
Metodologia
Foi empregada a cepa da espécie
Trichophyton rubrum ATCC (American Type
Culture Collection) 28188. Para o cultivo foram
utilizados os meios Agar Sabouraud-Dextrose
®
(ASD, OXOID ), e o meio líquido de cultura
®
Triptecaseina de soja (TSB, OXOID ).
A cepa de Trichophyton rubrum foi reativada
em meio ASD, cultivada por sete dias e incubado
a 28ºC.
Para a determinação da incorporação dos
fotossensibilizadores,
foram
utilizados
os
compostos Hp IX e Pp IX de origem comercial e
PpNpNA obtido por síntese. A caracterização
estrutural do composto sintético como o PpNetNA
foi obtida a partir da inserção do cloreto de acila
no grupo propiônico de Pp IX, seguido de uma
substituição do cloro pela amina primária de N,Ndimetiletildiamina. Já os compostos comerciais
como o hematoporfirina IX (Hp IX), sua matéria
prima é um derivado da Protoporfirina IX (PpIX). A
estrutura dos compostos estudados é apresentada
na Figura 1.
Os Fs foram dissolvidos em dimetilsufóxido
-1
(DMSO) na concentração de 1mg/mL . Desta
solução foi removido 0,05mL e adicionado em
microtubos contendo 1,1 mL de suspensão de
conídios de Trichophyton rubrum e meio TSB
(Tabela 1).
Culturas em meio TSB de T. rubrum obtidas
o
após incubação por 72 horas a 28 C em aparelho
Shaker, foram tratadas com os diferentes
fotossensibilizadores
por
15
minutos,
homogeneizadas por 1 minuto e em seguida foram
retiradas alíquotas da suspensão e depositadas
em lâminas de vidro e cobertas com lamínulas de
vidro para observação em microscópio de
fluorescência. O microscópio utilizado foi da Marca
ZEISS AXIOVERT 200. A objetiva usada é de 40X
para imagens de fluorescência. A câmara do tipo
Canon Power Shot G10. As imagens foram
captadas com excitação no azul (470 ± 20 nm) e
emissão a partir do verde λ> 515 nm.
Fotossensibilizadores utilizados no estudo.
Hp IX
PpNetNA
Pp IX
Tabela 1: Ensaio contendo: 0,1mL de suspensão de T. rubrum;
0,05mL de Fs em DMSO; de 1,0 mL de meio líquido TSB.
Encontro de Pós-Graduação e Iniciação Científica – Universidade Camilo Castelo Branco
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O
Na Figura 2 (B, D e F) são observadas as
incorporações dos fotossensibilizadores (Pp IX,
PpNetNA e Hp IX) em Trichophyton rubrum, por
imagens de fluorescência do Fs na região do
vermelho. A fluorescência é observada nas
paredes e interior do micro-organismo.
N
Discussão
OH
OH
NH
NH
N
N
N
N
NH
N
HN
HN
HN
O
O
O
N
O
OH HO
O
O
O
NH HN
N
Hp IX
Pp IX dimetil ester
Figura 1: Estrutura química
derivados da Protoporfirina IX.
dos
PpNetNA
fotossensibilizadores
Resultados
Como resultado pode ser observado imagens
da morfologia de fragmento de T. rubrum em
microscopia de fluorescência. Na Figura 2 (A, C e
E) são observadas a auto-fluorescência da
espécie por excitação em 470 nm. Nestas
imagens podem ser observadas as hifas com
forma cilíndrica, alongadas e ramificações e os
conídios como corpo de frutificação para sua
espécie.
A microscopia de fluorescência foi utilizada
com a finalidade de avaliar a capacidade de
penetração dos fotossensibilizadores no interior do
fragmento do Trichophyton rubrum.
Na Figura 2 (A, C e E) pode ser observada
fluorescência em hifas e conídios quando exposta
a excitação luz de 470nm, enquanto que na Figura
2 (B, D e F) verifica-se fluorescência em hifas e
conídios quando tratados com emissão de luz a
515 nm, indicando a penetração destes no interior
das estruturas.
Foram estudadas as influências das
alterações dos grupos funcionais periféricos dos
fotossensibilizadores e tais alterações podem levar
a mudanças na fotobiologia, visto que podem
alterar a incorporação e a biodistribuição do
cromóforo.
Conclusão
A
B
O presente estudo evidenciou que os
fotossensibilizadores Pp IX, PpNetNA e Hp IX
obteve uma resposta positiva na passagem da
parede e membrana celular do Trichophyton
rubrum pois são evidenciados seus compostos no
interior do fungo. Estudos sugere uma futura ação
fotodinâmica para inativação do mesmo e também
a necessidade de um estudo por microscopia
confocal para analisar a citolocalização dos
fotossensibilizadores em organelas do T. rubrum.
Referências
C
D
BORGERS,
M.;
DEGREEF,
H.;
CAUWENBERGH, G. Fungal infections of the skin:
infection process and antimycotic therapy. Current
Drug Targets. 6:849-862, 2005.
- PERES, N.A.T.; ROSSI, A.; MARANHÃO, F.C.A.
et al. Dermatófitos: interação patógeno-hospedeiro
e resistência a antifúngicos. Anais Brasileiros de
Dermatologia. 85:657-667, 2010.
E
F
Figura 2: Trichophyton rubrum ATCC 28188 após
incorporação dos fotossensibilizadores, visualizados em
microscopia de fluorescência 40x. (A e B: Pp IX; C e D:
PpNetNA; E e F: Hp IX). As setas apontam as hifas e os
conídios.
- SAVELLANO, M.D.; HASAN, T. Targeting cells
that overexpress the epidermal growth factor
receptor with polyethylene glycolated BPD
verteporfin photosensitizer immunoconjugates.
Photochem Photobiol. 77(4): 431-439, 2003.
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