Universidade Federal Fluminense
Faculdade de Medicina Veterinária
Programa de Pós-Graduação em Clínica e Reprodução Animal
KATIA MOREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO LAVADO TRAQUEAL DE
EQÜINOS DE PÓLO PÓS EXERCÍCIO
Niterói
2010
24
KATIA MOREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO LAVADO TRAQUEAL DE EQÜINOS DE PÓLO
PÓS EXERCÍCIO.
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Clínica e Reprodução Animal da
Universidade Federal Fluminense, para a obtenção
do título de Mestre. Área de concentração:Clínica
e Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. DANIEL AUGUSTO BARROSO LESSA
Niterói
2010
25
KATIA MOREIRA DA SILVA
AVALIAÇÃO CITOLÓGICA DO LAVADO TRAQUEAL DE EQÜINOS DE PÓLO
APÓS O EXERCÍCIO PÓS EXERCÍCIO
Dissertação apresentada ao Programa de Pósgraduação em Clínica e Reprodução Animal da
Universidade Federal Fluminense, para a obtenção
do título de Mestre. Área de Concentração:Clínica
Médica Animal.
Aprovada em Março de 2010
Banca Examinadora
___________________________________
Prof. Dr. Daniel Augusto Barroso Lessa
UFF
__________________________
Prof. Dr. Wilson Roberto Fernandes
FMVZ/USP
_____________________________________
Prof. Dr. Paulo de Tarso Landgraf Botteon
IV /UFRRJ
26
S586
Silva, Katia Moreira da
Avaliação citológica do lavado traqueal de
eqüinos de pólo pós exercício)/Katia Moreira da
Silva; orientador Daniel Augusto Barroso Lessa. 2010.
57f.
Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução
Animal) — Universidade Federal Fluminense, 2010.
Orientador: Daniel Augusto Barroso Lessa
1. Citodiagnóstico. 2. Cavalo de Polo. 3.
Citologia. 4. Endoscopia veterinária.
I. Título.
CDD 636.089607582
27
DEDICATÓRIA
A minha mãe, Elisabeth, por ser meu apoio, meu alicerce, meu tudo.
Ao Bernardo pelo apoio, compreensão e paciência,
principalmente nestes dois últimos anos.
Aos meus novos amigos, os cavalos.
28
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador, Prof. Daniel Lessa pelo apoio constante, ensinamentos e
compreensão.
Aos comandantes do Regimento de Cavalaria de Guardas Andrade Neves (RCGd/EB)
pela autorização para utilização dos animais neste trabalho. A todos do regimento pela
colaboração e auxílio, em especial ao tenente Estevão Grossi e tenente Henri.
Aos proprietários dos animais do Itanhangá Golf Clube por disponibilizarem os
animais para este estudo. Ao médico veterinário Alexandre pela disponibilidade e ajuda
inestimável sem a qual seria impossível a realização deste trabalho.
Ao grupo de pesquisa em medicina de eqüídeos da Universidade Federal Fluminense
(HIPIATRAS) em especial aos amigos Joana, Aline, Juliana, Denis, Maria Luisa e Vanessa
pela amizade, companheirismo e apoio demonstrados nessa missão. Sem a ajuda de vocês,
certamente este trabalho não teria chegado a lugar nenhum.
A Médica Veterinária Eliene Sad por sempre se dispor a ajudar e pelo empréstimo das
sondas utilizadas.
Ao Prof. Nayro Alencar por toda a ajuda e apoio no decorrer deste trabalho.
Aos amigos do Laboratório de Patologia Clínica da Universidade Federal Fluminense,
Laborlife Análises Clínicas e Laboratório Plasma pelo auxílio e disponibilidade de suas
instalações para confecção e leitura das lâminas
A todos aqueles que fizeram deste trabalho, um verdadeiro trabalho em equipe, o meu
sincero agradecimento.
29
RESUMO
O pólo é um dos mais antigos esportes eqüestres, tendo sido introduzido no Brasil na década
de 1920 e vem crescendo desde então. O aparelho respiratório é fundamental para a saúde e
bom desempenho atlético dos eqüinos, sendo os processos mórbidos neste sistema
responsáveis por prejuízos orgânicos e econômicos consideráveis. Dentre as enfermidades de
maior importância do trato respiratório eqüino, estão os processos inflamatórios não
infecciosos de vias aéreas posteriores e a Hemorragia Pulmonar Induzida pelo Exercício
(HPIE). A citologia de lavado traqueal é considerada mais específica do que somente o exame
endoscópico no diagnóstico dessas enfermidades. Considerando que os eqüinos de pólo ainda
são pouco explorados no que se refere a estudos clínicos, este trabalho teve por objetivo
avaliar a citologia do lavado traqueal de eqüinos regularmente utilizados em atividades de
pólo, com ênfase no diagnóstico da HPIE. Foram utilizados 37 equinos e para triagem e
formação dos grupos, foi realizado exame físico incluindo-se a endoscopia, 30 a 90 minutos
após a participação do animal na partida. O grupo 1 foi formado por animais sem alteração de
ausculta, com graus 0 e 1 de muco na endoscopia e/ou sangue na endoscopia, sendo os
animais do Grupo 2 àqueles com muco e sangue no exame. O lavado traqueal foi realizado
entre 16 e 24 horas após o exercício. A ocorrência de processo inflamatório pôde ser
caracterizada em 22,2% dos animais do Grupo 1 e 27,0% do Grupo 2. Para o diagnóstico da
HPIE foram considerados: a presença de hemácias, a eritrofagocitose e o escore total de
hemossiderófagos (ETH). Hemácias foram observadas em 44,4% dos animais do Grupo 1 e
66,6% do Grupo 2, enquanto a eritrofagocitose foi observada em 11,1% do Grupo 1 e 2,7%
do Grupo 2. Considerando o ETH, a HPIE não foi observada em nenhum animal do Grupo 1 e
encontrada em 22,2% no Grupo 2. Apesar de estarem aparentemente assintomáticos, os
animais apresentaram quadros citológicos compatíveis com processo inflamatório e HPIE em
proporções relevantes, fato que deve levar essas enfermidades a serem consideradas como
uma das primeiras opções de diagnóstico na investigação de queda de desempenho atlético de
equinos nessa atividade esportiva
Palavras-chaves: cavalo de pólo, endoscopia, HPIE, lavado traqueal, citologia.
30
ABSTRACT
Polo is one of the oldest team games, since 1920 and being in continuous development in this
country (Brazil).The respiratory tract is essencial to health and performance for the sport
equine medicine. Among the more important diseases are the
non infectious airways
disorders and exercise-induced pulmonary hemorrhage (EIPH).The cytology of tracheal wash
is considered more specific that endoscopic exam to diagnose this diseases. The objective of
this study was evaluate the cytology of tracheal wash of horses Thirty seven horses were used
in this study divided in groups by physical exam and endoscopic results. The tracheal wash
were performed between 16 and 24 hours after the game. Inflammatory disease could be
recognized in 22% of the animals of group 1 e 27,0% of group 2 For the diagnoses of EIPH
were considered the presence of red blood cells, eritrofagocitose and total hemossiderin score
(THS).. Red blood cells were seen in 44,4% of the animals of group 1 and 66,6% of group 2
and eritrofagocitose was found in 11,1% of group 1 and 2,7% of Group 2. Considering the
THS, EIPH were not observed in any animal of the group 1 and were seen in 22,2% os group
2. The results demonstrate that the horses apparently were health but they had cytological
patterns that indicate inflammatory disease and EIPH. This fact shows that these diseases
must be considered one of the most important options of diagnostic and investigation of bad
performance in this sport activity. The THS were developed for bronchoalveolar lavage
studies, so new studies must be done for estabilished a new cutoff point for THS in tracheal
washes.
Key Words: polo horses, endoscopy, EIPH, tracheal wash, citology
31
SUMÁRIO:
Página
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
09
LISTA DE ABREVIATURAS
10
LISTA DE APÊNDICES
11
RESUMO
12
ABSTRACT
13
1.INTRODUÇÃO.
14
2.REVISÃO DE LITERATURA..
16
3.MATERIAL E MÉTODO
23
3.1ANIMAIS
23
3.2. EXAME FÍSICO.
23
3.3. AVALIAÇÃO ENDOSCÓPICA
24
3.4. HEMOGRAMA E DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO PLASMÁTICO
25
3.5 - CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE PARA A FORMAÇÃO DOS GRUPOS:
25
3.6-OBTENÇÃO DO LAVADO TRAQUEAL:
25
3.7-PROCESSAMENTO E ANÁLISE DO LAVADO TRAQUEAL
27
3.7.1-Centrifugação do material e confecção de lâminas
27
3.7.2-Coloração do material
27
3.7.3-Avaliação citológica
28
3.8-INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
29
32
4.RESULTADOS
30
5.DISCUSSÃO:
37
6.CONCLUSÕES.
44
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
45
8. APENDICES
49
33
1.INTRODUÇÃO
A equideocultura é uma atividade econômica altamente relevante, sendo o Brasil hoje,
responsável pelo terceiro maior rebanho de equinos do mundo com 5,9 milhões de animais.
Dentre as atividades equestres realizadas, as esportivas vêm cada dia mais se destacando e
exigindo constante atualização dos profissionais envolvidos, principalmente no que tange a
clínica médica veterinária, desde a prevenção ao diagnóstico e tratamento das enfermidades
que acometem esses animais.
Dentre os esportes equestres, o pólo é um dos jogos de times mais antigos do mundo.
No Brasil, a partir de 2000, os organizadores dos torneios começaram a atrair novos
jogadores, a ampliar a área de influência do esporte e a desenvolver a prática do mesmo
(FANTINS, 2008; ARANHA, 2008). Desde então o esporte vem se desenvolvendo e
crescendo. Um jogo de pólo dura pouco menos de uma hora, e é dividido por períodos.
Conforme o nível dos participantes, podem variar de quatro a oito períodos por partida. Cada
período tem duração de sete minutos e é feito um intervalo de três minutos entre eles.
Apesar do número de praticantes não ser tão grande, se comparado com outros
esportes equestres, é importante ressaltar que pelas características do jogo, cada jogador
participa da competição com vários cavalos. Este fato aumenta o número de animais
utilizados para esta atividade esportiva. Se considerarmos, como exemplo, uma partida de sete
períodos, utilizando-se quatro cavalos por time em cada período, serão necessários
aproximadamente 56 animais por jogo.
O aparelho respiratório é fundamental para a saúde e bom desempenho atlético dos
equinos, sendo os processos mórbidos neste sistema responsáveis por prejuízos orgânicos e
econômicos consideráveis nesta espécie. De acordo com Derksen e Robinson (2002) dentre as
enfermidades de maior importância do trato respiratório equino, estão os distúrbios não
infecciosos de vias aéreas posteriores, tais como Obstrução Recorrente das Vias Aéreas
34
(ORVA), Doença Inflamatória das Vias Aéreas (DIVA) e Hemorragia Pulmonar Induzida
pelo Exercício (HPIE), justamente por serem os que mais acometem equinos, principalmente
os mais jovens e atletas.
O estudo das secreções obtidas do trato respiratório já vem sendo utilizado no Brasil e
tem sido considerado de grande valia, já que representa um meio semiológico importante,
ajudando no diagnostico das
doenças
(GONÇALVES, 1997;
SANCHES, 1998,
MICHELOTTO et al. 2007 ).
A citologia de lavado traqueal (LT) é considerada mais específica do que somente o
exame endoscópico, sendo descrita como uma ferramenta no diagnóstico da doença pulmonar
crônica, em particular no diagnóstico da ORVA e infecções por parasitos (DIXON, 1995). Em
casos de suspeita de HPIE em que o diagnóstico endoscópico é negativo, a citologia torna-se
fundamental devido à observação de células características dos processos hemorrágicos como
os hemossiderófagos (HODGSON e HODGSON, 2003). Alguns trabalhos indicam que quase
100% dos cavalos em treinamento demonstram hemossiderófagos em lavados (WHITWEEL
E GREET, 1984).
Apesar do lavado broncoalveolar (LBA) ser o método mais recomendado e utilizado
para coleta de material para a avaliação do trato respiratório posterior, Hoffman (2008) afirma
que realização deste procedimento exige que o animal permaneça em repouso nas 24 a 48
horas posteriores. No caso de animais atletas em atividade constante, como os utilizados no
pólo, esse repouso torna-se inviável. Nessas situações, o lavado traqueal pode ser utilizado,
uma vez que não há necessidade de repouso após a realização do procedimento.
Apesar do crescimento do número de animais utilizados para a atividade de pólo e a
alta frequência já relatada das enfermidades respiratórias em equinos (BURRELL, 1985;
ROSSDALE et al. 1985, SWEENEY, 1991; WOOD et al. 1999; CHAPMAN et al. 2000;
LESSA et al. 2005), equinos utilizados para a prática do pólo ainda são pouco explorados no
que se refere a estudos clínicos e epidemiológicos destas doenças.
Nesse contexto, este trabalho teve por objetivo avaliar a citologia do lavado traqueal
(LT) de equinos utilizados para jogo de pólo, com ênfase no diagnóstico semi-quantitativo da
hemorragia pulmonar induzida pelo exercício
35
2.REVISÃO DE LITERATURA
O aspirado traqueal foi introduzido por Pecora (1959) primeiramente na medicina
humana como método de colheita de amostras do trato respiratório para analises
microbiológicas e citológicas.
Beech (1975) foi uma das primeiras a introduzir a técnica do aspirado
traqueobrônquico em equinos. Para a coleta do material 10cm2 de área no terço inferior do
pescoço foi higienizada, como num procedimento cirúrgico, e infiltrada com anestésico local
subcutâneo. Após a incisão, uma agulha foi introduzida no espaço entre os anéis traqueais.
Após a remoção da agulha, um tubo com 30 cm de comprimento foi introduzido sendo
infundidos 30mL de solução salina, rapidamente aspirada.
A coleta de aspirado traqueal em equinos foi também descrita por Mansmann e Knight
(1972) e Mansmann e Strouss (1976), dentre outros. Posteriormente, Greet (1982) descreveu
o método de coleta do aspirado via endoscópio. Hodgson e Hodgson (2003) afirmam que este
método tem se tornado popular sendo considerado uma boa alternativa para coleta de material
de traquéia. Por ser uma técnica não invasiva, ela ainda permite que o catéter seja guiado e
proporciona a inspeção do trato respiratório na hora da coleta de material podendo ser
realizada a avaliação da traquéia (grau de hiperemia) e conteúdo luminal ( quantidade e
qualidade do muco, secreção mucopurulenta e sangue), dados que podem auxiliar na
interpretação dos resultados citológicos. Os autores ainda descrevem a técnica de coleta para
lavados traqueais. Para isso, um catéter de polietileno é inserido através do canal de biópsia
do endoscópio e 10 a 15 ml de solução salina são instilados. Na área ventral na traquéia,
anterior a carina, forma-se um acúmulo de fluido que pode então ser aspirado mais
facilmente. Esta técnica se aplica principalmente para o exame citológico. A técnica
transtraqueal possui a vantagem de eliminar a passagem pela cavidade nasal e porções do
36
trato respiratório anterior, diminuindo o risco de contaminação da amostra por
microorganismos. Porém, a técnica de aspiração via endoscópio é menos invasiva e permite a
visualização do trato respiratório e do material a ser coletado.
A descrição dos achados de lavados traqueais de animais considerados normais foi
realizada por Beech (1975). As amostras deste estudo eram compostas predominantemente
por células epiteliais colunares ciliadas, apresentando também raros neutrófilos, algumas
células mononucleadas e células fagocíticas. Podem ser encontrados alguns esporos e hifas
ocasionais, assim como células mononucleares grandes. Em alguns aspirados, havia células
multinucleadas com citoplasma vacuolado. A presença de eosinófilos e células caliciformes
foram baixas ou mesmo ausente em alguns animais. A autora também descreveu achados em
casos de animais com broncopneumonia. Nestes animais, os neutrófilos representavam cerca
de 40% das células e frequentemente excediam os 90% em casos agudos. Muitos desses
neutrófilos tinham núcleo hipersegmentado e aparentemente estavam fragmentados ou
degenerados. O muco na maioria dos animais era abundante, embora em alguns fosse escasso
e o aspirado quase que formado totalmente de agregados de neutrófilos. Macrófagos contendo
bactérias em seu citoplasma também foram descritos e em alguns casos, bactérias foram
observadas junto ao muco. O aspirado de quatro animais com histórico de epistaxe tinha em
sua maioria células epiteliais normais e macrófagos. Havia alguns macrófagos grandes com
grânulos esverdeados intracitoplasmáticos de hemossiderina.
Utilizando a coleta via endoscópio, Whitwell e Greet (1984) avaliaram 223 lavados
traqueais de 191 equinos. Por meio de uma análise celular semi-quantitativa, os autores
afirmam que as células epiteliais ciliadas eram de proporção significativa em 75% dos
animais normais. Macrófagos alveolares foram também encontrados em número considerável
em todas as categorias. Neutrófilos foram observados em quase todos os lavados, sendo sua
ausência encontrada em poucos animais normais. Embora os neutrófilos tenham formado uma
proporção significativa de células em um terço dos animais, os autores não consideram esta
uma avaliação importante, visto que parte dos animais possuía contagens celulares totais
baixas.
Larson e Busch (1985) realizaram 166 lavados traqueobrônquicos em animais sadios e
com achados histopatológicos de pneumonia intersticial, broncopneumonia, eosinofilia focal e
difusa e bronquite crônica e supurativa. Nos 92 animais com pulmões sadios, os autores
obtiveram uma média e desvio padrão das porcentagens de neutrófilos de 39±21% no lavado
traqueobrônquico, variando de 3 a 83%. Eosinófilos foram encontrados em 3,5±2,0 %
variando de 0 a 8%. Correlacionando os achados citológicos e histopatológicos dos animais
37
sadios e dos portadores de doença respiratória, os autores afirmam que existe pouca
correlação entre os achados histopatológicos e os achados do lavado traqueobrônquico.
Mair (1987) avaliou a importância do aspirado traqueal para equinos acometidos por
ORVA. Encontrou uma média de 61,5±25,8% de neutrófilos, confirmando as observações de
Whitwell e Greet
(1984) que verificaram que em animais com ORVA há aumento
significativo do número de neutrófilos.
Freeman e Roszel (1987) avaliaram o padrão citológico normal para aspirados
traqueais em eqüinos, por meio da obtenção de amostras de animais sem sinais clínicos de
doença respiratória e/ou anormalidades do sistema pulmonar em necropsia. Aspirados
traqueais dessas amostras celularidade discreta a moderada, ausência de sangue, baixa
quantidade de proteína, fibrina e debris celulares, podendo ser encontrado pequena quantidade
de muco.Os autores afirmam que pode haver grande quantidade de células epiteliais colunares
e cliliadas que podem apresentar núcleo picnótico. A presença dos macrófagos alveolares
indica que a área terminal das porções do trato respiratório foi alcançada e está sendo
representada. Essas células podem apresentar um citolplasma pouco denso ou espumoso,
como sinal de ativação. Foram encontrados nos animais sadios, número baixo de neutrófilos,
alguns degenerados e uma pequena quantidade de linfócitos.Eosinófilos podem ou não
estarem preesntes.
Sweeney et al. (1992) realizaram um estudo em animais de corrida aparentemente
saudáveis utilizando para a coleta do aspirado traqueal a técnica via trans-traqueal. Dos 66
animais avaliados, 73% apresentaram contagens percentuais de neutrófilos abaixo de 20%.
Em 12%, os valores para neutrófilos encontravam-se entre 21 e 40%. Contagens de
neutrófilos superiores a 40% foram obtidas em 15% dos animais. A presença de eosinófilos
foi observada em 29 animais (44%) sendo que somente em dois, a percentagem excedeu o
valor de 5%. As células epiteliais foram observadas em 19 (29%) dos animais.
Hemossiderófagos foram observados em 58 animais (86%), sendo que, metade destes era
sabidamente portador de HPIE diagnosticada por endoscopias prévias.
Bain (1997) também descreve a presença de células colunares ciliadas e não ciliadas
em animais considerados sadios. Poucos neutrófilos, macrófagos e quantidade escassa de
muco também podem ser encontrados. A percentagem relativa dos tipos celulares em animais
normais pode variar com a idade e o exercício. Os autores afirmam que potros tendem a ter
uma maior porcentagem de neutrófilos. Estas células podem estar presentes em animais
normais e suas características celulares são geralmente bem preservadas. Geralmente, os
neutrófilos compreendem menos de 20% da população de células nucleadas em animais
38
normais. Ocasionalmente, outros leucócitos podem estar presentes, como eosinofilos (<3%)
em animais normais.
Mair et al. (1987) avaliaram a celularidade de 42 secreções obtidas dos diferentes
níveis do trato respiratório (cavidade nasal, traquéia, brônquios e broncoalveolar) de equinos
de idades variadas. Os autores compararam também as diferenças nas contagens celulares de
secreções de traquéia obtidas via endoscopia e via trans-traqueal. A contagem diferencial do
lavado traqueal demonstrou diferença significativa entre as duas formas de coleta quanto à
percentagem de células epiteliais, macrófagos e neutrófilos. Em lavados obtidos via
endoscópio foi observada uma média de 49,1 ± 11,5% de células epiteliais enquanto que em
lavados trans-traqueais, os valores obtidos foram 19,8±6,1%.
Derksen et al (1989) não encontraram correlação estatisticamente significativa entre as
citologias de AT e LBA e afirmam que a população celular da traquéia não é representativa da
população celular nas vias aéreas posteriores. Em seu estudo, os autores avaliaram 50 equinos
com doença pulmonar crônica e dez animais controle, sem histórico de doença respiratória.
Utilizando para obtenção do aspirado a infusão de 20 mL de solução salina estéril via
endoscópio, os autores relatam uma contagem de neutrófilos nos animais controles de 32±8,9.
A presença de hemossiderófagos foi observada no LBA de nove animais, destes, somente em
quatro, estas células também foram observadas no LT.
Fernandes et al. (2000) realizaram um estudo com a finalidade de avaliar os tipos
celulares obtidos pelas técnicas de LBA e Lavado Traqueobrônquico (LTB) de cavalos
clinicamente sadios, em lâminas citológicas coradas pelo método de Rosenfeld. Neste estudo
utilizaram cinco equinos, que foram submetidos ao procedimento do LBA cinco vezes
seguidas com um intervalo de sete dias entre as coletas, totalizando 25 amostras. A análise das
citologias do LBA revelou uma porcentagem média de 81,5% de macrófagos, 2,91% de
linfócitos, 8,92% de neutrófilos, 0,15% de mastócitos e 0,76% de eosinófilos. O macrófago
foi o tipo celular predominante em ambos os lavados, comprovando a capacidade de que
ambas as técnicas possuem plena capacidade de obter amostras representativas das porções
bronco alveolares. Entretanto, a contagem de macrófagos mostrou uma diferença significativa
entre as amostras, onde o LTB apresentou uma maior proporção deste tipo celular. A
contagem diferencial dos demais tipos celulares foi semelhante. Segundo os autores, os
resultados os permitiram concluir que o LTB disponibiliza uma maior variedade celular, o que
significa que é capaz de coletar amostras de diferentes porções pulmonares que não só
broncoalveolar.
39
As contagens diferenciais entre amostras de LT e LBA também foram comparadas por
Malikides et al (2003). Neste estudo, foram realizados LT e LBA de 48 animais de corrida
com queda de performance, avaliando-se a concordância no diagnóstico de doença
inflamatória. Para tal, foram considerados sadios animais com contagens de neutrófilos abaixo
de 20% nos LT e abaixo de 5% no LBA. A coleta foi realizada de uma a duas horas após o
exercício em esteira. Em 19 das amostras pareadas, houve diferença na interpretação entre os
LT e LBA, sendo que a inflamação das vias aéreas foi indicada pelas amostras de traquéia em
13 e em broncoalveolar em seis.
A avaliação citológica de secreções do trato respiratório posterior é relatada como o
método mais específico para o diagnóstico da DIVA (DERKSEN e ROBINSON,2002).
Porém, a interpretação dos valores, principalmente quanto aos valores limítrofes de
neutrófilos apresenta controvérsia entre os autores.
Martin et al. (1999) avaliaram 42 LT de equinos com histórico de queda de
performance. Os lavados foram obtidos antes e 30 minutos após o exercício, por meio de
instilação de 30 mL de solução salina estéril via endoscópio. Foram considerados
clinicamente normais 10 animais (24%), levando-se em conta as amostras obtidas antes e após
o exercício. Em oito animais (19%) foi diagnosticada HPIE. Em sete equinos (17%) foram
encontradas nas duas amostras evidências de HPIE e DIVA Dos animais coletados, seis
amostras (14%) não puderam ser comparadas, pois o lavado obtido antes do exercício foi
considerado inadequado. A interpretação entre as amostras foi diferente em cinco dos 36
animais (14%). Os autores recomendam que seja colhida a amostra após o exercício, pois esta
contém mais secreções das vias aéreas e menos evidencias citológicas de contaminação
orofaríngea.
Christley et al (2001) em estudo de casos-controles, avaliaram 100 cavalos com tosse e
148 animais sem sinais clínicos. Nos animais com tosse foi observado um aumento
significativo no escore de muco de trato anterior e traquéia e também maior frequência de
hiperplasia folicular linfóide. Os AT destes animais tinham aumento de neutrófilos e
apresentaram com mais frequência a presença de bactérias intracelulares que os animais
controles.
Para determinar se há aumento nos valores de neutrófilos após o exercício, Malikides
et al (2007) realizaram AT de 40 animais. A coleta, realizada via endoscópio, por meio da
infusão de 10mL de solução salina estéril foi realizada 24 horas antes e uma a duas horas após
o exercício em esteira. A média da percentagem de neutrófilos foi significativamente maior
nas amostras coletadas após o exercício. Em 15 animais classificados como menos que 20 %
40
de neutrófilos antes do exercício, a percentagem nos AT após aumentou significativamente
excedendo os 20%. Em seis dos 15 animais, os valores aumentaram para mais de 50%. Estes
autores recomendam que para um diagnóstico mais preciso, a coleta do AT seja realizada após
o exercício, mas com intervalo de pelo menos uma a duas horas.
Hemorragia Pulmonar Induzida pelo exercício
A Hemorragia Pulmonar Induzida pelo Exercício (HPIE) é definida como sendo a
presença de sangue livre, de origem pulmonar, na árvore traqueobrônquica ou sinais de
sangue, após exercício intenso, geralmente identificado por endoscopia após 30 a 60 minutos
depois do exercício (COSTA et al., 2004; NEWTON et al., 2005) e com os hemossiderófagos
no Lavado Broncoalveolar (DOUCET e VIEL, 2002).É considerada por muitos, um dos
maiores problemas médicos em cavalos de esporte por acarretar pela diminuição de
desempenho e, em casos raros, levar o animal a morte.
Numerosas causas e mecanismos fisiopatológicos têm sido propostos para a
HPIE incluindo doenças das vias aéreas, obstrução de trato superior, hiperviscosidade
sanguínea induzida pelo exercício, estresse mecânico da respiração e locomoção,
redistribuição do fluxo sanguíneo no pulmão, diferenças nas pressões alveolares e hipertensão
Pascoe et al (1981), em um estudo com 235 cavalos puro-sangue inglês, determinaram
uma freqüência de 43,8% de hemorragia em vias aéreas, em diversos graus, sendo que
somente 0,8 % apresentaram epistaxe. Raphael & Soma (1982) realizaram um estudo
endoscópico em 191 animais de corrida em até duas horas após o exercício, verificando que
147 (75,4%) apresentavam evidências de HPIE e apenas 13 (9%) apresentavam epistaxe.
Estes resultados permitem inferir que, embora a hemorragia pulmonar seja encontrada em um
grande número de animais, a epistaxe é um achado relativamente infrequente deste fenômeno
(SWEENEY, 1991).
A ocorrência da HPIE já foi relatada em todos os cavalos PSI de corrida em
treinamento (WEST et al., 1993; HINCHCLIFF, 2007), mas também constitui um problema
em outras raças de cavalos que realizam exercício intenso, como os trotadores e os quarto de
milha, e em cavalos realizando exercício de menor intensidade, como os cavalos de salto e
tração (LAPOINTE et al., 1994; ERICKSON e POOLE, 2007; VICINO, 2007).
Mc Kane et al (1993) em estudo com LBA de 62 animais de 1 a 7 anos em atividade
esportiva. Os autores encontraram hemácias livres em 73% dos animais e hemossiderófagos
em 90 % das amostras o que indica a ocorrência de hemorragia imediata ou passada. Os
41
autores também relatam maior quantidade de hemossiderina nos animais mais idosos. Não
foram observadas diferenças na citologia do LBA no que se refere a sexo e performance
esportiva.
O escore semi quantitativo de hemossiderina nos macrófagos alveolares corados tem
sido descrito e utilizado para avaliar a gravidade dos episódios de hemoptise em humanos
(GOLDE et al, 1975). A utilização desse escore em LBA de equinos tem se mostrado um
método de diagnóstico mais sensível do que somente as endoscopias repetidas para a detecção
da HPIE (DOUCET e VIEL, 2002).
Hegedus et al. (2007) realizaram um estudo com equinos sadios e portadores de HPIE.
O lavado traqueal foi coletado duas horas após o exercício de acordo com metodologia de
Mansmann e Knight (1972). Os animais foram separados em três grupos - Grupo 1 Animais
com HPIE não tratados com furosemida, grupo 2, animais com HPIE tratados com
furosemida e grupo controle (animais sem sangramento). Observou-se aumento no numero de
neutrófilos nos grupos 1 e 2, portadores de HPIE (16,9% e 21,1%, respectivamente) quando
comparados aos valores do grupo controle (9,7%). Associado ao aumento dos neutrófilos,
houve um aumento de eosinófilos nos aspirados dos grupos 1 e 2 (4,5 e 15,8%) valores
maiores do que os apresentados pelo grupo controle (2,7%). Observou-se também, uma
redução no número de hemossiderófagos nos cavalos tratados com furosemida. O grupo 1
teve uma porcentagem de 7,8%, o grupo 2 teve média de 4,2 % e o grupo controle apenas
0,3% para a contagem deste tipo celular.
É aceito que a HPIE é um problema de cavalos atletas e não de uma raça específica ou
ligada a algum tipo de atividade. Biava et al (2006) descreveram a enfermidade em quartos de
milha, sendo que 40% dos cavalos participantes de provas de seis balizas e 75% dos
participantes de prova de três tambores apresentaram o problema. Lessa et al (2005) revisando
vários autores, relataram que a incidência da HPIE em cavalos de pólo era de 11%. Burrell et
al (1996) examinaram 60 equinos utilizados em corridas, uma hora após a competição e em
três corridas diferentes, tendo obtido um percentual de 87% dos animais com evidência
endoscópica de hemorragia pulmonar. Pascoe et al (1981), num estudo com 235 cavalos Puro
Sangue Inglês examinados com endoscópio de fibra óptica num período de 2 horas após o
exercício determinaram uma freqüência de 43,8 % (103) de eqüinos com vários graus de
hemorragia no lúmen traqueal. Apenas dois desses cavalos tinham epistaxe e não
demonstraram relação do grau de hemorragia com idade, sexo ou posição na corrida.
No Brasil, a ocorrência da HPIE foi avaliada Biava et al. (2006) em cavalos Quartode-Milha, sem evidências de sangue na endoscopia. Os autores encontraram evidências
42
citológicas de HPIE em lavados de 58 % dos cavalos. Lessa et al (2005) em estudo realizado
com 23 animais, encontraram evidências de HPIE em lavados broncoalveolares de 11 animais
(47,8%). Em um estudo no Jockey Clube Brasileiro, Da Nova et al. (2000) encontraram num
total de 200 animais, um percentual de 58% (117) positivos para HPIE. Em outro estudo
realizado por Ganem et al (2007) no mesmo local, foi encontrado um percentual de 52,46%
animais com evidências de sangue em endoscopia pós corrida.
Moran et al. (2003) submeteram ao exame endoscópico 39 cavalos de pólo em
treinamento no Chile. A realização do exame ocorreu duas a quatro horas após o exercício.
Demonstrou-se que 48% dos animais apresentavam algum grau de HPIE.
A ocorrência da HPIE em animais de pólo também foi avaliada por Voynick e
Sweeney (1986). Utilizando a endoscopia pós jogo como ferramenta de diagnóstico, os
autores encontraram uma frequência de 11,1% da enfermidade.
As limitações de diagnóstico do exame endoscópico, principalmente no que tange ao
intervalo entre o episódio hemorrágico e o momento do exame, ainda dificultam o diagnóstico
em muitos cavalos (MEYER et al, 1998).
Michelloto et al (2007) realizaram estudo com AT via endoscópio em equinos quartode-milha, participantes de prova de três tambores. Nenhum animal apresentou anormalidades
ao exame clínico, incluindo epistaxe. Porém, em três animais observou-se hemossiderófagos,
sugerindo que estes animais sofrem de HPIE subclínica. Foi observado também um aumento
no número de neutrófilos, obtendo média de 23,1 ±35,93 de neutrófilos. Segundo os autores, o
processo inflamatório muitas vezes passa despercebido por treinadores e proprietários, sendo
necessário o exame clinico detalhado, incluindo a endoscopia e a citologia, para a real
avaliação do trato respiratório.
A presença de hemossiderófagos em secreções traqueobrônquicas tem sido
estudada já há algum tempo. Porém, poucas tentativas têm sido realizadas a fim de quantificar
a observação (DOUCET e VIEL, 2002).
Doucet e Viel (2002) realizaram estudo com 74 animais, divididos em grupo controle
e HPIE positivos, baseados em resultados de histórico e endoscopia. Os autores afirmam que
todos os animais tiveram algum grau de hemossiderina, independente de seu grupo. Foi
observada diferença significativa entre os escores dos grupos controle e portadores de HPIE.
Por meio de testes estatísticos, os autores concluíram que quando utilizaram o escore de 75
como ponto de corte, o ETH demonstrou uma sensibilidade de 94% e especificidade de 88%
para detecção da HPIE.
43
Biava et al. (2008) utilizaram o escore de hemossiderófagos de Doucet e Viel (2002)
para avaliar a HPIE em 20 cavalos da raça quarto-de-milha. Os autores não observaram
presença de sangue na endoscopia em nenhum animal, porém, citologicamente, 15% dos
animais apresentaram ETH superior aos valores de referência, sendo considerados HPIE
positivos.
DeHeer e Mc Manus (2005) tomaram como base a metodologia de Doucet e Viel
(2002) para quantificação de hemossiderófagos e a aplicaram em lavados traqueais de felinos
com doenças respiratórias.
44
3.MATERIAL E MÉTODO
3.1. ANIMAIS
Foram utilizados 37 eqüinos adultos, mestiços de crioulo com PSI, de idade entre três
a 22 anos, regularmente utilizados em jogos de pólo (Apêndice 1 e 2). Destes animais, 20 (14
fêmeas e seis machos) pertencentes ao Itanhangá Golf Clube, localizado no Rio de Janeiro, no
bairro da Barra da Tijuca, e 17 (sete fêmeas e 10 machos) pertencentes ao Regimento de
Cavalaria de Guardas Andrade Neves (RCGd/EB), localizado no bairro de Deodoro, Rio de
Janeiro. Os animais pertencentes ao Itanhangá Golf Clube eram alimentados com ração
comercial, aveia e volumoso (feno de alfafa). Já os animais do RCGd eram alimentados com
ração comercial, feno de Coast Cross, e suplementados com sal mineral. Todos os animais
foram mantidos em cocheiras e periodicamente vermifugados e vacinados contra tétano,
influenza, encefalomielite leste, oeste e raiva.
3.2-EXAME FÍSICO
Foram registrados os dados de identificação dos animais, a idade e o peso. Também
foram anotadas a freqüência cardíaca (FC), freqüência respiratória (FR) e temperatura (T)
segundo Mc Gorum et al. (2002) bem como informações colhidas à inspeção, palpação,
percussão e ausculta do aparelho respiratório (Apêndice 3 ).
45
3.3-AVALIAÇÃO ENDOSCÓPICA
Os animais foram submetidos à avaliação endoscópica do trato respiratório, entre 30 e
90 minutos após o término do tempo no qual jogou, segundo a metodologia preconizada por
Pascoe et al. (1981) ( Apêndice 3).
O exame foi realizado utilizando-se um Colonofibroscópio Olympus modelo CF 10L,
acoplado a uma Microcâmera Karl Storz modelo Endovision XL 20280130 NTSC e uma
Filmadora Digital Sony modelo DCR HC-65. Todas as endoscopias foram digitalizadas,
armazenadas e analisadas posteriormente.
Após contenção física (cachimbo e tronco de contenção), o endoscópio foi introduzido
pelo meato ventral da narina direita ou esquerda, aleatoriamente. Foram analisadas as
estruturas anatômicas desde os meatos nasais até à bifurcação brônquica (carina). Foram
realizadas avaliações semi-quantitativas para a presença de sangue segundo Costa et al.
(2004) e para a presença de muco, segundo Gerber et al. (2004), conforme descrito a seguir:
Avaliação semi quantitativa para hemorragia segundo Costa et al. (2004).
•
Grau 1 – Traços de sangue na traquéia;
•
Grau 2 – Presença de filete de sangue na traquéia;
•
Grau 3 – Presença de sangue na traquéia em quantidade superior ao grau anterior;
•
Grau 4 – Presença abundante com acúmulo de sangue na traquéia;
•
Grau 5 – Hemorragia nasal ou presença de sangue abundante e acumulado na traquéia
até a orofaringe;
Avaliação semi quantitativa para presença de muco, segundo Gerber et al.(2004).
•
Grau 0 - Nenhum muco aparente;
•
Grau 1 - Pequenos e poucos pontos de secreção;
•
Grau 2 - Um número maior de pontos maiores de muco podendo a vir a formar
confluência;
•
Grau 3 - Presença de confluência de secreção na face ventral do lúmen traqueal,
podendo haver poças de secreção ao redor;
•
Grau 4 - Presença de secreção traqueal ocupando menos que 25% do lumen traqueal
•
Grau 5 - Presença de secreção traqueal profusa ocupando mais que 25% da extensão
da traquéia.
46
3.4 – HEMOGRAMA E DOSAGEM DE FIBRINOGÊNIO PLASMÁTICO:
As amostras de sangue foram obtidas por venopunção jugular e coletadas em tubo
contendo anticoagulante EDTA 10% sendo utilizadas para realização do hemograma,
conforme descreve Jain (1993). As contagens de hemácias, leucócitos e plaquetas foram
realizadas em aparelho semi automatizado Coulter T-890®, sendo conferidas posteriormente
pela observação do esfregaço sanguíneo. Esfregaços foram confeccionados e corados por
Panótico Instantâneo® para a realização da leucometria específica. A dosagem de fibrinogênio
plasmático foi realizada pelo método de precipitação pelo calor (JAIN, 1993).
3.5 - CRITÉRIOS DE ELEGIBILIDADE PARA A FORMAÇÃO DOS GRUPOS:
Todos os animais apresentaram frequência cardíaca, respiratória, temperatura e
resultados de hemograma e fibrinogênio plasmático dentro dos valores de referência segundo
Cowell e Tyler (1992). Esses animais foram então divididos em dois grupos (1 e 2) segundo
os resultados de ausculta e endoscopia conforme descrito a seguir:
Grupo 1 – Constituído por animais que apresentavam:
- Ausculta pulmonar normal segundo McGorum et al. (2002),
- Ausência de sangue na traquéia
- Escore até 1 para a presença de muco na traquéia.
Grupo 2: Constituído por animais que apresentavam um ou mais dos três itens abaixo:
- Ausculta pulmonar com ruídos respiratórios anormais (creptações finas, grossas, sibilos,
roncos isoladamente ou qualquer combinação desses) segundo McGorum et al. (2002)
- Achados endoscópicos de hemorragia (escore de 1 a 5)
- Escore de 2 a 5 para a presença de muco traqueal
3.6-OBTENÇÃO DO LAVADO TRAQUEAL:
Para obtenção do lavado traqueal os animais foram colocados em brete e contidos com
cachimbo. O endoscópio, contendo a sonda 1(Figura 1) em seu canal de trabalho, foi
introduzido pelo meato nasal ventral em direção a traquéia. A sonda foi posicionada na
47
traquéia em porção distal, anterior a carina, de acordo com técnica utilizada por Whitwell e
Greet (1984). Para tal, 20 a 40mL de solução salina estéril foram instilados, por meio de
seringas plásticas estéreis (Injex®) e imediatamente aspirados. As amostras foram
consideradas adequadas quando era possível observar partículas suspensas ou filamentos de
muco (Figura 2). O lavado obtido foi acondicionado em frascos cônicos graduados de 50mL,
mantido sob refrigeração até o momento do processamento, tempo esse que não excedeu a 6
horas pós coleta.
Figura 1 – Sonda para coleta transendoscópica (MILA® Delivery
Catheter), utilizada para a obtenção do lavado traqueal dos animais
de pólo. Rio de Janeiro, 2009.
1
MILA ® Delivery Catheter - 2.5mm x 190cm
48
Figura 2 - Lavado traqueal. Observa-se alteração de
coloração e presença de grande quantidade de muco.Rio
de Janeiro, 2009.
3.7-PROCESSAMENTO E ANÁLISE DO LAVADO TRAQUEAL
3.7.1-Centrifugação do material e confecção de lâminas
Alíquotas de 5mL de lavado foram submetidas a centrifugação a 110g por 5 minutos
em centrífuga RDE® modelo MC-16. O sobrenadante foi dispensado e o sedimento de células
utilizado para confecção das lâminas. Utilizou-se a técnica de esfregaço linear, segundo
Cowell e Tyler (1992). Nesta técnica, coloca-se uma gota da solução numa das extremidades
da lâmina. Com o auxílio de uma lâmina extensora, desliza-se a gota sobre a lâmina,
interrompendo o movimento no centro, buscando concentrar as células de forma linear. Foram
confeccionadas pelo menos duas lâminas de cada animal e posteriormente fixadas em álcool
metílico por 5 minutos.
3.7.2-Coloração do material
Pelo menos uma lâmina de cada animal foi corada pelo Giemsa e utilizada para a
contagem diferencial dos tipos celulares. A segunda lâmina foi corada pela técnica do Azul da
Prússia, de acordo com metodologia descrita a seguir:
49
•
Após fixação em metanol por 10 minutos, as lâminas foram hidratadas em água
corrente por 5 minutos. Após secagem, foram colocadas numa solução de partes iguais de
ferrocianeto de potássio a 0,5% e ácido clorídrico a 10% por 1 hora.
•
Decorrido este tempo, foram lavadas com água destilada, secadas novamente e
contracoradas com vermelho rápido nuclear a 0,1% por 10 minutos.
Essa coloração é utilizada para evidenciação de ferro citoplasmático sendo utilizada
para a avaliação semiquantitativa de HPIE por meio do escore de hemossiderófagos (ETH),
seguindo-se metodologia de Doucet e Viel (2002).
3.7.3-Avaliação citológica
A contagem diferencial dos tipos celulares de cada animal foi realizada por meio da
análise de 300 células em objetiva de 100 vezes e posteriormente calculada a média dos
valores encontrados.
Para a obtenção do escore de hemossiderófagos, foram observados 100 macrófagos em
objetiva de imersão de 100 vezes. Cada macrófago foi classificado segundo a quantidade de
hemossiderina contida, de acordo com metodologia de Doucet e Viel (2002) descrita abaixo.
Após a contagem, a quantidade de macrófagos obtida em cada grau foi multiplicada pelo
valor numérico (de 0 a 4) atribuído ao grau e posteriormente somada, obtendo-se então o ETH
(escore total de hemossiderina).
Sistema de graduação de hemossiderina em macrófagos segundo Doucet e Viel (2002)
Grau 0 – Ausência de coloração azulada no citoplasma
Grau 1 – Coloração discreta, azul clara no citoplasma
Grau 2 – Coloração azul escura em pequena parte da célula ou coloração de média intensidade
em toda o citoplasma
Grau 3 – Coloração azul escura na maior parte do citoplasma
Grau 4 – Célula totalmente preenchida por hemossiderina, demonstrando coloração azul
escura por todo o citoplasma.
50
3.8-INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS
Foram analisados os resultados individuais e calculados a média e desvio padrão da
contagem diferencial para os diferentes tipos celulares presentes no lavado traqueal dos
eqüinos dos dois grupos. Devido à diferença no número de animais entre os dois grupos, não
foi possível realizar uma análise estatística comparativa entre eles.
Os critérios utilizados como referência para a citologia traqueal foram os propostos
por Robinson (2003) sendo considerados sadios os animais com percentual de contagem para
neutrófilos, abaixo de 20% do total de células nucleadas e para eosinófilos, abaixo de 1%.
Para a avaliação da HPIE, foi realizada uma avaliação qualitativa para presença de
hemácias e eritrofagocitose.
Para o escore de hemossiderina, foi considerado como ponto de corte para
caracterização de HPIE, o escore acima de 75 preconizado por Doucet e Viel (2002) para
lavados broncoalveolares.
51
4.RESULTADOS
Os resultados da contagem diferencial para os tipos celulares presentes no lavado
traqueal dos eqüinos dos Grupos 1 e 2 encontram-se respectivamente nas Tabelas 1 e 2.
Tabela 1 - Resultados individuais, média e desvio padrão da contagem diferencial (expressos
em porcentagem) para os diferentes tipos celulares presentes no LT de eqüinos do grupo 1
(n=9). Rio de Janeiro, RJ. 2009.
Neutrófilo
Linfócito
2
2,8
3,2
28,5
0,0
65,6
0,0
4
7,3
21,3
36,6
0,0
34,8
0,0
6
16,6
5,7
41,7
0,0
36,0
0,0
9*
30,0
4,0
57,7
0,0
8,3
0,0
21
2,0
7,3
32,4
0,0
58,3
0,0
25
1,0
1,2
6,0
0,0
92,0
0,0
31
5,6
7,0
13,6
0,0
71,6
0,0
34*
78,6
2,3
13,4
0,3
5,4
0,0
36
0,5
2,3
10,6
0,0
86,6
0,0
16,0±25,3
6,0±6,1
26,7±17,2
0,0±0,1
51,0±31,7
0,0
Média ± DP
Macrófago
Eosinófilo
Célula
Animal
Epitelial
* valores de neutrófilos acima dos limites de normalidade (Robinson, 2003).
Mastócito
52
Figura 3 : Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 1 (
Animal 31). Presença de muco, predomínio de células epiteliais cilíndricas e
macrófagos. Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento 400X.
Figura 4 : Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 1
(Animal 2). Presença de células epiteliais cilíndricas ciliadas e um
eosinófilo. Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento 1000X.
53
Tabela 2 - Resultados individuais, média e desvio padrão da contagem diferencial (expressos
em porcentagem) para os diferentes tipos celulares presentes no LT de eqüinos do grupo 2
(n=28). Rio de Janeiro, RJ. 2009.
Célula
Animal
Neutrófilo
Linfócito
Macrófago
Eosinófilo
1
9,7
4,3
83,3
0,0
2,7
0,0
3
17,6
5,2
60,2
0,0
17,0
0,0
5
15,2
25,3
21,6
1,3
36,6
0,0
7
8,0
28,3
36,6
3,0
24,0
0,0
8*
87,3
7,0
5,6
0,0
0,0
0,0
10
5,0
2,6
27,8
0,0
64,6
0,0
11
17,6
10,0
67,6
0,0
4,6
0,0
12
2,0
12,0
14,5
0,0
71,5
0,0
13
18,3
6,4
54,6
0,4
20,3
0,0
14
16,3
3,3
72,0
0,0
8,4
0,0
15
5,6
5,6
67,5
0,0
21,3
0,0
16*
83,0
4,3
7,0
0,0
5,6
0,0
17*
31,6
7,3
21,0
0,6
39,3
0,0
18*
82,0
1,6
16,0
0,0
0,4
0,0
19
3,0
2,0
13,0
0,0
83,0
0,0
20
1,8
1,3
12,6
0,6
83,6
0,0
22
3,4
5,0
27,6
0,6
63,3
0,0
23
15,6
13,0
66,8
0,0
4,6
0,0
24*
78,3
3,0
17,0
0,0
1,7
0,0
26
1,0
3,3
15,7
0,0
79,0
0,0
27
4,0
2,0
13,4
0,0
80,6
0,0
28
10,0
10,3
37,0
0,6
42,1
0,0
29*
21,0
4,3
25,7
0,0
49,0
0,0
30*
28,0
5,4
59,0
0,0
7,6
0,0
32
13,0
16,6
51,8
0,0
18,6
0,0
33
1,6
3,4
26,0
0,6
68,4
0,0
35
0,3
0,4
21,3
2,6
73,6
0,0
37
2,0
10,0
65,3
0,4
22,3
0,0
Média ± DP
20,8±27,0
7,3±6,8
36,0±23,6
0,4±0,8
35,5±30,2
0,0
Epitelial
* Valores de neutrófilos acima dos limites de normalidade (Robinson, 2003).
** Valores de eosinófilos acima dos limites de normalidade (Robinson, 2003)
Mastócito
54
Considerando os valores propostos por Robinson (2003), a ocorrência de processo
inflamatório pôde ser caracterizada pelo infiltrado de neutrófilos em 22,2% dos animais do
Grupo 1 (Tabela 1). No grupo 2 a ocorrência do processo inflamatório foi observada em dez
animais (27,0%), sendo que destes, sete apresentaram infiltrado de neutrófilos e três de
eosinófilos (Tabela 2, Figuras 4 e 5).
Figura 4: : Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 2
(Animal 16). Grande quantidade de muco, presença de macrófago e de
infiltrado neutrofílico Coloração Giemsa. Microscopia óptica, aumento
1000X.
Figura 5: Fotomicrografia digitalizada de citologia de
LT do grupo 2 (Animal 7) Eosinófilos contendo
grânulos característicos bem definidos. Coloração
Giemsa. Microscopia óptica, aumento 1000X.
55
A seguir, estão apresentados os resultados referentes à avaliação citológica para
hemorragia pulmonar induzida pelo exercício.
Tabela 3 –Avaliação qualitativa para presença de
hemácias e semi quantitativa para o conteúdo de
hemossiderina em macrófagos (escore total de
hemossiderina, ETH) encontrados no LT de
eqüinos do Grupo 1 (n=9). Rio de Janeiro, RJ.
2009
Animal
Hemácias
ETH
2
Ausente
7
4
Presente
16
6
Presente
31,1
9
Ausente
21
21
Ausente
6
25
Presente
42
31
Ausente
27
34
Ausente
31
36
Presente
7
56
Tabela 4 – Avaliação qualitativa para presença
hemácias e semi quantitativa para o conteúdo
hemossiderina em macrófagos (escore total
hemossiderina, ETH) encontrados no LT de eqüinos
Grupo 2 (n=28). Rio de Janeiro, RJ. 2009
Animal
Hemácias
1
Ausente
26,6
3*
Presente
203,5
5
Presente
21,0
7*
Presente
204,0
8
Ausente
32,0
10
Presente
42,5
11
Ausente
23,0
12
Ausente
40,0
13*
Ausente
79,0
14
34,0
15*
Ausente
Presente
84,0
16
Presente
59,0
17
Presente
64,0
18
Ausente
16,0
19*
Ausente
151,0
20
Ausente
65,7
22
Presente
16,0
23
Presente
27,0
24
Presente
17,0
26
Presente
42,0
27
Presente
31,0
28
Presente
7,0
29
Presente
28,0
30
17,0
32
Presente
Ausente
33
Presente
11,0
35*
Presente
104,0
37
Presente
40,0
de
de
de
do
ETH
9,0
* Valores de escore compatíveis com HPIE segundo
Doucet e Viel (2002).
57
A presença de hemácias foi observada em quatro animais do Grupo 1 (44,4%) e 18
animais do Grupo 2 (66,6%).
Quanto a ocorrência de eritrofagocitose esta foi observada em somente no animal 6 do
Grupo 1, representando 11,1% e no animal 29 do Grupo 2, correspondendo a 2,7%.
Considerando o valor de escore para o conteúdo de hemossiderina em macrófagos
(escore total de hemossiderina, ETH) proposto por Doucet e Viel (2002), a ocorrência de
HPIE não foi observada em nenhum animal do Grupo 1 e pôde ser caracterizada em 22,2%
dos animais do Grupo 2 (Tabela 4,Figura 6 ).
Figura 6 - Fotomicrografia digitalizada de citologia de LT do grupo 2
(Animal 7). Presença de numerosos macrófagos em diferentes graus de
conteúdo de hemossiderina. Coloração Azul da Prússia. Microscopia óptica,
aumento 1000X.
58
5.DISCUSSÃO:
Os valores médios encontrados na contagem diferencial dos tipos celulares presentes
no LT de eqüinos do Grupo 1, estão dentro dos valores estabelecidos por Robinson, (2003)
para animais considerados sadios.
Com relação à contagem de neutrófilos do grupo 1, estes valores foram semelhantes
aos encontrados por Michelloto et al. (2007) que obtiveram 23,1 ±35,93% em animais sadios
e inferiores aos observados por Larson e Busch (1985) que obtiveram 39,0±21% e Derksen et
al. (1989) que obtiveram 32,0±8,9%. Mair (1987) obteve uma percentagem média (4,6±4,9)
abaixo da observada nesse estudo, assim como Fernandes et al. (2000) que encontraram
valores médios para neutrófilos de 8,92±7,41%, porém utilizaram a coleta por via
transtraqueal.
Essa grande variação dentre os números de neutrófilos, mesmo em animais
considerados sadios, é sabidamente uma das desvantagens da metodologia de lavado traqueal.
Corroborando estas informações, Dixon (1995) afirma que os valores de contagem diferencial
na secreção traqueal dos eqüinos ainda não estão bem definidos, particularmente quanto aos
limites superiores do número de neutrófilos. Taxas de mais de 40% são relatados em
secreções
respiratórias
de
animais
aparentemente
sadios
mantidos
estabulados.
Conseqüentemente, a interpretação da citologia que contém de 15 a 40% de neutrófilos
permanece problemática, embora a presença de mais de 40% de neutrófilos seja compatível
com inflamação pulmonar. Por outro lado, Sweeney et al. (1992), em estudo com uma
população jovem, homogênea (cavalos de corrida) e clinicamente normal, observaram que
cerca de 80% dos animais apresentaram valores de neutrófilos abaixo de 20%. Concordamos
com Hodgson e Hodgson (2003) quando constatam a dificuldade em associar o aumento no
percentual de células a uma patologia pulmonar.
Apesar da média do Grupo 1 estar dentro dos valores estabelecidos para animais
sadios, em dois (nove e 34) foi encontrado uma alta porcentagem de neutrófilos. O animal
59
nove apresentou uma contagem considerada por Dixon (1995) dentro de um intervalo crítico
para diagnóstico de quadros inflamatórios. Já o animal 34, apresentou praticamente o dobro
do valor mínimo para ser considerado compatível com inflamação.
Um aspecto a ser considerado é que esses animais não demonstraram alterações
clínicas, hematológicas ou de concentração de fibrinogênio plasmático. Além disso, esses
lavados não apresentaram características morfológicas de processo infeccioso (FREEMAN E
ROSZEL,1997 ) e nem de obstrução recorrente de vias aéreas (MAIR, 1987; WHITWELL E
GREET, 1984)
Por tudo isto, acreditamos que esses animais apresentam um quadro
inflamatório de vias aéreas posteriores de baixa intensidade e assintomático, mas seria
recomendável para o animal 9, a repetição dos exames para confirmação dos achados.
Os achados endoscópicos estão associados ao estado do animal no momento do
exame. Logo, estão sujeitos a interferências como, por exemplo, eliminação do muco pelos
mecanismos fisiológicos de depuração (movimento mucociliar, tosse e deglutição), o que
pode ter levado a uma interpretação sujeita a variações pela observação da traquéia sem
secreção no momento do exame endoscópico desses animais.
Ainda que os valores médios encontrados na contagem diferencial dos tipos celulares
presentes no LT de eqüinos do Grupo 2, estejam no limite máximo dos valores preconizados
por Robinson, (2003) para animais sadios, em sete destes animais foram encontrados valores
de neutrófilos acima de 20% , sendo que destes, quatro animais (8,16,18,24) apresentaram
mais de 40% de neutrófilos. Para estes animais, o resultado citológico permite confirmar os
achados de ausculta e/ou endoscópicos caracterizando um quadro inflamatório de vias aéreas
posteriores. Nos animais 29 e 30, foi visualizada secreção grau dois (vide apêndice 3) durante
o exame endoscópico, o que é considerado grau mínimo para presença de inflamação, a qual
foi confirmada pelo discreto infiltrado de neutrófilos, cujo percentual encontrado foi entre 20
e 40%. Logo, quando analisamos os dados em conjunto, é possível afirmar que estes animais
também sofrem de um processo inflamatório, possivelmente de baixa intensidade.
Para os eosinófilos, em nosso estudo, os percentuais médios obtidos estiveram dentro
dos valores de normalidade observados por Robinson (2003) de menos de 1%, tanto no Grupo
1 como no Grupo 2. A baixa presença de eosinófilos, já foi relatada por outros autores em
animais clinicamente normais (HODGSON e HODGSON, 2003) e em alguns estudos
(MARTIN, 1999), essas células são classificadas semiquantitativamente e não em
porcentagem. Porém, em três animais (5,7 e 35) do grupo 2, os valores encontrados foram
entre 1 a 3%. Os eosinófilos são reconhecidos atualmente por muitos como uma célula pró
inflamatória potente com considerável potencial de injúria tecidual e como um mediador
60
primário do dano epitelial e hiperatividade bronquial (HARE E VIEL, 1998). Embora
infiltrados de eosinófilos também possam estar relacionados a migrações parasitarias, não
foram observadas nessas citologias, características como presença de debris necróticos
(FREEMAN e ROSZEL, 1997). Alem disso, como estes animais eram regularmente
utilizados para competições de pólo e periodicamente vermifugados, a possibilidade do
aumento de eosinófilos ter sido causado por parasitos é remota. Em conjunto com o infiltrado
eosinofílico, esses animais apresentaram presença de secreção na endoscopia e achados
anormais de ausculta respiratória, o que nos leva a crer que esses animais apresentam quadros
brandos de alergia respiratória.
A porcentagem de macrófagos obtida em nosso estudo foram inferiores as observadas
por Sweeney et al. (1992) e Fernandes et al. (2000), porém estes autores utilizaram para coleta
a via transtraqueal. Mair et al. (1987), utilizando a coleta via endoscópio encontraram valores
menores e mais próximos ao encontrado em nosso estudo. Portanto, concordamos com
Fernandes et al. (2000) quando afirma que diferenças nas técnicas de coleta do LT podem
levar a esta discordância entre os resultados.
Mastócitos não foram observados em nosso estudo. Hughes et al, (2003) sugerem que
a porcentagem de mastócitos no lavado traqueal é mais baixa que em lavados
broncoalveolares, pois no LT há aumento na proporção de outros tipos celulares, como
neutrófilos.
A grande quantidade de células epiteliais encontradas nos animais do Grupo 1 deve-se
ao método de coleta e é compatível com achados de Mair et al. (1987) e Michelotto et al.
(2007) que encontrou 44,09±35,68 para animais sadios. Mair et al. (1987) obtiveram
contagens diferenciais significativamente diferentes entre a coleta transtraqueal e via
endoscópio, o que foi também relatado por Bain (1997) que afirmou que amostras obtidas via
endoscópio apresentam maior quantidade de células epiteliais devido ao atrito e descamação
da mucosa provocada pelo equipamento durante a sua passagem.
A ocorrência de processo inflamatório pôde ser caracterizada pelo infiltrado de
neutrófilos em 22,2% dos animais do Grupo 1 (Tabela 1). No grupo 2 a ocorrência do
processo inflamatório foi observada em dez animais (27,0%), sendo que destes, sete
apresentaram infiltrado de neutrófilos e três de eosinófilos. Sweeney et al. (1992) também
observaram evidências citológicas de doença inflamatória em aspirados traqueobrônquicos de
cavalos de corrida aparentemente sadios..
Em nosso estudo, foram observadas hemácias em 66,6% dos animais, achados
compatíveis com os de McKane et al. (1993) que observaram estas células em 73% dos
61
eqüinos em atividade. Freeman e Roszel (1997) declaram que em animais sadios, hemácias
podem estar ausentes ou serem encontradas em baixo número. Em animais com HPIE, os
mesmos autores afirmam que essa presença varia se existe hemorragia recente que ainda não
foi convertida a hemossiderina. A quantificação de eritrócitos recuperados no LBA foi
prosposta como método de avaliação semi quantitativa da severidade da HPIE.(MEYER et
al,1998). Porém, os estudos são conflitantes no que se refere à reprodutibilidade das técnicas e
há questionamentos sobre a real aplicação desta quantificação para indicação da severidade
da hemorragia pulmonar. Estudos sugerem que a quantificação dos eritrócitos no fluido
recuperado pode ser variável demais para permitir o uso desta técnica (BIRKS et al. 2003).
A presença de hemossiderófagos foi observada em todos os animais de nosso estudo,
concordando com observações de Sweeney et al. (1992) que identificaram hemossiderófagos
em lavados traqueais de 86% dos animais de corrida e aos de Mc Kane et al. (1993) que
detectaram hemosiderófagos no lavado broncoalveolar de 90% de animais. Whiwell e Greet
1984) relataram este achado em 18 de 19 animais em treinamento, e em somente 2 animais
que não estavam submetidos a treinamento, afirmando que todo equino submetido a exercício
extenuante sofre de algum grau de hemorragia pulmonar. Porém, Roszel (1988) afirma que
hemossiderófagos indicam algum grau de hemorragia, mas sua presença pode estar
relacionada a outras causas como insuficiência cardíaca congestiva com congestão pulmonar,
broncopneumonia por aspiração ou pleuropneumonias. Em nosso estudo, descartamos estas
outras causas de formação de hemossiderófagos por meio dos exames realizados para seleção
dos animais.
Apesar dos animais 7, 13 e 19 (Grupo 2) não apresentarem HPIE ao exame
endoscópico pós jogo, eles apresentaram quadros citológicos de hemorragia pregressa
importante, caracterizados por escores de hemossiderina maiores que 75. É possível que a
intensidade do exercício realizado neste dia pelos animais, não sido a tenha a ponto de levar a
sangramento perceptível. No animal 7, além dos hemossiderófagos, que são indicativos de
hemorragias passadas, também foram observadas hemácias. A presença de hemácias pode ser
devida a trauma ocasionado pela coleta e/ou hemorragia de baixa intensidade não
diagnosticada pela endoscopia. No caso deste animal, acreditamos que devido ao escore
elevado de hemossiderófagos, a presença de hemácias deve-se a um episodio de hemorragia
de baixa intensidade ocorrido no dia do jogo não observado na endoscopia.
No animal 3, o conjunto dos achados da endoscopia e citologia (ETH alto e presença
de hemácias) nos permite afirmar que trata-se de um animal que sofre episódios periódicos de
hemorragia clinicamente relevante.
62
Nos animais 8, 22 e 27 foram observadas hemácias, sendo nestes animais um achado
citológico compatível com sangramento recente, haja vista que foi observado sangramento
relevante na endoscopia pós jogo. Os ETHs destes animais estavam abaixo do estipulado para
hemorragia, indicando que estes animais não sofreram episódios de hemorragia pregressa e
relevante. Um estudo em crianças demonstrou que macrófagos dos aspirados de traquéia
somente tornam-se positivos para a coloração de azul da prússia, 50 horas apos um episodio
de hemorragia aguda e 72 horas apos contato com hemácias nas culturas de células
pulmonares (SHERMAN et al.,1984). A presença deste sangramento isolado pode ter sido em
função da intensidade de exercício realizado no dia da endoscopia.
O tempo de permanência dos hemossiderófagos nas secreções após o episódio de
sangramento ainda não foi completamente estabelecido em cavalos. Mc Kane e Slocombe
(1999) declaram que estes podem estar presentes no LBA e no aspirado até três semanas após
o episódio de hemorragia. Gosselin et al. (1989) estudando biópsias pulmonares concluíram
que a hemossiderina pode persistir de 2 semanas a 1 mês depois de um episódio isolado de
hemorragia em humanos. Estas informações podem também justificar o baixo ETH nestes
animais, pois mesmo que tenham sofrido hemorragia clinicamente importante, como não é
possível quantificar a quanto tempo ocorreram, o espaço de tempo entre o sangramento e a
realização do lavado traqueal pode ter sido superior ao prazo de detecção dos
hemossiderófagos. Segundo Hinchcliff et al. (2004), os hemossiderófagos somente estão
presentes no LBA de 7 a 21 dias após o episódio de sangramento.
Os animais 28 e 33 tiveram ETH baixos, ausência de sangue na endoscopia e presença
de hemácias no lavado traqueal. Acreditamos que nestes animais, por não terem sido
encontradas evidencias de sangramento prévio ou recente, a presença de hemácias pode ter
sido ocasionada por pequenos traumas causados pela sonda na hora da coleta. Para
comprovação dessa afirmação, seria necessário o estudo em um maior número de animais
para comparação entre a presença de hemácias em animais que sangram e a presença das
mesmas causadas simplesmente por trauma. Além disso, também não há por parte dos autores
consultados, uma padronização de análise semi quantitativa de hemácias relevantes para
HPIE.
A eritrofagocitose em nosso estudo foi observada em somente em 02 animais, sendo a
comparação entre estudos difícil, pela falta de relatos sobre a observação de eritrofagocitose
em lavados traqueais. Mc Kane e Slocombe (1999) em estudo com inoculação de sangue no
trato respiratório, afirmam que até o terceiro dia após a hemorragia, a presença de macrófagos
fagocitando hemácias é pouco observada, sendo o aumento da eritrofagocitose mais freqüente
63
após o terceiro dia e até o décimo dia pós inoculação. Outro fator que pode contribuir para a
ausência de eritrofagocitose deve se ao método adotado de coleta de material, o lavado
traqueal. Como frequentemente o local da hemorragia é o lobo caudal do pulmão, espera-se
que ocorra maior quantidade de eritrofagocitose nas vias mais distais e não no lúmen traqueal,
sendo este achado mais freqüente nos lavados broncoalveolares.
Considerando-se a combinação dos critérios: Presença de sangue na endoscopia e
escore de hemossiderófagos maior que 75; foi encontramos em nosso estudo 37,8 % de
ocorrência de HPIE, valores superiores aos relatados por Voynick e Sweeney (1986) e
inferiores aos encontrados por Moran et al. (2003). Porém, ambos realizaram somente a
endoscopia pós jogo, ao contrário do nosso estudo, onde se utilizou a citologia traqueal. A
ocorrência de HPIE em nosso estudo, quando consideramos somente o valor de escore para o
conteúdo de hemossiderina em macrófagos foi semelhante a encontrada por Biava (2008).
Segundo Mc Kane et al (1993), a ocorrência e severidade da HPIE pode variar dependendo do
nível de exigência do exercício.
Doucet e Viel (2002) definiram como ponto de corte o valor para ETH acima de 75 a
ser empregado em lavados broncoalveolares. Porém, os mesmos autores sugerem que para
propósitos de pesquisa, outros pontos de corte mais específicos podem ser definidos,
dependendo dos objetivos de triagem para seleção dos indivíduos do estudo. Dos animais que
apresentarem evidências endoscópicas de HPIE (total=10), 03 (30%) tiveram ETH acima de
75, e 05 (50%) tiveram abaixo de 75 e acima de 25, indicando que é possível que quando o
método a ser utilizado for o lavado traqueal, o ponto de corte a ser considerado pode ser mais
baixo. Os mesmos autores afirmam ainda, que um escore acima de 150 parece ter uma
especificidade de 100% na identificação da HPIE, mesmo em animais sem presença de
sangue na endoscopia pós exercício. Da mesma forma, um ETH de 25 ou menos demonstrou
sensibilidade de 100% em detectar os animais negativos. Em humanos, escores acima de 100
são considerados indicativos de hemoptise, embora os hemossiderófagos tenham sido
identificados em indivíduos com escores acima de 25 e sem histórico de hemorragia
pulmonar.
Derksen et al. (1989) sugerem que a população celular da traquéia não é representativa
da população celular nas vias aéreas posteriores. Em seu estudo, a presença de
hemossiderrófagos foi observada no LBA de nove animais, destes, somente em quatro estas
células também foram observadas no LT. A população celular nas vias aéreas pode diferir
significativamente por causa da migração celular local para e do lúmen aéreo. As vias aéreas
de maior calibre podem transportar material originado de ambas as vias aéreas condutoras e
64
também da área de superfície alveolar; com isso, diferentes áreas contribuem com secreções
de uma maneira não homogênea. . Considerando também que o local onde comumente
ocorrem episódios de hemorragia é o lobo caudal do pulmão, é provável que o lavado traqueal
seja um material mais diluído que o LBA quando consideramos a presença de
hemossiderófagos. Diferenças nas populações traqueais, das vias aéreas periféricas e na
superfície alveolar também podem ser explicadas por diferenças nas taxas de renovação
celular (DERKSEN et al. 1989). Por isso, sugerimos que novos estudos com um número
maior de animais, sadios e portadores de HPIE sejam realizados para elaboração de um novo
ponto de corte para ETH em lavados traqueais.
.
6.CONCLUSÃO
Apesar de estarem aparentemente sadios, os animais apresentaram quadros
citológicos compatíveis com processo inflamatório e HPIE em proporções relevantes,
fato que deve levar essas enfermidades a serem consideradas como uma das primeiras
opções de diagnóstico na investigação de queda de desempenho atlético de origem
respiratória em equinos nessa atividade esportiva.
66
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72
Apêndice 1: Dados gerais de identificação dos eqüinos do Grupo 1 (n=9).. Rio de
Janeiro, R.J. 2009
Animal
2
4
6
9
21
25
31
34
36
Idade
(anos)
6
8
8
15
5
10
5
6
9
Peso (kg)
sexo
400
440
436
480
420
415
395
370
400
F
F
F
M
F
F
F
F
M
73
Apêndice 2 : Dados gerais de identificação dos eqüinos do Grupo 2. Rio de Janeiro,
R.J. 2009
Animal
1
3
5
7
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
22
23
24
26
27
28
29
30
32
33
35
37
Idade
(anos)
6
9
6
6
6
8
6
8
9
9
5
4
3
8
9
3
8
9
22
9
13
8
17
7
5
9
8
9
Peso (kg)
sexo
440
410
440
436
420
415
461
410
440
440
450
400
410
440
436
420
420
415
470
450
480
390
435
430
415
413
395
395
F
F
F
F
F
F
F
M
F
F
M
F
M
M
F
F
M
M
M
M
M
M
M
F
F
F
M
M
74
Apêndice 3 –Avaliação física dos eqüinos do Grupo 2 (n=28) – Resultados de ausculta
pulmonar – Rio de Janeiro, RJ. 2009
Animal
Ausculta
1
Sadn
3
Sadn
5
Creptação grossa Crânio/Ventral
7
Leves Estertores bilaterais
8
Creptação grossa médio/dorsal
10
Creptação grossa Crânio/Ventral
11
Sibilo Caudo/Dorsal
12
Creptação grossa Crânio/Ventral
13
Creptação grossa Caudo/Ventral
14
Creptação grossa Caudo/Medial
15
Sadn
16
Creptação grossa Caudo/Dorsal
17
Creptação grossa Crânio/Ventral
18
Creptação grossa Caudo/Medial
19
Creptação grossa Caudo/Dorsal
20
Sadn
22
Creptação grossa Caudo/Dorsal
23
Sibilo crânio/Ventral
24
Creptação grossa Crânio/Ventral
26
Creptação grossa Caudo/Medial
27
Creptação grossa médio/dorsal
28
Sibilo Crânio/Ventral
29
Creptação grossa Crânio/Ventral
30
Sadn
32
Creptação grossa Caudo/Medial
33
Creptação grossa Caudo/Dorsal
35
Hiperfonese
37
Hipofonese de pulmão esquerdo
sadn-sem alterações dignas de nota.
75
Apêndice 4 – Avaliação endoscópica dos eqüinos do Grupo 1 (n=9).Rio de Janeiro. RJ
Animal
Secreção
Sangue
2
1
-
4
1
-
6
-
-
9
1
-
21
-
-
25
-
-
31
-
-
34
1
-
36
1
-
76
Apêndice 5– Avaliação endoscópica dos eqüinos do Grupo 2 (n=28).Rio de Janeiro. RJ.
Animal
Catarral
Sangue
1
1
1
3
-
3
5
1
-
7
2
-
8
-
2
10
1
-
11
1
-
12
-
-
13
-
-
14
1
-
15
2
1
16
1
-
17
-
-
18
2
-
19
-
-
20
-
1
22
-
3
23
2
1
24
-
1
26
2
-
27
-
3
28
2
-
29
2
-
30
2
-
32
1
-
33
-
-
35
2
1
37
-
1