PRECOCIDADE SEXUAL EM FÊMEAS DA RAÇA NELORE E POLIMORFISMO DE
NUCLEOTÍDEO ÚNICO (SNP) NO GENE RECEPTOR DA LEPTINA
André Vieira do Nascimento1; Bruno do Amaral Crispim2; Lara Endres da Silva3; Alexandre
Campos Banari3; Leonardo de Oliveira Seno4; Alexeia Barufatti Grisolia5
UFGD/FCBA- Caixa Postal 533, 79804-970- Dourados/MS, E-mail: [email protected]
1) Aluno do Curso Biotecnologia da UFGD, voluntário de iniciação científica PIVIC-UFGD 2011/12; 2)PósGraduanda em Biologia Geral/Bioprospecção UFGD-FCBA; 3) Alunos do Curso de Biotecnologia da UFGD,
Bolsista de Iniciação Científica PIBIC-UFGD 2011/12; 4)Professor da UFGD, Faculdade de Ciências Agrárias;
5)Professora da UFGD, Faculdade de Ciências Biológicas e Ambientais; e-mail: alexeiagrisolia.ufgd.edu.br
RESUMO
O polimorfismo T945M existente no éxon 20 na posição nucleotídica 115 promove substituição
do nucleotídeo C por T no gene receptor da leptina, alterando o aminoácido treonina por
metionina, como consequência, modifica a isoforma do receptor com porção citoplasmática longa
(LEPR-b), prejudicando a eficiência do receptor. O objetivo do estudo foi identificar e associar o
polimorfismo T945M com as características de peso corporal e idade ao primeiro parto (IPP) em
154 vacas comerciais da raça Nelore. O DNA genômico foi extraído de sangue periférico e
genotipado por meio de PCR-RFLP, com a endonuclease de restrição TaqI. As análises
estatísticas foram realizadas com auxílio dos softwares CERVUS e SAS. Fragmentos com 375pb,
400pb/375pb e 400pb foram observados, respectivamente para os genótipos C/C, C/T e T/T. As
frequências alélicas encontradas foram de 0,86 para C e 0,14 para T. Em relação às frequências
genotípicas foram observadas maior frequência para o C/C (0,727) em 112 animais quando
comparada ao genótipo C/T e T/T com frequências 0,266 (41 animais) e 0,007 (1 animal),
respectivamente. Dentre as características fenotípicas estudadas apenas IPP (idade ao primeiro
parto) não atendeu as pressuposições do modelo. Esta característica foi dicotomizada e avaliada
pelo teste não paramétrico de Kruskal-Wallis (p<0,05). As características de peso foram
submetidas à análise de variância. Para IPP não foi observada associação significativa (p>0,05)
com o polimorfismo. Também não foram observadas associações do marcador em estudo com as
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características de ganho de peso. Entretanto, efeito significativo (p<0,05) de ano e mês de
nascimento esteve relacionado com os pesos aos 120 (P120) e 365 (P365) dias. Esses resultados
sugerem que o SNP escolhido pode não estar envolvido diretamente com as características
produtivas e reprodutivas, mas essas podem estar associadas à outra mutação localizada na região
do gene do receptor da leptina ou próxima a ele.
Palavras-chave: Bos indicus, idade ao primeiro parto, PCR-RFLP
INTRODUÇÃO
O Brasil contém o maior rebanho bovino comercial do mundo, por esse motivo a pecuária
têm papel fundamental na economia do país. Porém, para que possa se firmar no cenário do
comércio mundial e atender ao mercado consumidor cada vez mais exigente é necessário o
desenvolvimento de tecnologias que possibilitem melhorar o aproveitamento dos rebanhos
(ABIEC, 2012).
Os aspectos reprodutivos interferem diretamente na lucratividade do rebanho na pecuária
de corte,. Devido a esse fato, pesquisas relacionadas à área de biotecnologia animal que
possibilitem desvendar tecnologias que permitam identificar no rebanho de fêmeas indivíduos
com maior eficiência reprodutiva são de grande interesse econômico (VACIUNAS, 2007).
As fêmeas zebuínas apresentam menor eficiência reprodutiva, com menor fertilidade e
puberdade tardia, quando comparadas às fêmeas das raças taurinas (LÔBO, 1998). Desta forma, a
busca pela precocidade sexual em zebuínos tem despertado grande interesse de pesquisadores
(VARGAS et al., 1998; MARTINEZ-VELAZQUEZ et al., 2003) e deve ser adotada como
critério de seleção de novilhas de corte (MARSON et al., 2008), considerando que a idade à
puberdade tardia é fator determinante das baixas taxas de sucesso fecundativo e, evidentemente,
da baixa eficiência do sistema de produção.
As técnicas de biologia molecular possibilitaram pesquisas detalhadas de genes
envolvidos com características quantitativas por meio do uso da seleção assistida por marcadores
moleculares (VECHETINI, 2007). Pesquisas vêm sendo realizadas com o intuito de proporcionar
que novilhas cada vez mais jovens alcancem a puberdade, passem para fase adulta otimizando a
produção (VACIUNAS, 2007).
Várias pesquisas têm demonstrado associação de hormônios relacionados com a
precocidade, dentre eles podemos destacar a leptina. A leptina, hormônio protéico, é um dos
sinalizadores bioquímicos responsáveis em informar o sistema nervoso de que as reservas
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energéticas são suficientes para o início da puberdade e vida reprodutiva (NEGRÃO & LICINIO,
2000). Apesar do mecanismo de sinalização ainda não estar totalmente esclarecido, sabe-se do
papel fundamental que este hormônio desempenha na passagem da fase da puberdade para a fase
reprodutiva dos animais (VACIUNAS, 2007).
Vários polimorfismos nos genes da leptina (LEP ou ob) e de seu receptor (LEPR)
indicaram associação com diferentes concentrações plasmática deste hormônio e características
de carcaça, produção de leite e eficiência alimentar em diferentes raças bovinas (FITZSIMMONS
et al., 1998; LIEFERS et al., 2002; LAGONIGRO et al., 2003; NKRUMAH et al., 2005).
Em bovinos, polimorfismos no gene LEP estão associados com ingestão alimentar,
crescimento, composição de carcaça, características do leite, intervalo entre partos, promovendo a
homeostase energética do animal (HOUSEKNECHT et al., 1998).
Os receptores de membrana deste hormônio desempenham função primordial para
desencadear estímulos celulares na presença do hormônio específico, caso estes receptores
apresentem alguma alteração, o indivíduo pode tornar-se resistente a leptina e consequentemente
comprometendo a função fisiológica do mesmo. Estudo de polimorfismos associados ao gene
receptor de leptina (LEPR) é de grande importância quanto se deseja estudar a expressão
hormonal, esse fato está relacionado à interação do sinalizador bioquímico com receptores
localizados nos tecidos alvos (KOMISAREK & DORYNEK, 2006). Portanto o gene LEPR pode
ser considerado candidato relevante para associação com características produtivas.
O gene do receptor da leptina, localizado no cromossomo 3, é composto por 20 éxons e
pode, por splicing alternativo, gerar seis isoformas diferentes no receptor de membrana, onde
todas apresentam a mesma porção extracelular, diferindo-se no tamanho da porção
citoplasmática, característica que confere maior ou menor efeito fisiológico da leptina
(TARTAGLIA, 1997).
O polimorfismo T945M ocasiona a substituição da base citosina por timina na posição
nucleotídica 115 no éxon 20, que resulta na substituição de aminoácido treonina por metionina na
posição 945. Essa modificação pode induzir a alteração estrutural na isoforma do receptor com
porção citoplasmática longa de LEPR, modificando assim, (LEPR-b). Essa alteração implica em
ineficiência na transdução do sinal químico por uma isoforma curta com capacidade transdutora
menor, comprometendo a função hormonal da leptina (LIEFERS et al., 2004).
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Sendo assim, o objetivo desta pesquisa foi verificar a ocorrência de polimorfismos no
gene receptor da leptina em fêmeas da raça Nelore do Mato Grosso do Sul e associar a
característica fenotípica de idade ao primeiro parto (IPP).
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo utilizou 154 fêmeas da raça Nelore provenientes de rebanho comercial
localizado no município de Iguatemi (MS). Oriundas de proles de 17 touros, nascidas entre o
período de 2005 e 2007. Os animais foram submetidos às seguintes pesagens: 120 dias (P120),
210 dias (P210), 365 dias (P365) e 450 dias (P450) e o ganho médio de peso diário de cada
animal foi calculado para cada animal. A característica reprodutiva de idade ao primeiro parto
(IPP) das novilhas também foi avaliada.
Para obtenção do DNA coletou-se de cada animal 4,5 mL de sangue periférico. As amostras
foram armazenadas em tubos do tipo Vacuntainer® com EDTA potássico à -20°C até o
processamento. A extração de DNA foi realizada a partir de 300 µL do sangue total utilizando a
metodologia adaptada de Sambrook et al. (1998).
O DNA extraído foi submetido à eletroforese (120V, 150 mA por 40 minutos) em gel de
agarose 2% corado com brometo de etídeo para a avaliação da qualidade do material genético
(Figura1).
1
2
3
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Figura 1. Amostras de DNA bovino visualizadas em gel de agarose 2% corado com brometo
de etídio.
A genotipagem gene LEPR (accession number AJ580801) foi realizada pela técnica de
PCR-RFLP utilizando os primers (Foward:5’-GCAACTACAGATGCTCTACTTTTGT-3’ e
Reverse:5’-CAGGGAAATTTCCCTCAAGTTTCAA-3’) de acordo com metodologia descrita
por Komisarek & Dorynek (2006), com algumas adaptações. O volume por reação de
amplificação foi de 25 μL contendo aproximadamente 50 ng de DNA genômico, 13 μL do Mix
de PCR (Fermentas), 1,5 μL de cada primer (10pmol/μL) e 7 μL de H2O livre de nucleases. As
reações consistiram de desnaturação inicial de 94ºC por 5 minutos, seguidos de 35 ciclos de 94ºC
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por 30 segundos, 56ºC por 30 segundos, 72ºC por 30 segundos e extensão final de 72ºC por 5
minutos. Em seguida, os produtos de PCR foram digeridos por quatro horas a 65ºC com 5
unidades da enzima de restrição TaqI (Fermentas) e posteriormente submetido a eletroforese em
gel de agarose 2% corado com brometo de etídeo para observação dos fragmentos digeridos. A
frequência genotípica e gênica do polimorfismo na população foi avaliada levando em
consideração o equilíbrio de Hardy – Weinberg por meio do programa CERVUS (MARSHALL
et al,1998).
Os dados estatísticos foram analisados com o auxílio do pacote computacional SAS (2000).
Os resultados foram submetidos ao teste de Shapiro-Wilk para verificar a normalidade dos
resíduos e de Bartlett para caracterizar a homogeneidade entre as variâncias. Entre as
características estudadas apenas IPP não atendeu as pressuposições do modelo matemático.
Assim sendo, esta característica foi dicotomizada (mediana = 26,6 meses) e avaliada pelo teste
não paramétrico de Kruskal-Wallis (p<0,05). As características de peso foram submetidas à
análise de variância.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A amplificação por PCR do gene LEPR resultou num fragmento com 400 pb (Figura 2).
Após a digestão com a TaqI, em indivíduos portadores do alelo C foi observado a digestão do
produto amplificado em dois fragmentos sendo um de 375 pb e outro 25 pb. A existência de
apenas alelo T no genótipo implica em ausência de corte enzimático permanecendo com 400 pb.
Diante do exposto foi possível então observar fragmentos com 375pb, 400pb/375pb e 400pb,
respectivamente para os genótipos C/C, C/T e T/T (Figura 3).
Ld
NO
1
2
3
4
5
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7
8
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10
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12
400pb
Figura 2. Eletroforese em gel de agarose 2% dos produtos de PCR do gene LEPR de DNA
bovino (fêmea). Ld: Marcador de peso molecular de100pb (Fermentas); NO: controle negativo;
1 a 12 produtos amplificados com fragmentos de 400pb.
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Ld
1
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400pb
375pb
Figura 3. Eletroforese em gel de agarose 2% dos produtos de PCR do gene LEPR de DNA
bovino (fêmea) clivado com enzima de restrição TaqI. Os indivíduos 1, 2, 3, 6, 8 e 9 foram
homozigotos CC, 4, 5, 7 e 10 foram heterozigotos CT e Ladder (Ld) de 100pb.
Na Tabela 1 foram apresentados os resultados referentes às análises genotípicas do grupo
populacional estudado, realizadas no programa CERVUS.
Tabela 1. Frequência alélica e genotípica, heterozigosidade observada e esperada, Equilíbrio
de Hardy-Weinberg (EHW) e Conteúdo de Informação Polimórfica (PIC) para o polimorfismo
na posição nucleotídica 115 do éxon 20 do gene receptor da leptina.
Freq. Alélica
Freq. Genotípica
Polimorfismo
Ho
He
EHW
PIC
C
T
CC
CT
TT
SNP 115
0,86
0,14
0,727
0,266
0,007
0.266
0.241
0.3095
0.211
As frequências alélicas encontradas foram de 0,86 para C e 0,14 para T, esses resultados
divergem de dados encontrados em bovinos da raça Holstein-Friesian por Komisarek & Dorynek
(2005) que obtiveram 8% para T e 92% para o C e de Liefers et al. (2004) com 4% e 96% . Tal
diferença entre as frequências alélicas observadas pode ser explicada pelo fato do presente estudo
ter sido realizado a genotipagem de bovinos da raça Nelore (origem zebuina) e as pesquisas
citadas na literatura terem utilizado bovinos da raça Holstein-Friesian (origem taurina).
Entretanto, quando os resultados do referido estudo foram comparados aos de Silva (2008)
realizados também com animais Nelore indicaram semelhança dos valores das frequências
alélicas que foram de 12% e 88% respectivamente para os alelos T e C.
Em relação às frequências genotípicas as maiores foram para o C/C (0,727) em 112 animais
quando comparada ao genótipo C/T com frequências de 0,266 (41 animais) e T/T 0,007 (1
animal), respectivamente. A população em estudo, se mostrou com baixa variabilidade de acordo
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com a heterozigosidade observada para o marcador utilizado, e o alelo C apresenta-se fixado em
praticamente todos os indivíduos. Assim a seleção artificial utilizada no rebanho pode estar
proporcionando a fixação desse alelo na população. Os valores de heterozigosidade observada e
esperada não divergiram significamente, já que a população se apresentou em equilíbrio de
Hardy-Weinberg, sendo que essa situação normalmente não ocorre em rebanho comercial,
sugerindo que o polimorfismo exista em poucos dos animais reprodutores, pois o alelo T se
mostra em frequência muito inferior comparado com o alelo C.
O conteúdo de informação polimórfica desta população (PIC= 0,211) demonstrou que o
marcador é pouco informativo, de acordo com
Botstein et al. (1980), que classifica os
marcadores com valores de PIC superiores a 0,5 são considerados muito informativos, com
valores entre 0,25 e 0,5 medianamente informativos e valores inferiores a 0,25 são considerados
pouco informativo.
Tabela 2. Médias para Idade ao Primeiro Parto (IPP) e Peso corporal (P120, P210, P365 e P450),
Coeficiente de Variabilidade (CV) e P valor.
Genótipo
Caract.
C/C
C/T
T/T
CV(%)
P valor
IPP
28,15
29,73
29,99*
14,33
0,22
P120
126,9
124,6
138
10,85
0,90
P210
181,8
179,9
200
9,95
0,99
P365
231,2
231,1
218
9,24
0,67
P450
269,4
296,6
-
7,86
0,66
* Único valor encontrado para o genótipo T/T.
Para a IPP os resultados não foram significativos (p>0,05) para associação com o
polimorfismo (Tabela 2), com base na proximidade entre as médias e o desvio padrão. De acordo
Houseknecht et al. (1998) a leptina foi associada a características reprodutivas, pois esse
hormônio necessita interagir com seus receptores específicos, os quais exercem influência na
efetividade do sinalizador e, consequentemente nessas características, o que não foi observado
neste estudo. Esse polimorfismo pode ter gerado uma isoforma que não interferiu na ação da
leptina, permitindo a sua funcionalidade, dessa forma não foi identificado associação entre esse
polimorfismo e característica reprodutiva.
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Também não foram observadas associações do marcador com todas as características de
ganho de peso. Entretanto, efeito significativo (p<0,05) de ano e mês de nascimento esteve
relacionado com os pesos aos 120 (P120) e 365 (P365) dias, assim ao contrariando a hipótese
inicial, de maneira que efeitos ambientais podem estar influenciando nestas características e não
nos genótipos.
CONCLUSÃO
Os resultados sugerem que o SNP escolhido pode não estar envolvido diretamente com as
características estudadas, mas essas podem estar associadas à outra mutação localizada na região
do gene do receptor da leptina ou próxima a ele. Perspectivas de pesquisas de outros
polimorfismos deverão ser exploradas em regiões codificadoras deste gene para a população.
AGRADECIMENTOS
A FUNDECT - Fundação de Apoio ao Desenvolvimento do Ensino, Ciência e Tecnologia
do Estado de Mato Grosso do Sul pelo apoio financeiro.
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