UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA
SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES
MOLECULARES EM SOJA PARA
RESISTÊNCIA AO FITONEMATÓIDE
Heterodera glycines RAÇA 3
SYBELLI MAGDA COELHO GONÇALVES ESPINDOLA
2004
1
SYBELLI MAGDA COELHO GONÇALVES
ESPINDOLA
SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES
MOLECULARES EM SOJA PARA
RESISTÊNCIA AO FITONEMATÓIDE
Heterodera glycines RAÇA 3
Dissertação apresentada à Universidade Federal
Uberlândia, como parte das exigências do Programa
Pós-Graduação em Agronomia – Mestrado, área
concentração em Fitotecnia, para obtenção do título
“Mestre”.
Orientador
Prof. Dr. Osvaldo Toshiyuki Hamawaki
UBERLÂNDIA
MINAS GERAIS – BRASIL
2004
2
de
de
de
de
SYBELLI MAGDA COELHO GONÇALVES
ESPINDOLA
SELEÇÃO ASSISTIDA POR MARCADORES
MOLECULARES EM SOJA PARA
RESISTÊNCIA AO FITONEMATÓIDE
Heterodera glycines RAÇA 3
Dissertação apresentada à Universidade Federal
Uberlândia, como parte das exigências do Programa
Pós-Graduação em Agronomia – Mestrado, área
concentração em Fitotecnia, para obtenção do título
“Mestre”.
Aprovada em 31 de março de 2004
Profa. Dra Maria Amelia dos Santos
UFU
Dr. Luís Fernando Alliprandini
Syngenta Seeds Ltda
Dra Maria Eugênia Lisei de Sá
Epamig
Prof. Dr. Osvaldo Toshiyuki Hamawaki
(Orientador)
UBERLÂNDIA
MINAS GERAIS – BRASIL
3
de
de
de
de
DEDICO
Ao meu marido
Luiz Harmed Salmen Espindola
Aos meus pais
Antônio Coelho da Silva (“In Memoriam”)
Julieta Gonçalves Rosa Coelho
Aos meus irmãos
Klébia Maria Coelho Gonçalves
e
Álvaro Alexandre Coelho Gonçalves
4
AGRADEÇO
Ao Dr. Luís Fernando Alliprandini pelos valiosos ensinamentos, pela
amizade, dedicação e presteza em me orientar, colaborando durante todas as
etapas de realização desse trabalho.
Ao professor Dr. Osvaldo Toshiyuki Hamawaki pela orientação na
confecção desse trabalho e pela confiança em mim depositada.
A professora Dra. Maria Amélia dos Santos pela disposição na coorientação desse trabalho, pelos seus ensinamentos e por estar sempre disposta
em ajudar.
A Dra Maria Eugênia Lisei de Sá pela grandiosa colaboração na
execução desse trabalho. Obrigada pela amizade, companheirismo, dedicação e
pelas palavras de amizade e estímulo.
Ao Instituto de Ciências Agrárias da Universidade Federal de
Uberlândia pela oportunidade de realização do curso de mestrado.
Ao CNPq pela concessão da bolsa de estudos.
A empresa Syngenta Seeds LTDA pela oportunidade de estágio, pela
colaboração no desenvolvendo desse trabalho e contribuição com todo o suporte
técnico e financeiro que se fizeram necessários.
A Ms. Cristhiane Abegg Bothona por conceder a oportunidade de
desenvolvimento
desse
trabalho
contando
com
sua
competência
e
disponibilidade. Obrigada pela amizade e incentivo. Sou muito grata por tudo.
As amigas do laboratório de Marcadores Moleculares da Syngenta
Seeds LTDA Kátia Bernardeli e Jéssika Monteiro Rocha pela amizade,
dedicação e pela disposição em ajudar em todos os momentos do
desenvolvimento desse trabalho.
A todos os amigos e funcionários da empresa Syngenta Seeds LTDA
que direta ou indiretamente contribuíram para o sucesso desse trabalho.
5
Principalmente ao Claudio Franco, Eliasário César dos Santos, Luciano e José
Baltasar de Sousa; obrigada pela atenção e pela disponibilidade de estarem
sempre ajudando nos momentos de necessidade. A colaboração de vocês foi de
grande importância.
Aos professores Dr. Heyder Diniz Silva e Dra. Denise Garcia Santana
pela colaboração na análise dos dados e pelo tempo dedicado.
A todos os professores, técnicos e funcionários administrativos, que
contribuíram para a minha formação, pelos ensinamentos e palavras de amizade
e estímulo.
A todos os colegas do curso de mestrado, em especial a Lílian A de
Oliveira pelo companheirismo; a Daniella A das Virgens, Maria Cecília Sarento
de Castro e Vitor Hugo B. Barbieri pelas horas e horas de estudos
compartilhadas, pela colaboração e apoio no desenvolvimento desse trabalho e
pelo companheirismo.
Aos amigos Décio Shigihara e Maurício Souza pela amizade e apoio
dedicados.
Ao meu marido Luiz Harmed Salmen Espindola por sua paciência,
encorajamento e amor.
A Deus que permitiu que eu encontrasse essas pessoas pelo meu
caminho.
6
SUMARIO
página
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..........................................................................5
2.1- A importância econômica e alimentar da soja..................................6
2.2 Doenças da soja..................................................................................6
2.3-O nematóide de cisto da soja (NCS)..................................................7
2.3.1-Histórico..........................................................................................8
2.3.2- Biologia e Ciclo de Vida................................................................8
2.3.3 Sintomas........................................................................................10
2.3.4-Dispersão e Controle.....................................................................12
2.4- Herança da resistência ao nematóide de cisto da soja.....................15
2.5 Uso de marcadores moleculares no melhoramento genético de
plantas.....................................................................................................17
3. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................23
3.1-Populações avaliadas........................................................................23
3.2-Localização e instalação do experimento.........................................23
3.3-Avaliação Genotípica.......................................................................24
3.4-Avaliação Fenotípica........................................................................24
3.4.1-Obtenção do inóculo......................................................................24
3.4.2-Inoculação.....................................................................................25
3.4.3-Avaliação.......................................................................................25
3.4.4-Herdabilidade................................................................................26
3.4.5-Ganho com a seleção.....................................................................26
3.4.6-Teste qui-quadrado........................................................................27
3.4.7-Análise estatística..........................................................................27
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................28
7
4.1-Variação Fenotípica..........................................................................28
4.2-Predição do fenótipo de resistência ao NCS, raça 3, com os
marcadores Satt-141 e Satt-168..............................................................34
5.CONCLUSÕES................................................................................................43
ANEXO A...........................................................................................................44
ANEXO B...........................................................................................................45
6. REFERÊNCIAS..............................................................................................46
8
RESUMO
Gonçalves-Espindola, Sybelli M. Coelho. Seleção assistida por marcadores
moleculares em soja para resistência ao fitonematóide Heterodera glycines
raça 3. UFU, 2004. (Dissertação-Mestrado em Agronomia)*
A ocorrência de doenças na cultura da soja é um dos principais fatores
que limitam a obtenção de altos rendimentos. O nematóide de cisto da soja
(NCS), Heterodera glycines,Ichinoe ocupa posição de destaque entre os vários
patógenos que reduzem a produção dessa cultura. Sendo esse fitonematóide de
difícil controle, a medida mais eficaz tem sido o uso de cultivares resistentes.
Para isso, o presente trabalho teve como objetivo identificar genótipos com
maior grau de resistência ao nematóide de cisto da soja, raça 3, e avaliar a
eficiência dos marcadores Sat-168 e Sat-141 associados a QTL (Quantitative
Trait Loci) de resistência a esse caráter. O ensaio foi conduzido em casa de
vegetação e o delineamento experimental foi de blocos casualizados com seis
repetições. As populações estudadas foram oriundas dos cruzamentos CD-201
(susceptível) e Foster IAC (resistente), Conquista (susceptível) e S83-30
(resistente), La-Suprema (susceptível) e S57-11 (resistente) e Parecis
(susceptível) e S65-50 (resistente). As plantas foram previamente genotipadas
para a resitência ao NCS com os marcadores microssatélites Sat-141 e Sat-168.
Essas populações foram inoculadas com 2154 ovos e juvenis e avaliadas com
base no índice de fêmeas(IF), sendo IF<10% classificadas como resistentes e
IF≥10%, susceptíveis. A eficiência ou precisão desses marcadores associados foi
obtida por meio de uma tabela de contingência, contrastando-se a avaliação
genotípica e fenotípica. Foram identificadas 2 linhagens resistentes na população
oriunda de CD-201 x Foster IAC; 25 na população resultante de S57-11 x La
Suprema; e 6 naquela proveniente de S65-50 x Parecis. Nenhuma linhagem
resistente foi observada na população derivada de Coquista x S8330.Considerando o valor preditivo positivo e a precisão apresentada pelos
microssatélites Sat-141 e Sat-168, na população derivada de S57-11 x La
Suprema, esses marcadores mostraram-se como uma ferramenta útil na seleção
para resistência ao NCS, raça 3.Na população derivada de CD-201 x Foster IAC
embora os marcadores tenham demonstrado baixa precisão, o alto valor
preditivo positivo garante um diagnóstico positivo seguro.
* Comitê Orientador: Osvaldo Toshiyuki Hamawaki- UFU; Maria Amelia dos
Santos- UFU; Luis Fernando Alliprandini- Syngenta Seeds Ltda e Maria
Eugênia Lisei de Sá- EPAMIG.
9
ABSTRACT
Gonçalves-Espindola, Sybelli M. Coelho. Marker-assisted selection for
soybean resistance to Heterodera glycines, race 3. UFU, 2004. (DissertationMaster Program in Agronomy)*
Disease occurrence in soybean is one of the main limiting factors for
high yield and the soybean cyst nematode (SCN), Heterodera glycines Ichinohe,
chairs among the different pathogens responsible for yield decrease. As the
nematode control is difficult the best way to overcome this proble is to develop
soybean resistant cultivars. The objective of this study was to identify resistant
genotypes and to evaluate the efficiency of marker assisted selection with Sat168 and Sat-141 associated to SCN, race 3, resistance QTL (Quantitative Trait
Loci) on identification of resistant genotypes. The experiment was carried out in
greenhouse and the experiental desing was in a randoized blocks with six
replications. Soybean populations were originated from CD-201 (susceptible)
and Foster IAC (resistant), Conquista (susceptible) and S83-30 (resistant), LaSuprema (susceptible) and S57-11 (resistant) and Parecis (susceptible) and S6550 (resistant). Plants were previously genotyped to SCN resistance by using the
microsatellite markers Sat-141 e Sat-168. The populations were inoculated with
2154 eggs and juveniles and evaluated according to the Female Index (F I), so
that only plants with FI<10% were classified as resistent. The arker selection
efficiency or precision was analysed by a contigency table considering the
genotypic versus phenotypic evaluation for each line. It was possible to identify
two resistant lines in the CD-201 x Foster population, 25 in S57-11 x La
Suprema and 6 in S65-50 x Parecis. No resistent line was observed in Conquista
x S83-30. Considering the positive predictive values and precision of the
icrosatellites Sat-141 and Sat-168, in the S57-11 x La Suprema population these
markers showed as an useful tool for selection of SCN, race 3.On population
CD-201 x Foster IAC the positive predictive value indicated a safe diagnostic, in
despite of its low precision
* Advisor Group: Osvaldo Toshiyuki Hamawaki- UFU; Maria Amelia dos
Santos- UFU; Luis Fernando Alliprandini- Syngenta Seeds Ltda and Maria
Eugênia Lisei de Sá- EPAMIG.
10
1-INTRODUÇÃO
A soja [Glycine Max (L) Merril] é uma planta milenar, sendo difícil
estabelecer sua origem e sua história. Há relatos de que essa leguminosa
já seria cultivada pelos chineses há cerca de cinco mil anos. Sua espécie
mais antiga, a soja selvagem, crescia principalmente nas terras baixas e
úmidas, junto aos juncos nas proximidades dos lagos e rios da China
Central. Há três mil anos a soja se espalhou pela Ásia, onde começou a
ser utilizada como alimento (BLACK, 2000; HAMAWAKI,et.al.,2002).
Na América foi citada pela primeira vez, nos Estados Unidos, no
início do século XIX, como promissora planta forrageira e produtora de
grãos, tendo iniciado a sua expansão naquele país, a partir de 1930. Essa
expansão em poucas décadas foi um dos mais impressionantes
fenômenos da história da agricultura norte-americana.
No Brasil, o grão chegou em 1882. Nesse ano, foram relatados os
resultados dos primeiros testes feitos com algumas variedades no Estado
da Bahia. A partir de então, diversos estudos foram feitos em diferentes
pontos do país.
Em 1941, essa leguminosa apareceu pela primeira vez nas
estatísticas oficiais do Rio Grande do Sul. Foi quando a soja começou a
ser cultivada em larga escala, sendo a suinocultura e a triticultura
elementos que contribuíram para a sua consolidação nesse estado. Os
suinocultores encontraram na soja a fonte de proteína que faltava para a
composição da ração, e os produtores de trigo, com a expansão dessa
cultura na década de 50, apoiada por ações governamentais, perceberam
–na como excelente alternativa para a realização de duas safras por ano
agrícola, por meio da alternância trigo/soja, o que maximizava a uso dos
ativos agrícolas permanentes.
11
O grão de soja dá origem a subprodutos dos quais os principais são o
farelo e o óleo. Outros, mais elaborados, são utilizados pela
agroindústria de alimentos e indústria química. A proteína de soja dá
origem a produtos comestíveis (ingredientes de padaria, massas,
produtos de carne, cereais, misturas preparadas, bebidas, alimentação
para bebês, confecções e alimentos dietéticos). Utilizada também pela
indústria de adesivos e nutrientes, alimentação animal, adubos,
formulador de espumas, fabricação de fibra, revestimento, papel,
emulsão para tintas e outras aplicações. Já a soja integral é utilizada pela
indústria de alimentos em geral, e o óleo bruto se transforma em óleo
refinado e lecitina, que dá origem a inúmeros outros produtos.
A boa adaptação da soja nas terras do Sul do país e a crescente
demanda dos mercados interno e externo deram estabilidade aos preços
do produto no mercado, o que incentivou o aumento de área. Em pouco
tempo, os cientistas não só criaram tecnologias específicas para as
condições de solo e clima do Cerrado, como conseguiram criar a
primeira cultivar para regiões tropicais brasileiras, que permitiu que a
soja produzisse no Cerrados, onde antes a planta não se desenvolvia
(Embrapa, 2003).
A criação de novas cultivares fez muito mais que desbravar as novas
fronteiras agrícolas do Brasil, até então consideradas improdutivas, levou
a soja a todas as regiões de clima tropical do mundo. A geração de
tecnologias contribuiu para que o Brasil aumentasse sua produção de
soja, passando a ocupar o segundo lugar entre os maiores produtores de
soja do mundo. Em 1975, a produção brasileira era em torno de 10
milhões de toneladas ao ano. Em 2001, o país já produzia cerca de 36
milhões de toneladas, sendo a região central do Brasil responsável por
50% dessa produção. Em 2003, o Brasil figura como o segundo produtor
12
mundial, responsável por 52, das 194 milhões de toneladas produzidas
em nível global ou 26,8% da safra mundial (EMBRAPA, 2003).
A soja teve rápida expansão no Brasil devido ao seu valor
econômico e graças ao seu desenvolvimento por meio de melhoramento
genético de novas cultivares mais adaptadas às condições do país. No
entanto, essa expansão da cultura foi acompanhada por problemas
fitossanitários em que vários patógenos disseminaram pelas regiões
produtoras (YORINORI, 2000).
No Brasil, cerca de 50 doenças já foram registradas na cultura as
quais são responsáveis por prejuízos anuais que chegam a 15-20% da
produção total do país. Algumas podem causar 100% de perdas
(Embrapa, 2002).
O nematóide de cisto da soja (NCS), Heterodera glycines Ichinohe,
foi detectado no Brasil na safra 1991/92 (LIMA, et. al.,1992) e tornou-se
imediatamente uma grande ameaça à sojicultura nacional.
Em áreas já infestadas, há necessidade de conviver com o problema,
e para reduzir as perdas existem algumas estratégias de controle, como
rotação de culturas, uso de variedades resistentes e manejo do solo
(MENDES, 1993).
O uso de variedades resistentes é um dos métodos mais eficientes e
econômicos para o controle do NCS. Todavia, pela grande variabilidade
existente nessa espécie de nematóide, o uso contínuo de uma mesma
variedade resistente exerce pressão de seleção, estimulando o
desenvolvimento de outras raças capazes de parasitar tal variedade
(Niblack,et. al., 1992). Tal fato é possível porque os genes para
resistência a uma determinada população não protegem contra outras
populações da mesma espécie (Dropkin, 1988). Dessa forma, torna-se
13
necessário a avaliação e desenvolvimento de novos germoplasmas como
fonte de resistência para o melhoramento da soja.
A evolução de biotecnologia tem sido de grande importância no
desenvolvimento de plantas resistentes a patógenos e pragas, buscando
disponibilizar, comercialmente, culturas de importância econômica que,
por apresentarem graves problemas fitossanitários comprometem sua
alta produção ou a sanidade do meio ambiente (utilização de
agrotóxicos). O isolamento de novos genes envolvidos na resistência a
patógenos e pragas, é um desafio que abre novas perspectivas na
obtenção de plantas resistentes.
Técnicas
de
marcadores
moleculares
tais
como,
RFLP,
microsatélites, RAPD e AFLP, são capazes de identificar loci de
resistência. Esses estudos permitiram a identificação de genes de
resistência em diferentes culturas. Para o melhorista, é de grande
importância o mapeamento genético de características quantitativas de
herança (QTLs), associadas à resistência horizontal, ou seja, poligênica,
que por sua vez possibilita a identificação de novos genes.
Dessa forma, espera-se, com esse trabalho, contribuir com os
programas de melhoramento de soja que visam a incorporação de genes
de resistência ao nematóide de cisto da soja. Para isso, o mesmo teve
como principais objetivos:
1-Identificar genótipos com maior grau de resistência ao nematóide
de cisto da soja.
2- Avaliar a eficiência dos marcadores Satt-168 e Satt-141 ligados a
QTL (Quantitative Trait Loci) de resistência ao nematóide de cisto da
soja, raça 3, para a identificação de genótipos resistentes nas populações
estudadas.
14
2-REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1- A importância econômica e alimentar da soja
A soja é uma cultura mundialmente importante tanto pelos valores
econômicos como nutricionais (Yue, et. al.,2001). Essa cultura tem apresentado,
nas últimas cinco décadas, uma taxa superior à taxa de crescimento
populacional, ocupando lugar de destaque na alimentação humana e animal, nos
cinco continentes. Atualmente é a mais importante oleaginosa cultivada no
mundo (BLACK, 2000).
Do total mundial de produção das principais oleaginosas (soja, algodão,
amendoim, colza, linho e palma) estimada em 280 milhões de toneladas, a soja
participa com cerca de 56%, ou seja, aproximadamente 157 milhões de
toneladas, sendo a leguminosa de maior expressão econômica no planeta com
teor de óleo compreendido entre 20 e 22% e apresentando alto teor de proteínas.
A expansão do cultivo da soja no Brasil foi possível pelo pioneirismo no
cultivo em regiões com latitudes inferiores a 20o (ROESSING; GUEDES, 1993).
Em 2003, o Brasil figurou como o segundo maior produtor mundial de soja,
responsável por 52 das 194 milhões de toneladas produzidas em nível global, ou
26,8% da safra mundial. Isso corresponde a 18 milhões de hectares plantados
produzindo em torno de 2764kg/ha. A cultura da soja é responsável pelo
arrecadamento anual de uma receita direta para o Brasil de mais de sete bilhões
de dólares e indiretamente de mais de 35 bilhões de dólares. (Embrapa, 2003).
2.2 Doenças da soja
A ocorrência de doenças na cultura da soja é um dos principais fatores
que limitam a obtenção de altos rendimentos. Isso, associado a outros fatores
como adaptabilidade a diferentes altitudes, solos e condições climáticas,
15
impedem que se alcance a exploração econômica do seu potencial máximo de
rendimento.
No Brasil já foram identificadas em torno de 50 doenças que ocorrem na
cultura da soja, causadas por fungos, bactérias, vírus e nematóides. Esse número
continua aumentando com a expansão da soja para novas áreas. Dessa forma,
algumas doenças, que ocorriam de forma mais amena em algumas regiões,
começam a aparecer trazendo grandes perdas. Assim, pode-se observar que a
importância econômica de cada doença varia de ano para ano, e de região para
região, dependendo da condição climática de cada safra (YORINORI 2002).
A expansão de áreas irrigadas para o cultivo da soja no outono/inverno
favorece a sobrevivência de inóculo de fungos e nematóide, causando maiores
perdas na safra seguinte. Além disso, a monocultura e a adoção de práticas de
manejo inadequadas têm favorecido o surgimento de novas doenças e agravando
as de menor importância.
De acordo com Yorinori (2002), o aumento da intensidade das doenças
aumenta também as perdas na produção da soja brasileira; tendo em 1994
causado prejuízos de US$1.269.485.000 e em 2000 o montante chegou a
US$1.388.047.000, sendo que desse total US$133.182.000 foram devido a
infestação do nematóide de cisto da soja.
2.3-O nematóide de cisto da soja (NCS)
Pelo seu grande potencial em causar prejuízos significativos e
comprometer o solo onde a soja é cultivada, o nematóide Heterodera glycines
Ichinohe 1952, conhecido como nematóide de cisto da soja (NCS) ocupa posição
de destaque entre os vários patógenos que reduzem a produção dessa cultura.
16
2.3.1-Histórico
O nematóide de cisto da soja foi relatado pela primeira vez no Japão em
1915, embora se acredite que seja originário da China. Com base na descrição de
sintomas e publicações anteriores, alguns autores sugerem que este nematóide já
ocorria na região centro-norte do Japão desde 1881, causando a doença
conhecida como “nanismo amarelo da soja” (soybean yellow dwarf) (Baldwin &
Mundo-Ocampo, 1991). Inicialmente, acreditava-se que a doença era causada
por uma raça de Heterodera schachtii capaz de atacar a soja, e somente em 1952
é que a espécie H. glycines foi descrita por Ichinohe. Depois, o nematóide foi
relatado na China, Coréia, Taiwan, parte da antiga União Soviética, Canadá,
Estados Unidos e Colômbia. Na América Latina, o nematóide de cisto da soja
foi encontrado pela primeira vez em 1983, ocorrendo em áreas de soja e feijão,
no Vale Del Cauca, na Colômbia (MENDES, 1993).
No Brasil, esse nematóide foi identificado na safra de 1991/1992, em
amostras de solo e de raízes de soja precedentes de Nova Ponte –MG, Campo
Verde-MT, e Chapadão do Céu –GO (LORDELLO ET. AL., 1992;
MONTEIRO; MORAIS, 1992; LIMA ET. AL., 1992).
A origem deste nematóide no Brasil é desconhecida. É possível que já
ocorresse no país, em plantas nativas localizadas em pequenos focos isolados, e
em baixo nível populacional. Somente após vários anos de cultivo intensivo da
soja os níveis populacionais elevaram, e foram capazes de causar sintomas
visíveis. É possível, também, que tenha sido introduzido no Brasil via semente
ou outro meio que veicule solo aderente, proveniente de países onde o problema
já ocorria há vários anos (MENDES, 1993).
2.3.2- Biologia e Ciclo de Vida
Pertencente à família Heteroderidae, o gênero Heterodera inclui
espécies que se caracterizam pela formação de cistos. O cisto é o corpo da fêmea
17
adulta morta, cheia de ovos, o qual, no final do ciclo de vida, torna-se um
envoltório protetor, de cor marrom, altamente resistente às condições adversas.
As espécies deste gênero constituem três grupos: schachtii, com 25 espécies
incluindo o H. glycines; goettingiana com 23 espécies, e avenae, com nove
espécies (BALDWIN; MUNDO-OCAM PO, 1991).
O nematóide H. glycines é uma espécie anfimítica, onde uma única
fêmea pode atrair mais de um macho e por eles ser fecundada. Durante seu ciclo
de vida, uma fêmea pode produzir de 200 a 600 ovos viáveis, dos quais alguns
podem ser ovipositados e mantidos envoltos por uma matriz gelatinosa até a
eclosão, enquanto os demais permanecem retidos no interior da fêmea madura
que se transformará em cisto (CARES; BALDWIN, 1995).
O ciclo de vida pode durar de 24 a 30 dias sob condições ótimas. Os
ovos depositados no solo eclodem rapidamente, proporcionando rápido
incremento na população através da ocorrência de três a seis ciclos do nematóide
em um mesmo ciclo de soja (SCHMITT; BARKER,1985), enquanto 50 a 90%
dos ovos retidos no cisto eclodem dentro de um ano. Alguns dos ovos podem
permanecer viáveis mais de oito anos, sob condições de elevada umidade e de
baixa temperatura (CARES; BALDWIN, 1995).
Os juvenis do NCS, na fase de juvenil de 2o estádio, eclodem dos ovos
no solo quando a temperatura e umidade forem adequadas, e somente eles são
capazes de infectar raízes da soja. Os juvenis eclodidos que não penetram nas
raízes do hospedeiro morrem por falta de alimento, por predação, ou pelo
parasitismo, dentro de alguns dias ou semanas. O máximo de eclosão ocorre com
a temperatura diurna de 26oC, e combinação com a noturna de 22oC, sendo mais
estimulada por plantas em fase pós floração do que por plantas no estádio
vegetativo. Exsudatos radiculares de plantas hospedeiras possivelmente
estimulam mais a eclosão de juvenis e podem estar também envolvidos na
atração e na penetração dos juvenis infectivos (SCHMITT; RIGGS,1991)
18
Os juvenis do segundo estádio, geralmente, penetram próximo da ponta
da raiz. Após penetrarem nas raízes da soja, os juvenis movem-se até
encontrarem o tecido vascular. Nessa fase, param de movimentar, perdem a
maioria dos músculos de seus corpos, e começam a se alimentar. Para se
alimentarem, os nematóides injetam as secreções que modificam algumas
células radiculares, transformado-as em locais de alimentação especializados
chamados sincícios. Enquanto os nematóides se alimentam, avolumam o corpo.
Os machos, após se libertarem da cutícula de quarto estádio, deixam a raiz em
busca de fêmeas maduras expostas na superfície da raiz (CARES;
BALDWIN,1995).
Após a fertilização, os machos morrem, mas as fêmeas permanecem
unidas às raízes e continuam a se alimentar. As fêmeas inchadas começam a
produzir ovos, e inicialmente depositam em uma massa gelatinosa fora do corpo,
sendo que dois terços dos ovos permanecem ainda,dentro de seus corpos.
Quando a cavidade inteira do corpo da fêmea adulta torna-se cheia de ovos, essa
morre tornando-se uma estrutura conhecida como cisto. Os cistos são
desalojados das raízes e se tornam livres no solo. As paredes do cisto tornam-se
muito resistentes e fornecem grande proteção para os ovos ali contidos. Os ovos
do NCS sobrevivem dentro do cisto até que as circunstâncias se tornem
apropriadas para os juvenis eclodirem. Embora muitos juvenis possam eclodir
no primeiro ano, alguns também sobreviverão dentro dos cistos por muitos anos.
2.3.3 Sintomas
Os sintomas dos danos do nematóide de cisto da soja podem ser
classificados em duas categorias: sintomas na parte aérea, e sintomas no sistema
radicular. Na parte aérea, os sintomas dos danos do NCS não são consistentes, e
pode haver ausência de sintomas por diversos anos após a introdução do
19
nematóide em uma lavoura. Os sintomas da parte aérea, quando presentes em
uma lavoura, formam reboleiras circulares ou oblongas que, após alguns anos,
podem ocupar toda a lavoura. Em geral, as plantas apresentam-se com nanismo,
folhas amareladas, e, às vezes com as margens necrosadas. Acontece também
perda prematura de folhas e floração reduzida com baixa produção de grãos
(CARES; BALDWIN, 1995).
Os estragos da parte aérea podem ser confundidos pelos danos devido à
compactação, a clorose por deficiência do ferro, a outras deficiências
nutricionais, ao stress hídrico, ao dano por herbicidas, ou a outras doenças da
planta. Freqüentemente, as perdas de produtividade devido ao NCS não são
percebidas durante anos, devido à ausência de sintomas na parte aérea, ou
porque os sintomas foram atribuídos a algum outro problema da produção da
soja. O primeiro sintoma óbvio da infestação do NCS aos campos de soja pode
ser a aparência de plantas bem menos vigorosas, amareladas e raquíticas.
Adicionalmente, as fileiras de soja em lavouras infestadas, freqüentemente,
demoram a fechar as entrelinhas. As plantas que crescem em solos altamente
infestados podem permanecer raquíticas durante toda a estação de crescimento.
Como mencionado anteriormente, os sintomas dos danos do NCS na
parte aérea não ocorrem sempre consistentemente, podendo variar de severos a
inexistentes. A intensidade dos sintomas é influenciada pela idade e pelo vigor
das plantas da soja, a densidade de população do nematóide nos horizontes do
solo, da fertilidade do solo e da umidade, e de outras circunstâncias ambientais.
Os danos do NCS geralmente são mais severos em solos arenosos, mas
ocorrerão prontamente em todos os tipos de solo. As perdas mais severas de soja
estão associadas a solos arenosos (KOENNING et. al., 1988; CARES;
BALDWIN, 1995)
20
As raízes infectadas com o nematóide são raquíticas. O NCS diminui
também o número de nódulos de fixação biológica do nitrogênio nas raízes, e a
infecção das raízes pelo NCS pode torna-las mais suscetíveis à infecção por
outros patógenos do solo; podendo também ocorrer aumento no número de
raízes secundárias (TODD; PEARSON, 1988; CARES; BALDWIN, 1995).
No campo, o único sinal diagnóstico na identificação da infecção do
NCS é a presença de fêmeas adultas expostas nas raízes da soja. As fêmeas
apresentam formato de limão e são brancas, inicialmente, mas variam em torno
do amarelo, chegando ao marrom quando de sua morte (cisto). Na maioria dos
anos, tal diagnóstico de campo pode ser executado começando quatro a seis
semanas após semeadura, e continua até o início da maturação da soja
(MENDES, 1993).
2.3.4-Dispersão e Controle
O cisto, por ser uma estrutura altamente resistente, se caracteriza como a
unidade de dispersão mais eficiente. Isso permite que o nematóide seja levado,
facilmente, de uma área para outra, a curtas ou longas distâncias por qualquer
método que envolva movimento de solo. Dessa forma, o nematóide de cisto
pode ser disseminado pelo vento, água da chuva ou irrigação, máquinas e
implementos agrícolas, homens, aves, animais domésticos e selvagens
(YORINORI, et al., 1994; MENDES, 1995, CARES; BALDWIN,1995, ).
As sementes constituem um importante meio de disseminação do
nematóide. Sementes de soja, ou outra espécie vegetal, provenientes de áreas
infestadas, podem conter torrões com cistos incrustados, e serem responsáveis
pela introdução do patógeno em áreas onde ele ainda não ocorre (RIGGS;
SCHMITT, 1989; MENDES, 1995).
Considerando os modos de disseminação do nematóide de cisto da soja,
se torna necessário algumas medidas de controle para evitar ou retardar a entrada
21
desse nematóide em áreas não infestadas. Um bom programa de controle
sanitário seria: limpeza de máquinas, implementos agrícolas, veículos, e até
mesmo sapatos, para eliminar o solo aderente, e também o uso de sementes
beneficiadas, para eliminar os torrões infestados. Essas são medidas que visam
prevenir a disseminação do nematóide (MENDES, 1993).
Quando o nematóide já foi introduzido, outras medidas de controle
devem entrar em ação, na tentativa de minimizar as perdas no sistema de
produção. A rotação de culturas é uma medida efetiva e prática para o controle
de H. glycines. Geralmente, o cultivo de plantas não hospedeiras como o milho,
sorgo, trigo, algodão, amendoim e várias outras culturas, pode reduzir a
população do patógeno em 70-90% (CARES; BALWIN, 1995). Este decréscimo
na população do nematóide permite que cultivares de soja susceptíveis sejam
cultivadas sem que haja perdas significativas na produção. No entanto, após um
ano de uso de cultivares susceptíveis, a população do nematóide terá aumentado,
exigindo que a seqüência de rotação de cultura com plantas não hospedeiras e
cultivares resistentes seja reiniciada (MENDES, 1993).
A eclosão de juvenis de H. glycines é lenta e gradual, o que exige
períodos longos de rotação, de no mínimo dois anos para o seu controle. O
plantio de espécies não hospedeiras e que estimulem a eclosão de juvenis pode
reduzir o tempo de sobrevivência dos ovos, permitindo que períodos de rotações
menores sejam praticados (SCHMITT; RIGGS, 1991). A rotação de culturas
com espécies de plantas que estimulam a eclosão de juvenis, permitindo a sua
penetração, mas limitando o seu desenvolvimento e reprodução, tem sido uma
das estratégias utilizadas no controle do nematóide de cisto da beterraba
açucareira (VALLE, et.al., 1997).
O manejo adequado do solo (níveis mais altos de matéria orgânica,
saturação de bases dentro do indicado para a região, parcelamento do potássio e
solos arenosos, adubação equilibrada, suplementação com micronutrientes e
22
ausência de camadas compactadas) ajuda a aumentar a tolerância da soja ao
nematóide (Embrapa, 2003).
O uso de cultivares resistentes é um dos métodos mais econômicos e
eficientes de controle do nematóide de cisto da soja. A resistência da soja ao H.
glycines é do tipo reação de hipersensibilidade, na qual os tecidos afetados
morrem e o nematóide não consegue completar seu desenvolvimento. Juvenis de
segundo estádio penetram os tecidos das raízes de cultivares resistentes tão
rapidamente quanto aquelas de cultivares susceptíveis. Contudo, nas resistentes,
poucos dias após a infecção, o sincício necrosa entra e colapso, e o nematóide
morre antes de atingir a fase adulta. Em seguida, há deposição de materiais da
parede secundária em volta dos tecidos necrosados da área doente (MENDES,
1993).
A resposta de hipersensibilidade (HR) é geralmente definida como uma
resposta rápida, induzida no vegetal onde ocorre morte celular, localizada na
área de infecção do patógeno avirulento. Desta maneira, acredita-se que a planta
impede a multiplicação do patógeno nas células infestadas, limitando e
interrompendo o processo da disseminação da infecção. Morfologicamente, a
resposta de hipersensibilidade é reconhecida como uma clorose localizada, que
aparece 24h após a infecção, progredindo para uma lesão necrótica. O
mecanismo da ativação da HR em plantas é comparável ao mecanismo da morte
celular programada nas células animais (Wang et al, 1996).
Plantando soja resistente no solo infestado, a reprodução do nematóide é
reduzida. A maioria dos juvenis será incapaz de alimentar-se e reproduzir-se nas
raízes de variedades resistentes, mas alguns nematóides sobreviverão e se
reproduzirão. Uma conseqüência direta da reprodução reduzida do nematóide na
planta resistente da soja é o rendimento melhorado. Embora as variedades
23
resistentes ao nematóide de cisto rendam significativamente melhor do que as
suscetíveis nas lavouras infestadas com o nematóide, as variedades resistentes
podem produzir ligeiramente menos do que as variedades suscetíveis em
lavouras não infestadas.
Visto que o uso continuado de cultivares resistentes pode induzir a
pressão de seleção e favorecer mudanças na freqüência gênica da população do
nematóide, levando ao surgimento de novas raças (RIGGS; SCHMITT, 1988;
MENDES, 1993; CARES; BALDWIN, 1995), sugere-se que os programas de
controle do nematóide de cisto da soja incluam além de espécies não hospedeiras
e cultivares resistentes, também cultivares susceptíveis de soja. Por isso os
programas de melhoramento da soja têm buscado a inserção, em seu
germoplasma, de genes de resistência ao nematóide de cisto da soja com a
intenção de associar plantas com boas características agronômicas à resistência a
essa doença.
2.4- Herança da resistência ao nematóide de cisto da soja
Muitas fontes de germoplasma resistentes têm sido usadas com sucesso
em programas de melhoramento da soja que visam a incorporação de genes de
resistência ao nematóide de cisto da soja. Contudo, a ocorrência de múltiplas
raças genotípicas no campo faz com que dificulte o controle do NCS, o que
resulta na necessidade das cultivares de soja carregarem uma ampla variedade de
genes de resistência.
Três genes recessivos de resistência, rhg1, rhg2 e rhg3 foram
identificados como controladores da resistência na cultivar Peking contra
populações encontradas no campo na Carolina do Norte, EUA (CALDWELL,
et. al., 1960). Um quarto gene designado como Rhg4 foi identificado em Peking
em 1965 (MATSON; WILLIANS, 1965). Contudo, Rao Arelli et. al (1992)
identificaram, na mesma cultivar, apenas três genes, dois recessivos e um
24
dominante (rhg1, rhg2 e Rhg4), condicionando resistência ao nematóide de cisto
da soja raça 3.
Análises com marcadores moleculares localizaram o gene rhg1 no grupo
de ligação G do mapa genético da soja (YUE, et. al.,2001;CREGAN, et. al.,
1999b; MUDGE et al.,1997; WEBB et al., 1995) e o gene Rhg4, no grupo de
ligação A2 (MATHEWS, et. al., 1998; WEISEMANN et. al., 1992)
Em trabalhos desenvolvidos por Webb et. al., (1995) e Cregan et. al.,
(1999b) foi relatado que nenhum dos alelos de resistência rhg1 ou Rhg4
promovem completa resistência. No entanto, o rhg1 é considerado o principal
gene, ou seja, a sua presença é necessária para a expressão da resistência
(MUDGE, et. al., 1997). Este se encontra presente em várias fontes de
resistência tais como: PI209332, PI88788, PI90763, PI437654 e Peking. Este
locus controla mais de 50% da variação total da resistência e o alelo resistente
tem efeito contra várias raças do nematóide (CONCIBIDO et. al., 1997;
MUDGE et. al., 1997). Concibido et. al. (1996) relataram que o QTL mapeado
no grupo de ligação G, em PI209332, é responsável por 35% da resistência a
raça 1, 50% de resistência à raça 3 e 54% de resistência à raça 6.
Diversos trabalhos têm objetivado o mapeamento de genes para
resistência ao nematóide de cisto da soja raça 3 (CONCIBIDO et. al., 1994;
WEBB et. al., 1995; CONCIBIDO, et. al., 1996a, 1996b; MATHEUS, et. al.,
1998; CREGAN et. al., 1999b; QIU, et. al., 1999). Contudo, pouco se sabe sobre
os loci de resistência para outras raças e a relação genética entre genes de
resistência para as diferentes raças.
Yue et. al. (2001), investigando a relação entre locus de resistência a
diferentes raças do NCS, mostraram que certos loci de resistência foram
ancorados a intervalos pouco comuns, sugerindo que algum desses genes pode
compartilhar resistência a diferentes raças.
25
2.5 Uso de marcadores moleculares no melhoramento genético de
plantas
O uso de variedades com desempenho superior e adaptadas aos
ambientes de cultivo é o grande responsável pelos ganhos na produção agrícola.
O melhoramento de plantas tem tido papel fundamental no desenvolvimento da
agricultura, gerando novas variedades portadoras de características de interesse
agronômico. O aumento na eficiência de seleção, o melhor conhecimento e
caracterização do germoplasma e a maximização dos ganhos genéticos têm sido
objetivos de melhoristas de plantas do mundo inteiro. Sendo assim, tem-se
buscado, constantemente, novas formas de alcançar estes objetivos.
Os
melhoristas
de
plantas
têm
tradicionalmente
selecionado
variabilidade com base no fenótipo (aparência de um indivíduo). Esta estratégia
tem sido de sucesso para características de alta herdabilidade, onde o fenótipo
reflete a constituição genética do indivíduo, mas nem sempre para características
de baixa herdabilidade (o fenótipo pode não refletir o genótipo). Estratégias
como teste de progênies e seleção em gerações avançadas têm sido utilizadas
para minimizar as dificuldades da seleção. Essas, contudo, não diminuem ou
evitam os efeitos da interação genótipo x ambiente, que podem mascarar o
fenótipo. Portanto, a expressão do genótipo (constituição genética de um
indivíduo) sob condições ambientais específicas pode mudar. Desta forma,
selecionar o fenótipo é como perseguir um alvo móvel, que muda com o
ambiente. Uma forma de evitar este problema seria selecionar indivíduos
superiores com base no genótipo, pois este independe do ambiente e não muda
durante o ciclo de vida de um indivíduo.
Assim, a utilização de marcadores moleculares torna-se bastante
promissora, não só para aumentar a eficiência na seleção de genótipos resistentes
a doenças, que são de natureza quantitativa, mas também para auxiliar na
escolha de genitores com maior grau de resistência, ou apresentando diferentes
26
genes de resistência, visando o acúmulo destes em seus descendentes. De acordo
com Meksem,et. al.,(1999), a variação contínua no fenótipo observado e muitas
características importantes para a agricultura são causadas pela segregação
independente de poligenes de pequeno efeito.
Diversos caracteres das espécies vegetais são controlados por genes
qualitativos. Mas a grande maioria de características herdáveis e de importância
econômica são de natureza quantitativa, ou seja, resultam da ação conjunta de
vários genes. O fenótipo resultante da expressão desses genes apresenta uma
distribuição contínua, ao invés de classes fenotípicas discretas. Os loci
associados ao controle genético desses caracteres são denominados QTL
(Quantitative Trait Loci - locos controladores de caracteres quantitativos). Os
estudos desses caracteres são feitos por meio de análises e inferências
estatísticas que procuram descrever as características de uma distribuição
fenotípica contínua para a identificação dos QTLs por marcadores moleculares,
os quais poderão fornecer informações mais precisas da arquitetura dos genes
que controlam caracteres quantitativos (MELO, 2000).
O mapeamento de QTLs baseia-se na associação entre os marcadores
moleculares e os dados fenotípicos, utilizando-se modelos genético-estatísticos.
As metodologias de mapeamento de QTLs têm permitido estimar o número e a
localização de genes que controlam a variação fenotípica de um caráter, a
magnitude de seus efeitos e as interações com outros QTLs. Isso permite uma
melhor compreensão dos caracteres quantitativos, além do monitoramento das
regiões genômicas onde estão posicionados os locos de interesse. Marcadores
moleculares ligados a esses QTLs têm sido usados na seleção de genótipos
(MAS_Marker assisted selection ou seleção assistida por marcadores
moleculares) com resistência a doenças.
O uso dos marcadores moleculares como uma ferramenta no
melhoramento de plantas marca um grande avanço no desenvolvimento de novas
27
cultivares com importantes características agronômicas e de difícil avaliação.
Marcadores moleculares podem ser empregados também na seleção de
características de interesse. Neste caso, é necessário primeiro identificar
marcadores associados a essas características através do mapeamento molecular
(MILACH, 1998c). Uma vez que esta informação esteja disponível, é possível
selecionar os indivíduos com o marcador de interesse, sem que haja necessidade
de avaliar o fenótipo dos mesmos. Essa técnica, também conhecida como
seleção assistida por marcadores moleculares (SAMM), pode ter grande impacto
nos casos em que a característica de interesse é de avaliação difícil e cara.
Os marcadores RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição) (BOTSTEIN, et. al.,
1980), baseiam-se na fragmentação do DNA com enzimas de restrição e
hibridização de sondas específicas a esses fragmentos. O polimorfismo advém
do fato de que diferentes indivíduos podem ter seu DNA cortado em diferentes
posições, gerando assim, fragmentos de diferentes tamanhos. Esses marcadores
comportam-se como co-dominantes, visto que ambos os alelos podem ser
visualizados em indivíduos heterozigotos (ABDELNOOR; ALMEIDA, 1999).
A técnica de PCR ( Polymerase Chain Reaction - Reacão em cadeia da
polimerase) (SAIKI et. al., 1985) baseia-se na amplificação de segmentos
específicos do DNA, utilizando-se de primers que flanqueiam o segmento a ser
amplificado. Esses primers hibridizam-se a seqüências complementares de
DNA, de tal forma que a amplificação ocorre na região compreendida entre os
primers.
O RAPD ( Random Amplified Polymorphic DNA - polimorfismo de
DNA amplificado ao acaso) (WILLIAMS, et. al., 1990) também é um marcador
baseado na técnica de PCR. Os marcadores RAPD são gerados pela
amplificação de segmentos espalhados no genoma com o uso de primers únicos
de seqüência arbitrária. Esses primers, com tamanho de aproximadamente 10
28
nucleotídeos, ligam-se a seqüências complementares no genoma, permitindo
que, assim, haja amplificação de segmentos compreendidos entre esses. Os
produtos de amplificação gerados podem ser separados por eletroforese em gel
de agarose ou poliacrilamida e corados com brometo de etídium ou prata. Os
marcadores RAPD são, geralmente, dominantes, com o polimorfismo verificado
pela presença ou ausência de um determinado fragmento.
Os marcadores AFLP ( Amplified Fragment Length Polymorphism_
polimorfismo de comprimento de fragmentos amplificados) (VOS, et. al., 1993)
são baseados na amplificação seletiva, pela técnica de PCR, de fragmentos de
DNA pré-digeridos com duas enzimas de restrição específicas, uma de corte raro
e outra de corte freqüente, no genoma. Em cada reação de amplificação são
gerados múltiplos fragmentos de DNA, distribuídos aleatoriamente no genoma.
Estes fragmentos gerados são visualizados em gel de poliacrilamida
desnaturante. O polimorfismo é verificado pela amplificação ou não de
determinado segmento do genoma, tratando-se, portanto, de um marcador do
tipo dominante, embora, em alguns casos seja possível identificar o heterozigoto
pela intensidade das bandas (ABDELNOOR; ALMEIDA, 1999).
Marcadores Microssatélites ou SSR ( Simple Sequence Repeat_
Seqüências simples repetidas) (TAUTZ, 1989) consistem numa classe de DNA
repetitivo formada por pequenas seqüências (2 a 5 nucleotídeos repetidas ao
acaso). A variação no número de repetições dessas seqüências gera uma grande
quantidade de polimorfismo, tornando-as bastante atraentes para estudos
genéticos (RONGWEN, et. al., 1995). Dentre os marcadores moleculares
disponíveis atualmente, os microssatélites constituem a classe com o mais alto
grau de polimorfismo. A técnica baseia-se no fato de que as seqüências de DNA
que flanqueiam os microssatélites são conservadas, permitindo a seleção de
primers específicos. Assim, esses primers são usados para amplificar as regiões
repetitivas por meio da reação em cadeia da polimerase gerando bandas que
29
podem variar de indivíduo para indivíduo. Esses polimorfismos são detectados
quando o produto da amplificação de um locus, em particular, difere em
comprimento do produto de um outro genótipo, devido a diferenças no número
de unidades repetidas existentes na região entre os primers, caracterizando o
comportamento
co-dominante
deste
marcador,
e
sendo
encontrados,
freqüentemente, casos de múltiplos alelos.
A utilidade dos microssatélites baseia-se em dois fatores principais:
possuem o mais elevado nível de informação de polimorfismo detectado, visto
que apresentam a expressão co-dominante, e são capazes de distinguir
indivíduos próximos que estejam segregando para poucas características
(POWELL, et. al., 1996).
Marcadores de DNA possuem um grande potencial no melhoramento
visando a resistência ao NCS. Para isso os microssatélites são os mais indicados,
pois são mais baratos e menos trabalhosos do que os RFLP. Além disso,
apresentam mais polimorfismo em soja do que os RFLP (MUDGE et. al., 1997).
O uso de marcadores moleculares é uma eficiente alternativa para a
avaliação genotípica da resistência ao NCS e permite uma seleção eficiente de
resistência poligênica a esse patógeno (SCHUSTER, et. al., 2001). Ainda,
podem ser usados na seleção indireta de caracteres de difícil avaliação e/ou que
são altamente afetadas pelo ambiente (SCHUSTER, et. al., 2001;YOUNG;
TANKSLEY, 1989;).
Em estudos com os marcadores microssatélites Satt-082, Satt-001 e Satt574, Schuster, et. al., (2001) mostraram que a seleção assistida por esses
marcadores foi mais eficiente na identificação de plantas resistentes e
susceptíveis do que o método convencional.
Poucos trabalhos têm sido desenvolvidos para a resistência às raças 1, 2
e 5 do nematóide de cisto da soja (YUE, et.al., 2001). Marcadores RFLP
associados aos grupos de ligação B (B1 ou B2), E, H e A2 foram encontrados
30
associados com a resistência à raça 1 do NCS (HEER, et. al., 1998; QIU, et. al.,
1999). Vierling et. al (1996) relataram que o marcador RFLP A006 foi associado
com um alelo de resistência que foi responsável por 91% do total da variação. O
mesmo marcador foi encontrado no grupo de ligação B1 associado com alelos
para resistência às raças 1, 2 e 5 do nematóide de cisto da soja, em população
resultante do cruzamento entre a cultivar “Hamilton” e a PI89772 (YUE, et.al.,
2001).
31
3-MATERIAL E MÉTODOS
3.1- Populações avaliadas
No presente estudo foram utilizadas quatro populações oriundas de
diferentes cruzamentos.
A primeira população foi denominada de 9024, sendo composta de 43
linhagens F5:6 provenientes do cruzamento CD-201 (susceptível) e Foster IAC
(resistente) contrastantes em relação à resistência ao NCS, raça 3.
A segunda foi denominada de 7103, sendo composta de 38 linhagens
F5:6 provenientes do cruzamento Conquista (susceptível) e S83-30 (resistente)
contrastantes em relação à resistência ao NCS, raça3.
A terceira população foi denominada de 7105, sendo composta de 60
linhagens F5:6 provenientes do cruzamento La-suprema (susceptível) e S57-11
(resistente) contrastantes em relação à resistência ao NCS, raça 3.
E, por último, a população denominada 7109, composta por 44
linhagens F5:6 provenientes do cruzamento Parecis (susceptível) e S65-50
(resistente) contrastantes em relação à resistência ao NCS, raça 3.
A fonte de resistência das linhagens S57-11 e S65-50 é oriunda da PI
88788 e a fonte da resistência da linhagem S83-30 e da cultivar Foster-IAC é
oriunda da cultivar ‘Peking’.
3.2-Localização e instalação do experimento
O experimento foi conduzido em condições de casa de vegetação na
Estação experimental da Syngenta Seeds Ltda, no período de 15/03/2003 a
28/04/2003.
O delineamento experimental foi o de blocos casualizados com seis
repetições, onde cada planta constituiu uma repetição.
32
Para todos os experimentos, as sementes das linhagens e variedades
(progenitores) foram semeadas em tubetes contendo substrato de solo e areia na
proporção de 1:2. Os tubetes foram mantidos em vasos plásticos de 6 L com
areia (5 tubetes/vaso) umedecida, diariamente, para o controle da temperatura.
3.3-Avaliação Genotípica
As populações utilizadas haviam sido anteriormente submetidas a
seleção assistida por marcadores moleculares, de acordo com os procedimentos
internos da Syngenta Seeds Ltda (confidencial). Foram utilizados os marcadores
microssatélites Sat-141 e Sat-168 para a identificação dos alelos de resistência e
classificação das linhagens como resistentes ou suscetíveis.
3.4 Avaliação Fenotípica
3.4.1-Obtenção do inóculo
O inóculo utilizado foi obtido de solo naturalmente infestado por
Heterodera glycines, raça 3, coletado na Fazenda Lhoman em Irai de Minas,
MG. Para a obtenção de ovos, coletou-se o solo, misturado com raízes. As raízes
foram separadas e colocadas sobre a peneira com malha de 0,85 mm ( 20 mesh),
acoplada sobre outra com malha de 0,15 mm ( 100 mesh), e lavadas sob jato de
água. As fêmeas retidas na peneira foram recolhidas com auxílio de jatos de
água de uma pisseta e então colocadas em uma peneira de 100 mesh, usada
exclusivamente para o esmagamento de cistos e fêmeas do nematóide. As
fêmeas foram esmagadas com o fundo de um tubo de ensaio para a liberação dos
ovos. Durante o esmagamento, foi adicionando água para que os ovos passassem
para a peneira de malha de 0,026 mm (500 mesh) acoplada abaixo da peneira de
esmagamento. Esses ovos retidos na peneira de 500 mesh foram recolhidos com
jatos de solução de sacarose (454 g/L de água) e a suspensão centrifugada a
33
2400 rpm, em centrífuga de mesa '
Excelsa Baby II’ modelo 206-R, durante 1
min. O sobrenadante foi vertido em peneira de 500 mesh e lavado, para retirar o
excesso de sacarose. Recolheram-se os ovos para um copo de Becker e a
suspensão calibrada com auxílio da câmara de Peters para conter 359 ovos/mL.
3.4.2-Inoculação
Realizou-se a inoculação 10 dias após o plantio, quando a plântula de
soja se encontrava com o primeiro trifólio já abrindo. Fez-se três furos com 1,5
cm de profundidade e 0,5 cm de diâmetro, eqüidistantes entre si. Em seguida,
foram depositados, com o auxílio de uma seringa sem agulha, 2mL da suspensão
de ovos em cada perfuração. Dessa forma, foram inoculados 2154 ovos/ tubete
ou planta.
3.4.3 Avaliação
A determinação do número de fêmeas presentes nas raízes foi realizada
33 dias após a inoculação. Para isso as plantas foram cuidadosamente arrancadas
dos tubetes e seu sistema radicular lavado, sob jato d’água, em peneira 20 mesh,
acoplada sobre a de 100 mesh. As fêmeas retidas na peneira de 100 mesh foram
então recolhidas com auxílio de jatos de água para copo de vidro americano
simples. Também foi recolhida uma amostra de 200 cm3 do solo de cada tubete.
Esse solo foi adicionado para um recipiente que recebeu 1 L de água. Realizouse o processo de destorroar o solo e promoveu-se mistura da suspensão,
deixando-a em repouso por 15 s. A suspensão foi vertida na peneira de 20 mesh
acoplada a uma de 100 mesh. Os cistos retidos na peneira de 100 mesh foram
recolhidos com jatos de água para um copo. As suspensões provenientes de raiz
e solo foram filtradas em papel de filtro demarcado e levado ao microscópio
estereoscópio, para a contagem de fêmeas (raiz) de cistos (solo). As reações das
34
linhagens foram determinadas com base no índice de fêmeas (IF), proposto por
Golden et al (1970):
IF =
Média de fêmeas desenvolvidas no genótipo
x 100
Média de fêmeas desenvolvidas no parental susceptível
Para cada linhagem foi calculado o índice de fêmeas. Quando esta
apresentava índice menor que 10%, a reação era considerada negativa, ou seja,
classificada como resistente. Para ser considerada susceptível deveria apresentar
índice maior que 10%.
3.4.4-Herdabilidade
Foram estimadas as herdabilidades no sentido amplo, para a seleção com
base nas médias dos tratamentos, utilizando as estimativas dos componentes de
variância, usando a fórmula representada abaixo:
h2= σg2
, onde σg2 = variância genética estimada e
σf2
σf2 = variância fenotípica estimada
e,
σf2 = (θn –1)2 ,
ou seja, variância das médias = variância fenotípica
σg2 foi operado por meio do programa SAS, calculando os componentes
de variância entre as progênies.
3.4.5-Ganho com a seleção
A partir da estimativa da herdabilidade chegoou-se ao ganho de seleção
usando a seguinte fórmula:
35
GS = h2 x Ds
Ds= diferencial de seleção
Ds = Ms - Mo
Mo = média original
Ms = média dos genótipos selecionados
DS% = GS x 100
Mo
3.4.6-Teste qui-quadrado
O teste qui-quadrado foi utilizado para verificar a significância dos
desvios. O valor de qui-quadrado foi estimado pela seguinte expressão:
χ2 =
(Fo-Fe)2 ,
onde Fo = freqüência observada
Fe
Fe =freqüência esperada
3.4.7-Análise estatística
Para análise estatística os dados foram transformados para (x + ½) e
submetidos à análise de variância pelo teste de F. As médias foram agrupadas
pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade.
36
4-RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1- Variação Fenotípica
Durante o desenvolvimento do experimento a temperatura mínima da
casa de vegetação manteve-se, em média, a 19,0oC e a máxima em torno de
32,2oC. A temperatura do solo, medida por um geotermômetro, variou entre
22,6oC e 31,8oC.
HILL E SCHMITH (1989) verificaram que o máximo de eclosão dos
ovos do nematóide de cisto ocorre com temperatura diurna de 26oC, em
combinação com a noturna de 22oC. O ciclo pode se prolongar à medida que a
temperatura cai, sendo o desenvolvimento do nematóide totalmente impedido
em condições de temperatura inferiores a 10oC e, também, a partir de 34oC
(WRATHER et al., 1984).
Desse modo, pode-se dizer que o experimento foi conduzido em boas
condições de temperaturas do solo e do ar que atingiram estágios críticos, a
ponto de interferirem no desenvolvimento normal da população de nematóide
inoculada.
A partir dos resultados da análise de variância, observou-se variabilidade
entre as linhagens e genitores, exceto na população 7103. Os coeficientes de
variação encontrados foram 40,84; 39,59; 51,34 e 49,98 para as populações
9024, 7103, 7105 e 7109, respectivamente (Tabela 1A).
Todas as populações se comportaram de forma diferenciada quanto à
classificação das linhagens em resistente (IF< 10%) e susceptível (IF ≥ 10%).
Na população 9024, apenas duas linhagens apresentaram reação de resistência
ao NCS, raça 3, que equivale a 4,65% do total (Tabela 1).
37
TABELA 1: Número médio de fêmeas (NMF), índice de fêmeas (IF%) e reação
dos genitores e linhagens de soja da população 9024. Uberlândia, 2003.
Linhagens/
Parentais
NMF
IF
(%)1 Reação2
9024-38
9024-87
0,00 a
0,50 a
0,0
5,8
9024-148
9024-90
1,67 a
4,60 a
19,2
53,1
9024-39
9024-110
5,00 a
5,20 a
57,7
60,0
9024-122
9024-107
5,60 a
6,00 a
64,6
69,2
9024-77
9024-155
7,00 a
7,33 a
80,8
84,6
9024-101
9024-137
8,20 a
8,67 a
94,6
100,0
9024-16
9024-73
9,00 a
9,00 a
103,8
103,8
9024-124
9024-183
9,17 a
9,17 a
105,8
105,8
9024-27
9024-161
9,20 a
9,25 a
106,2
106,7
9024-100
9024-123
10,00 a
10,00 a
115,4
115,4
9024-91
9024-196
10,17 a
10,80 a
117,3
124,6
9024-199
10,80 a
124,6
R
R
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1
Reação2
9024-44
9024-93
10,83 a
10,83 a
125,0
125,0
9024-152
9024-166
11,00 a
11,00 a
126,9
126,9
9024-187
9024-144
11,00 a
11,17 a
126,9
128,8
9024-81
9024-117
11,20 a
11,33 a
129,2
130,8
9024-2
9024-26
11,50 a
11,83 a
132,7
136,5
9024-167
9024-127
12,33 a
13,00 a
142,3
150,0
9024-129
9024-55
13,50 a
13,83 a
155,8
159,6
9024-59
9024-71
13,83 a
15,33 a
159,6
176,9
9024-94
9024-86
16,00 a
17,17 a
184,6
198,1
9024-164
9024-115
19,00 a
25,17 a
219,2
290,4
Foster IAC
CD-201
0,67 a
8,67 a
7,7
100,0
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
1 IF (%) = (NMF no genótipo/NMF no parental susceptível) x 100.
2 R: resistente, IF < 10%; S: suscetível, IF ≥ 10%.Médias seguidas de letras distintas
minúsculas na coluna diferem entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
A população 7103 não apresentou nenhuma linhagem resistente (Tabela
2). A população 7105 apresentou maior variação no número médio de fêmeas e
maior número de genótipos resistentes (Tabela 3). Nessa, foram detectados 26
genótipos resistentes, (41,93%) e, em alguns desses genótipos, não foi
encontrada nenhuma fêmea ou cisto.
38
TABELA 2: Número médio de fêmeas (NMF), índice de fêmeas (IF%) e reação
dos genitores e linhagens de soja da população 7103. Uberlândia, 2003.
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1
Reação2
7103-181
7103-109
7103-130
7103-9
7103-182
1,25 b
3,00 b
3,25 b
3,50 b
5,50 b
11,4
27,3
29,5
31,8
50
7103-53
7103-79
6,25 b
6,60 b
56,8
60
7103-70
7103-66
7103-152
7103-22
7103-15
7103-200
7103-85
7,33 b
7,50 b
7,80 b
8,33 b
8,50 b
8,67 b
8,80 b
66,7
68,2
70,9
75,8
77,3
78,8
80
7103-7
7103-174
7103-83
8,83 b
9,00 b
9,00 b
80,3
81,8
81,8
7103-107
7103-40
9,33 b
9,50 b
84,8
86,4
7103-57
9,60 b
87,3
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1
Reação2
7103-72
7103-176
7103-162
7103-35
7103-74
9,60 b
9,80 b
10,60 b
11,20 b
11,20 b
87,3
89,1
96,4
101,8
101,8
7103-169
7103-26
11,33 b
13,20 a
103
120
7103-113
7103-154
7103-98
7103-156
7103-172
7103-39
7103-167
13,33 a
13,67 a
13,67 a
13,83 a
16,50 a
16,50 a
16,60 a
121,2
124,2
124,2
125,8
150
150
150,9
7103-140
7103-166
7103-43
20,00 a
20,50 a
22,00 a
181,8
186,4
200
7103-179
S-8330
26,67 a
0,50 b
242,4
4,5
Conquista
11,00 b
100,0
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
R
S
1 IF (%) = (NMF no genótipo/ NMF no parental susceptível)
2 R: resistente, IF < 10%; S: suscetível, IF ≥ 10%.
x 100.
Médias seguidas de letras distintas minúsculas na coluna diferem entre si a 5%
de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
Na população 7109 foram observadas 6 linhagens resistentes ao NCS, ou
seja, 13,63% do total (Tabela 4). Embora conceitualmente este parental seja
classificado como susceptível (IF=10,2), sua reação pode ser vista como sendo
de resistência quando analisado do aspecto da proximidade do valor de corte
admitido e pela sua capacidade de gerar progênies com IF menores que seu
valor.
39
TABELA 3: Número médio de fêmeas (NMF), índice de fêmeas (IF%) e reação
dos progenitores e linhagens de soja da população 7105. Uberlândia, 2003.
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1
Reação2
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1 Reação2
7105-105
7105-120
7105-167
7105-51
0b
0b
0b
0b
0
0
0
0
R
R
R
R
7105-23
7105-158
7105-188
7105-106
3,5 a
3,6 b
4,2 b
5,5 a
15,2
15,7
18,3
23,9
S
S
S
S
7105-173
7105-155
7105-26
7105-94
7105-161
0,33 b
0,5 b
0,5 b
0,5 b
0,6 b
1,4
2,2
2,2
2,2
2,6
R
R
R
R
R
7105-144
7105-135
7105-166
7105-31
7105-175
5,5 b
6,0 a
6,0 a
6,0 a
6,5 a
23,9
26,1
26,1
26,1
28,3
S
S
S
S
S
7105-34
7105-151
0,6 b
0,75 b
2,6
3,3
R
R
7105-164
7105-152
6,8 a
7,0 a
29,6
30,4
S
S
7105-41
7105-103
0,75 b
1b
3,3
4,3
R
R
7105-95
7105-148
7,0 a
7,17 a
30,4
31,2
S
S
7105-70
7105-130
7105-126
7105-30
7105-8
7105-75
7105-154
7105-146
7105-184
7105-98
7105-185
1,17 b
1,2 b
1,25 b
1,4 b
1,5 b
1,67 b
1,8 b
2b
2b
2b
2,2 b
5,1
5,2
5,4
6,1
6,5
7,2
7,8
8,7
8,7
8,7
9,6
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
R
7105-24
7105-13
7105-142
7105-53
7105-48
7105-197
7105-49
7105-4
7105-77
7105-156
7105-32
8,0 a
8,5 a
8,75 a
8,8 a
9,0 a
9,5 a
9,5 a
10,0 a
10,0 a
10,83 a
11,5 a
34,8
37
38
38,3
39,1
41,3
41,3
43,5
43,5
47,1
50
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
7105-99
7105-11
7105-36
7105-56
7105-176
2,2 b
2,33 b
2,5 b
2,5 b
3,25 b
9,6
10,1
10,9
10,9
14,1
R
S
S
S
S
7105-122
7105-35
7105-58
7105-50
7105-14
11,67 a
11,8 a
12,0 a
16 a
16,75 a
50,7
51,3
52,2
69,6
72,8
S
S
S
S
S
7105-108
7105-170
3,4 b
3,5 b
14,8
15,2
S
S
S-5711
La Suprema
1 IF
0,33 b
23 a
1,4 R
100,0 S
(%) = (NMF no genótipo/NMF no parental susceptível) x 100.
resistente, IF < 10%; S: suscetível, IF ≥ 10%.
Médias seguidas de letras distintas minúsculas na coluna diferem entre si a 5%
de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
2 R:
40
TABELA 4: Número médio de fêmeas (NMF), índice de fêmeas (IF%) e reação
dos progenitores e linhagens de soja da população 7109. Uberlândia, 2003.
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1
Reação2
Linhagens/
Parentais
NMF
IF (%)1
Reação2
7109-199
7109-80
0,2 c
0,5 c
2
5,1
R
R
7109-94
7109-167
5,2 c
5,4 c
53,1
55,1
S
S
7109-83
7109-92
7109-163
7109-30
7109-87
7109-120
7109-141
7109-194
7109-119
7109-173
7109-28
0,5 c
0,6 c
0,75 c
0,8 c
1,33 c
1,5 c
1,5 c
1,5 c
1,6 c
1,8 c
1,8 c
5,1
6,1
7,7
8,2
13,6
15,3
15,3
15,3
16,3
18,4
18,4
R
R
R
R
S
S
S
S
S
S
S
7109-23
7109-70
7109-162
7109-38
7109-77
7109-174
7109-139
7109-99
7109-97
7109-125
7109-110
6c
6,8 c
7,17 c
8,17 c
8,25 c
8,5 c
8,6 c
8,6 c
10,4 b
10,5 b
10,75 b
61,2
69,4
73,1
83,3
84,2
86,7
87,8
87,8
106,1
107,1
109,7
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
S
7109-85
7109-56
1,8 c
2c
18,4
20,4
S
S
7109-172
7109-123
12,33 b
13,33 b
125,9
136,1
S
S
7109-8
7109-164
7109-74
2c
2,33 c
2,33 c
20,4
23,8
23,8
S
S
S
7109-115
7109-79
7109-192
13,8 b
17,33 a
20,5 a
140,8
176,9
209,2
S
S
S
7109-14
7109-128
2,83 c
3,5 c
28,9
35,7
S
S
7109-184
7109-121
21,17 a
22,33 a
216
227,9
S
S
7109-33
7109-42
3,5 c
4,17 c
35,7
42,5
S
S
7109-101
S-6550
24,5 a
1c
250
10,2
S
R*
7109-78
4,4 c
44,9
S
Parecis
9,8 b
100,0
S
1 IF (%) = (NMF no genótipo/NMF no parental susceptível)
2 R: resistente, IF < 10%; S: suscetível, IF ≥ 10%.
x 100.
Médias seguidas de letras distintas minúsculas na coluna diferem entre si a 5%
de probabilidade pelo teste de Scott-Knott.
*Genitor considerado como resistente.
A estimativa da herdabilidade é um parâmetro de grande utilidade em
programas de melhoramento. Ela permite antever a possibilidade de sucesso
com a seleção, refletindo a proporção da variação fenotípica como indicador do
fator reprodutivo (RAMALHO et al., 2000). Tal parâmetro foi estimado para as
populações 9024, 7103, 7105 e 7109 apresentando, respectivamente, 46%, 28%,
41
66% e 77% de herdabilidade para a característica resistência ao nematóide de
cisto da soja, raça 3 (Tabela 1A e 2A). Esses valores indicam a proporção da
variação do número de fêmeas, que é de natureza genética. Dessa forma, pode-se
observar que as populações 7105 e 7109 sofreram menor influência de fatores
ambientais quando comparadas com as outras duas populações.
SHUSTER et al. (2001), trabalhando com uma população de soja
oriunda do cruzamento entre a cultivar resistente ‘Hartwig’ e a linhagem
susceptível BR-92-31983, para resistência ao NCS, raça 14, estimaram uma
herdabilidade de 70,2%. Essas estimativas, como calculadas no presente estudo,
consideram todos os loci envolvidos com a resistência. Para obter essas
estimativas é necessário avaliar famílias com várias repetições.
MANSUR et al. (1993) encontraram valores altos de herdabilidade para
a resistência ao NCS, raça 3, usando análise das médias das gerações. O mesmo
resultado foi encontrado por WEBB et al. (1995), baseando nos componentes de
variância, para estimar a resistência ao nematóide de cisto da soja.
Dessa forma, pode-se dizer que nas populações 7105 e 7109 o fenótipo
representou bem o genótipo, sendo possível aplicar uma seleção fenotípica. Na
população 9024 e também na 7103 essa representação foi pouco precisa. Nas
quatro populações o ganho de seleção estimado foi de 31,31%; 0,0%, 25,06% e
41,47%, respectivamente (Tabela 1A).
As populações 7105 e 7109 destacaram-se por apresentarem melhores
perspectivas dentro de um programa de melhoramento, pelo fato de
apresentarem
maiores
variabilidades
genéticas
e
maiores
valores
de
herdabilidade para a característica em questão, especialmente a população 7109,
na qual obteve-se maior ganho de seleção estimado.
42
4.2 Predição do fenótipo de resistência ao NCS, raça 3, com os
marcadores Sat-141 e Sat-168
O melhoramento para a resistência ao nematóide de cisto da soja traz
consigo algumas complicações, quando baseado somente na análise fenotípica
do caráter em questão. Linhagens em gerações iniciais, selecionadas por meio da
análise fenotípica apenas, provavelmente, irão segregar nas gerações seguintes
para o devido locus heterozigoto. Por isso, a seleção baseada em ambos,
fenótipo e genótipo (seleção assistida por marcadores moleculares), é requisitada
para assegurar a resistência estável.
As populações analisadas fenotipicamente foram genotipadas para a
resistência ao NCS, raça 3, utilizando-se os marcadores microssatélites Sat-168 e
Sat-141. Esse último flanqueia o principal locus de resistência, o rhg1, e está
localizado a uma distância de 1,5 cM deste, no grupo de ligação molecular G da
soja, desenvolvido por CREGAN et al. (1999b). O Sat-168 situa-se a 0,4 cM do
locus rhg1 e está localizado no grupo de ligação B.
A eficiência ou precisão desses marcadores associados em distinguir
linhagens resistentes e susceptíveis ao nematóide de cisto, raça 3, foi analisada
nas quatro populações em estudo. Isso foi feito por meio de uma tabela de
contingência do genótipo analisado por microssatélites versus o fenótipo
analisado em casa de vegetação. Para auxiliar na interpretação desses dados,
alguns parâmetros foram avaliados, tais como a sensibilidade, a especificidade, o
valor preditivo positivo, o valor preditivo negativo e a eficiência ou precisão dos
marcadores (Tabela. 5).
43
TABELA 5: Parâmetros determinados na avaliação da performance dos
marcadores Satt-141 e Satt-168 nas populações 9024, 7103, 7105 e 7109
Termos
Descrição
Diagnóstico positivo
Indica presença do alelo de resistência
Diagnóstico negativo
Indica ausência do alelo de resistência
Sensibilidade
Proporção dos diagnósticos positivos
corretos (verdadeiros positivos) no
total de casos positivos
Proporção de diagnósticos negativos
corretos (verdadeiros negativos) no
total de casos negativos
Proporção dos diagnósticos positivos
corretos no total de diagnósticos
(fenotípico) positivos.
Proporção dos diagnósticos negativos
corretos no total de diagnósticos
(fenotípico) negativos.
Proporção dos diagnósticos corretos
(positivos e negativos) no total de
diagnósticos.
Especificidade
Valor Preditivo Positivo
Valor Preditivo Negativo
Precisão ou Exatidão
Adaptado de Vieira, 2003
Para a população 9024, os marcadores microssatélites apresentaram,
juntos, uma precisão de 45% (18/40) (Tabela 6). Em contra partida, mostrou alta
especificidade de 100% (17/ 17) (Tabela 6 e 7). Em outras palavras, não
apresentou nenhum resultado falso negativo. A alta especificidade garante que o
marcador se liga apenas ao locus de resistência quando ele está presente. Dessa
forma, pode-se dizer que na população 9024 os microssatélites Sat-168 e Sat141 possuem a probabilidade de 100% de não detectar o locus de resistência ao
NCS, raça 3, quando ele não está presente. Nessa população, por apresentar alta
44
especificidade e baixa sensibilidade de 4,35% (1/23) e ainda, não ter apresentado
nenhum resultado falso negativo, esses marcadores são mais eficientes em
diagnosticar a ausência do locus de resistência. Embora a probabilidade dos
marcadores estarem ligados ao locus de resistência seja muito pequena (4,35%),
quando isso ocorre, a probabilidade de que seja um diagnóstico errado é nula,
pois seu valor preditivo positivo é de 100% (1/1).
TABELA 6: Tabela de contingência comparando a análise fenotípica para
resistência ao NCS, raça 3, e a análise genotípica com os marcadores Sat-141 e
Sat-168 para a população 9024. Uberlândia, 2003.
Sat-141 e Sat-168
Não Possui gene
Possui gene
Casa de
Total
Resistência
Resistência
Vegetação
17
22
39
Susceptível
00
01
01
Resistente
17
23
40
Total
2
χ =0,02
P<0,05
Modelo: 9:7
Para a população 9024, pelo teste de χ2, aceitou-se a hipótese de que os
marcadores segregam de acordo com o modelo de epistasia recessiva dupla (9:7)
(Tabela 6), pela recombinação entre dois genes independentes com dois alelos
cada. Dessa forma, a resistência somente ocorre quando existe a participação
conjunta nos dois locos. No caso de susceptibilidade, os indivíduos possuem
ausência completa dos alelos dominantes ou apenas um alelo dominante em um
dos loci.
Para a população 7103 aceitou-se a hipótese, pelo teste de χ2, de
segregação 3:1 (Tabela 8). Essa proporção é característica do modelo
dominância completa entre os alelos. Nesse caso, o homozigoto dominante e
45
heterozigoto apresentam o mesmo fenótipo, ou seja, resistente. Os indivíduos
susceptíveis possuem o genótipo homozigoto recessivo.
A população 7105, também se adequou ao modelo de dominância
completa (Tabela 9), porém ao contrário da 7103, a característica de resistência
foi recessiva.
Para a população 7109 (Tabela 10) foram aceitas tanto a hipótese de
dominância completa (3:1), como a de epistasia recessiva dupla (9:7), com
dominância para o caráter de resistência.
TABELA 07: Resumo dos parâmetros admitidos pelos marcadores Sat-141 e
Sat-168 nas populações 9024, 7103, 7105 e 7109. Uberlândia, 2003.
Populações
Parâmetros
Sensibilidade (%)
Especificidade (%)
Valor Preditivo positivo (%)
Valor Preditivo negativo (%)
Exatidão (%)
9024
7103
7105
7109
4,3
100,0
100,0
43,5
45,0
0,0
100,0
0,0
27,0
27,0
76,4
73,8
54,1
88,5
74,5
11,1
84,6
60,0
31,4
32,0
Para a população 7103 os marcadores Sat-141 e Sat-168 apresentaram
precisão de 27,03% (10+0/37) (Tabela 8). Embora tenha sido observada uma
alta especificidade de 100% (10/10), a sensibilidade foi nula (0/27). Dessa
forma, nessa população, a probabilidade dos marcadores não identificarem o
locus de resistência quando ele não está presente é de 100%, ou seja, não ocorre
diagnóstico falso-negativo. Porém, a probabilidade de ocorrer o contrário é de
0%, que é a sensibilidade dos marcadores.
Os valores preditivos indicam se os marcadores estão, de fato, fazendo o
diagnóstico correto , ou seja, se positivo, indica a presença do locus de
46
resistência, se negativo, indica ausência. Um valor preditivo alto significa alta
probabilidade de acerto e vice-versa (VIEIRA, 2003). O valor preditivo do
marcador de DNA depende da ligação com o gene de resistência e da expressão
fenotípica do gene em seus genitores além do ambiente (PRABHU, et al., 1999).
TABELA 8: Tabela de contingência comparando a análise fenotípica para
resistência ao NCS, raça 3, e a genotípica com os marcadores Sat-141 e Sat-168
para a população 7103. Uberlândia, 2003.
Sat-141 e Sat-168
Não Possui gene
Possui gene
Casa de
Total
Resistência
Resistência
Vegetação
10
27
37
Susceptível
00
00
00
Resistente
10
27
37
Total
χ2=1,29
P<0,05
Modelo: 3:1
Ao contrário da população 9024, a 7103 apresentou valores preditivos
positivo e negativo baixos de 0% e 27%, respectivamente. Isso indica uma alta
taxa de diagnósticos falso–positivos, o que não proporciona confiabilidade no
diagnóstico feito por esses marcadores, nessa população.
Um dos principais inconvenientes na seleção assistida por marcadores
moleculares acontece quando o marcador usado para a seleção está distante do
gene de interesse, levando a ocorrência de “crossing-over” entre o marcador e o
gene. Isso resulta em uma alta porcentagem de diagnósticos falso-positivos e/ou
falso-negativos (MOHAN et al., 1997).
Os marcadores Sat-141 e Sat-168 apresentaram uma precisão de 74,58%
(31+13/59) em distinguir os fenótipos resistentes e susceptíveis ao NCS, raça 3,
na população 7105 (Tabela 9). Para essa mesma população, apresentaram, ainda,
47
um alto valor preditivo negativo de 88,57% (31/35) (Tabela 7). Dessa forma,
pode-se dizer que a probabilidade de se ter um diagnóstico positivo correto
(valor preditivo positivo= 54,17%) é menor do que a de dar um diagnóstico
negativo correto (88,57%). Foram observadas altas taxas de sensibilidade e
especificidade, 76,47% e 73,81%, respectivamente. Isso refletiu em um número
menor de diagnósticos falso- positivos. Apresentando uma precisão de 74,58% e
ainda um valor preditivo negativo de 88,57%, os microssatélites utilizados
apresentaram boa performance nessa população. Dessa forma, tem-se uma maior
confiabilidade na seleção das linhagens, ou seja, ao selecionar plantas
susceptíveis, a chance de sucesso é maior (88,57%) do que ao selecionar plantas
resistentes (54,17%).
TABELA 9: Tabela de contingência comparando a análise fenotípica para
resistência ao NCS, raça 3, e a análise genotípica com os marcadores Sat-141 e
Sat-168 para a população 7105. Uberlândia, 2003.
Sat-141 e Sat-168
Não Possui gene
Possui gene
Casa de Vegetação
Total
Resistência
Resistência
31
04
35
Susceptível
11
13
24
Resistente
42
17
59
Total
χ2=0,35
P<0,05
Modelo: 3:1
Para a população 7109, os microssatélites Sat-141 e Sat-168
apresentaram uma precisão de apenas 32,5% (14/40) (Tabela 7 e10). Além disso,
a sensibilidade foi de apenas 11,11% (3/27), o que refletiu em um alto índice de
resultados falso-positivos (24). Em contra partida, obteve-se uma especificidade
de 84,61% (11/13), ou seja, não indicou presença do alelo de resistência quando
48
este não estava presente. Essa alta especificidade trouxe, como conseqüência, a
baixa ocorrência de diagnóstico falso-negativo. O valor preditivo positivo (3/5)
indicou que houve 60%(3/5) de probabilidade de acerto nos diagnósticos
positivos.
TABELA 10: Tabela de contingência comparando a análise fenotípica para
resistência ao NCS, raça 3, e a análise genotípica com os marcadores Satt-141 e
Satt-168 para a população 7109. Uberlândia, 2003.
Sat-141 e Sat-168
Não Possui gene
Possui gene
Casa de
Total
Resistência
Resistência
Vegetação
11
24
35
Susceptível
02
03
05
Resistente
13
27
40
Total
χ2=0,14
P<0,05
Modelo: 3:1
9:7
Seleções com marcadores moleculares associados podem permitir
seleção de segmentos genômicos com alta probabilidade de carregar o alelo de
resistência rhg1, mas também poderiam acarretar uma quantia significativa de
arraste de ligação (linkage drag). Esse é um lado negativo das cultivares
resistentes, onde na maioria das vezes, os genes de resistência estão ligados a
genes que conferem características agronômicas indesejáveis, como a baixa
produtividade e coloração atípica do tegumento (CARES & BALDWIN, 1995)
A utilização de um locus apenas poderia selecionar, pelo menos, algum genótipo
susceptível (falso-positivo) como resultado de recombinação entre o
microssatélite e o alelo de resistência (CREGAN, 1999b).
49
locus
Uma possível solução para a não ocorrência de diagnóstico falsopositivo seria o uso de marcadores mais próximos do locus de resistência. Por
isso, nesse trabalho, foram utilizados dois marcadores que flanqueiam o alelo
rhg1. Apenas a população 7105 apresentou baixa taxa de diagnóstico falso
positivo.
As populações nas quais os marcadores apresentaram melhor eficiência
foram a 7105, com bons resultados em todos os parâmetros avaliados; e a 9024,
com o valor preditivo positivo de 100%.
MUDGE et al. (1997), ao utilizarem dois marcadores microssatélites
(BARC- Satt-038 e BARC- Satt-130), observaram 97% de precisão na predição
do fenótipo resistência ao NCS, raça 3. CONCIBIDO et al. obtiveram 90% de
eficiência na seleção de indivíduos resistentes e uma população F5:6 usando
marcador molecular associado com o QTL de resistência ao NCS.
CREAGAN (1999b) afirmou que a seleção de genótipos, carregando
algum alelo de resistência ao NCS, com o locus rhg1, pode ser consumada com
alto grau de sucesso usando seleção assistida por marcador molecular com Satt309 e/ou Sat-168. Também relatou que a presença do locus Sat-141, próximo de
rgh1, pode permitir a seleção de genótipos sem o arraste de ligação.
Considerando os resultados de outros trabalhos e os encontrados no
presente estudo, provavelmente, a porcentagem de eficiência da seleção não será
a mesma para outras populações provenientes de outros cruzamentos, mesmo
tendo a mesma fonte de resistência. Essa variação é influenciada,
principalmente, pela variação fenotípica e pela distância entre o locus do
marcador e o locus que controla a resistência à doença. Por isso, torna-se
necessário a utilização de, pelo menos, dois marcadores fortemente associados
ao locus de resistência ou, ainda, um marcador que seja o próprio gene de
resistência.
50
A baixa herdabilidade encontrada nas populações 7103, 7105 e 9024
pode inviabilizar a seleção baseada na análise fenotípica apenas. Nesse caso, o
uso de marcadores pode tornar a seleção eficiente, visto que não é afetada pelo
ambiente. Considerando o valor preditivo positivo e a precisão apresentada pelos
marcadores Sat-141 e Sat-168 na população 7105, esses mostraram-se como
uma ferramenta útil na seleção para resistência ao NCS, raça 3, nessa população.
Na população 9024, embora os marcadores tenham demonstrado baixa
precisão, o alto valor preditivo positivo garante um diagnóstico positivo seguro.
Dessa forma, o melhorista pode optar pelo uso desses marcadores, de acordo
com o objetivo no momento da seleção. Para seleção de materiais resistentes em
todos os genótipos diagnosticados como positivos, a probabilidade de ser um
diagnóstico errado é nula.
O uso de marcadores moleculares no melhoramento de plantas é uma
prática recente e ainda requer alguns cuidados. A prática da seleção assistida por
marcadores
pode
auxiliar
bastante
um
programa
de
melhoramento,
principalmente, quando o caráter desejado apresenta baixa herdabilidade e
grande influência do ambiente. A melhor alternativa tem sido a prática em
conjunto do melhoramento baseado em análise fenotípica e genotípica. Enquanto
isso, esforços têm sido feitos para o desenvolvimento de um número maior de
marcadores em busca daquele que seja o próprio gene.
51
5-CONCLUSÕES
Foram
identificadas
duas
linhagens
resistentes
resultantes
do
cruzamento CD-201 x Foster IAC (população 9024).
A população resultante do cruzamento S-8330 x Conquista (população
7103) não apresentou nenhuma linhagem resistente.
A população 7105 se apresentou como a mais promissora para seleção
com base na avaliação fenotípica e genotípica, apresentando 25 linhagens
resistentes. Sendo esta seguida da população 9024 que apresentou valor
preditivo de 100%.
Já a população 7109 apresentou 6 linhagens resistentes.
Os marcadores moleculares Sat-141 e Sat-168, na população 7105, se
apresentaram como ferramenta útil na seleção assistida por marcadores para a
resistência ao NCS, raça 3.
As populações apresentaram correlação entre o fenótipo de resistência
ao NCS e o diagnóstico dado pelos marcadores Sat-141 e Sat-168.
Visto os resultados obtidos nas tabelas de contingência, os marcadores
microssatélites Sat-141 e Sat-168 se mostraram mais seguros para o uso na
seleção prévia de genótipos que apresenta a susceptibilidade ao NCS, raça 3, nas
populações 7105 e 9024.
Ainda são necessários novos estudos com relação a utilização de
marcadores para a seleção de genótipos visto que não se pode esperar os
mesmos resultados de outras populações oriundas de outras fontes de resistência.
52
ANEXO A
TABELA 1A Resumo da análise de variância quanto à reação ao NCS , raça 3,
em genótipos de soja das populações 9024, 7103, 7105 e 7109.
População
População
População
População
9024
7103
7105
7109
GL
QM
GL
QM
GL
QM
GL
QM
FV
Blocos
5
25.37** 5
36,73 5
2,71* 5
4.46*
Tratamentos 44
2.88** 39
2,52
61
3,14** 45
4.91**
Progênie
42
2.54*
37
2,03
59
2,87** 43
4.96*
Resíduo
198
1.29** 146
1,32
184
0,97** 180
1.14**
Média
2,85
2,9
1,96
2,23
CV
40.84
39.59
51,34
49.98
h2 (%)
46
28
66
77
GS (%)
31,31
0
25,06
41,47
Todos os dados foram transformados em x+1/2
FV: fatores da variação; Gl: graus de liberdade; QM: quadrado médio; CV:
coeficiente de variação; h2: herdabilidade; GS: ganho de seleção estimado.
*teste significante a 5% de probabilidade.
**teste significante a 1% de probabilidade.
53
ANEXO B
TABELA 2A-Variância genética e fenotípica entre as progênies das populações
7103, 7105, 7109 e 9024.
População 7103
População 7105
População 7109
População 9024
σ2g
0,1452
0,4666
0,7677
0,2260
σ2f
0,5024
0,7033
0,9988
0,4912
σ2g= variância genética estimada
σ2f= variância fenotípica estimada
54
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