AVALIAÇÃO DA PRESENÇA DE MICROCISTINAS NO RESERVATÓRIO DO
FUNIL E NAS DIFERENTES ETAPAS DE TRATAMENTO DE ÁGUA NA ESTAÇÃO
DE TRATAMENTO DE AGUA DO GUANDU
Jobson Machado Barbosa
ABSTRACT
The microcystins (MCYSTs), hepatotoxic heptapeptides produced by cyanobacterias
species, already had been told as causing poisoning on wild and domestic animals, and more
recently the death of about 60 hemodialitic patients due from hepatic failure was evidenced,
after to receive dose lethal from intravenous microcystins.
In 1999 the World Health
Organization (WHO) established the acceptable maximum level of MCYSTs for water used
for oral consumption in 1 µg.L-1.dia-1 and adopted by Brazilian health legislation 1469/00
(actually 518/04), it inserted this relative limit in the procedures and responsibilities to the
control and monitoring the water quality for human consumption. In this direction, this work
aim: 1) Monitoring the presence of microcystins in water samples of the Funil Reservoir, 2)
Verify bioaccumulation of microcystins in zooplanktonics organisms in this Reservoir, 3)
Monitoring the presence of microcystins in water samples on different stages of treatment in
the Guandu Plant. The zooplanktonics fraction rather than 300µm presented great variation,
observing itself a maximum concentration in dez/04 of 2654 µg.g-1. The intermediate fraction
presented concentration above 2000 µg.g-1 in the months of nov/02 and jun/03 reaching a
maximum value of 2787 µg.g-1 in dez/03. The MCYSTs had been detected in zooplankton at
least one of the fractions during all period of study, exactly without having detection in the
fitoplanktonics fractions.
Key-words: microcystins, bioaccumulation, reservoir.
1
RESUMO
As
microcistinas
(MCYSTs),
heptapeptídeos
hepatotóxicos
produzidos
por
cianobactérias, já foram relatadas como causadoras de envenenamento de animais selvagens
e domésticos e mais recentemente foi constatada a morte de cerca de 60 pacientes
hemodialisados devido à falência hepática, após contato com água contendo microcistinas.
Em 1999, a Organização Mundial da Saúde (OMS) estabeleceu o nível máximo aceitável de
microcistinas para água utilizada para consumo oral em 1 µg.L-1.dia-1 e a Portaria n.o
1469/00 (atual 518/04), inseriu este limite nos procedimentos e responsabilidades relativos
ao controle e vigilância da qualidade da água para consumo humano. Neste sentido, este
trabalho teve por objetivos: 1) monitorar a presença de microcistinas em amostras de água
do Reservatório do Funil, 2) verificar a bioacumulação de microcistinas em organismos
zooplanctônicos deste reservatório e 3) monitorar a presença de microcistinas em amostras
de água de diferentes etapas de tratamento na Estação de Tratamento de Água do Guandu. A
fração zooplanctônica maior que 300µm apresentou grande variação, observando-se uma
concentração máxima em Dez/04 de 2654,12µg.g-1. A fração intermediária apresentou
concentração acima de 2.000 µg.g-1 nos meses de nov/02 e jun/03 atingindo um valor
máximo de 2.787µg.g-1 em dez/03. As microcistinas foram detectadas no zooplâncton em
pelo menos uma das frações durante todo o período de estudo, mesmo sem haver detecção
nas frações fitoplanctônicas.
Jobson Machado Barbosa
Aporte financeiro:
CNPq
Tel: (55 xx 21)2562-6647 e-mail: [email protected]
Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de Cianobactérias
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Centro de Ciências da Saúde
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2
INTRODUÇÃO
As atividades humanas levam a usos múltiplos dos recursos hídricos tais como:
suprimento para abastecimento público, irrigação, uso industrial, navegação, recreação e
aqüicultura. Embora essas atividades variem de acordo com a ocupação da bacia de
drenagem e com a organização econômica e social da região, elas geram impactos e
deterioração da qualidade da água disponível. Como conseqüência desses impactos, é
comum a verificação de acelerados processos de eutrofização – enriquecimento artificial
dos ecossistemas –, a partir, sobretudo, de descargas de esgotos domésticos e industriais
dos centros urbanos e das regiões agricultáveis. Esta eutrofização artificial produz
mudanças na qualidade da água, incluindo redução do oxigênio dissolvido e da
biodiversidade aquática, perda das qualidades cênicas, morte extensiva de peixes e aumento
da incidência de florações cianobactérias, podendo provocar um crescimento no custo de
tratamento da água e levar a graves conseqüências relacionadas à saúde publica.
Vários gêneros e espécies de cianobactérias que formam florações podem produzir
toxinas (cianotoxinas), às quais apresentam efeitos danosos para a biota aquática, podendo
também atingir a saúde humana.
As cianotoxinas podem ser incluídas em três grandes grupos, de acordo com suas
estruturas químicas: os peptídeos cíclicos, os alcalóides e os lipopolissacarídeos. As
cianotoxinas mais encontradas são as microcistinas (MCYST), que são heptapeptídeos
cíclicos hepatotóxicos, apresentando uma DL50 de 25 a 150 μg de MCYST/Kg de peso
corpóreo (Chorus and Bartram, 1999), sendo que a dose oral é de 5000 μg de
microcistina/Kg de peso corpóreo. Os padrões da Organização Mundial de Saúde de 1997
já citam as cianotoxinas dentre os agentes patogênicos principais, nos aspectos
microbiológicos. No Brasil, já foram registrados alguns casos de intoxicação por
cianotoxinas em humanos e em outros animais, como aves e mamíferos (TEIXEIRA et al.,
1993). Um dos casos que mais recebeu destaque pela imprensa, tendo sido este o primeiro
constado, ocorreu em Caruaru – PE –, no primeiro semestre de 1996, onde 64 pacientes
renais crônicos em uma clínica de hemodiálise morreram devido à intoxicação aguda por
MCYST (JOCHINSEN et al., 1998 e CARMICHAEL et al., 2001).
3
Segundo dados da AWWA (1995), para se estabelecer os níveis máximos aceitáveis (ou
níveis de efeitos não adversos) são utilizados muitos tipos de dados biológicos, toxicológicos e
epidemiológicos. FALCONER et al. (1994) definiram em 1 μg de equivalente de MCYST/L
como o limite máximo aceitável para consumo humano de água não conferindo risco crônico,
tendo a OMS adotado este valor como referência (CHORUS & BARTRAN, 1999).
MATERIAL E MÉTODOS
Coleta das Amostras
Reservatório do Funil
Este trabalho é parte integrante de um projeto multidisciplinar intitulado Bioacumulação e
biomagnificação de metais pesados, micropoluentes orgânicos e cianotoxinas nos
reservatórios do sistema Rio Paraíba do Sul – Rio Guandu e no sistema lagunar de
Jacarepaguá e foi todo desenvolvido no Laboratório de Ecofisiologia e Toxicologia de
Cianobactérias, no Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho-UFRJ, no período de
novembro/2002 a maio/2005.
Mensalmente, foram realizadas coletas no Reservatório de Funil em quatro pontos
distintos, denominados 1, 4, 7 e 8 com as seguintes coordenadas (Figura 1):
Ponto 1- S 22º 31’ 51.3’’ W 44º 40’ 47.4’’;
Ponto 4- S 22º 32’ 40.3 ’’ W 44º 37’ 21.5’’;
Ponto 7- S 22º 32’ 45.5’’ W 44º 34’ 56.1’’;
Ponto 8- S 22º 31’ 46.6’’ W 44º 33’ 56.3’’.
Foram coletados dois litros de água da subsuperfície nos pontos citados, após a coleta as
amostras foram acondicionadas em recipiente refrigerado com auxílio de gelo e transportadas
até o laboratório.
Durante o período de realização deste projeto no Reservatório do Funil, foi analisado
também o perfil de alguns dados físico-químicos relativos a este reservatório, como:
temperatura, pH, oxigênio dissolvido (OD), condutividade elétrica e profundidade de extinção
do Disco de Secchi (Transparência).
4
As amostras de organismos planctônicos foram coletadas com auxílio de cinco redes de
arrasto, quatro com abertura de malha de 25 μm e outra com malha de 300 μm, somente no
ponto 8, onde se localiza a barragem.
ETAG
Neste local de estudo, o trabalho foi realizado no período de junho/2002 a agosto/2003,
sendo dois litros de água foram coletados mensalmente na ETAG nos seguintes pontos:
1- ponto de captação (água bruta);
2- água bruta no laboratório da ETAG
3- água decantada do decantador VETA;
4- água decantada do decantador NETA;
5- água tratada da adutora Lameirão;
6- água tratada da adutora NEZR (oriunda do sistema Marpicu);
7- água bruta 5 km acima do ponto de captação do Rio Guandu.
As amostras 2, 3, 4, 5 e 6 foram todas coletadas dentro do laboratório da ETAG em
torneiras existentes no local e as amostras 1 e 7 foram coletadas na subsuperfície. Também foi
coletada amostra de lodo do decantador NETA. Após a coleta, todas as amostras foram
acondicionadas em recipiente refrigerado com auxílio de gelo e transportadas para o
laboratório para posterior extração.
Extração e Purificação das Microcistinas
Fração Total
No laboratório, as amostras 5 e 6 da ETAG, por se tratarem de amostras de água tratada,
foram primeiramente submetidas ao gelo/degelo por três vezes a fim de causar o rompimento
da membrana celular de todos os organismos que ainda existissem nesta amostra. As amostras
do Reservatório do Funil sofreram o mesmo processo de gelo/degelo por três vezes, a fim de
causar lise celular das células fitoplanctônicas existentes. Após este procedimento, as amostras
5
foram filtradas em filtros de borosilicato e passadas por um cartucho de octadecil-silano
(ODS) (Bond Elut C-18, Varian) previamente ativado por 20 mL de metanol 100% e 20 mL
de água Milli-Q e posteriormente lavado com 20 mL de água Milli-Q e 20 mL de metanol
20% e eluído com 20 mL de metanol 100%. Esta ultima fração foi então evaporada,
ressuspensa em 1 mL de metanol 50%, filtrada em filtro de nylon com porosidade de 0,45 μm
e analisada através de técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) (TSUJI et
al., 1994).
As amostras de fitoplâncton e zooplâncton do ponto 8 do Reservatório do Funil, após a
separação, e as amostras de lodo da ETAG foram congeladas, posteriormente liofilizadas e
extraídas, segundo KRISHNAMURTHY et al. (1986), que consiste de extração do material
liofilizado em uma solução de metanol:butanol:água (75:5:20 v/v) por três vezes, agitando-se
por uma hora cada uma das extrações, centrifugando cada fração e separando-se o
sobrenadante. O sobrenadante resultante desta extração é evaporado em até 1/3 de seu volume
inicial. Esse extrato é passado em cartucho de octadecil-silano (ODS) (Bond Elut C-18,
Varian), previamente ativado com 20 mL de metanol 100% e 20 mL de água Milli-Q, e
posteriormente lavado com 20mL de água Milli-Q, 20 mL de metanol 20% e eluído com 20
mL de metanol 100%. Após total evaporação da fração metanólica e ressuspenção em 1 mL de
metanol 50%, filtra-se em filtros de nylon com porosidade de 0,45 μm e analisa-se através de
técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
Frações Particulada e Dissolvida
As amostras 1, 2, 3, 4 e 7 foram, no laboratório, imediatamente filtradas em filtros de
borosilicato, onde a partir daí teremos as frações particulada e dissolvida.
As MCYST contidas na fração retida nos filtros foram extraídas segundo a metodologia
proposta por KRISHNAMURTHY et al. (1986), descrita anteriormente.
A fração que não ficou retida nos filtros foi considerada fração dissolvida e a extração de
microcistinas dissolvidas seguiu a metodologia de TSUJI et al. (1994), onde um volume
conhecido de amostra é passado em um cartucho de octadecil-silano (ODS) (Bond Elut C-18,
Variant) previamente ativado por 20 mL de metanol 100% e 20 mL de água ultra-pura(MilliQ) e posteriormente lavado com 20 mL de água Milli-Q e 20 mL de metanol 20% e eluído
6
com 20 mL de metanol 100%. Esta ultima fração foi passada por um cartucho de sílica,
previamente ativado com metanol 100% e posteriormente eluído com 30 mL de metanol 100%
e 20 mL de uma solução de água ultra-pura:TFA (Ácido trifluoracético):metanol (10:0,1:89,9
v/v). Esta fração foi evaporada e posteriormente ressuspensa em 1mL de metanol 50%, e após
filtração em filtro de nylon com porosidade de 0,45 μm, foi submetida a uma análise por
cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC).
Condição Cromatográfica
As análises foram realizadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
acoplado a um detector de Diiodo, operando a 238ηm. A detecção foi feita em condições
isocráticas, em coluna de fase reversa Lichrospher® 100 RP-18 (5μm) LiChroCART 125-4. A
fase móvel consiste de acetonitrila e acetato de amônio 20 mM a um pH de 5,0, na proporção
de 28:72 v/v, com fluxo de 1,0mL/min. O espectro de absorção de cada pico foi analisado na
faixa de 195 a 300 ηm, utilizando-se um fotodetector de diiodo, verificando-se qual pico
apresentou espectro de absorção semelhante ao padrão de Microcistina.
RESULTADOS
Não foi verificada a presença de microcistinas nas amostras de água coletadas no Rio
Guandu, no ponto de captação da água e nos diferentes pontos de tratamento da ETAG. Nesta
área de estudo, esta toxina foi detectada somente no lodo formado após o tratamento de
floculação da ETAG (Tabela 1). Estes resultados foram apresentados a CEDAE, companhia
responsável pelo abastecimento de água da cidade do Rio de Janeiro e responsável pela
ETAG.
Nas análises dos organismos planctônicos, foram detectados concentrações de equivalentes
de MCYSTs -LR não só nas frações fitoplanctônicas, como também nas frações
zooplanctônicas (figura 10). IBELINGS e colaboradores (2005), em um estudo realizado em
ambiente eutrófico, encontraram concentrações menores nas frações fitoplanctônicas (máx.
3912µg.g-1) e concentrações mais próximas nas frações zooplanctônicas (máx. 1352µg.g-1).
7
Outros trabalhos (KOTAC et al.,1996) que buscaram estudar a concentração de equivalentes
de MCYSTs-LR em organismos zooplanctônicos em ambientes naturais também obtiveram
resultados próximos aos obtidos neste ambiente de estudo.
Figura 10: Concentração de equivalentes de MCYST-LR em organismos planctônicos nas
diferentes frações
DISCUSSÃO
Alguns estudos indicam uma transferência de cianotoxinas em simples ou múltiplos
componentes da cadeia alimentar na biota aquática. A transferência de nodularina via
zooplâncton para larvas de peixes e crustáceos já foi descrita (KARJALAIMENM et al.,
2005), assim como a acumulação de microcistinas em peixes de uma lagoa tropical
(MAGALHÃES et al., 2001). Outros estudos provaram não existir a possibilidade de
biomagnificação das microcistinas na cadeia alimentar de um lago (IBELINGS et al., 2005).
No Reservatório do Funil, têm sido freqüentes as florações de cianobactérias, inclusive já
tendo sido isoladas cepas produtoras de microcistinas. As microcistinas encontradas nas
amostras de água e nos organismos planctônicos do Reservatório do Funil estão relacionadas à
presença do gênero Microcystis. A dominância de cianobactérias neste reservatório está
diretamente relacionada à alta disponibilidade de nutrientes (principalmente P e N) disponíveis
nas águas do mesmo, pois vem sofrendo aporte contínuo de uma grande quantidade de
poluentes orgânicos e industriais, assim sendo, o Reservatório do Funil possui as condições
8
ambientais adequadas ao desenvolvimento de florações de cianobactérias produtoras de
toxinas, o que tem se mostrado cada vez comum.
Comparando-se os dados de campo com a análise quali-quantitativa do fitoplâncton podese perceber que nos meses em que foi verificada uma maior concentração celular (novembro e
dezembro de 2002) a temperatura da água estava elevada, acima de 28º C, os valores de pH
também estavam elevados (maiores que 9,9 e 9,5), os valores de condutividade elétrica foram
os maiores durante o período de estudo (99,3 e 89,7) e a transparência da coluna d’água
apresentou valores mais baixos (0,5m e 0,6m).
Os fatores Ttemperatura e Ccondutividade elétrica não sofreram grandes variações no
período em que foram analisados. O OD sofreu variações maiores com picos de 12.5 mg/L em
janeiro/2003 e uma queda bruta para 0,8 mg/L em fevereiro/2003.
Após o fracionamento das amostras de organismos Planctônicos do Reservatório do Funil,
pode-se verificar que a fração menor que 25µm, representada principalmente por pequenas
partículas de sedimento, apresentou uma concentração máxima de equivalentes de MCYSTLR de 504,44 µg.g-1 em novembro/03.
A fração zooplanctônica, medindo entre 25 e 300µm, apresentou concentração acima de
2200 µg.g-1 somente nos meses de novembro/02 e junho/03 e a fração maior que 300µm
variou mais, observando-se valores abaixo do limite de detecção do método (<LD) nos meses
dezembro/02, fevereiro, abril e agosto/03 e um máximo em janeiro/04 de 1.659 µg.g-1.
Já as frações fitoplanctônicas apresentaram elevados valores de MCYSTs, chegando a
4.727 µg.g-1 em dezembro/03 e 5.966 µg.g-1 em janeiro/04, na fração maior que 300µm, e
6.649 µg.g-1 em janeiro/04 na fração intermediária. As MCYSTs foram detectadas no
zooplâncton em pelo menos uma das frações durante todo o período de estudo, mesmo sem
haver detecção nas frações fitoplanctônicas. Além disso, foi observada uma correlação
positiva entre a concentração de MCYSTs na fração zooplanctônica maior que 300um e a
fração fitoplanctônicas total (R = -0,56; p = 0,04).
A presença desta toxina esteve em maior concentração nos organismos fitoplanctonicos em
relação aos organismos zooplanctonicos. Pode-se observar também a bioacumulação de
MCYSTs nos organismos Zooplanctonicos, pelo fato de terem como hábitos alimentares as
células produtores desta toxina.
9
Não foi verificada a presença de microcistinas nas amostras de água coletadas no Rio
Guandu, no ponto de captação da água e nos diferentes pontos de tratamento da ETAG. O que
significa que a presença de MCYSTs no Reservatório do Funil não reflete a presença da
mesma na ETAG. Nesta área de estudo, no entanto, esta toxina foi detectada somente no lodo
formado após o tratamento de floculação da ETAG, pois uma concentração maior de
moléculas de mcysts mantém-se aderida ao sedimento resultante do processo de floculação das
células.
TABELAS
Tabela 1: Concentração de equivalentes de Mcyst-LR em amostras de Lodo Coletado na ETAG.
Data da coleta
Concentração Mcysts μg.g-1
30/07/02
s/ amostragem
13/08/02
s/ amostragem
27/08/02
1,94
11/09/02
s/ amostragem
24/09/02
0,28
29/10/02
0,17
27/11/02
< LD
19/12/02
< LD
29/01/03
< LD
25/02/03
< LD
27/03/03
s/ amostragem
29/04/03
< LD
28/05/03
< LD
26/06/03
s/ amostragem
14/08/03
s/ amostragem
10
CONCLUSÕES
1- Não foram encontradas microcistinas dissolvidas no Rio Guandu e em nenhuma etapa do
tratamento de água da ETAG;
2- O Reservatório do Funil apresentou condições ideais para a proliferação e dominância de
cianobactérias durante todo o período de estudo;
3- Os resultados apresentados até aqui demonstram concentrações elevadas de mcysts no
fitoplancton;
4- Foi possível verificar a bioacumulação desta toxina no zooplancton;
5- Os dados apresentados até agora reforçam a necessidade de continuidade deste trabalho,
pois o Reservatório do Funil é de grande importância para a região, por se tratar de fonte de
sustento para pescadores locais e lazer, tendo às suas margens um clube náutico inserido,
como para a cidade do Rio de Janeiro, que tem em suas águas a maior fonte de abastecimento.
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