Programa de Pós-Graduação em Biologia Evolutiva
Associação Ampla entre a Universidade Estadual de Ponta Grossa
(Departamento de Biologia Estrutural, Molecular e Genética) e a
Universidade Estadual do Centro Oeste (Departamento de Ciências
Biológicas)
PROJETO DE PESQUISA
ANÁLISE DA AUSÊNCIA DE FLUXO GÊNICO EM POPUALÇÕES DE Astyanax aff.
fasciatus NA BACIA DO ALTO RIO TIBAGI (PARANÁ, BRASIL) E SUAS INFERÊNCIAS
EVOLUTIVAS
Orientador:
Prof. Dr. Roberto Ferreira Artoni
Co-orientador:
Prof. Pós Dr. Mateus Henrique Santos
Mestrando:
Alceu Ferreira Júnior
PONTA GROSSA – PARANÁ
2015
INTRODUÇÃO
Populações pequenas e isoladas, geograficamente ou não, tendem a reduzir sua
variabilidade genética devido ao endocruzamento, dessa forma, uma população naturalmente isolada,
como presente na Furna2 do Parque que não promova fluxo gênico com populações próximas, pode
ter acúmulos de sutis diferenças genéticas, que, com o tempo podem inviabilizar cruzamento e/ou
gerar descendência fértil, com as demais populações caso cessem seu isolamento geográfico especiação alopátrica - (Ridley, 2004) ou, permanecendo a ausência de fluxo gênico, esta pode iniciar
um processo evolutivo denominado depressão endogâmica (Frankhan, 2008).
A ausência de fluxo gênico promovendo a especiação incorre no aumento da
biodiversidade de um ecossistema, para tanto, a população “livre deste fluxo” precisa ter numero
expressivo de membros e um habitat que lhe permitam “fugir” do gargalo evolutivo da depressão
endogâmica, cuja repetição de endocruzamento aumenta significativamente a possibilidade de
acumulo de mutações deletérias, assim, ao invés de culminar em especiação de uma população, tem-se
possivelmente uma extinção populacional, reduzindo a biodiversidade local. (Ganem e Drummond,
2011).
O Parque Estadual de Vila Velha (PEVV) apresenta condições geográficas distintas que
permitem o estudo evolutivo comparativo entre populações endogâmicas de Astyanax aff. fasciatus
isoladas em depressões doliniformes denominadas furnas (Figura 1).
”.
Figura 1. Mapa hidrográfico do estado do Paraná (a) e destaque para o relevo que
apresenta as Furnas do Parque Estadual de Vila Velha, Paraná (b). Shibatta e Artoni
(2005).
Ressalta se que as furnas 1 e 2 recebem água do lençol freático e de precipitações pluviais, a
furna 3 não apresente lamina de água, enquanto a furna 4 recebe águas do córrego da roça e a Lagoa
Dourada recebe água de lençol freático e de inundações do Rio Guabiroba, afluente do rio Tibagi.
Assim, enquanto a furna 4 e Lagoa Dourada tem ligações com outros corpos de água, permitindo
contato e o fluxo gênico entre populações distintas de Astyanax fasciatus, diferentemente do ocorrido
as furnas 1 e 2 permanecem isoladas (Artoni et al., 2006).
Um dos primeiros estudos evolutivos nas populações altamente isoladas de Astyanax
pertencentes à bacia do alto rio Tibagi refere-se ao estudo cariotípico realizado por Matoso et al.
(2002), na qual foi descrito o cariótipo de Astyanax aff. fasciatus (denominado Astyanax sp.) através
da analise de 10 exemplares – (05 machos e 05 fêmeas), oriundos da Furna 1, pertencente ao Parque
Estadual Vila Velha, revelando 2n= 48 cromossomos, destes 3 pares de metacêntricos, 9 pares de
submetacêntrico, 7 pares de subtelocêntricos e 5 pares de acrocêntricos, não havendo diferenças
evidentes entre o cariótipo de machos e fêmeas. Outros estudos cariotípicos foram realizados em
populações de Astyanax aff. fasciatus na bacia do alto rio Tibagi, chegando a conclusão de que se trate
de um complexo de espécies, com dois cariomorfos que possuem 2n = 50 cromossomos e distintos
padrões de banda-C e outro com 2n = 48 cromossomos (Artoni et al., 2006).
A diversidade deste complexo de espécies foi também acessada em diferentes ocasiões
acerca da anatomia corporal, especialmente em relação a morfologia merística (Shibatta e Artoni,
2005; Artoni et al. 2006). Uma análise qualitativa da variabilidade genética em A. aff. fasciatus do
alto Rio Tibagi e PEVV com base no polimorfismo obtido por digestão enzimática (RFLP) da região
D-Loop do DNAmit evidenciou que essas populações soa geneticamente diferentes (Matoso et al.,
2010). Uma hipótese filogenética foi estabelecida pela analise de sequências do gene 12S do DNA
mitocondrial destas populações de A. aff. fasciatus e confirmou o complexo de espécies (Matoso et
al., 2013).
O estado de vulnerabilidade das populações de A. aff. fasciatus confinados nas Furnas do
PEVV também já foi relatado na literatura, quer seja por evidencias morfológicas (Gross et al., 2004),
assim como pelo emprego de marcadores moleculares (Matoso et al., 2004).
Contudo, algumas perguntas acerca da biologia evolutiva desses peixes ainda continuam
sem respostas a exemplo do comportamento da variabilidade genética nas populações e aspectos
adaptativos, assim como o tempo de isolamento reprodutivo e se este realmente é efetivo para estas
populações.
JUSTIFICATIVA E RESULTADOS ESPERADOS
O presente projeto é complementar a estudos por nós realizados no início dos anos 200 no
Parque Estadual de Vila Velha. Naquela oportunidade realizamos trabalho inédito de levantamento
completo da icitiofauna local que resultou em um livro publicado, vários artigos científicos em
revistas indexadas e inúmeras divulgações em congressos e também na mídia, a exemplo do Globo
Repórter, Jornal Hoje e Paraná TV. Também foi resultado importante à formação de alunos de
iniciação científica e de pós-graduação (mestrado e doutorado) com subprojetos atrelados ao projeto
principal,
que
podem
ser
consultados
no
Currículo
Lattes
do
pesquisador
(http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4728593H6 ).
Contudo, muitas lacunas e perguntas ainda ficaram em aberto e que podem ser agora
respondidas com novas tecnologias, especialmente em relação aos lambaris (Astyanax aff. fasciatus)
que habitam as Furnas do PEVV, esperando que:
- A análise da sequência do DNA mitocondrial do gene citocromo-oxidase, (DNABarconding) permitirá inferir se, de fato, os exemplares amostrados pertencem a espécie A. fasciatus.
- Os dados fornecidos pela amplificação dos microssatélites permitirão estipular o grau de
endemismo dos espécimes de Astyanax aff. fasciatus capturados da população da Furna 2 do Parque
Estadual de Vila Velha com espécimes representantes de populações deste complexo de espécies
presentes no Alto Rio Tibagi.
- Estes resultados possibilitarão a divulgação cientifica em eventos destacados na área, assim
como a publicação de artigos científicos em periódico de alto impacto.
- Não obstante, o treinamento e formação de recursos humanos para o ensino superior será
um dos principais produtos deste projeto. Destacando ainda a disponibilidade de informação para o
manejo monitorado geneticamente para os peixes das Furnas do PEVV.
OBJETIVOS
Analisar a ausência de fluxo gênico entre uma população isolada de Astyanax aff fasciatus
presente na formação geológica denominada de Furnas 2 comparando com populações da mesma
espécie do alto rio Tibagi, circundante ao Parque Estadual Vila Velha no Paraná, com vistas a inferir
sobre a estrutura populacional e tempo de divergência evolutiva.
METAS
Proceder a identificação molecular das populações através da análise de seqüências parciais
do gene Citocromo oxidase (COI) do DNA mitocôndrial (DNA Barcode).
Estabelecer parâmetros genéticos de populações de Astyanax aff. fasciatus presentes nas
Furnas 2, com análise por primers oriundos de Astyanax altiparanae ou seja, promovendo a priori, a
transferibilidade interespecífica.
Inferir dados acerca da relação da população de A. aff. fasciatus isolada na Furna 2 com
Astyanax aff. fasciatus do alto rio Tibagi.
Comparar novas amostras com amostras antigas (10 anos) de A. aff. fasciatus da Furna 2,
estimando tempo de isolamento desta população, seu grau de endemismo (perda de variabilidade
genética
MATERIAL E MÉTODOS
Serão analisadas amostras do DNA genômico e mitocondrial da espécie Astyanax aff.
fasciatus presente na Furna 2 e no alto rio Tibagi, utilizando amostras de banco de tecidos do
Laboratório de Genética Evolutiva (LabGEv) da Universidade Estadual de Ponta Grossa (UEPG) com
pelo menos 10 anos de estocagem (30 animais/tecidos da localidade da Furna 2 do PEVV e 30
animais/tecidos da localidade do Alto Rio Tibagi), bem como acesso a amostras recentes (30
animais/tecidos da localidade da Furna 2 do PEVV e 30 animais/tecidos da localidade do Alto Rio
Tibagi), perfazendo um total de 120 para o N amostral. A identificação específica será realizada pelo
Dr. Oscar Akio Shibatta e exemplares representativos do estudo serão depositados no Museu de
Zoologia da Universidade de Londrina (MZUEL), além da identificação molecular por DNA-barcode.
O trabalho tem a autorização do Ministério de meio Ambiente – MMA (Instituto Brasileiro do Meio
Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis – IBAMA; Instituto Chico Mendes de Conservação da
Biodiversidade – ICMBio; Licença 15115-1).
METODOLOGIA
Os peixes serão coletados com tarrafas, redes e peneiras, e transportados vivos, em condições
de oxigenação, para o LabGEv onde serão mantidos em aquários até sua utilização em análises
moleculares.
A extração do DNA genômico será realizada com tampão salino (Aljnabi & Martinez, 1997).
Cada amostra de tecido de aproximadamente 10mg será homogeneizada em 800 µL de tampão salino
(NaCL 0,4 M; Tris-HCL 10mM pH=8,0 e EDTA 2mM pH=8,0) usando pistilo adaptado a um
agitador mecânico por 10-15s. Adicionar 80µL de SDS 20% (CF=2%) e 16 µL de Proteinase K 20
mg/mL (CF=400µg/µL) e mistura bem. Incubar as amostras a 55-65ºC por pelo menos 1h ou
overnight. Adicionar 300 µL de NaCL 6M. Agitar as amostras em Vortex por 30s a velocidade
máxima e centrifugar por 20 minutos a 13.000g. Transferir o sobrenadante para outro tubo. Adicionar
igual volume de isopropanol e misturar bem. Incubar a -20ºc por 1 h. centrifugar por 10 minutos a 4ºC
a 13.000g. Levar o pellet com 300 µL de etanol 70%, centrifugar por 5 minutos a 13.000g. Secar e
ressuspender em 300-500 µL de H2O estéril (100 µL=98 µL TE + 2 µL de RNase 10 mg/mL.
As reações de PCR (Polimerase Chain Reaction) serão conduzidas em um volume final de 20
µL 3,12 mM de MgC12 (50mM), 0,09mM de dNTPs (1,25 mM), 0,05pM de cada primer (10µM), 0,5
unidade de Taqpolimerase w 1,5 µl de amostra de DNA (40 a 50 ng). Os ciclos da reação serão
iniciados com uma etapa de desnaturação de cinco minutos a 95ºC, seguidos de 35 ciclos, compostos
de 30 segundos de desnaturação a 95ºC, 30 s de temperatura de anelamento de cada iniciador e cinco
segundos de extensão a 72ºC. Após os ciclos, usa-se uma extensão final de cinco minutos a 72ºC.
Após a amplificação, os produtos da PCR serão corados com GelRedTM e visualizados em gel
de agarose a 1% para a determinação da qualidade e tamanho dos fragmentos amplificados. Os
produtos de PCR que serão usados para o seqüenciamento serão purificados com a enzima ExoSapIT®, de acordo com a metodologia descrita em Oliveira et al. (2011) e enviados ao sequenciamento
automático.
O sequenciamento das amostras será realizado na empresa ACTGene Análises Moleculares
Ltda, (centro de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, RS) utilizando o sequenciador automático ABI
3500 Genetic Analyzer armado com capilares de 50 cm e polímero POP7 (Appplied Biosystems). Os
DNAs-moldes (60ng) serão marcados utilizando-se 2,5% pmol do iniciador (tabela 1) e 0,5 L do
reagente BigDive Terminator v3.1 Cycle Sequencing Standart (Applied Biosystems) em um volume
final de 10 µL. As reações de marcação serão realizadas em termociclador LGC XP Cycler com uma
etapa de desnaturação inicial a 96º por 3 min seguida de 25 ciclos de 96ºC por 10 s, 55ºC por 5 s e
60ºC por 4 min. Uma vez marcadas, as amostras serão purificadas pela precipitação com isopropanol
a 75% e lavagem com etanol a 60%. Os produtos serão diluídos em 10 µL de formamida Hi-Fi
(Applied Biosystems), desnaturados a 95ºc por 5 min, resfriado em gelo por 5 min e eletroinjetados no
sequenciador automático. Os dados de sequenciamento serão coletados utilizando-se o programa Data
Collection
2
(Applied
Biosystems)
“KB_3500_POP7_BDYv3.mob”,
com
BioLIMS
os
parâmetros
Project
Dye
Set
“3500_Project1”,
“Z”,
Mobility
Run
Module
File
1
“FastSeq50_POP7_50cm_cfv_’00”, e Analysis Module 1 “BC-#%))SR_Seq_Fast.saz”.
O alinhamento das sequencias “foward” e “reverse” de cada amostra dos respectivos genes
serão comparadas, corrigidas e editadas usando o programa “Chromas Life 2.0”, para o alinhamento
múltiplo das seqüências, o pacote de programas “Bioedit v 7.0.9”, o qual inclui o programa “Clustal
W, 1.8.” e, para garantir a fidelidade da posição dos nucleotídeos das sequencias, os pontos de
mutação serão checados manualmente, utilizando o programa “Chromas Lite, 2.0” e, quando
necessário, possíveis erros nas sequência, interpretados pelo alinhamento como mutação, serão
eliminados. A confirmação da veracidade das sequencias obtidas será realizada pela comparação com
informações disponíveis no banco de dados de sequencias do NCBI, GenBanK utilizado o programa
BLAST.
A identificação molecular das espécies seguirá a analise por similaridade das sequencias
parciais do gene COI com o arquivo do banco de dados do projeto BOLD (Barcode of life data
Systems), acessível em (http://v3.boldsystems.org/).
A variabilidade genética das populações será acessada por meio de marcadores moleculares
baseados em locos microssatélites, após a transferabilidade dos iniciadores originalmente descrita para
Astyanax altiparanae (Zaganini, 2012).
A análise do polimorfismo de tamanhos fragmentos será feita através e eletroforese
microfluídica, estabelecendo padrões compatíveis com a presença dos alelos esperados para cada
lócus.
Com a amplificação dos microssatélites, estimar-se-á o déficit de heterozigotos, o equilíbrio
de Hardy-Weinberg, a diferenciação gênica, as frequências alélicas e as heterozigosidade esperadas e
observadas utilizando-se o programa GENEPOP versão 3.4 (Raymond e Rousset, 1995).
Será empregada a estatística F (Fis e Fst) (Weir e Cockerham, 1984). Para cada uma das
populações, será calculado o índice de endogamia (Fis) e o desequilíbrio de ligações através do
programa FSTAT versão 2.9.3.2 (Goudet, 1995). Também será calculada, a partir dos dados
genéticos, o Tamanho Efetivo Populacional (Ne). O nível de s ignificancia adotado em todas as
análises descritas será de 5%, ajustado com a correção sequencial de Bonferroni (Rice, 1989).
Também será dado o enfoque interpopulacional, verificando assim a estruturação genética
dessas populações. Será, portanto, determinado se há presença de fluxo gênico (o que indicará
ocorrência ou não de migração). Para isso, será utilizada uma analise bayesiana com programa
STRUCTURE (Pritchartd et al. 2003).
Serão calculados os índices padrões de diversidade, como a diversidade nucleotídica e
diversidade haplotípica, utilizando o programa Arlequim, 3.5 (Excoffier et al. 2005). Além desses
índices, também serão calculados possíveis desvios da neutralidade com os testes D de Tajima
(Tajima 1989), Fs de Fu (Fu et al 1997).
CUSTOS DO PROJETO
Os recursos financeiros para execução do projeto estão garantidos por verba do PROAP da
CAPES vinculado ao PPG-Biologia Evolutiva e ao projeto aprovado pelo CNPq processo n°
304233/2013-7. “Biodiversidade, Citogenética e Preservação dos Peixes dos Campos Gerais IV”, em
nome do pesquisador principal Prof. Dr. Roberto Ferreira Artoni.
CRONOGRAMA DE EXECUÇÃO
ANO 2014 (Já executado em azul)
ATIVIDADE
Revisão bibliográfica
Reestruturação do projeto
Levantamento dos tecidos
no LabGEv-UEPG
padronização das técnicas
a serem utilizadas
Treinamento das técnicas
de bioinformática
Captura de exemplares de
no alto Rio Tibagi
Mar
Abr
Mai
Jun
Jul
Ago
Set
Out
Nov
Dez
ANO 2015 (em vermelho etapas na área do PEVV. Em verde etapas a serem ainda executadas)
ATIVIDADE
Revisão bibliográfica
Ja
Fv
Ma
Ab
Ma
Ju
Jl
Ag
St
Ou
Nv
Captura de exemplares
Furna 2 PEVV
Seqüenciamento do
DNA
Análise preliminar dos
dados
Descrição dos dados e
discussão
ANO 2016 (em vermelho etapas na área do PEVV. Em verde etapas a serem ainda executadas)
ATIVIDADE
Amostragens e análises
Complementares
Revisão de análise de
dados
Formatação de trabalhos
para publicação e
relatório IAP
Ja
Fv
Ma
Ab
Ma
Ju
Jl
Ag
St
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alijani, S. M.; Martinez, I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCRbased techniques. Nucleic acids research, v. 25, n. 22, p. 4692 - 4693, 1997.
Artoni, R. F.; Almeida, M. C. Genética de peixes neotropicais. I. Aspectos da conservação genética
dos peixes no Parque Estadual de Vila Velha, Paraná, Brasil. Revista Publicatio UEPG Ciências
Biologicas e da Saúde, v. 9, n. 2, p. 7 - 15, 2003.
Artoni, R. F.; Shibatta, O. A.; Gross, M. C.; Schneider, C. H.; et al. Astyanax aff. fasciatus Curvier
1819, (Teleostei, Characidae): evidences of a species complex in the upper rio Tibagi basin (Paraná,
Brazil). Neotropical Ichthyology, v. 4, n. 2, p. 197 - 202, 2006.
Artoni, R. F., et al., Epifluorescence and light microscopy evidencing structural and functional
polymorphism of ribosomal DNA in fish (Teleostei: Astyanax fasciatus). Micron, v. 39, n. 8, p.1156 1159, 2008.
Artoni, R. F.; Shibata, O. A.; et al. Peixes do parque estadual do vila velha, aspectos da historia
natural, da biologia evolutiva e da conservação. Ponta Grossa: Editora UEPG, 2006.
Excoffier, L.; Laval, G.; Schneider, S. Arlequin version 3.0: an integrated software package for
population genetics data analysis. Evolutionary Bioinformatics Online, v.1, p. 47 - 50, 2005.
Frankham, R. Genetic adaptation to captivity in species conservation programs. Molecular ecology, v.
17, n. 1, p. 325 - 333, 2008.
Fu; Y.; Charlesworth, D.; Namkoong; G. Point estimation and graphical inference of marginal
dominance for two. Genetical Research, v. 70, n. 2, p. 143, 1997.
Ganem, R.; Drummond, J. A. Biologia da conservação: as bases científicas da proteção da
biodiversidade. GANEM; R. S. Conservação da Biodiversidade; Legislação e Políticas Públicas.
Brasília: Câmara dos Deputados, n. 11, p. 46, 2011.
Goudet, J. FSTAT (Version 1.2): A computer program to calculate F-statistics. Journal Heredity, v.
86, n. 6, p. 485 – 486, 1995.
Gross, M. C; Schneider, C. H.; Almeida-Matiello, M. C.; Leite, M. L.; Bertollo, L. A. C.; Artoni, R. F.
Population structure, fluctuating asymmetry and genetic variability in an endemic and highly isolated
Astyanax fish population(Characidae). Genetic and Molecular Biology, v. 27, n. 4, p. 529 – 535, 2004.
Matoso, D. A.; Martins, C.; Artoni, R. F.; Galetti Jr, P. M. Preliminary qualitative analysis on mtDNA
in Astyanax fasciatus populations Cuvier, 1819 (Teleostei; Characidae) indicate population
distinctiveness. Brazilian Archives of Biology Technology, v. 53, n. 3, p. 663 - 667, 2010.
Matoso, D. A.; Da Silva, M.; Artoni, R. F.; Torres, R. A. Molecular Taxonomy and evolutionary hypothesis
concerning Astyanax fasciatus (Characiformes, Characidae) from Vila Velha State Park and Tibagi
and Iguaçu Rivers. Genetics and Molecular Research, v. 12, n. 1, p. 631 - 638, 2013.
Matoso, D. A.; Artoni, R. F.; Galetti Jr, P. M. Genetic diversity of the small characid fish Astyanax
sp., and its significance for conservation. Hydrobiologia, v. 527, n. 1, p. 223 - 225, 2004.
Matoso, D. A.; Vicari, M. R.; Almeida, M. C.; Shibatta, O. A.; Moreira-Filho, O.; Bertollo, L. A. C.;
Artoni, R. F. Karyotypic studies in the Characidae fish, genus Astyanax an endemic and highly
isolated population of Astyanax sp. Cytologia, n. 67, p. 123 – 128, 2002.
Oliveira, C.; et al. Phylogenetic relationships within the species of family Characidae (Teleostei:
Ostariophysi: Characiformes) based on multilocus analysis and extensive ingroup sampling. BMC
Evolutionary Biology, v. 11, n. 1, p. 275, 2011.
Pritchard, J. K, et al. Documentation for STRUCTURE software:Version 2. 2003
Raymond, M.; Rousset, F. GENEPOP Version 1.2: Population genetics software for exat tests and
ecumenicism. Journal of Heredity, v. 86, n. 3, p. 248 – 249. 1995.
Rice, W. R. Analyzing tables of statistical tests. Evolution, v. 43, p. 223 - 225, 1989.
Ridley, M. Evolução. 3ª edição. São Paulo: Saraiva, 2006.
Shibatta, O. A.; Artoni, R. F. Sobre a identidade das populações alopátricas de Astyanax
(Characiformes: Characidae) das formações das Furna 1 e Furna 2 do Parque Estadual de Vila Velha,
Paraná, Brasil. Publicatio UEPG Ciências Biológicas e da Saúde, v. 11, n. 2, p. 7 - 12, 2005.
Tajima, F. Statistical method for testing the neutral mutation hypothesis by DNA polymorphism.
Genetics, v. 123, n. 3, p. 585 – 595, 1989.
Tamura, K.; Dudley, J.; Nei, M.; Kumar, S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis
(MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution, v. 24, n. 8, p.1596 – 1599, 2007.
Telenius, H.; Carter, N. P.; Bebb, C. E.; Nordenskjold, M.; Ponder, B. A.; Tunnacliffe, A. Degenerate
oligonucleotide primed PCR: General amplification of target DNA by a single degenerate primer.
Genomics, v. 13, n. 3, p. 718 – 725. 1992.
Vicari, M. R.; Nogaroto, V.; Noleto, R. B.; Cestari, M. M.; Cioffi, M. B.; Almeida, M. C.; MoreiraFilho, O.; Bertollo, L. A. C.; Artoni, R. F. Satellite DNA and chromosomes in Neotropical fishes:
Methods, applications and perspectives. Journal of Fish Biology, v. 76, n. 5, p. 1094 – 1116, 2010.
Weir, B.; Cockerham, C. Estimating F statistics for the analysis of population structure. Evolution, v.
38, n. 6, p. 1358 – 1370, 1984.
Zaganini, R. A. et al. Isolation and characterization of microsatellite loci in the Neotropical fish
Astyanax altiparanae (Teleostei: Characiformes) and cross-species amplification. Journal of Genetics,
v. 91, n.1, p. 24 - 27. 2012.