Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Centrode Tecnologia
Departamento de Engenharia Química
Programa de Pós-graduação em Engenharia Química
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Produção de enzimas por fungos em fermentação
semi-sólida utilizando bagaço de coco e pedúnculo de
caju como substratos
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
Orientadora: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo
Coorientadora: Profª. Drª. Cristiane Fernandes de Assis
JANEIRO/2014
NATAL/RN
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
PRODUÇÃO DE ENZIMAS POR FUNGOS EM
FERMENTAÇÃO SEMI-SÓLIDA UTILIZANDO BAGAÇO
DE COCO E PEDÚNCULO DE CAJU COMO
SUBSTRATOS
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Engenharia Química da
Universidade Federal do Rio Grande do Norte,
como parte dos requisitos necessários para
obtenção do grau de Mestre em Engenharia
Química, sob orientação da Prof. Dr. Gorete
Ribeiro de Macedo e coorientação da Prof. Dr.
Cristiane Fernandes de Assis.
JANEIRO/2014
NATAL/RN
Catalogação da Publicação na Fonte.
UFRN / CT / DEQ
Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.
Oliveira Júnior, Sérgio Dantas de.
Produção de enzimas por fungos em fermentação semi-sólida utilizando bagaço
de coco e pedúnculo de caju como substratos / Sérgio Dantas de Oliveira Júnior. Natal, 2014.
103 f.: il.
Orientador: Gorete Ribeiro de Macedo.
Co-orientador: Cristiane Fernandes de Assis.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação
em Engenharia Química.
1. Enzimas - Dissertação. 2. Coco - Dissertação. 3. Caju - Dissertação. 4. Fungos
- Dissertação. 5. Resíduos industriais - Dissertação. I. Macedo, Gorete Ribeiro de
II. Assis, Cristiane Fernandes de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
IV. Título.
RN/UF
CDU 577.15(043.3)
OLIVEIRA JÚNIOR, Sérgio Dantas de. Produção de enzimas por fungos em fermentação
semi-sólida utilizando bagaço de coco e pedúnculo de caju como substratos. Dissertação de
Mestrado, UFRN, Programa de Pós Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, Área de
Concentração: Engenharia Química, Natal/RN, Brasil.
Orientadora: Profª. Drª. Gorete Ribeiro de Macedo
Coorientadora: Profª. Drª. Cristiane Fernandes de Assis
RESUMO – A produção de enzimas por microrganismos utilizando resíduos agroindustriais
é importante e pode estar associada a diversas aplicações, tais como indústrias de alimentos,
química, têxtil entre outras. O objetivo deste trabalho é a produção de enzimas CMCase,
Xilanase, Avicelase e FPase através da fermentação em estado sólido (FES), usando como
substrato o bagaço do coco verde e o pedúnculo de caju seco, utilizando os microrganismos
Penicillium chrysogenum e um fungo isolado da casca do coco (Aspergillus fumigatus). A
metodologia do planejamento experimental fatorial e análise de superfície de resposta estudou
a influência da variação da umidade e do pH. Foram realizadas fermentações usando o bagaço
do coco como substrato, nos cultivos utilizando o Aspergillus fumigatus e o fungo Penicillium
chrysogenum, e uma mistura com 50% de bagaço do coco e de 50% do pedúnculo de caju
com o fungo Penicillium chrysogenum, as condições de cultivo foram: 120 horas a 30 °C em
BOD, variando umidade e pH. Com o objetivo de verificar a influência das variáveis:
umidade e pH, foi elaborado um planejamento experimental fatorial 22, sendo então dois
fatores e dois níveis para cada fator com três repetições no ponto central. Os níveis das
variáveis independentes utilizadas foram, na ordem crescente (-1, 0, +1), para umidade 66%,
70,5% e 75% e para o pH 3, 5 e 7. Foi usado o programa computacional STATISTICA TM
(versão 7.0, da StatSoft, Inc.) para calcular os efeitos principais das variáveis e suas
interações. A metodologia de superfície de resposta foi usada para avaliar as condições da
FES. A caracterização química e físico-química do bagaço do coco verde determinou as
composições de Celulose (%) = 39,09; Hemicelulose (%) = 23,80; Lignina Total (%) = 36,22
e de Pectina (%) = 1,64. Já para a caracterização do pedúnculo de caju os valores foram de
Celulose (g) =15,91; Hemicelulose (%) = 16,77; Lignina Total (%) = 30,04 e Pectina (%) =
15,24. Os resultados obtidos indicam o potencial dos materiais como substrato para
fermentação semi sólida visando produção de enzimas. Os dois microrganismos utilizados
apresentaram como bons produtores de celulases. Os resultados mostraram o potencial do
fungo isolado na produção da enzima CMCase, com valor máximo de 0,282 UI/mL e para a
enzima Avicelase o valor máximo variou entre 0,018 – 0,020 UI/mL, usando apenas o bagaço
do coco como substrato. O fungo Penicillium chrysogenum apresentou os melhores resultados
para as enzimas CMCase = 0,294 UI/mL, FPase = 0,058 UI/mL, Avicelase = 0,010 UI/mL e
Xilanase = 0,644 UI/mL, usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como sustratos. O
fungo Penicllium chrysogenum apresentou atividades enzimáticas usando apenas o coco como
substrato, para CMCase = 0,233 UI/mL, FPase = 0,031 – 0,032 UI/mL, Avicelase = 0,018 –
0,020 UI/mL e Xilanase = 0,735 UI/mL. Portanto, concluiu-se que os microrganismos e os
substratos utilizados apresentam potencial para processos de produção de enzimas em cultivo
semi-sólido.
Palavras-chave: Penicillium chrysogenum, Planejamento experimental, CMCase, Avicelase,
Xilanase, FPase.
ABSTRACT
The production of enzymes by microorganisms using organic residues is important and it can
be associated with several applications such as food and chemical industries and so on. The
objective of this work is the production of CMCase, Xylanase, Avicelase and FPase enzymes
by solid state fermentation (SSF) using as substrates: bagasse of coconut and dried cashew
stem. The microorganisms employed are Penicillium chrysogenum and an isolated fungus
from the coconut bark (Aspergillus fumigatus). Through the factorial design methodology and
response surface analysis it was possible to study the influence of the humidity and pH. For
Penicillium chrysogenum and the isolated fungus, the coconut bagasse was used as culture
medium. In another fermentation, it was used the mixture of coconut bagasse and cashew
stem. Fermentations were conducted using only the coconut bagasse as substrate in cultures
with Penicillium chrysogenum fungus and the isolated one. A mixture with 50% of coconut
and 50% of cashew stem was employed only for Penicillium chrysogenum fungus, the
cultivation conditions were: 120 hours at 30 °C in BOD, changing humidity and pH values. In
order to check the influence of the variables: humidity and pH, a 22 factorial experimental
design was developed, and then two factors with two levels for each factor and three
repetitions at the central point. The levels of the independent variables used in ascending
order (-1, 0, +1), to humidity, 66%, 70.5% and 75% and pH 3, 5 and 7, respectively. The
software STATISTICATM (version 7.0, StatSoft, Inc.) was used to calculate the main effects
of the variables and their interactions. The response surface methodology was used to
optimize the conditions of the SSF. A chemical and a physic-chemical characterization of the
coconut bagasse have determined the composition of cellulose (%) = 39.09; Hemicellulose
(%) = 23.80, Total Lignin (%) = 36.22 and Pectin (%) = 1.64. To the characterization of
cashew stem, the values were cellulose (g) = 15.91 Hemicellulose (%) = 16.77, Total Lignin
(%) = 30.04 and Pectin (%) = 15.24. The results indicate the potential of the materials as
substrate for semisolid fermentation enzyme production. The two microorganisms used are
presented as good producers of cellulases. The results showed the potential of the fungus in
the production of CMCase enzyme, with a maximum of 0.282 UI/mL and the Avicelase
enzyme the maximum value ranged from 0.018 to 0.020 UI/ mL, using only coconut bagasse
as substrate. The Penicillium chrysogenum fungus has showed the best results for CMCase =
0.294 UI/mL, FPase = 0.058 UI/mL, Avicelase = 0.010 UI/mL and Xylanase = 0.644 UI/ mL
enzyme, using coconut bagasse and cashew stem as substrates. The Penicllium chrysogenum
fungus showed enzymatic activities using only the coconut as substrate for CMCase = 0.233
UI/mL, FPase = 0.031 to 0.032 UI/ mL, Avicelase = 0.018 to 0.020 UI/mL and Xylanase =
0.735 UI/ mL. Thus, it can be concluded that the used organisms and substrates have offered
potential for enzyme production processes in a semi-solid cultivation.
Keywords: Penicillim chrysogenum, experimental design, CMCase, Avicelase, Xylanase,
FPase.
Dedico esta Dissertação aos meus pais
e irmãos.
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora Profa. Gorete Ribeiro de Macedo que durante
todos esses meses sempre vibrou com o trabalho e incentivou todos com seu
entusiasmo a persistir, com toda a sua sabedoria.
Aos meus pais que sempre me mostraram o valor da educação.
Aos meus amigos Pedro Ferreira, Pedro Henrique, Ruthinéia, Nathália Araújo e
Paulo Fortunato pelo incentivo e as conversas durante todos esses meses.
Ao meu irmão Diego e a minha irmã Maria Carolina pela confiança e o incentivo
que sempre me passaram.
Aos meus amigos e amigas de Fortaleza, em especial ao João Feijó, sempre
presente em todos os momentos vitoriosos na minha vida.
À Profa. Cristiane pelo apoio ao trabalho.
Aos amigos do LEB Francisco Canidé, Alexandre Guilherme, Carlos Padilha e
Michelle Vaz pela companhia no laboratório e apoio na produção das enzimas.
Ao Prof. Everaldo, excelente professor, pela colaboração no planejamento
experimental.
A todos os membros da banca: Profa. Gorete Ribeiro, Profa. Cristiane Fernandes
Prof. Mateus de Freitas, Profa. Sharline Florentino que aceitaram fazer parte da
banca examinadora trazendo importantes contribuições para o trabalho.
As minhas queridas e companheiras Francisca Pereira, Angelinne Costa, Paula
Luciana, Emilianny Rafaely, e Jútima Siqueira pelo apoio, companheirismo, pela
amizade criada e as risadas em todos os momentos.
A dona Neide pela amizade criada e a Mazinha pela ajuda em todos os
momentos que eu precisei.
Em especial a minha querida mãe Maria de Lourdes que sempre torceu pelo
meu sucesso, me incentivando, dando apoio e carinho.
Dissertação de Mestrado
SUMÁRIO
Lista de figuras................................................................................................................... x
Lista de tabelas................................................................................................................... xiii
Nomenclatura..................................................................................................................... xiv
1. Introdução.....................................................................................................................
1
2. Revisão Bibliográfica....................................................................................................
5
2.1 - O coco.......................................................................................................................
6
2.2 - O caju......................................................................................................................... 8
2.3 – Fungos Filamentosos................................................................................................
10
2.3.1 - Fungo: Penicilum chrysogenum.............................................................................
11
2.4 – Enzimas..................................................................................................................... 13
2.4.1 - Celulases................................................................................................................
13
2.4.1.1. Endoglucanases..................................................................................................... 16
2.4.1.2. β-glucosidase........................................................................................................
16
2.4.1.3. Exoglucanases....................................................................................................... 16
2.4.2 – Pectinases............................................................................................................... 17
2.4.3 – Xilanase.................................................................................................................
18
2.5 - Fermentação Semi-Sólida.......................................................................................... 19
2.5.1 . Vantagens da FSS...................................................................................................
21
2.5.2. Desvantagens da FSS............................................................................................... 22
2.5.3. Parâmetros que influenciam a produção enzimática por FES................................
22
2.5.3.1. Umidade................................................................................................................ 22
2.5.3.2. Temperatura..........................................................................................................
23
2.5.3.3. pH.........................................................................................................................
23
2.5.3.4. Tamanho da partícula............................................................................................ 23
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
janeiro/ 2014
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Dissertação de Mestrado
2.5.3.5. Concentração inicial do inóculo...........................................................................
24
3. Material e Método.........................................................................................................
25
3.1 - Bagaço de coco......................................................................................................... 26
3.2 - Pedúnculo de caju..................................................................................................... 26
3.3
- Caracterização química e físico-química do bagaço de coco verde e do
pedúnculo de caju.............................................................................................................. 27
3.3.1. Determinação de sólidos totais................................................................................
27
3.3.2. Determinação de extrativos.....................................................................................
28
3.3.3. Determinação de polissacarídeos............................................................................. 28
3.3.3.1. Hidrólise com H2SO4 (72%)................................................................................
28
3.4 - Determinação de lignina..........................................................................................
29
3.4.1. Lignina insolúvel....................................................................................................
29
3.4.2. Teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais..................................................
29
3.4.3. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)..
30
3.5 - Determinação da pectina...........................................................................................
31
3.6 - Determinação dos minerais......................................................................................
32
3.7 - Microrganismos......................................................................................................... 33
3.8 - Isolamento de uma linhagem fúngica produtora de celulase................................
33
3.8.1. Identificação da linhagem fúngica produtora de celulase........................................ 33
3.8.2. Meio para Triagem em placa de Petri......................................................................
34
3.9 - Ativação do inóculo................................................................................................... 34
3.9.1. Obtenção da solução de esporos e preparo do inóculo............................................
35
3.10 - Processo de Fermentação.....................................................................................
36
3.10.1. Condições da Fermentação....................................................................................
36
3.11 - Cinética da Fermentação......................................................................................... 37
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Dissertação de Mestrado
3.12 - Extração das enzimas.............................................................................................. 37
3.13 - Determinação da enzima Celulase..........................................................................
38
3.13.1. Determinação da atividade CMCase (Endo-1,4-β-Dglucanase)..........................
38
3.14 - Determinação da atividade FPase...........................................................................
39
3.15 - Determinação da atividade da β –glicosidase........................................................
39
3.16 - Determinação da atividade da Xilanase..................................................................
40
3.17 - Determinação da atividade da Avicelase................................................................. 40
3.18 - Determinação da atividade da Pectinase.................................................................
41
3.19 - Determinação de açúcares redutores.......................................................................
42
3.20 - Determinação da quantificação de proteínas por Bradford.....................................
42
3.21 - Determinação da celulose residual..........................................................................
43
3.22 - Planejamento Experimental..................................................................................... 44
4 - Resultados e Discussão................................................................................................ 46
4.1 - Caracterização dos resíduos: Bagaço do coco e pedúnculo de caju.........................
46
4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde............................................... 49
4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde............................................... 49
4.3 - Determinação dos minerais do pedúnculo de caju....................................................
51
4.4 - Seleção de microrganismo produtor de celulase.......................................................
53
4.4.1. Isolamento de linhagem fúngica produtora de celulases........................................
53
4.4.2. Triagem em meio Avicel.........................................................................................
54
4.5 - Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando um
fungo isolado da casca do coco nas fermentações com o coco como
substrato............................................................................................................................. 56
4.6 - Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o
Penillium chrysogenum nas fermentações com a mistura de bagaço do coco e o
pedúnculo de caju como substratos................................................................................... 60
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
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Dissertação de Mestrado
4.7 - Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o
Penillium chrysogenum nas fermentações com apenas o bagaço do coco como
substrato............................................................................................................................. 69
4.8 - Cinética do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) e do Penicillium
chrysogenum..................................................................................................................... 76
5. Conclusões....................................................................................................................
84
6. 6. Referências Bibliográficas............................................................................................. 86
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Dissertação de Mestrado
LISTA DE FIGURAS
Figura 2.1 - Representação esquemática das partes estruturais características do coco
verde. Fonte: EMBRAPA, 2010........................................................................................ 6
Figura 2.2 - Pedúnculo de caju. Fonte: EMBRAPA, 2000................................................ 9
Figura 2.3 - Ilustração da Placa Penicillium chrysogenum. Fonte: SUPER NOVA
CIÊNCIA, 2012................................................................................................................. 12
Figura 2.4 - Representação do Sistema enzimático envolvido na degradação da
celulose. Fonte: Adaptado por Aron et al., 2005.............................................................. 14
Figura 2.5 -Estrutura da parede celular de plantas. Fonte: IPPA, 2008........................
15
Figura 2.6 - Estrutura primária de uma molécula de pectina. Fonte: Alkorta, et al.,
1998................................................................................................................................... 17
Figura 2.7 - Fermentação semi-sólida em frascos Erlenmeyer em BOD. Fonte:
Autor.................................................................................................................................. 20
Figura 3.1 - Representação dos resíduos utilizados como substratos: (a) bagaço do coco
e (b) pedúnculo de caju...................................................................................................... 27
Figura 4.1 - Aspecto da morfologia cultural da cepa de fungo isolado da casca do coco
(Aspergillus fumigatus)...................................................................................................... 54
Figura 4.2 - Crescimento do fungo Penicillium chrysogenum em palca de Petri com
Avicel................................................................................................................................. 55
Figura 4.3 - Crescimento do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) da casca do coco
em palca de Petri com Avicel............................................................................................ 55
Figura 4.4 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a
atividade da CMCase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do
coco como subtrato............................................................................................................ 57
Figura 4.5 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a
atividade Avicelase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do
coco como subtrato............................................................................................................ 57
Figura 4.6 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
CMCase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como
substrato............................................................................................................................. 58
Figura 4.7 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Avicelase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como
subtrato............................................................................................................................... 59
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
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Dissertação de Mestrado
Figura 4.8 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo
de caju como subtratos........................................................................................................... 62
Figura 4.9 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo
do caju como subtratos..........................................................................................................
63
Figura 4.10 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo
do caju como subtratos..........................................................................................................
64
Figura 4.11 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do
caju como subtratos...............................................................................................................
64
Figura 4.12 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo
de caju como substratos.........................................................................................................
66
Figura 4.13 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Avicelase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o
pedúnculo de caju como substratos...................................................................................
66
Figura 4.14 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo
de caju como substratos.........................................................................................................
67
Figura 4.15 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática FPase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de
cajucomo substratos............................................................................................................... 68
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Dissertação de Mestrado
Figura 4.16 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
subtrato..................................................................................................................................
71
Figura 4.17 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
subtrato..................................................................................................................................
71
Figura 4.18 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
subtrato..................................................................................................................................
72
Figura 4.19 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
subtrato..................................................................................................................................
72
Figura 4.20 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
substrato.................................................................................................................................
73
Figura 4.21 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
substrato.................................................................................................................................
74
Figura 4.22 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
substrato................................................................................................................................
75
Figura 4.23 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática FPase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando apenas o bagaço do coco como
substrato.................................................................................................................................
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xiii
Dissertação de Mestrado
Figura 4.24 - Perfil dos teores de açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose
residual produzidos pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus) durante 10 dias de
cultivo....................................................................................................................................
77
Figura 4.25 - Perfil dos teores de açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose
residual produzidos por Penicillium chrysogenum durante 10 dias de cultivo...................... 78
Figura 4.26 - Perfil de atividade de CMCase e Avicelase durante os 10 dias na
fermentação semi-sólida, utilizando o fungo isolado (Aspergillus fumigatus).................
80
Figura 4.27 - Perfil de Atividade das enzimas CMCase, Xilanase, Avicelase e FPase
durante os 10 dias na fermentação semi-sólida, utilizando o fungo Penicillium
chrysogenum e o coco como substrato..................................................................................
81
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
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Dissertação de Mestrado
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1 - Produção de coco e área produzida nos principais países................................
8
Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os valores de cada componente presente no
extrato hidrolisado.................................................................................................................
30
Tabela 3.2 - Condições instrumentais utilizadas no ICP/OES..........................................
32
Tabela 3.3 - Parâmetros para a identificação dos minerais..............................................
32
Tabela 3.4 - Composição do meio de triagem em placas de Petri........................................
34
Tabela 3.5 - Ensaios do planejamentos fatorial ( 22 )..........................................................
44
Tabela 3.6 - Proporção da matéria prima e microrganismo utilizado nas fermentações.....
45
Tabela 4.1 - Caracterização do bagaço do coco verde e do pedúnculo de caju..................... 47
Tabela 4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde.....................................
50
Tabela 4.3 - Determinação dos minerais no pedúnculo de caju............................................
52
Tabela 4.4 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da
CMCase e Avicelase produzida pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus).......................
56
Tabela 4.5 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da
CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo Penicillium chrysogenum
usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como substratos.....................................
61
Tabela 4.6 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da
CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo Penicillium chrysogenum
usando o bagaço do coco como substrato............................................................................
70
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
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Dissertação de Mestrado
NOMENCLATURA
Aa Atividade de água
ABNT Associação Brasileira de Normas Técnicas
abs
Absorbância
ACC Amêndoa da castanha de caju
ART Açúcares redutores totais
A.E
Atividade enzimática
DNS ácido 3,5 – dinitro-salicílico
FES
Fermentação em estado sólido
FS
Fermentação submersa
FSS
Fermentação semi-sólida
FPU
Uma unidade de atividade em papel de filtro
h
Hora
L
litro
min
Minutos
N
Nitrogênio
P
Fósforo
p/v
Peso por volume
Pa
pressão de vapor de água do substrato
Pt.
Proteína
rpm
Rotações por minuto
UI/mL Unidade de atividade por mililitro
v/v
Volume por volume
PDA Potato Dextrose Agar
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
janeiro/ 2014
xvi
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
Capítulo 1 - Introdução
1. Introdução
O Brasil é o maior produtor mundial de frutas tropicais, apresentando terras de
excelentes qualidades que são utilizadas para cultivo de uma ampla variedade de frutas. Na
região Nordeste do Brasil destacam-se os subprodutos de frutas em virtude da ampla
disponibilidade (Rogério, 2005). Podem ser citados então os subprodutos oriundos do cultivo
e do processamento agroindustrial de abacaxi, abacate, banana, caju, coco, mamão, manga,
maracujá, uva, acerola, goiaba, laranja, tomate e urucum.
O grande consumo de água de coco verde (in natura ou industrializada) vem
aumentando a geração de resíduo oriundo da casca desse fruto, o que acaba representando um
grave problema quanto ao descarte desse material, principalmente nas grandes cidades onde
são levados para lixões e aterros sanitários. As cascas de coco verde correspondem
aproximadamente 85% do peso bruto do fruto e a sua degradação leva em torno de 8 anos
(Rosa et al., 2001). O coco verde, por ser um material rico em matéria orgânica e reciclável,
pode ser utilizado na fabricação de vários produtos. Isso em decorrência da sua composição,
que tem como principais componentes a celulose e hemicelulose, os quais proporcionam
grandes índices de rigidez e dureza. A indústria de processamento de coco (verde ou maduro)
gera uma quantidade significativa de resíduos. Nesse caso, “coir” é o nome dado às fibras que
constituem o mesocarpo grosso ou casca do coco (Cocos nucifera L.) e que são usadas para
produção de tapetes, esteiras e como substrato agrícola.
Deve-se considerar ainda que, no Nordeste do Brasil é encontrada a maior diversidade
do gênero Anacardium, por essa razão, (Johnson, 1973) considerou o Estado do Ceará como
local de origem do cajueiro. Além disso, cerca de 98% da área brasileira cultivada com
cajueiro, está situada no Nordeste segundo Pessoa et al., (1995). No Brasil, devido a grande
presença de espécies, este se divide em dois grupos: o tipo comum (gigante), o mais
difundido, apresentando porte elevado com altura variando de 5 a 8 m, podendo atingir até 15
metros. O diâmetro da copa, em geral, varia de 12 a 14 m e, em casos excepcionais, até 20 m
(Barros, 1995). Por sua vez, cajueiros do tipo anão precoce caracterizam-se por apresentar
porte baixo, em média 4 m, diâmetro da copa de 6 a 8 m, grande precocidade etária e
florescimento entre 6 e 18 meses (Barros et al., 1998).
A amêndoa da castanha de caju é rica em vitaminas, ácidos graxos não saturados e
proteínas. O pedúnculo apresenta teores elevados de vitamina C, açúcares, minerais (cálcio,
ferro e fósforo) e fibras. O aproveitamento do pedúnculo de caju é inferior a 20% do total
2
Capítulo 1 - Introdução
produzido, sendo utilizado para o consumo in natura, fabricação de doces, compotas e
bebidas diversas. Uma das causas para esse baixo aproveitamento está relacionada ao tempo
de deterioração do mesmo, que ocasiona excessivas perdas no campo e na indústria (Campos,
2003). O agronegócio do caju é uma das principais atividades do Nordeste brasileiro com
produção de cerca de 200 mil toneladas de amêndoas e dois milhões de toneladas de
pedúnculo. A utilização industrial do pedúnculo de caju é direcionada principalmente ao
mercado interno com a produção de sucos e doces (Oliveira e Andrade, 2007) que geram
resíduos, o pedúnculo de caju, que, em geral são reaproveitados para enriquecimento da ração
animal ou descartados por falta de incentivo de seu uso na alimentação humana.
Como alternativa para utilizar materiais que seriam descartados e sem qualquer tipo de
cuidado uma alternativa seria a utilização desses resíduos na produção de enzimas por
fermentação utilizando fungos filamentosos, pelo fato de serem excelentes microrganismos
que se adapatam as condições adversas, como baixa umidade, pH e temperaturas variadas. O
processo de fermentação semi-sólida (FSS) envolve o crescimento e metabolismo de
microrganismos, na ausência ou quase ausência de água livre, empregando um substrato
sólido, ou suporte. A FSS se apresenta como uma tecnologia para usar resíduos gerados,
como substratos, diminuíndo possíveis problemas ambientais (Rocha, 2010). Processos
utilizando substratos sólidos são economicamente importantes para os países como Brasil,
com uma abundância de biomassa e resíduos agroindustrais, que podem ser utilizados como
matérias-primas baratas (Castilho et al., 2000). Esta técnica tem muitas vantagens sobre a
fermentação submersa incluindo altos rendimentos e a baixa demanda de energia (Krishna,
2005).
Os resíduos agrícolas contêm de 20 a 60% de celulose, 20 a 30% de hemicelulose e 15
a 30% de lignina. O bagaço de coco contém aproximadamente 23 a 43% de celulose e o
restante de hemicelulose (3 a 12%) e lignina (35 a 45%) (Rosa et al., 2001). De acordo com
Gouveia et al., (2009) o pedúnculo de caju apresenta 20,56% de celulose, 10,17% de
hemicelulose e 32,26% de lignina.
Os microrganismos que atuam degradando os materiais celulósicos são capazes de
produzir enzimas chamadas de celulases, de acordo com Castro, (2006). Com os valores de
celulose, hemicelulose e lignina presentes no bagaço do coco e do pedúnculo de caju após a
caracterização dos mesmos, é possível a produção de enzimas em especial as celulases, que
são enzimas que atuam na degradação de substratos lignocelulósicos.
3
Capítulo 1 - Introdução
O objetivo deste trabalho foi o estudo da produção de enzimas através da
fermentação em estado sólido, usando como substratos o bagaço de coco e o pedúnculo de
caju seco, utilizando um fungo natural isolado da casca do coco e o Penicillum chrysogenum.
Com base na metodologia do planejamento experimental fatorial e análise de superfície de
resposta, estudou-se a influência da umidade inicial do meio e o do pH.
4
CAPÍTULO II
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
2. Revisão Bibliográfica
2.1. O coco
O gênero Cocus é constituído pela espécie Cocus nucifera L. que, por sua vez, é
composta por algumas variedades. As mais importantes, no âmbito do agronegócio,
socioeconômico e agroindustrial, são as variedades Typica (var. Gigante) e Nana (var. Anã),
que acredita-se ter originado de uma mutação gênica da Gigante (Frutas do Brasil, 2002;
Santos et al.,1996).
O coco, fruto formado a partir de uma semente chamada drupa, é constituído
basicamente por um epicarpo, que consiste em uma camada externa fina e lisa que forma a
sua casca; mesocarpo, camada intermediária fibrosa de onde obtém-se a fibra; endocarpo,
uma camada lenhosa e dura e a castanha chamada de albúmen sólido, que é a parte do fruto de
maior valor comercial, além da água de coco (Figura 2.1). O fruto chega a alcançar o peso
médio de 3 a 4 Kg e a quantidade de água diminui à medida que o coco amadurece (Portal
São Francisco, 2005).
Figura 2.1 - Representação esquemática das partes estruturais características do coco verde.
Fonte: EMBRAPA, 2010.
O fruto do coqueiro é constituído por albúmen líquido (água de coco), albúmen sólido
ou amêndoa, endocarpo e casca. A casca representa em torno de 57% do fruto sendo
composta pelo mesocarpo (fibra e pó) e epicarpo (camada mais externa da casca). O volume e
o peso da casca variam com as condições climáticas da região de plantio, com a adubação,
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6
Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
com os tratos culturais e fitossanitários do coqueiro e com a variedade cultivada (EMBRAPA,
2010).
A fibra de coco extraída do mesocarpo, parte espessa fibrosa do fruto apresenta uma
elasticidade superior a outras fibras vegetais, além de uma elevada capacidade de resistir à
umidade e a altas variações nas condições climáticas. É constituída de materiais
lignocelulósicos, cujas características são a baixa densidade, a boa flexibilidade no
processamento e a facilidade de modificação a agentes químicos, além de ser fonte de
recursos renováveis e biodegradáveis (Pannirselvam et al., 2000; Vale et al., 2006).
Quanto à sua composição, as fibras são formadas basicamente de celulose,
hemicelulose, lignina, pectina e minerais. A celulose é o principal constituinte da estrutura,
sendo um polissacarídeo linear de alta massa molecular formado principalmente de glicose,
responsável pela estabilidade e resistência das fibras. A hemicelulose é um polissacarídeo
formado pela polimerização de vários açúcares (glicose, xilose, galactose, arabinose e
manose) e atua como ligante entre a celulose e a lignina (Passos, 2005).
A lignina é um polímero complexo responsável pela formação da parede celular. Sua
concentração nas fibras influencia na estrutura, na morfologia, na flexibilidade e taxa de
hidrólise. As fibras com alto teor de lignina são de excelente qualidade e alta flexibilidade
(Passos, 2005).
A pectina, um polissacarídeo com função aglutinante, é um dos constituintes da parede
celular. Os componentes minerais são os responsáveis pela formação das cinzas após a
incineração das fibras (Passos, 2005).
As fibras das cascas de coco possuem uma quantidade menor de celulose, contudo, o
percentual de lignina é grande, cerca de duas a quatro vezes maior que os valores existentes
nas fibras de juta e sisal, tornando-a extremamente vantajosas frente às outras fibras. O teor de
lignina nas fibras varia em função da idade do fruto, girando entre 20% nas fibras de coco
jovem e de aproximadamente 35% no fruto maduro (Passos, 2005).
Estima-se que o Brasil possui uma área plantada de 280 mil hectares de coqueiro,
destinados à produção do fruto verde para o consumo da água de coco (Tabela 2.1). As cascas
geradas representam 80% a 85% do peso bruto do fruto e cerca de 70% de todo lixo gerado
nas praias brasileiras representam cascas de coco verde. Este material tem sido direcionado
aos aterros sanitários, com toda a sua matéria orgânica, potenciais emissores de gases estufa
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7
Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
(metano). Assim, proliferando focos de vetores transmissores de doenças, mau cheiro,
possíveis contaminações do solo e destruição da paisagem natural (Rosa et al., 2001).
Tabela 2.1 - Produção de coco e área produzida nos principais países.
País
Produção (ton)
Área Colhida (ha)
Indonésia
19.500.000
2.950.000
Filipinas
15.319.500
3.379.740
Índia
10.894.000
1.940.000
Brasil
2.759.044
287.016
Mundo
60.713.136
11.230.626
Fonte: FAO, 2004.
O reaproveitamento de resíduos agro industriais em processos biotecnológicos tem
sido uma boa solução na reutilização de materiais que podem conter muitas substâncias de
alto valor agregado que, geralmente são rejeitados pelas indústrias, como por exemplo, o
bagaço do coco. Oliveira, (2010) isolou um fungo da casca do coco e produziu enzimas
celulolícas utilizando o bagaço do coco como substrato avaliando uma linhagem de
Trichoderma spp para a produção de enzimas. Em outro trabalho de mesma autoria utilizou o
microrganismo Aspergillus niger NRRL 2001e verificou a influência do pH e da temperatura
na atividade celulase produzida em meio contendo bagaço de coco verde (cocos nucifera l.)
como substrato.
2.2. O Caju
O cajueiro (Anacardium occidentale L.) é uma planta tropical, originária do Brasil.
Apesar de ser encontrada em quase todo o território nacional, a Região Nordeste é
responsável por mais de 90% da produção nacional de caju (Melo Filho, 2002).
O verdadeiro fruto do caju, a castanha, é dotado de amêndoa oleaginosa, com teor de
óleo de 55 a 60%, 15 a 20% de proteínas e em torno de 5% de carboidratos, é consumida no
mercado interno e produto de exportação (Medina et al., 1980). Além de frágil, o pedúnculo é
altamente perecível. A vida útil do caju após a colheita, quando armazenado em temperatura
ambiente não ultrapassa 48 horas; sob-refrigeração à 5 ºC, com 85% a 90% de umidade
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
relativa e devidamente embalado, a vida útil do caju é de cerca de dez a quinze dias (Cruz,
1989; Montenegro et al., 2003).
O pedúnculo pode ser aproveitado de diversas maneiras, como por exemplo, para a
produção de sucos, geléias, cajuína, sorvete entre outros produtos (Aguiar et al., 2000; Paiva
et al., 2000).
A amêndoa da castanha do caju constitui-se o principal produto de utilização do
cajueiro. O líquido da casca da castanha (LCC) e o pedúnculo, entretanto, também são
derivados de grande importância no aproveitamento do cajueiro. O pedúnculo é consumido
“in natura” ou industrializado sob a forma de diversos produtos. O grande valor nutritivo do
pedúnculo é uma característica do fruto (Figura 2.2) sob a forma de vitaminas e sais minerais,
nele encontrando-se a vitamina C em níveis quase cinco vezes maiores que na laranja, tendo
ainda, entre outros, a presença de cálcio, ferro e fósforo. (Cavalcanti, 2002; Araújo, 1995).
Figura 2.2 - Pedúnculo de caju. Fonte: EMBRAPA, 2000.
A cajucultura é uma das cultivares mais importantes no Brasil, principalmente na
economia nordestina, em razão do fruto se destacar como produto de exportação, além do
potencial de agregação de valor por meio do aproveitamento do pedúnculo (Souza et al.,
2004).
No Brasil, a agroindústria do caju está concentrada na região Nordeste, tendo
apresentado em 2008 uma produção anual de 243.253 toneladas, onde os estados do Ceará,
Piauí e Rio Grande do Norte participam com 90% dessa produção (IBGE, 2008). O parque
industrial é composto por 12 empresas (8 no estado do Ceará, 3 no Rio Grande do Norte e 1
no estado do Piauí), onde são processadas anualmente até 360 mil toneladas de castanha,
gerando 70 mil toneladas de amêndoa de castanha de caju (AAC) e 45 mil toneladas de
líquido da casca da castanha (LCC) (Teixeira, 2007). O Ceará representa 50% da área
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
cultivada de caju no país, sendo responsável pela geração de 30 mil empregos diretos e cem
mil empregos indiretos.
A utilização de resíduos, bagaços e cascas oriundos de indústriais de alimentos em
processos biotecnológicos tem sido uma alternativa eficaz para o seu uso, os quais são
descartados sem qualquer tipo de tratamento adequado e agravando os problemas ambientais.
O pedúnculo de caju é um exemplo de material que em sua grande parte é rejeitado, como
observado por Guedes, (2010), que estudou a influência de pré-tratamentos de dois resíduos
lignocelulósicos (bagaço do pedúnculo de caju e casca de coco) utilizados como substratos na
indução à síntese de enzimas celulolíticas. Ribeiro, (2010) estudou o extrato enzimático
celulolítico produzido por Trichoderma reesei ATCC 2768, utilizando-se bagaço do coco e o
pedúnculo de caju. Santos, (2007) observou a produção de pectinases através da fermentação
em estado sólido, usando como substrato o pedúnculo de caju seco e como agente da
fermentação o microrganismo Aspergillus niger CCT 0916. Deste modo, mostra-se o
potencial dos resíduos e bagaços utilizados como substrato para produção de enzimas.
2.3. Fungos Filamentosos
Os fungos são seres vivos eucariontes, multicelulares, alguns unicelulares (leveduras)
que desempenham diversos papéis na natureza. Como por exemplo, os fungos
decompositores, que apresentam um papel importante no ecossistema, decompondo material
orgânico, tornando muito dos nutrientes contidos nele disponíveis para outros organismos. A
decomposição libera dióxido de carbono na atmosfera e retorna compostos nitrogenados e
outras substâncias ao solo, onde eles podem ser utilizados novamente. Suas atividades são tão
necessárias para a continuidade da existência do mundo quanto são aquelas dos produtores.
Para que haja uma classificação adequada em relação a que filo um fungo pertence, as
características
macroscópicas
e
microscópicas
devem
ser
identificadas.
Existem
características que podem descrever fungos pertencentes a mais do que um filo, sendo
algumas dessas específicas.
As colônias aveludadas ou pulverulentas são formadas por fungos multicelulares, os
fungos filamentosos. O corpo de um fungo filamentoso é composto de longos filamentos de
células conectadas, as hifas. Quando elas são divididas em unidades celulares uninucleadas,
são chamadas de hifas septadas. Os septos possuem poros que fazem com que o citoplasma
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
das células se comunique. Em algumas classes de fungos as hifas não têm septos e são
denominadas cenocíticas. O conjunto de hifas é denominado micélio. Este pode ser do tipo
vegetativo ou reprodutor. No primeiro caso, o micélio libera enzimas digestivas sobre o
substrato, permitindo a digestão extracelular do alimento, que depois será absorvido pelo
fungo, isso apenas ocorre nas extremidades. Enquanto houver alimento, o fungo permanecerá
no mesmo local, crescendo continuamente (Rodrigues e Lacaz, 1992).
Os fungos filamentosos podem crescer na faixa entre 1,5 e 11, mas as leveduras não
toleram pH alcalino. Muitas vezes, a pigmentação dos fungos está relacionada com o pH do
substrato.
Os fungos filamentosos atuam com eficiência na degradação de compostos celulósicos
devido à produção de enzimas celulases que reduzem as estruturas dos substratos através da
hidrólise. As principais celulases atuantes na degradação de material lignocelulósico, a partir
da hidrólise, são as endoglucanases, exoglucanases e β-glucosidades (Sun e Cheng, 2002).
Essa degradação ocorre devido ao complexo sistema enzimático produzido pelos fungos
filamentosos, como Celulases, Hemicelulases, Xilanases, Pectinases, Proteases, entre outros.
2.3.1. Fungo Penicillum chrysogenum
Penicillium constituem um grupo de microrganismos que sintetizam grandes
quantidades de metabólicos secundários, em certos casos atingem uma produção de 75% a
mais que outras classes de microrganismos (Cafêu et al., 2005). As espécies de Penicillium
têm uma alta diversificação, tanto na sua morfologia, representada na Figura 2.3, quanto na
produção de metabólitos secundários, como exemplo os antibióticos, micotoxinas,
antioxidantes, anticancerígenos, inseticidas, herbicidas, enzimas e fungicidas, (Frisvad et al.,
2004; Samon et al., 2000).
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
Classificação científica:








Reino: Fungi
Divisão: Ascomycota
Subdivisão: Pezizomycotina
Classe: Eurotiomycetes
Ordem: Eurotiales
Família: Trichocomaceae
Gênero: Penicillium
Espécie: chrysogenum
Figura 2.3 - Ilustração da Placa de Penicillium chrysogenum. Fonte: SUPER NOVA
CIÊNCIA, 2012.
Porém, algumas espécies desse gênero também são produtoras de micotoxinas. A
importância desses compostos tóxicos varia muito de acordo com os fatores ecológicos e
biológicos para cada espécie. As espécies Penicillium citrionigrum e Penicillium islandicum
produzem toxinas potentes, mas como ambas são raras na natureza, as toxinas produzidas por
essas espécies não são consideradas importantes (Pitt, 2002).
O Penicillium é microrganismo oportunista de plantas, espécies desse gênero
encontram-se amplamente distribuídas, e apresentam impactos negativos e positivos. Muitas
espécies de Penicillium são reconhecidas por produzirem metabólicos tóxicos, as micotoxinas
mais importantes encontradas em alimentos são ocratoxina A, pantulina, critinina e
citreoviridina (Pitt, 2002). Em muitas regiões tropicais e subtropicais, o clima permite a
produção agrícola durante o ano todo, porém, essas mesmas condições, alta umidade e ótimas
temperaturas também são propícias ao desenvolvimento de fungos. A deterioração de grãos
armazenados é um problema para a economia (Ribeiro et al., 2003). Doenças de pós-colheita
podem causar grandes perdas em diversos produtos agrícolas. A produção de frutos cítricos
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
geralmente é produzida em regiões subtropicais, muitas vezes distantes do mercado
consumidor, sendo inevitável o seu armazenamento e consequentemente o desenvolvimento
dos fungos (Yahyazadeh et al., 2008). Os fungos estão entre os principais fatores que podem
prejudicar a comercialização de frutas cítricas, perdas econômicas na produção de citrus
podem ser enormes. A indústria de citrus envolve uma grande quantidade de recursos
financeiros no mundo todo, existem diversos fatores que podem modificar a produção de
citrus, sendo a presença de fungos uma das mais importantes, em particular a presença de
fungos como Penicillium italicum e Penicillium digitatum (Gómez-Sanchis et al., 2012).
Numerosas espécies do gênero Penicillium apresentam um valor particular, as espécies
mais conhecidas nesse aspecto são Penicillium notatum, produtor do antibiótico – penicilina,
descoberta por Alexander Fleming em 1928-1929. Na indústria de alimentos destacam-se
Penicillium camemberti e Penicillium roqueforti, estes espécies estão relacionada com a
produção de determinados tipos de queijos (Chavez et al., 2006).
Bhat et al. (1989) encontraram oito endoglicanases em culturas de Penicillum
pinophtluma. Entretanto, Lee et al. (2010), estudando uma nova espécie, o Penicillium
purpurogenum, encontraram uma endoglicanase. Jorgensen et al. (2003) encontraram três
endoglicanases (EGa, EGb1 e EGb2) duas celobioidrolases (CBHa e CBHb) e uma xilanase
(XYL) em culturas do P. brasililianum.
31
2.4. Enzimas
São proteínas especiais que têm ação catalisadora e são produzidas pelas células,
estimulando ou desencadeando reações químicas importantíssimas para a vida, que
dificilmente se realizariam sem a presença delas. Esses biocatalisadores orgânicos são
produzidos pelas células, mas podem evidenciar a sua atividade intra ou extracelularmente. A
característica principal da ação enzimática sobre o organismo é sua especialidade. Cada tipo
de enzima atua sobre um composto ou substrato associado, cuja estrutura deve se encaixar à
enzima de modo que os centros ativos coincidam perfeitamente.
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
2.4.1. Celulases
O conjunto de enzimas envolvidas na degradação da celulose é denominado celulase,
elas são capazes de romper as ligações glicosídicas β-1,4, entre as unidades de glicose. A
maioria dos estudos sobre celulase refere-se a enzimas microbianas devido ao potencial de
converter material celulósico insolúvel em glicose. A celulase é oriunda de microrganismos,
animais e plantas e é formada por C1-celulase, C2-celobiase e exocelulase.
De acordo com Peixoto, (2006) as enzimas celulase podem ser divididas em:
1. Endo-β(1-4) glucanase ou β(1-4) D-glucano-4-glucanohidrolase ou Cxcelulase ou
CMCase: hidrolisa ligações β(1-4) ao acaso dentro da cadeia de celulose liberando glicose,
celobiose e celodextrinas.
2. Exo-β(1-4) glucanase ou Avicelase ou exo glucana-4-glucanohidrolase ou C1
celulase: hidrolisa as ligações glicosídicas da celulose a partir da extremidade não redutora
liberando celobiose;
3. Celobiase ou β(1-4) glicosidase: hidrolisa as ligações do tipo β(1-4) (celobiose,
trealose, gentiobiose) e libera glicose;
4. Exo-β(1-4) D-glucana-glicohidrolase: hidrolisa as ligações β(1-4) glicosídicas de
celodextrinas e libera glicose. A atividade diminui com a diminuição da cadeia do substrato.
A Figura 2.4 representa a ação das enzimas que degradam a celulose.
Figura 2.4 - Representação do sistema enzimático envolvido na degradação da celulose.
Fonte: Adaptado por Aron et al., 2005.
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
Na indústria alimentícia, as celulases são usadas em vários processos, principalmente
na extração de componentes do chá verde, proteína de soja, óleos essenciais, aromatizantes e
do amido da batata doce. Essas enzimas participam ainda dos processos de produção do
vinagre de laranja e do ágar e na extração e clarificação de sucos de frutas cítricas. Na
natureza existe uma grande variedade de microrganismos que produzem celulases, mas
apenas alguns são capazes de degradar a celulose natural.
A maioria das celulases microbianas comercialmente utilizadas é produzida pelas
espécies Trichoderma
viridae, Aspergillus niger e Penicillum oxalicum. O potencial de
mercado destas enzimas tem sido estimado em cerca de 400 milhões de dólares por ano, com
crescente aplicação na produção e desenvolvimento de biocombustíveis e na biotecnologia
(Zang et al., 2006).
A celulase de origem fúngica é produzida quando o microrganismo é inoculado em
meios de culturas que contenham celulose, sefarose (polissacarídeo bastante utilizado na
produção de resinas para a purificação de proteínas), lactose ou celobiose como fonte de
carbono. A maior produtividade é obtida quando se utiliza a celulose na forma pura
(cristalina) ou complexada (Peixoto, 2006). Gao et al., (2008) citam a importância do
interesse nas celulases e suas aplicações industriais: extração de suco de frutas, indústria de
celulose e papel, indústria têxtil etc.
A Figura 2.5 esquematiza a estrutura da parede celular e seus principais componentes.
Figura 2.5 - Estrutura da parede celular de plantas. Fonte: IPPA, 2008.
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
Entretanto, um grande problema se apresenta referente ao custo de produção da
enzima. Na natureza esses microrganismos são bastante eficientes na degradação da celulose,
porém os seus extratos enzimáticos não são tão eficazes como in vitro. Desde modo é
necessário que haja um pré-tratamento da celulose usando ácido ou base, ou até mesmo
moendo, para que haja a destruição das porções cristalinas desse polímero. Assim, a produção
de celulases por meio da fermentação semi-sólida seria uma boa alternativa, já que os
microrganismos são bons produtores desta enzima.
2.4.1.1. Endoglucanases
São enzimas do complexo celulásico, responsáveis pela iniciação da hidrólise,
clivando as ligações glicosídicas da cadeia celulósica de forma randômica. Atuam no meio
das regiões amorfas, liberando oligossacarídeos de diferentes graus de polimerização,
produzindo novas cadeias terminais (Wood et al., 1989; Lynd et al., 2002).
A disposição do sítio ativo das endoglucanas facilita o ataque da enzima ao longo da
cadeia de celulose, permitindo uma redução no grau de polimerização. Isso ocorre devido à
maior exposição das ligações glicosídicas na região amorfa que são mais facilmente atacadas,
pois as interações de hidrogênio que ocorrem entre as cadeias são mais fracas (Pinto, 2006;
Schülein, 2000).
2.4.1.2. β-glucosidase
As β-glucosidases, também denominadas celobiases, possuem a função de hidrolisar a
celobiose gerada pelas celobiohidrolase e endoglucanases em glicose. Estas enzimas não são
consideradas como celulases legítimas, pois não atuam diretamente na cadeia celulósica,
apenas sobre o substrato solúvel. Porém sua presença é muito importante para a eficiência da
hidrólise da celulose, pois remove da mistura a celobiose formada (Medve, 1997; MiettinenOinonen, 2007).
2.4.1.3. Exoglucanases
Atuam nas extremidades redutoras e não redutoras da cadeia de celulose e
oligossacarídeos. Algumas pesquisas mostram que a celobiohidrolase é responsável pela
ruptura física do substrato, acarretando a desestratificação das fibras através do aumento das
regiões intersticiais. Esse fenômeno transforma as regiões cristalinas em amorfas, tornando-as
mais suscetíveis à ação da celulase, aumentando a taxa de hidrólise (Lynd et al., 2002).
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
2.4.2. Pectinases
As pectinases são enzimas capazes de hidrolisar ligações glicosídicas do tipo α-1,4
entre as unidades de ácido galacturônico ou o do seu derivado metoxilado. As pectinases
formam um grupo de enzimas que degradam substâncias pécticas, hidrolisando ligações
glicosídicas ao longo da cadeia carbônica. Podem ser despolimerizantes ou desesterificantes e
são produzidas por plantas, fungos filamentosos, bactérias e leveduras (Figura 2.6) (Bobbio,
1989; Cheftel e Cheftel, 1976; Turquois et al., 1999).
Figura 2.6 - Estrutura primária de uma molécula de pectina. Fonte: Alkorta, et al.,1998.
As pectinas fazem parte de um grupo de substâncias denominadas de substâncias
pécticas, as quais também incluem o ácido péctico, ácido pectínico e protopectina,
apresentando-se como um polissacarídeo complexo de alta massa molecular (Campbell et al.,
1979).
As pectinases foram algumas das primeiras enzimas a serem utilizadas
comercialmente nas preparações de vinhos e sucos de frutas ao redor de 1930 e somente a
partir de 1960, quando os estudos sobre a natureza química de tecidos vegetais se tornaram
mais aparentes, é que os cientistas começaram a utilizar as enzimas mais eficientemente. As
pectinas são de grande interesse para indústria de alimentos. Essas substâncias estão sendo
utilizados na forma de pó, como ingrediente, devido a sua capacidade de atuar como agentes
geleificantes, principalmente na elaboração de geleias.
As pectinases são muito utilizadas nas indústrias de sucos de frutas para reduzir
viscosidade, melhorar e aumentar a eficiência de filtração e de clarificação no tratamento
preliminar da uva em indústrias vinícolas; na maceração, liquefação e extração de tecidos
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
vegetais; na fermentação de chá, café e cacau, para melhorar a extração de óleos vegetais, na
extração de polpa de tomate e no tratamento e degomagem de fibras naturais para as
indústrias têxteis e de papel. As pectinases também são utilizadas para reduzir o amargor
excessivo em cascas de citrus, restaurar o aroma perdido durante secagem e melhorar a
firmeza de pêssego e picles processados. A infusão de pectinase e β-glicosidase aumentam o
aroma e as substâncias voláteis de frutas e vegetais, aumenta a quantidade de agentes
antioxidantes em óleo de oliva extra virgem e reduz a indução ao ranço (Shen et al., 1999).
2.4.3. Xilanase
Xilanases são β-glucanases capazes de catalisar a hidrólise do xilano e que devido à
sua estrutura heterogênea demandam complexo xilanolítico para sua total degradação e não
apenas uma enzima. As xilanases são divididas em endoxilanases e as 1,4- β-xylosidases.
Dependendo de sua origem biológica, uma ou mais isoformas de endo – 1,4-β-xilosidase (1,4β-D-xilano-hidrolase) clivam o xilano randomicamente em suas ligações β-1,4 em pequenos
fragmentos como xilotriose e xilobiose. A β-xilosidase (β- D-xilosídeo-xilohidrolase)
hidrolisa xilobiose e pequenos xilo-oligossacarídeos em regiões não redutoras até xilose.
Endo-xilanases, os maiores componentes do sistema xilanolítico de microrganismos, têm sua
ação facilitada por enzimas acessórias que removem as ramificações da cadeia do xilano
como a α-L-arabinofuranosidase, α-glucuronidase, acetilxilano esterase e ácido felúrico
esterase, entre outras (Prade, 1995; Simão et al., 1997; Zanoelo et al., 2004; Polizeli et al.,
2005; Collins et al., 2005).
As enzimas xilanolíticas são produzidas por uma variedade de microrganismos, no
entanto os fungos são os produtores principais, secretando Xilanases que auxiliam no
branqueamento das xilanas. Atualmente, a produção de Xilanases em escala industrial é
dominada por espécies de Trichoderma e de Aspergillus (Haltrich et al., 1996; Phan et al.,
1998).
A importância das enzimas Xilanases está relacionada com seu potencial de aplicação
na indústria e sua eficiência nos processos de clareamento de polpa de papel, recuperação de
fibras celulósicas têxteis e bioconversão da biomassa em combustíveis e substâncias químicas
(Prade, 1995). Na panificação, por exemplo, as Xilanases são adicionadas ao pão para
aumentar o seu volume específico, determinando a textura do miolo e seu sabor final
(Camacho e Aguiar, 2003). Na fabricação de cerveja ocorre liberação de longas cadeias
arabinoxilanas, que aumentam a viscosidade podendo deixar a cerveja turva. As Xilanases
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
auxiliam na solubilização das arabinoxilanas a oligossacarídeos menores, diminuindo sua
viscosidade e conseqüentemente eliminando a turbidez da cerveja. A produção de etanol a
partir de pentoses como a xilose é uma maneira viável que vem sendo estudada (Rizzatti,
2004).
De acordo com Medeiros, (2007) foi possível verificar o potencial de Xilanases
presentes no filtrado de cultura e de xilanases purificadas de Penicillium chrysogenum no
processo de branqueamento de polpa celulósica de pseudo caule de bananeiras frutíferas.
Justificando o seu potencial para a produção da enzima Xilanase como descrito neste trabalho.
2.5. Fermentação Semi-Sólida
A fermentação semi-sólida (FSS) também chamada de fermentação sólida ou em
estado sólido vem se destacando nos estudos e avanços obtidos no aproveitamento de
resíduos. A FSS é um processo microbiano que se desenvolve na superfície de materiais
sólidos, que apresentam a propriedade de absorver ou de conter água, com ou sem nutrientes
solúveis. Estes materiais sólidos podem ser biodegradáveis ou não. Para a FSS, é necessário
que os microrganismos cresçam com nutrientes difusíveis sob ou sobre a interface líquidosólido, o substrato deve garantir as condições necessárias ao desenvolvimento dos mesmos,
para se evitar o gasto com pré-tratamentos severos, e com substâncias que venham a ser
adicionadas ao substrato por falta de algum elemento importante (mineral) ao crecimento do
microrganismo (Viniegra-Gonzalez, 1997).
Este tipo de fermentação se caracteriza por ser de dois tipos: uma, em que as
condições para o estado sólido são propiciadas pelo próprio substrato, representado na Figura
(2.7). Na outra FSS, o desenvolvimento do processo se dá utilizando um suporte inerte
(Couto; Sanromán, 2005; Moraes et al., 2001).
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
Figura 2.7 - Fermentação semi-sólida em frascos Erlenmeyer em BOD. Fonte: Autor.
A aplicação comercial da FSS pode ser dividida em dois tipos (Mitchell et al., 2002):
a) Aplicações sócio-econômicas, tais como: a compostagem de resíduos, valorização
de produtos lignocelulósicos e fibras alimentares;
b) Aplicações economicamente lucrativas, tais como: a produção de enzimas, ácidos
orgânicos e alimentos fermentados.
A FSS apresenta diversas vantagens devido a suas características físicas e químicas,
especialmente sua reduzida atividade de água. A FSS difere bastante da Fermentação
Submersa (FSm), relativamente à esporulação e produção de enzimas, assim como de
metabólitos secundários, bem como no modo de mistura e difusão. É um processo que
favorece do reduzido teor de água, gerando um processo industrial limpo, com baixos níveis
de água residual, economizando energia no processo de recuperação (“downstream”)
(Viniegra-Gonzalez, 1997).
De acordo com alguns grupos de pesquisadores, o uso da FSm era melhor, pois,
acreditava-se ser ela mais conveniente e mais produtiva. Nos últimos cinquenta anos esses
grupos cresceram mais e mais e a FSS foi sendo esquecida. Foi uma decisão mais ou menos
arbitrária, pois não levou em conta o conhecimento científico dominado nos dois processos,
nem se fez qualquer tipo de comparação efetiva. As razões foram provavelmente a maior
facilidade para conduzir o processo de FSm, a monitoração e o controle (Smail et al., 1995).
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
2.5.1. Vantagens da FSS
De acordo com os autores Bramorski (1997) e Lu, Maddox e Brooks (1998) algumas
vantagens da FSS em relação a FSm :
• O meio é geralmente simples, constituído de produtos agrícolas não refinados que
podem conter todos os nutrientes necessários para o crescimento do microrganismo. Isto
significa que o pré–tratamento pode ser simplesmente um cozimento, com água para
umidificar ou dilatar o substrato, ou a quebra do substrato na superfície para aumentar a
acessibilidade aos nutrientes internos ou a moagem de grandes partículas de substrato para
partículas menores;
• O tratamento de efluentes e disposição de resíduos é geralmente simples ou
minimizado. Geralmente todo o produto é utilizado, principalmente se é intencionado ao uso
como suplementação alimentar de animais;
• O custo de esterilização é reduzido, pois se aquece menos água;
• O espaço ocupado pelo equipamento de fermentação é pequeno, considerando-se o
rendimento do produto. Utiliza-se menor quantidade de água e o substrato é concentrado;
• Como a maioria das bactérias requer altos níveis de mistura líquida, a FSS exclui, ou
reduz, sensivelmente, o problema da contaminação bacteriana;
• O meio é facilmente aerado, desde que haja espaço entre as partículas do substrato;
• A solubilidade e difusão de oxigênio e outros gases, são maiores na FSS;
• O resíduo remanescente possui um volume reduzido e este resíduo não apresenta
condições para o desenvolvimento de patógenos;
• Geralmente, o único componente necessário a ser adicionado ao meio é água,
embora, ocasionalmente, outros nutrientes como fonte de nitrogênio ou minerais possam ser
adicionados;
• Torna-se possível a obtenção de esporos que são impossíveis de se obter em cultura
submersa;
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
• Menor custo dos equipamentos;
• Exige menor demanda de energia.
2.5.2. Desvantagens da FSS
• Os tipos de microrganismos que podem ser usados são limitados, em função das
condições do processo, tais como: baixa concentração de água livre.
• Em operações de grande escala, o calor gerado pelo metabolismo microbiano deve
ser removido, o que se torna mais difícil na FSS que no processo submerso;
• A transferência de oxigênio entre as partículas do meio pode se tornar um problema,
quando se utiliza granulometria do substrato muito elevado;
• Medidas de pH, O2, CO2 e cálculo de rendimento de produto são mais complexos;
• Controle de temperatura é crítico e, muitas vezes, é necessário controlar a
composição da atmosfera no que diz respeito a O2, CO2 e outros metabólitos voláteis;
• A mistura dificulta o controle de crescimento microbiano e de variáveis como
agitação, aeração e concentração de nutrientes e produtos.
2.5.3. Parâmetros que influenciam a produção enzimática por FSS
2.5.3.1. Umidade
A umidade do meio de cultivo é um dos principais parâmetros que influencia a
fermentação em estado sólido. O tipo de substrato, o microrganismo utilizado e o produto
final desejado são os principais fatores que determinam o teor de umidade que o substrato
deverá ser presente.
O substrato com a umidade adequada deverá apresentar condições para que haja
transferência de nutrientes e de oxigênio. No entanto, as partículas devem apresentar aberturas
que facilitam a passagem de gases e do calor. Portanto um alto teor de umidade acabaria
prejudicando a porosidade do meio, e assim diminuiria as trocas dos gases e aumentaria a
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
tempetatura interna do meio. Entretanto, se a umidade for muito baixa irá prejudicar o
crescimento do microrganismo, portanto irá influenciar no produto final em interesse. A
umidade na fermentação sólida pode variar de 18 a 85%, variando em função da capacidade
de absorção do meio de cultivo utilizado (Del Bianchi et al., 2001, citados por Lima, et al.,
2001).
2.5.3.2. Temperatura
O crescimento microbiano gera calor que deve ser dissipado, pois altas temperaturas
prejudicam o crescimento dos microrganismos. Um dos problemas da FES é a remoção do
calor. O uso da refrigeração mostra-se inadequado para dissipar o calor metabólico (Hasan,
2002). Para que haja um controle do calor, pode-se injetar ar comprimido, controlar a
temperatura do equipamento (Schmidell et al., 2001).
2.5.3.3. pH
O controle do pH durante a FES é muito difícil de ser realizado devido à
heterogeneidade e consistência do material. Uma maneira de controlar a variação do pH é a
utilização de substratos com boa capacidade tamponante ou adição de soluções-tampão
durante a etapa de umidificação do substrato (Schmidell et al., 2001).
2.5.3.4. Tamanho da partícula
O tamanho da partícula é requisito muito importante, pois está diretamente associado
as trocas gasosas, ao crescimento do microrganismo e a disponibilidade de recursos para o
consumo do microrganismo. Por tanto, é importante a escolha do tamanho das partículas, por
que partículas pequenas oferecem uma maior área de contato, o que é importante para o
crescimento do microrganismo, porém partículas muito pequenas acabam se aglomerando,
dificultando assim a respiração e aeração do meio fermentativo, ocasionando um baixo
crescimento do microrganismo. No entanto, partículas maiores favorecem uma melhor
respiração e aeração, porém limita o crescimento do microrganismo. Assim é importante
determinar o tamanho adequado de partícula para satisfazer a condição respiração/aeração e o
crescimento microbiano (Hasan, 2002).
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Capítulo2 - Revisão Bibliográfica
2.5.3.5. Concentração inicial do inóculo
Sandhya et al., (2005) afirmaram que o tamanho do inóculo é um importante fator
biológico, o qual determinará a biomassa produzida pela fermentação. Portanto, uma
quantidade adequada de concentração de inóculo, em relação à quantidade de substrato
utilizado, é necessária para garantir a fermentação do meio, suprir a necessidade e não esgotar
os nutrientes necessários para o desenvolvimento microbiano.
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CAPÍTULO III
MATERIAL E MÉTODOS
Capítulo 3 - Material e Métodos
3. Material e Métodos
3.1. Bagaço de coco
A casca e o mesocarpo fibroso foram utilizados para a obtenção do bagaço da casca de
coco verde. A coleta foi feita em um quiosque na praia de Ponta Negra- Natal (RN). Após a
seleção dos cocos, as etapas do processo foram à dilaceração do material com facão, lavagem,
secagem, moagem e armazenamento. A desidratação dos resíduos da casca de coco foi
realizada em secador do tipo bandeja a 70 °C por cinco dias, e moído em triturador (moinho
tipo Willye, TE – 680, marca: Tecnal), sendo em seguida classificados em peneira de 20
mesh, diâmetro de abertura de 0,850 mm e, posteriormente, armazenados em sacos plásticos à
temperatura ambiente.
3.2. Pedúnculo de caju
O resíduo do caju foi lavado e esmagado para a retirada da polpa, foi obtido a partir do
pedúnculo de caju adquirido de uma empresa produtora de castanhas CIONE, localizada na
cidade de Fortaleza-CE. Os frutos estavam maduros e apresentavam coloração vermelha. Os
cajus foram lavados em água corrente, o pedúnculo limpo foi triturado e peneirado para
separação do suco. O material fibroso foi lavado 15 vezes com 3 L de água a cada lavagem
para a retirada dos açúcares (Fawole e Odunfa, 2003). O bagaço úmido foi disposto em
bandejas de polietileno e levados a estufa com circulação de ar a temperatura de 70 ºC por um
período de 48 horas. Após o término da secagem o resíduo foi peneirado para a separação das
partículas maiores.
Os dois resíduos secos e com a granolumetria padronizadas foram usados para a
caracterização físico-química e como meio para o crescimento dos microrganismos na
fermentação semi sólida. Na Figura 3.1 estão respresentados o bagaço do coco verde e o
pedúnculo do caju, respectivamente.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
(a)
(b)
Figura 3.1 - Representação dos resíduos utilizados como substratos: (a) bagaço do coco e (b)
pedúnculo de caju.
3.3. Caracterização química e físico-química do bagaço de coco verde e do
pedúnculo de caju
3.3.1. Determinação de sólidos totais
A metodologia aplicada é da NREL - Determination of Total Solids in Biomass (Sluiter
et al., 2008). Em um béquer de 100 mL, previamente tarado, foi pesads cerca de 3 gramas de
bagaço. O béquer foilevado para estufa 105 °C por 24 horas. Após esse período, o material
então foi colocado em dessecador para efetuar uma nova pesagem. A umidade foi
determinada em triplicata e calculada conforme a Equação (3.1).
(
)
(3.1)
Sendo:
% U = percentual de umidade
Mseca = massa seca obtida pela diferença entre o peso do conjunto depois da estufa e o peso do
béquer.
Múmida = massa úmida obtida pela diferença entre o peso do conjunto antes de ser levado para
estufa e o peso do béquer.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
3.3.2. Determinação de extrativos
Para a determinação de extrativos método adaptado de NREL - Determination of
Extractives in Biomass (Sluiter et al., 2008), foram pesados 3 g de bagaço, que foram
submetidos a um tratamento em um aparelho de Soxhlet, utilizando três reagentes e água por
último em temperaturas diferentes durante 24 horas. Os reagentes utilizados foram o
Diclorometano (50 °C), Etanol/Tolueno (1:2 V/V, 120 °C), Etanol 95% (80 °C) e Água (120
°C).
Ao final do processo extrativo, o cartucho com o material seco foi colocado em estufa
à 100 °C até peso constante. A percentagem de extrativos foi calculada com base na diferença
de massa, conforme a Equação (3.2).
(3.2)
Sendo:
%Ext: percentual de extrativos
Mi: massa seca não extraída
Mf: massa seca extraída
3.3.3. Determinação de polissacarídeos
3.3.3.1. Hidrólise com H2SO4 (72%)
A determinação dos polissacarídeos foi empregado o método da NREL- Determination
of Structural Carbohydrates and Lignin Biomass (Crocker et al., 2008). Uma amostra de
aproximadamente de 2 g (base seca) foi transferida para um béquer de 100 mL e tratada com
13 mL de H2SO4 72%, sob vigorosa agitação, por 7 minutos em um banho com controle de
temperatura a 45,0 ± 0,5 °C.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
A reação foi interrompida com a adição de 50 mL de água destilada, sendo a mistura
reacional transferida para frascos Erlenmeyers de 500 mL, onde se completou o volume de
água adicionando-se 275 mL. O Erlenmeyer foi fechado e autoclavado por 15 minutos a 1,05
atm. O frasco foi então retirado e resfriado até a temperatura ambiente. O material hidrolisado
foi separado dos sólidos por filtração, utilizando-se papel de filtro seco e tarado. O hidrolisado
foi recolhido em um balão volumétrico de 500 mL e o sólido contido no papel de filtro foi
lavado com porções de 50 mL de água destilada até atingir o volume do balão.
3.4. Determinação de lignina
3.4.1. Lignina insolúvel
O material retido no papel de filtro, após a hidrólise ácida, que corresponde à lignina
insolúvel e inorgânica, foi submetido a uma lavagem com água destilada até isenção de
sulfatos (aproximadamente 1500 mL) e seco em estufa à 50 °C. Por diferença de massa, foi
determinado o teor de lignina insolúvel e inorgânico (cinzas). Para se obter o teor de lignina
insolúvel real foi necessário se determinar as cinzas do material retido no papel de filtro.
3.4.2. Teor de cinzas da lignina insolúvel e cinzas totais
Após a determinação da lignina insolúvel em meio ácido, o resíduo no papel de filtro
foi transferido para um cadinho de porcelana previamente tarado. A amostra foi calcinada
lentamente até 300 °C, em seguida, por mais duas horas à 800 °C, em mufla.
Para a determinação das cinzas totais segui a metodologia proposta em NREL Determination of Ash in Biomass (Templeton et al., 2008), foi pesado aproximadamente 2 g
do bagaço em cadinho de porcelana previamente tarado. O material foi digerido em mufla à
300 °C e calcinado à 800 °C por duas horas. Por diferença de peso de massa, o teor de cinzas
da lignina insolúvel e das cinzas totais foi determinado de acordo com a Equação (3.3).
(3.3)
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Capítulo 3 - Material e Métodos
Sendo:
% cinzas = porcentual em massa de cinzas
Mc = massa de cinzas (diferença entre massa do cadinho com cinzas e a massa do cadinho
vazio)
Ma = massa da amostra seca (base seca)
3.4.3. Análise do hidrolisado por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE)
A determinação dos teores de celulose e de hemicelulose depende das concentrações
de carboidratos e de ácidos orgânicos presentes no hidrolisado. Fatores de conversão são
usados para converter as massas destes compostos em massas de celulose e hemicelulose
(Tabela 3.1). Estes fatores se baseiam na estequiometria de conversão dos componentes em
suas moléculas percursoras: celulose ou hemicelulose.
A análise dos carboidratos e ácidos orgânicos foi realizada por Cromatografia Líquida
de Alta Eficiência (CLAE) utilizando a coluna Shim-Pack SCRH-101H (Shimadzu Co. Japan)
com detector de índice de refração- IR a uma temperatura de 65 °C, e uma solução de ácido
sulfúrico 0,005 M utilizada como fase móvel sob fluxo de 0,6 mL/min.
Tabela 3.1 - Tabela de caracterização e os valores de cada componente presente no extrato
hidrolisado.
Componente
Fator de conversão
Celobiose
0,95
Glicose
0,9
Xilose
0,88
Arabinose
0,88
Ácido Acético
0,72
HMF
1,29
Furfural
1,37
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Capítulo 3 - Material e Métodos
O volume de injeção na coluna foi de 20 µL. As amostras foram previamente filtradas
em membranas de 0,22 µm, para remoção de possíveis partículas insolúveis. As
concentrações de cada componente foram obtidas através de curvas de calibração que
correlacionam as concentrações dos padrões preparados com as respectivas áreas dos
cromatogramas.
3.5. Determinação da pectina
Os métodos de determinação de pectinas se baseiam na extração por água quente
seguida por precipitação com álcool e, após a purificação, pesagem na forma de pectato de
cálcio ou ácido livre.
Foram pesados 20 g da amostra em um béquer de 1000 mL, adicionando-se 400 mL de
solução de HCl 0,05 N levando-se para aquecimento por duas horas a 80-90 °C, recolocandose água quando necessário. Após este período a suspensão foi resfriada até temperatura
ambiente e, então, foi transferida para uma proveta de 500 mL completando-se o volume com
água destilada. A solução foi filtrada com auxílio de algodão.
Do extrato filtrado foi medido 200 mL em uma proveta que foi transferido para um
béquer de 1000 mL, acrescentando-se 250 mL de água destilada. A solução foi neutralizada
com NaOH 1 N, usando papel indicador de pH. Após a neutralização, foi adicionado 10 mL
de NaOH 1 N em excesso, com agitação constante. Essa solução ficou em repouso por uma
noite (overnight). No dia seguinte, foi adicionado 50 mL de ácido acético (1 N) e após 5
minutos foram acrescentados 25 mL de solução de CaCl2 (1 N), com agitação. A solução foi
colocada em ebulição por 2 minutos e depois deixou-se em repouso por 3 horas. Logo em
seguida, a mesma foi filtrada com papel de filtro devidamente tarado. O precipitado foi então
lavado com água destilada fervendo, usando-se nitrato de prata para verificar a presença de
cloretos. O papel de filtro contendo o pectato de cálcio foi colocado na estufa a 105 °C até
peso constante (Rangana, 1979). A pectina foi expressa em % de pectato de cálcio através da
Equação (3.4).
(
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) (
)
(3.4)
31
Capítulo 3 - Material e Métodos
3.6. Determinação dos minerais
Após a determinação do teor de cinzas, os mesmo foram solubilizados com ácido
nítrico (10%) e submetidos às análises por Espectrometria de Emissão Ótica em Plasma
Indutivamente Acoplado (ICP/OES)-(Tabelas 3.2 e 3.3). Para a determinação dos minerais
presentes na constituição dos resíduos.
Tabela 3.2 - Condições instrumentais utilizadas no ICP/OES.
Parâmetros
Condições
Potencial do plasma
1150 W
Gás refrigerante
4mL/min
Gás auxiliar
0,5 mL/min
Visão
Axial
Nebulizador
MiraMist
Pressão de nebulizador
0,16 μPa
Tabela 3.3 - Parâmetros para a identificação dos minerais.
Elemento
λ (nm)
*(LD)
**(LQ)
Ca
422,673
0,3333
1
Cu
324,754
0,01
0,03
Fe
259,94
0,01
0,03
P
178,29
0,01
0,03
Mg
383,826
0,3333
1
Mn
293,93
0,01
0,03
K
766,491
0,3333
1
Na
588,995
0,3333
1
Zn
213,856
0,01
0,03
*LD-Limite de detecção
**LQ-Limite de quantificação.
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Método
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
USEPA 6010C
32
Capítulo 3 - Material e Métodos
3.7. Microrganismos
Um dos agentes de fermentação que foi usado é uma linhagem do fungo filamentoso
Penicilllium chrysogenum (807) da coleção ARS Culture Collection – BFPM Research Unit,
National Center for Agriculture Utilization Research e um fungo isolado casca do coco.
3.8. Isolamento de uma linhagem fúngica produtora de celulase
Um fungo produtor de celulases foi isolado da casca de coco. A linhagem foi
inoculada em frascos Erlenmeyer contendo caldo batata-dextrose e incubadas à 30 °C em
Incubadora Refrigerada com Agitação orbital a 200 rpm (TE-421, TECNAL). Após 48 horas,
as cepas foram transferidas para placas de Petri contendo ágar celulose com a seguinte
composição: 0,5 g/L de MgSO4 (sulfato de magnésio); 0,5 g/L de KCl (cloreto de potássio);
3,0 g/L de NaNO3 (nitrato de sódio); 0,01 g/L de FeSO4.7H2O (sulfato de ferro); 1,0 g/L de
K2HPO4 (fosfato de potássio); 15 g/L de ágar-ágar; 5,0 g/L de celulose microcristalina. As
placas foram incubadas à 30 °C por 120 horas (Braga et al., 2009). As colônias que
apresentaram halo foram selecionadas como produtoras de celulases.
3.8.1. Identificação da linhagem fúngica produtora de celulase
O microrganismo foi identificada no laboratório BIOTRENDS, localizado em
Fortaleza. O microrganismo foi cultivado em placas de Petri contendo o meio Ágar Batata
durante 5 dias à 30 °C para ativação e validação de pureza. A cultura foi crescida em meio
Caldo Batata por 24 h e utilizada na extração de DNA com o detergente catiônico CTAB
(brometo de cetil-trimetilamônio), baseado no protocolo descrito por Warner, (1996). Após
quantificação e avaliação de pureza, o DNA genômico foi utilizado nas reações de PCR para
amplificação da região compreendendo o espaço Interno Transcrito (ITS1), o gene 5,8S e o
espaço Interno Transcrito (ITS2) utilizando os iniciadores ITS1 (5’-CTT GGT CAT TTA
GAG GAA GTA A-3’) e ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA TATGC-3’) (White et al.,
1990). Os produtos de PCR após serem analisados por eletroforese em gel de agarose foram
purificados, quantificados e utilizados nas reações de sequenciamento. Foram realizadas 2
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Capítulo 3 - Material e Métodos
reações de sequenciamento utilizando os iniciadores ITS1 e ITS4. As duas sequências obtidas
foram de ótima qualidade e após alinhamento foi possível obter uma sequência consenso com
tamanho de 610 pb.
3.8.2. Meio para Triagem em placa de Petri
O fungo foi cultivado em meio sintético contendo AVICEL (Fluka Biochemika, Suiça)
como única fonte de carbono. A composição do meio é mostrada na Tabela 3.4. Este meio foi
esterilizado a 1 atm por 20 min.
Tabela 3.4 - Composição do meio de triagem em placas de Petri.
Componentes
Concentração (g/L)
NaNO3
3,0
K3PO4
1,0
MgSO4
0,5
KCl
0,5
FeSO4.7H2O
0,01
Agar
20,0
Avicel
5,0
3.9. Ativação do inóculo
Após ser retirado da ampola na qual estava armazenado,o microrganismo Penicillium
chrysogenum foi inoculado em placas contendo agar batata dextrose (BDA) que foram
incubadas a ± 28 °C por 7 dias sendo, em seguida, realizados repiques em novas placas com a
mesma constituição. Os esporos foram retirados das placas adicionando-se 2 mL de água
esterilizada. Deste modo, eles eram usados na etapa de ativação e utilizados para o primeiro
repique em meio BDA em placas de Petri durante 5 dias à 30 ºC, bem como para a realização
do segundo repique para a produção do inóculo da fermentação.
Os esporos do segundo repique foram utilizados para obtenção de grande quantidade
de esporos no meio de sabugo de milho. Cada repique podia ser mantido sob refrigeração por
um período de quatro meses. (Couri; Farias, 1995)
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Capítulo 3 - Material e Métodos
Para cada Erlenmeyer de 125 mL foram pesados 4,6 g de sabugo de milho seco e
moído e adicionado 6 mL da solução umidificante (solução de nutrientes) foram adicionadas
ao sabugo. A fim de preparar a solução umidificante, foi preparada 100 mL de solução de
fosfato de potássio monobásico 200 g/L (solução A), 100 mL de solução B contendo 3,96 g
de sulfato de zinco heptahidratado e 4,6 g de sulfato de ferro II heptahidratado e 50 mL de
solução 56 g/L de peptona. As soluções foram autoclavadas (20 min à 121 °C) e,
posteriormente, 0,19 mL da solução A e 0,025 mL da solução B foram adicionadas às 50 mL
da solução peptonada. Para inoculação do meio de sabugo de milho foram transferidos 1 mL
de uma solução 0,2% (v/v) de Tween 80 para tubos com os microrganismos de segundo
repique. Com auxílio de uma alça de platina os microrganismos foram suspensos e transferiuse 1 mL para cada frasco com o sabugo. Os frascos foram agitados e incubados em estufa à 30
ºC por um período de 5 dias. Após este período os frascos foram armazenados sob
refrigeração e utilizados como inóculo nos ensaios de fermentação.
3.9.1. Obtenção da solução de esporos e preparo do inóculo
No processo fermentativo, houve a padronização da quantidade de esporos inoculados,
tudo para que não houvesse diferença a mais ou a menos no crescimento do microrganismo e
para que as atividades enzimáticas não ficassem tão diferentes.
O repique do fungo foi feito em câmara de fluxo laminar, sendo que a obtenção do
inóculo para a FES foi realizada através da propagação dos esporos da cepa de Penicillium
chrysogenum e do fungo isolado, utilizando meio de cultura com Agar-agar e PDA (Potato
Dextrose Agar) em Erlenmeyers de 125 mL autoclavados. Antes de inocular os esporos, 6
mL de uma solução umidificante (solução de nutrientes) foram adicionadas ao sabugo. A fim
de preparar a solução umidificante, foi preparada 100 mL de solução de fosfato de potássio
monobásico 200 g/L (solução A), 100 mL de solução B contendo 3,96 g de sulfato de zinco
heptahidratado e 4,6 g de sulfato de ferro II heptahidratado e 50 mL de solução 56 g/L de
peptona. As soluções foram autoclavadas (20 min à 121 °C) e, posteriormente, 0,19 L da
solução A e 0,025 mL da solução B foram adicionadas às 50 mL da solução peptonada.
A inoculação do microrganismo ocorreu com a transferência de 1 mL de solução
Tween 80 a 0,2% (p/v) para as placas contendo o fungo. Com o auxílio de uma ponteira,
raspou-se a superfície do meio com o objetivo de descolar os esporos aderidos ao meio BDA.
Coletou-se 1 mL da solução de Tween contendo esporos e transferiu-se para o meio com
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Capítulo 3 - Material e Métodos
sabugo, tomando-se o cuidado de distribuí-lo bem por todo o substrato e foram incubado no
DBO à 30 °C por cinco dias.
Após esse período foi obtida a solução de esporos, pela adição de solução com Tween
80 a 0,2% (p/v) sob agitação. A contagem dos esporos foi realizada em câmara de Neubauer,
com auxilio do microscópio binocular (modelo BX 51, OLYMPUS). A concentração de
esporos utilizada como inóculo foi de 1×106 esporos/g de meio sólido (Coelho et al.,2001).
Após realizar as contagens, a quantidade de esporos por mL foi calculada. A
quantidade média de esporos foi dividida por 2 para representar um dos lados da câmara e
multiplicada pelo fator 10.000. Esse fator corresponde a transformação do volume de 0,1 μL
por lado da câmara para se determinar o número de esporos presentes por mL de suspensão,
como representado na Equação (3.5).
(
)
(3.5)
3.10. Processo de Fermentação
As fermentações foram realizadas em Erlenmeyer de 250 mL de volume contendo 5 g
de material composto por bagaço de coco quando o microrganismo utilizado foi o Penicillium
chrysogenum e o fungo isolado, houve fermentação com uso de metade de bagaço de coco e
metade com resíduo de caju, ou seja, 2,5 g de bagaço de coco com 2,5 g de bagaço de caju,
apenas o Penicillium chrysogenum foi utilizado nessa fermentação e autoclavados a 1,0 atm
(121 ºC) durante 15 min.
3.10.1. Condições da Fermentação
Foram pesados 5 g do substrato em base seca adicionados 5 mL do inóculo com uma
concentração de 1,0 x 106 esporos/mL (Coelho et al.,2001) e uma quantidade da solução
salina nutriente (0,1%, nitrato de amônio 0,1% e sulfato de magnésio heptahidratado 0,1%
(p/v), com pH corrigido para 3, 5 e 7 com ácido clorídrico 3 M e hidróxido de sódio 0,1 M)
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Capítulo 3 - Material e Métodos
que variava de acordo com a umidade desejada (66, 70,5 e 75%), onde os volumes variados
foram de 5, 7 e 10 mL respectivamente. As fermentações ocorreram em frascos do tipo
Erlenmeyer de 250 mL, essas medições foram de acordo com o planejamento experimental.
Os frascos foram esterilizados e então os microrganismos inoculados e incubados em BOD à
30 °C. Após 120 horas de fermentação foi realizada a etapa de extração do complexo
enzimático.
3.11. Cinética da Fermentação
Tendo em vista as condições estabelecidas nas fermentações preliminares, realizadas
de acordo com o planejamento experimental, foi acompanhada a cinética de produção
enzimática por um período de 10 dias à temperatura ambiente de 30 ± 2 ºC em BOD, sendo
realizadas amostragens a cada 24 horas. As amostras foram analisadas determinando-se as
atividades de Celulases, Xilanase, açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose
residual.
.
3.12. Extração das enzimas
A extração das enzimas ao término da fermentação foi realizada com adição de 4 mL
de solução tampão acetato 200 mM (pH 4,5) por grama de bagaço utilizado no processo
fermentativo, ou seja 20 mL no total, agitando-se manualmente com um bastão de vidro
durante 1 hora em banho-maria à 30 °C. A separação de células e do caldo contendo as
enzimas foi realizada por filtração com papel de filtro, o material filtrado foi centrifugado em
seguida por 20 minutos a 3500 rpm à 4 °C. O sobrenadante foi recuperado e armazenado a 18 ºC para posterior análise das atividades enzimáticas. Todos os ensaios foram realizados em
duplicata.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
3.13. Determinação da enzima Celulase
3.13.1. Determinação da atividade CMCase (Endo-1,4-β-Dglucanase)
A atividade celulolítica da endoglucanase (Endo-1,4-β-Dglucanase) foi determinada
pelo método da carboximetilcelulose (CMC) de acordo com a metodologia adaptada de Ghose
(1987). Uma solução de carboximetilcelulose (CMC) 4% (p/v) era preparada em tampão
citrato de sódio 50 mM (pH 4,8). Uma alíquota de 0,5 mL desta solução foi adicionada em
tubo de ensaio e levada a banho termostático à 50 °C por 1 minuto para equilibrar a
temperatura. O mesmo volume (0,5 mL) de solução enzimática foi adicionado e a mistura foi
incubada no banho-maria à 50 °C por 10 minutos. A solução final foi analisada pelo método
do DNS, usando a solução de CMC (4%) como branco. Determinou-se o teor de açúcar na
solução enzimática antes da reação realizando-se, para tanto, a mesma diluição com tampão
citrato de sódio 50 mM pH 4,8 que foi realizado na mistura reacional com a solução de CMC.
Sendo a atividade enzimática expressa em U.mL⁻¹.
A atividade enzimática foi expressa em UI (μmol de produto liberado/minuto),
conforme Equação (3.6).
(
)
(
(
)
(3.6)
)
* Apenas se for necessário diluir o sobrenadante (solução de enzima)
** Fator obtido da curva padrão
A concentração da enzima foi expressa por UI/mL, conforme as Equação (3.7) e (3.8).
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(
)
(
)
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(
)
(3.7)
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Capítulo 3 - Material e Métodos
(3.8)
* Apenas se for necessário diluir o sobrenadante (solução de enzima)
** Fator obtido da curva padrão
3.14. Determinação da atividade FPase
A quantificação da atividade FPásica foi realizada em papel de filtro de acordo com a
metodologia adaptada de Ghose (1987). O substrato utilizado foi o papel de filtro Whatman
N°. 1 cortado em tiras de 1,0 x 6,0 cm. O substrato foi colocado em tubos de ensaio e
adicionado 2,0 mL de 0,05 mol.L-1 de tampão citrato pH 4,8 e 1 mL do extrato enzimático
(diluído quando necessário) e incubado em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232) à 50 ºC
por 60 minutos. A reação foi interrompida pela retirada de 1 mL da mistura e adicionada a
tubos de ensaio contendo 1,0 mL de DNS, terminando a reação de formação de açúcares. A
determinação dos mesmos foi feita segundo metodologia adapatada de Miller (1959). Uma
unidade de atividade em papel de filtro (FPU) corresponde a 1 mol de açúcares redutores,
expresso como glicose, liberados por minuto. Como representado nas equações 3.7 e 3.8.
3.15. Determinação da atividade da β –glicosidase
Em pequenos tubos de ensaio foi adicionado 1,0 mL do caldo contendo enzima,
diluída em tampão citrato de sódio pH 4,8 à 50 ºC, adicionando-se 1,0 mL da solução do
substrato celobiose, misturando-se e depois incubado em banho-maria (Nova Instruments, NI
1232) à 50 °C por 30 minutos. A reação foi interrompida pela imersão do tubo em água
fervente por 5 minutos. Transferiu-se o tubo para um banho em água fria e determinou-se a
glicose produzida usando um kit baseado na reação de glicose oxidase-peroxidase (GODPOD). Foi adicionado 1,0 mL do sobrenadante (diluído se necessário) em tubos já contendo
1mL de tampão citrato de sódio. Pipetou-se 10 µL da mistura em um tubo contendo 1 mL do
reagente GOD-POD. Realizando-se a determinação da glicose. O branco para zerar o
espectrofotômetro (Termo Spectonic, Genesys 10 uv), era constituído de 1mL do reagente
GOD-POD.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
A partir da concentração de glicose foi determinada a atividade enzimática (UI/mL).
Uma unidade de atividade β-glucosidásica (UI) foi definida como a quantidade de enzima que
catalisa a liberação de 1 μmol de glicose por minuto,medida por espectrofotometria (leitura a
505 nm) sob as condições de ensaio padrão.
3.16. Determinação da atividade da Xilanase
A atividade da Xilanase foi determinada pela liberação da quantidade de açúcar
redutor de uma solução a Xilana (1%) (Sigma) preparada em solução tampão citrato de sódio
0,05 mol.L-1, pH 5,0, à 50 ºC. A mistura reacional consistiu de 2 mL de uma solução de
xilana, aclimatada por 10 minutos na temperatura da reação e 1 mL do complexo enzimático,
previamente diluído segundo a necessidade. A reação processou-se em tubos incubados a 50
ºC por 30 minutos em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232). A reação foi interrompida
pela retirada de 1 mL da mistura que foi adicionada a tubos de ensaio contendo 1 mL de DNS,
parando a reação de enzimática. A quantidade de açúcar redutor liberado foi determinada pelo
método de DNS (Miller, 1959). Uma unidade (UI) de atividade enzimática correspondeu a
1μmol de xilose liberada por minuto medida por espectrofotometria (leitura a 540 nm) nas
condições de ensaio.
3.17. Determinação da atividade da Avicelase
Em tubos de ensaio, adicionou-se 1mL da solução de Avicel 101 (1%). O volume final
do ensaio podia variar, no entanto, mante-se uma proporção de 1:1 entre as quantidades de
sobrenadante e solução de substrato (AVC), em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232) à
50 °C sob agitação por 1 minuto para equilibrar a temperatura. Adicionou-se 1mL do
sobrenadante (solução de enzima) diluindo-se quando necessário, que foi incubado em banhomaria à 50 °C por 2 horas, em seguida centrifugando-se os tubos por 5 minutos em centrífuga
(Centrifuge 5804 R, EPPENDORF), retirando-se da amostra 0,5 mL e adicionando-se 2,5 mL
de DNS. A determinação de açúcares redutores foi realizadopelo método do DNS. O branco
foi feito para zerar o espectrofotômetro. Adicionando-se 0,5 mL de AVC (1%) e 2,5 mL de
reagente DNS. O tempo zero foi feito para determinar a concentração de açúcares redutores
no sobrenadante, antes da ação da enzima no AVC (1%). Transferiu-se 0,5 mL do
sobrenadante para tubos de ensaios contendo 0,5 mL de tampão acetato de sódio 50 mM pH
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Capítulo 3 - Material e Métodos
5,0. Agitou-se e transferiu 0,5 mL da solução obtida para tubos contendo 2,5 mL de reagente
DNS. Realizou-se a determinação de açúcares redutores.
3.18. Determinação da atividade da Pectinase
A metodologia para determinação da atividade da pectinase foi a mesma descrita por
Rodríquez –Fernández (2007).
Em tubos de ensaio foram adicionados 0,9 mL da solução pectina 0,5% em tampão
citrato 0,1 M para pH 4, incubado em banho-maria (Nova Instruments, NI 1232) à 50 ºC
durante 5 min. Adicionar 0,1 mL do extrato contendo a enzima. Agitando-se imediatamente
os tubos. A reação foi incubada à 50 ºC durante 15 min adicionou 2,5 mL de DNS e
imediatamente agitou-se. Os tubos de ensaio foram colocados em um banho-maria com água
fervendo durante 5 minutos, após os 5 minutos os tubos foram resfriados até temperatura
ambiente e adicionados 2,5 mL de água destilada em cada tubo de ensaio. As amostras foram
lidas em espectrofotômetro (Termo Spectonic, Genesys 10 uv) utilizando o comprimento de
onda 540 nm.
A unidade de atividade foi determinada com a quantidade de ácido galacturônico
liberado por mililitro por minuto (mmolmL-1 min-1) nas condições estabelecidas.
Para o cálculo da atividade enzimática, os açúcares liberados pela reação enzimática
foram determinados utilizando o método do ácido dinitrosalicílico (Miller,1959). As amostras
foram lidas no espectrofotômetro (540 nm).
Uma curva padrão do ácido galacturônico 0,001%, foi construída tomando volumes
diferentes da solução de ácido galacturônico (0,2 - 0,8 mL) e completando-se o volume com
água destilada até 1 mL. O branco foi feito adicionando-se 1mL de água destilada num tubo
de ensaio. Foi adicionado 2,5 mL do reativo DNS em cada tubo de ensaio. Um gráfico de
D.O. (densidade óptica) versus concentração (concentração do ácido galacturônico) foi
também obtido o coeficiente angular (m) e o intercepto da reta (n), onde foram calculados por
mínimos quadrados, e considerados na equação (3.9).
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Capítulo 3 - Material e Métodos
A atividade da pectinase será calculada pela Equação (3.9).
(
)
( )( )
(3.9)
A: Atividade enzimática (U/mL).
DO: Densidade óptica da amostra.
m: Coeficiente linear da curva padrão (mmol de Ac. Galact./mL).
n: Interseção da curva padrão.
VR: Volume de reação (1 mL).
Va: Alíquota do extrato enzimático (0,1 mL).
t: Tempo de reação (min).
d: Diluição.
3.19. Determinação de açúcares redutores
Durante o cultivo, a determinação de açúcares redutores foi realizada pelo método do
ácido 3,5 –dinitrosalicílico (Miller, 1959). A determinação da concentração de açúcares
redutores foi feita adicionando-se 0,5 mL da amostra a 0,5 mL do reagente DNS em tubos de
Folin-Wu que foi deixado para um banho em água fervente por 10 minutos. Após este tempo,
resfriava-se os tubos em banho com água em temperatura ambiente e completava-se o volume
a 2,5 mL com água destilada, os quais eram homogeneizados e, a seguir, efetuava-se a leitura
da absorbância. A calibração do zero no aparelho foi feita utilizando um teste em branco, em
que 1 mL de água destilada substituía a amostra, seguindo o mesmo procedimento. O método
foi previamente padronizado por uma curva de calibração de glicose (0,1 a 1,0 mg/mL com
intervalos de 0,1 g/L). As leituras foram realizadas a 540 nm em espectrofotômetro (Termo
Spectonic, Genesys 10 uv).
3.20. Determinação da quantificação de proteínas por Bradford
O conteúdo total de proteína do soro de leite foi quantificado a partir de uma curva
padrão tendo como referência lisozima usando o método do Biureto (Gornal; Bardawill;
David, 1949). Nesse caso foi utilizado um espectrofotômetro UV-Visível (Thermo Spectronic
modelo Genesys 10uv).
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Capítulo 3 - Material e Métodos
A reação de Biureto é um método que pode ser usado para determinar a quantidade de
proteína solúvel em solução. O reagente Biureto (sulfato de cobre em uma base forte) reage
com bandas peptídicas mudando a cor da solução. O espectrofotômetro é usado então para
medir a intensidade da cor resultante: quanto mais escura a solução, mais proteína solúvel em
solução.
Utilizou-se 1 mL da amostra pronta e adicionou-se 1,5 mL do reagente de Bradford. O
conteúdo de todos os tubos foi agitado, logo após ficou em repouso em temperatura ambiente
por 15 minutos em seguida, efetuou-sea leitura de absorbância em espectrofotômetro a 595
nm.
A curva padrão que correlaciona valores de absorvância ao conteúdo protéico de
soluções foi obtida utilizando-se albumina bovina sérica, como padrão, em concentrações na
faixa de 0,1 a 1 mg/mL com intervalos de 0,1 mg/mL. Os pontos da curva padrão foram
submetidos às mesmas etapas que as amostras dos extratos enzimáticos, para sua
quantificação.
3.21. Determinação da celulose residual
O conteúdo de celulose das culturas foi determinada pela metodologia (Updegraff,
1969) com adaptações. Um grama da cultura (do resíduo fermentado) foi pesado e suspenso
em solução de ácido nítrico, ácido acético (6 mL: 150 mL de 80% ácido acético com 15 mL
de ácido nítrico puro) e fervido durante 30 minutos em banho-maria. O sobrenadante foi
removido com uma pipeta Pasteur. Os peletes foram aferridos, após arrefecimento e
centrifugação (3000 x g, durante 20 min), as pelotas foram lavadas com água destilada (10
mL), e a celulose residual foi seco à 70 °C sob pressão reduzida até peso constante. Cada
valor medido de conteúdo de celulose residual é uma média de duas repetições de cada
amostra de cultura.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
3.22.Planejamento Experimental
Com o objetivo de verificar a influência das variáveis: umidade e pH, foi elaborado
um planejamento experimental fatorial 22, sendo então dois fatores e dois níveis para cada
fator com três repetições no ponto central como mostra a Tabela (3.5). Os níveis das variáveis
independentes que serão utilizadas é na ordem crescente (-1, 0, +1), para umidade inicial
66%, 70,5% e 75% e para o pH serão 3, 5 e 7.
Foi usado o programa computacional STATISTICTM (versão 7.0, da StatSoft, Inc.)
para calcular os efeitos principais das variáveis e suas interações, bem como os dados
relativos à Análise de Variância (ANOVA). A metodologia de superfície de resposta foi usada
para avaliar as condições da FES.
Tabela 3.5 - Ensaios do planejamento fatorial ( 22 ).
Ensaio
pH
Umidade (%)
1
3,0 (-1)
66,0% (-1)
2
3,0 (-1)
75,0% (+1)
3
7,0 (+1)
66,0% (-1)
4
7,0 (+1)
75,0% (+1)
5*
5,0 (0)
70,5% (0)
6*
5,0 (0)
70,5% (0)
7*
5,0 (0)
70,5% (0)
*Ponto central
O objetivo principal do planejamento fatorial para o fungo isolado e para o fungo
Penicillium chrysogenum, variando o pH e a umidade para avaliar a produção das enzimas em
meio contendo apenas coco, e uma mistura de coco e caju.
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Capítulo 3 - Material e Métodos
A Tabela 3.6 - mostra a proporção utilizada do bagaço do coco e do pedúnculo de caju
usados nos experimentos e qual o microrganismo que foi inoculado para realização das
fermentações seguindo o planejamento fatorial.
Tabela 3.6 - Proporção da matéria prima e microrganismo utilizado nas fermentações.
Bagaço do coco (g)
Pedúnculo de caju (g)
Microrganismo utilizado
5
0
Fungo isolado
5
0
Penicillium chrysogenum
2,5
2,5
Penicillium chrysogenum
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CAPÍTULO IV
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
4. Resultados e Discussão
4.1.Caracterização dos resíduos: Bagaço do coco e pedúnculo de caju
A caracterização é importante para se conhecer a composição dos resíduos com
relação ao conteúdo de nutrientes e a composição química dos resíduos, que são importantes
na síntese das enzimas e para o crescimento dos microganismo no subtratos.
Os valores de celulose, hemicelulose, lignina e pectina são apresentados na Tabela
(4.1) esses valores são importantes para que se possa compreender a composição da matéria
prima usada nas fermentações, pois, o bagaço do coco o pedúnculo de caju foram usados
como subtratos para o crescimento de um fungo isolado e para o fungo filamentoso
Penicillium chrysogenum, as fermentações permitiram determinar o potencial de produção de
enzimas desses microrganismos, e a caracterização desses materias é uma maneira de
informar a quantidade de uma fonte de carbono e de nitrogênio.
Tabela 4.1- Caracterização do bagaço do coco verde e do pedúnculo de caju.
Análises
Bagaço do coco verde
Pedúnculo do caju
Teor de Umidade (%)
9,24 ± 0,14
5,36 ± 0,30
Teor de Extraíveis (%)
25,39 ± 0,24
6,24 ± 0,47
Teor de Cinzas (%)
0,46 ± 0,02
0,54 ± 0,30
Lignina Total (%)
36,23 ± 0,12
30,04 ± 0,65
Hemicelulose (%)
23,79 ± 0,31
16,77 ± 0,98
Celulose (%)
39,09 ± 0,48
15,91 ± 1,09
Pectina (%)
1,64 ± 0,06
15,24 ± 0,48
O bagaço e o pendúnculo são matérias orgânicas vegetais ricas em polissacarídeos
(açúcares complexos), como a celulose e hemicelulose, compostos encontrados nas paredes
celulares das células vegetais. Também está presente a lignina (biomassa lignocelulósica).
Esses três materiais juntos constituem mais de 75% da biomassa vegetal e conferem
resistência mecânica à planta. O restante da biomassa é composta por substâncias como
proteínas, óleos vegetais e minerais.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Os extraíveis do material vegetal, tais como ceras, álcoois, lipídeos, esteroides, ácidos
graxos, hidrocarbonetos e flavonoides, não foram contabilizados por que não era o interesse
no estudo aqui apresentado, no caso o teor de extraíveis do bagaço do coco foi de 25,39% e
do pedúnculo de caju foi de 6,24%. Alguns desses compostos extrativos podem ser tóxicos.
Essas moléculas podem variar de acordo com a espécie analisada e o processamento ao qual
será submetido o material vegetal. O restante dos materiais são considerados substâncias nãoextrativas, pois compõem as cinzas que restam quando a matéria orgânica é queimada, o teor
de cinza do bagaço do coco foi de 0,46% e do pedúnculo do caju foi de 0,54%. Esses
compostos são inorgânicos, conhecidos como sais ou minerais, como potássio, sílica,
manganês, sódio, cálcio, entre outros. A composição das substâncias não-extrativas depende
das condições de solo, de clima e meio ambiente.
Os valores de umidade, extraíves, cinzas, lignina, hemicelulose e pectina, foram
quantificados para determinar a composição dos resíduos bagaço do coco e do pedúnculo de
caju. O teor de extraíveis é importante para que não seja contado como teor de lignina.
A composição do pedúnculo do caju e do coco variam largamente em função da
variedade, do estado de maturação, do tamanho, da duração da colheita e de variações
ambientais regionais, entre outros fatores. De acordo com os resultados esses dois materiais
que na sua maior parte são descartados, são constituídos de altos teores de celulose,
hemicelulose, lignina total e pectina, desde modo não há necessidades de grandes
complementos nutricionais para o crescimento e o desevolvimentos dos microrganismos
usados nas fermentações.
A composição do bagaço do coco de acordo com Rosa et al, (2001) apresentou as
seguintes porcentagens de lignina (35 a 45%), celulose (23 a 43%) e de hemicelulose (3 a
12%), comparando com os resultados obtidos com o do autor, confirma-se que o bagaço de
coco é um excelente material lignocelulósico, apresentando uma porcentagem de celulose de
39,09%, conferindo uma boa resistência e flexibilidade ao material, o teor de hemicelulose foi
de 23,79%, revelando a sua alta resistência a ataques químicos e enzimáticos e o teor de
lignina total encontrado foi 36,23% por não ter sido realizado qualquer tipo de pré-tratamento
no bagaço, o teor de lignina foi alto, podendo ocasionar uma limitação no crescimento de
microrganismo ou até inbir e se comparado ao valor do autor, o valor encontrado está de
acordo.
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janeiro/ 2014
48
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
De acordo com a de Gouveia et al, (2009) para a caracterização do pedúnculo de caju,
as porcentagens de celulose (20,56%), hemicelulose (10,17%) e lignina (35,26%),
comparando com os valores encontrados a porcentagem de celulose foi de 15,91%
confirmando a sua resistência e flexibilidade, a porcentagem encontrada de hemicelulose foi
de 16,78%, assim como o bagaço do coco o pedúnculo é resistente a ataques químicos e
enzimáticos, já o teor de lignina encontrado foi de 30,04% pelo seu alto teor encontrado, tanto
no bagaço do coco quanto no pedúnculo de caju a presença de lignina pode dimuir ou até
mesmo nem permitir o crescimento de microrganismos, dificultando a ação das enzimas sobre
os materiais, desde modo os valores encontrados por este autor é semelhante ao encontrado
aqui descrito, comprovando que o bagaço de coco e pedúnculo de caju são ricos em celulose e
apesar dos teores de lignina terem sidos altos, o fungo isolado e o fungo Penicillium
chrysogenum conseguiram se desenvolver e produzir enzimas.
4.2. Determinação dos minerais no bagaço do coco verde
Os minerais foram quantificados após a determinação do teor de cinzas, os mesmo
foram solubilizados com ácido nítrico 10% e submetidos às analises por ICP/OES. Todos os
ensaios foram realizados com três repetições e os valores apresentados são uma média dos
resultados obtidos.
Segundo os autores Brígida et al, (2010) e Kämpf e Fermino (2000) a composição
elementar depende consideravelmente da composição do solo onde a cultura do coco está
sendo produzida, a época do ano e a quantidade de chuvas.
A Tabela 4.2 mostra a composição mineral para o bagaço do coco. A determinação
dos minerais serve para verificar a ausência ou o execesso de um determinado componente,
por que alguns minerais são tóxicos aos fungos quando estão presentes em excesso. No caso
de algum componente em falta ou em baixa concentração torna-se necessário a suplementação
de algum componente quando for inocular o microrganismo.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Tabela 4.2 - Determinação dos minerais no bagaço do coco verde.
Mineral
Valor (mg/L)
Ni
ND
Pb
1,35
Mn
19,12
Cd
0,182
Cu
11,97
Zn
13,72
Cr
0,825
Fe
60,99
*ND – Não determinado
O valor de Cu presente no bagaço do coco pode estar relacionado com uma possível
contaminação durante o processo de conservação adotado ou também com a origem do
coco.No entanto, as concentrações de Fe e Mn variam muito, essas variações nesses
elementos podem estar associadas ao tipo de solo.
O teor de zinco presente nas cinzas do bagaço do coco pode ser devido a possíveis
processos galvânicos utilizados por algumas indústrias em suas atividades, localizadas
próximas às áreas de cultivo ou ao ponto de venda (Gonçalves, 2008). Outra hipótese é a
drenagem urbana, carreando zinco presente no solo como fertilizante agrícola. A adição
global de zinco no solo através de fertilizantes é da ordem de 260 a 1.100 ton/ano (Campos et
al., 2005). O elemento cromo também se mostrou presente nas amostras do bagaço do coco,
essa presença pode ser em decorrência de indústrias de ligas metálicas que possam estar
contaminando os solos.
O teor de chumbo presente pode ser devido ao tráfego intenso na região que libera
vapores de chumbo para a atmosfera, os quais são depositados na superfície através das
chuvas por exemplo, à ocupação urbana desordenada, as quais lançam esgoto no rio e deste
modo contaminando os mesmos.
O cádmio é encontrado na natureza quase sempre junto com o zinco, em proporções
que variam de 1:100 a 1:1000, na maioria dos minérios e solos, na agricultura uma fonte
direta de contaminação pelo cádmio é a utilização de fertilizantes fosfatados. Sabe-se que a
captação de cádmio pelas plantas é maior quanto menor o pH do solo (solo do cerrado).
Portanto as chuvas ácidas são um fator determinante no aumento da concentração do Cádmio
nos produtos agrícolas.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Os principais metais pesados presentes no solo e nos produtos utilizados na agricultura
são Co, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Sn e Zn (Abreu et al., 2002). Entre esses, deve-se
ressaltar que alguns são essenciais às plantas (Cu, Fe, Mn, Mo, Ni, e Zn), bactérias fixadoras
de nitrogênio (Co e Mo), animais (Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Mo, e Zn) e microrganismos (Co, Cr,
Cu, Mg, Mn, Ni, e Zn). A contaminação dos solos por metais pesados pode ter origem natural
ou antropogênica, sendo esta a principal razão do aumento crescente dos metais pesados nos
solos, provocando distúrbios muitas vezes de difícil recuperação para o ambiente (Abreu et
al., 2002). As plantas acabam absorvendo esses metais que são transferidos para as folhas,
frutas e outras partes.
Cooley et al, (1986) observaram que o metal pesado cádmio em dosagens maiores
causa efeitos deletérios sobre o metabolismo celular e progressiva inibição da esporulação do
fungo, deste modo pode-se concluir que os metais pesados (cádmio e chumbo) presentes no
bagaço do coco não irão prejudicar o crescimento dos microrganismos nas fermentações
utilizando o bagaço do coco como sustrato devido as baixas concentrações. Uma propriedade
importante das enzimas celulolíticas é sua capacidade de ser influenciada por outras
moléculas, especialmente metais, sejam sofrendo efeitos inibitórios ou indutores. Dentre os
íons avaliados, os que inibem mais frequentemente as celulases são Hg+2, Cu+2, Ag+ e Zn2+,
que chegam a provocar até a perda total da atividade catalítica, estando presentes em
concentrações tão baixas quanto 2 mM (Lima et al., 2005).
4.3. Determinação dos minerais do pedúnculo de caju
Os teores de minerais foram determinados por espectrometria de emissão atômica com
fonte de plasma indutivamente acoplado – ICP/OES, segundo AOAC, 2000, com
mineralização por via seca acordo com a amostra. Os dados dos mineirais do pedúnculo de
caju foram obtidos da Tabela Brasileira de Composição de Alimentos (Taco, 2011).
Diversos meios de suplementação são descritos na literatura com o objetivo de suprir
as necessidades nutricionais microbianos em termos de carbono, nitrogênio, fósforo, minerais
e vitaminas são utilizados (Aguiar e Menezes, 2000). Em relação ao sistema celulolítico da
maioria das linhagens fúngicas, este precisa ser induzido pela presença do substrato. Gong e
Tsao (1975) relataram diversas fontes de celulose complexa (ex: bagaço de cana e resíduos
lignocelulósicos), gentibiose, soforose e lactose como indutoras da produção de celulases em
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51
Capítulo 4 – Resultados e Discussão
fermentação submersa. No entanto, a resposta das células fúngicas aos diferentes meios varia
dependendo da concentração e tipo de indutor, tornando necessário o conhecimento das
exigências nutricionais do microorganismo com o intuito de estimular a síntese enzimática.
A Tabela 4.3 mostra a composição mineral para o pedúnculo de caju. Os minerais
contemplados são: cálcio, ferro, magnésio, manganês, fósforo, sódio, potássio, cobre e zinco.
A determinação dos minerais é importante para verificar a ausência ou o execesso de um
determinado mineral, pois, alguns minerais são tóxicos aos fungos quando estão presentes em
excesso. No caso de algum componente em falta ou em baixa concentração torna-se
necessário a suplementação de algum componente quando for inocular o microrganismo.
Tabela 4.3 - Determinação dos minerais no pedúnculo de caju.
Mineral
Valor (mg/100 g)
Ca
1
Mg
10
Mn
0,12
P
16
Fe
0,2
Na
3
K
124
Cu
0,07
Zn
0,1
Fonte: TACO, 2011.
A disponibilidade dos nutrientes para as plantas vai depender das entradas e saídas dos
elementos no solo e das transformações que aí ocorrem. A conversão entre formas orgânicas e
minerais, imobilização e mineralização, operada por organismos do solo, é uma componente
importante na ciclagem do nitrogênio, fósforo, enxofre e micronutrientes. A taxa de
mineralização depende das condições de vida dos organismos em termos de características do
solo (pH, arejamento, temperatura, e teor de água) e dos resíduos orgânicos (granulometria,
teores de lenhina e fenóis, e equilíbrio entre o carbono por um lado, e o nitrogênio, o fósforo e
o enxofre por outro)(Bertoldi et al, 1983).
A disponibilidade dos micronutrientes (ferro, manganésio, zinco, cobre e níquel)
depende do pH, do potencial redox e do teor de matéria orgânica dos solos. As deficiências de
ferro, manganésio e zinco são vulgares em solos calcários, enquanto que a toxicidade de
manganésio é frequente em solos ácidos ou alagados (Lindsay e Norwell 1978).
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Muitas espécies fúngicas podem se desenvolver em meios mínimos, contendo amônia
ou nitritos, como fontes de nitrogênio. Oligoelementos (ferro, zinco, manganês, cobre,
molibdênio e cálcio) são exigidos em pequenas quantidades (Ehlers, 1994).
O fósforo é necessário para a formação dos ácidos nucleicos e para a síntese dos
compostos orgânicos de alta energia - adenosina trifosfato (ATP). O fósforo é fornecido na
forma de sais de fosfato para ser usado por todas as células microbianas (Ehlers, 1994).
A maior parte das células necessita de alguns ions metálicos como cálcio, potássio,
magnésio, ferro, manganésio, zinco, cobre, molibdénio, níquel, cobalto e sódio para as suas
várias atividades celulares. Estes ions são necessários em quantidades ínfimas
(micronutrientes), sendo usados como cofatores e ativadores de enzimas (Ehlers, 1994).
4.4. Seleção de microrganismo produtor de celulase
4.4.1. Isolamento de linhagem fúngica produtora de celulases
A análise comparativa da sequência obtida com outras depositadas em bancos de
dados mundiais (GenBank) revelou 100% de identidade com sequências de fungos da espécie
Aspergillus fumigatus. Logo, concluiu-se que se trata de um fungo filamentoso pertencente a
esta espécie. A classificação taxonômica:

Domínio: Eukaryota

Reino: Fungi

Filo: Ascomycota

Classe: Eurotiomycetes

Ordem: Eurotiales

Família: Trichocomaceae

Gênero: Aspergillus

Espécie: Aspergillus fumigatus
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
O aspecto morfológico da cultura após crescimento está apresentado em placa de Petri
na Figura 4.1.
Figura 4.1 - Aspecto da morfologia cultural da cepa de fungo isolado da casca do coco
(Aspergillus fumigatus).
4.4.2. Triagem em meio Avicel
A primeira etapa de avaliação do potencial celulolítico das 2 linhagens de fungos
filamentosos, a primeira do gênero Penicillium e a segunda do fungo isolado (Aspergillus),
consistiu na observação do crescimento dos fungos em placa de Petri contendo substrato
celulósico, Avicel, como única fonte de carbono. Pode-se observar durante esse processo que
as duas linhagens avaliadas apresentaram capacidade de hidrolisar o substrato celulósico,
Avicel, caracterizando a presença de celulases, especificamente de exoglucanases, produzidas
por essas linhagens, como é mostrado nas Figuras 4.2 e 4.3.
Apesar de alguns autores considerarem que na presença de Avicel as enzimas
produzidas serão Avicelases, para que essa enzima exerça sua função é necessária à presença
de endoglucanases para iniciar o processo de hidrólise do substrato. Todo o experimento foi
realizado em duplicata.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Figura 4.2 - Crescimento do fungo Penicillium chrysogenum em palca de Petri com Avicel.
Figura 4.3 - Crescimento do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) da casca do coco em palca
de Petri com Avicel.
A princípio, de acordo com a função catabólica dos fungos filamentosos, as enzimas
deveriam ser produzidas na presença da celulose, porém a maioria dos fungos do gênero
Penicillium apresentam enzimas indutivas. Estas enzimas se formam durante o crescimento
do fungo e na presença de um indutor (Kubicek et al., 2009). Portanto, a presença de Avicel
no meio de cultura desse experimento em placas de Petri, além de ser fonte de carbono para o
crescimento das linhagens de Penicillium e para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus),
funcionou como um indutor na produção de celulases por esses fungos. As duas linhagens que
conseguiram crescer no meio de cultura com Avicel como única fonte de carbono e com
função de indutor, apresentaram habilidade de degradar esse substrato devido capacidade de
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
produção do complexo celulolítico,especialmente das exoglucanases. Desde modo, os ensaios
em placas com Avicel podem ser utilizados para um screening rápido de microrganismos.
Este teste permitiu concluir a capacidade que as duas linhagens tem em hidrolisar o substrato
celulósico.
Um planejamento fatorial (22) foi utilizado para verificar a influência das variáveis:
umidade e pH, usando o fungo isolado e o fungo Penicillium chrysogenum, conforme item
3.21.
4.5. Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando um fungo
isolado da casca do coco nas fermentações com o bagaço do coco como substrato.
A Tabela 4.4 - apresenta o planejamento experimental e os resultados obtidos de
atividade celulolítica do extrato enzimático produzido pelo fungo isolado por fermentação
semi sólida, em função da umidade e do pH, dos quais foram avaliados as atividades
enzimáticas CMCase e Avicelase.
Tabela 4.4 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da CMCase e
Avicelase produzida pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus).
A. E. CMCase
A. E. Avicelase
Experimentos
pH
Umidade(%)
(UI/mL)
(UI/mL)
1
2
3
4
5*
6*
7*
3
3
7
7
5
5
5
66
75
66
75
70,5
70,5
70,5
0,282 ± 0,002
0,252 ± 0,003
0,279 ± 0,006
0,267 ± 0,023
0,216 ± 0,001
0,218 ± 0,003
0,224 ± 0,002
0,011 ± 0,002
0,013 ± 0,021
0,010 ± 0,001
0,010 ± 0,021
0,018 ± 0,008
0,019 ± 0,003
0,020 ± 0,004
*Ponto central
De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.4 para atividade CMCase, apenas a
umidade é significativo para um nível de 95%. O pH e a interação não influenciaram
positivamente na produção da CMCase. A umidade é um parâmetro importante para a síntese
da enzima. O mesmo não ocorre para o diagrama de Pareto da Figura 4.5 para atividade da
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Avicelase, nenhum dos efeitos e a interação não foram significativos, mostrando assim que a
umidade, o pH e a interação entre eles não é satisfatória para a produção desta enzima nestas
condições.
Figura 4.4 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade da
CMCase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como
subtrato.
Figura 4.5 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Avicelase para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como
subtrato.
No caso a umidade demonstrou exercer influência na síntese das enzimas. O elevado
teor de umidade inicial pode afetar o crescimento do microrganismo, pois a porosidade do
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
meio e a difusão de oxigênio são reduzidas, dificultando a formação do produto (Raimbault e
Alazard, 1980). Por outro lado, em baixos teores de umidade inicial, a produção enzimática
também pode ser reduzida porque o fungo sofre modificações na membrana celular,
conduzindo a limitações de transporte e afetando o metabolismo microbiano (AcuñaArguelles et al., 1994). Portanto, o importante é trabalhar com uma umidade intermediária,
que mantenha o equilíbrio entre a disponibilidade de água, expansão do substrato e efeitos de
difusão do oxigênio.
As fermentações ocorreram com a temperatura fixa, à 30 °C. As melhores condições
apresentadas para a produção da enzima CMCase foram dos experimentos 1 e 3. A umidade
de 66% consistiu no melhor resultado para a produção da enzima CMCase, com atividades
enzimáticas de 0,282 e 0,279 UI/mL, mostrando assim uma alta capacidade de degradar a
CMC. No caso da atividade da Avicelase os experimentos que apresentaram a melhor
produção da enzima foram os 5, 6 e 7, ou seja, os pontos centrais, apresentando os valores de
0,018 , 0,019 e 0,020 UI/mL, neste caso a umidade intermediária (70,5%) e pH (5)
influenciaram em uma maior produção da enzima.
A Figura 4.6 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima CMCase. As condições para produção da CMCase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi
de 0,282 UI/mL.
Figura 4.6 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática CMCase
para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como substrato.
A Figura 4.7 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima Avicelase. As condições para produção da Avicelase
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi
de 0,020 UI/mL. Observa-se pouca inclinação da superfície de resposta, indicando que os
efeitos não são significativos para 95% de confiança, para os níveis avaliados.
Figura 4.7 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática Avicelase
para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) usando o bagaço do coco como subtrato.
A fermentação em meio semi-sólido reproduz o habitat natural dos fungos
filamentosos, de modo que esses microrganismos são capazes de crescer satisfatoriamente em
substrato sólido e excretar grandes quantidades de enzimas, como por exemplo, as celulases
(Silva et al., 2005). A escolha por um substrato específico para o cultivo em estado sólido,
leva em consideração o custo e à viabilidade. O cultivo em substratos lignocelulósicos
possibilitam fornecer elementos à nutrição fúngica, semelhante ao que ocorre em habitats
naturais.
A atividade de Avicelase também foi observada por Menezes e Hennies (1991), que
obtiveram valores próximos a 0,25 UI/mL de celulase quando utilizaram bagaço de cana-deaçúcar pré-tratado com solução de hidróxido de sódio 4% como total de fonte de carbono, na
presença do fungo Aspergillus niger. Desde modo existe a necessidade de um pré-tratamento
para a remoção, pelo menos parcial da lignina presente na fibra vegetal, possibilitando maior
consumo do substrato e indução às sínteses enzimáticas, como verificado por Aguiar e
Menezes (2000).
Segundo os autores Ferreira et al. (2011) o valor da atividade enzimática da CMCase
observada foi de 2,291 UI/mL com umidade de 60% durante 96 h usando por meio da
fermentação em estado sólido do resíduo de cajá sob ação do fungo Aspergillus niger.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
De acordo com os resultados obtidos no presente estudo, comparado-se com o do autor
pode-se afirmar que a linhagem é boa produtora de celulases, seu crescimento foi bem efetivo
no substrato semi-sólido, além de apresentar elevadas concentrações no extrato enzimático
bruto, quando a produção de celulases utilizando o bagaço do coco. De acordo com os
resultados, principalmente o da CMCase.
Destaca-se que não houve atividade para as enzimas, Pectinase, FPase, Xilanase e βglicosidase. No caso da ausência da atividade da Pectinase uma das hipóteses é o baixo teor
de pectina que foi de 1,64% o indutor da atividade de poligalacturonase. No caso da ausência
da atividade da Xilanase mesmo o bagaço do coco apresentando uma concentração de
hemicelulose de 23,79% possivelmente o fungo isolado não foi capaz de hidrolisar a
hemicelulose. Com relação a ausência da enzima β-glicosidase pode estar ligada a falta de
ação deste microrganismo na clivagem da celobiose em unidades de glicose (Galbe e Zacchi,
2002). Na ausência da atividade da FPase pode ser pela dificuldade de acesso das enzimas ao
substrato, se comparado aos outros substratos que possuem uma área superficial bem maior.
4.6. Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o
Penicillium chrysogenum nas fermentações com a mistura de bagaço do coco e o
pedúnculo de caju como substratos.
A Tabela 4.5 apresenta o planejamento experimental e os resultados obtidos de
atividade celulolítica do extrato enzimático produzido pelo fungo Penicillium chrysogenum
por fermentação semi sólida, em função da umidade e do pH, dos quais foram realizados
ensaios das atividade enzimáticas CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase usando o bagaço do
coco e o pedúnculo de caju como substratos, na proporção de 50% de massa para cada
resíduo.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Tabela 4.5 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo
Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como substratos.
Experimentos
pH
Umidade(%)
A.E. CMCase (UI/mL)
A. E. Avicelase (UI/mL)
A. E. Xilanase (UI/mL)
A. E. FPase (UI/mL)
1
3
66
0,305 ± 0,004
0,003 ± 0,001
0,514 ± 0,003
0,058 ± 0,006
2
3
75
0,240 ± 0,007
0,001 ± 0,001
0,408 ± 0,001
0,030 ± 0,005
3
7
66
0,294 ± 0,008
0,010 ± 0,006
0,644 ± 0,006
0,026 ± 0,001
4
7
75
0,219 ± 0,001
0,002 ± 0,001
0,465 ± 0,005
0,028 ± 0,013
5*
5
70,5
0,240 ± 0,001
0,003 ± 0,002
0,416 ± 0,001
0,030 ± 0,004
6*
5
70,5
0,262 ± 0,001
0,001 ± 0,001
0,419 ± 0,001
0,026 ± 0,003
7*
5
70,5
0,249 ± 0,003
0,002 ± 0,002
0,413 ± 0,006
0,031 ± 0,003
*Ponto central
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
O Diagrama de Pareto fornece o efeito quantitativo estimado que cada uma das
variáveis possuem sobre a atividade de celulases, estabelecendo quais destes efeitos
encontram-se dentro do intervalo de confiança estabelecido para a análise estatística (95%).
De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.8 para atividade CMCase, apenas a
umidade é significativo para um nível de 95%. O pH e a interação não influenciaram na
produção da CMCase. O mesmo ocorre para atividade Avicelase como representado na Figura
4.9, na qual apenas a umidade influenciou de maneira significativa para a produção desta
enzima. Nessas figuras mostra-se claramente que o pH e a interação entre os parâmetros não
apresentam efeito significativo para a produção dessas duas enzimas usando o bagaço do coco
e o pedúnculo do caju como substratos.
Figura 4.8 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de
caju como subtratos.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Figura 4.9 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do
caju como subtratos.
A umidade é um parâmetro importante para a produtividade dessas duas enzimas, a
melhor umidade foi de 66% com pH 3 para a enzima CMCase e a umidade de 66% com pH 5
para a enzima Avicelase.
De acordo com o diagrama de Pareto das Figuras 4.10 e 4.11 para as atividades
Xilanase, Fpase, a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros é significativo para um
nível de 95%. A umidade, o pH e a interação entre as variáveis influenciaram de maneira
significativa para a produção destas enzimas. Nas Figuras 4.10 e 4.11 mostram claramente
que a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros apresentam efeito significativo para a
produção dessas duas enzimas usando o bagaço do coco e o pedúnculo do caju como
substratos. A umidade é um parâmetro importante para a produtividade dessas duas enzimas,
a melhor umidade foi de 66%. Na Figura 4.11 o pH 3 no caso, é o parâmetro que mais
influencou na produção da FPase, mas a umidade e a interação entre eles foram significativas.
Sérgio Dantas de Oliveira Júnior
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Figura 4.10 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do
caju como subtratos.
Figura 4.11- Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a atividade
FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo do caju
como subtratos.
A umidade é considerada um fator crítico para o crescimento dos fungos em substrato
sólido. Como a quantidade de água é sempre limitada, ao contrário da fermentação submersa,
onde há um grande excesso, o controle do nível de umidade é essencial à otimização do
processo em fermentação sólida. Um alto teor de umidade diminui a porosidade, a difusão de
oxigênio, a eliminação de dióxido de carbono e aumenta o risco de contaminação por
bactérias. Por outro lado um baixo teor de umidade pode levar a um menor crescimento do
microrganismo (George et al., 2001).
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Dessa forma de acordo com os resultados é possível perceber que existe uma relação
entre a umidade ideal com a melhor atividade enzimática, sendo que os melhores resultados
apontam melhor condição ao teor de umidade de 66%.
Os picos de atividade enzimática de CMCase, FPase, Avicelase e Xilanase foram
atingidos em valores de umidade de 66% para mistura bagaço de coco e pedúnculo de caju em
todas as fermentações testadas com o fungo Penicillium chrysogenum. A água exerce um
papel importante na FES, pois é responsável pela difusão de solutos, gases e metabólitos
inibitórios, bem como pela absorção celular (Pandey, 2003).
Para cada espécie de microrganismo utilizado, existe um valor ótimo de umidade do
substrato para o crescimento celular, que pode não coincidir com o melhor valor para a
expressão do produto que se pretende obter no processo, como por exemplo, enzimas
(Amorim, 2011).
Na FES, o microrganismo possui um limite de água para suas atividades metabólicas e
seu crescimento, a atividade de água (Aw) ótima para fungos é por volta de 0,7; para
leveduras 0,8, e para bactérias 0,9, no caso do Penicillium (diversas espécies) a sua atividade
de água é aproximadamente de 0,85, e uma pequena mudança nesses valores ótimos causa um
grande distúrbio no crescimento e metabolismo dos microrganismos (Andrade, 1999).
Como mostrado na Figura 4.11 o pH
é o parâmetro que mais influenciou
significativamente, o pH pode variar em resposta às atividades metabólicas dos microorganismos, devido à produção de ácidos durante a fermentação ou mesmo do consumo
destes e a formação de compostos como uréia, por exemplo, que tendem a elevar o pH (Brand
et al., 2000).
A Figura 4.12 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima CMCase. As condições para produção da CMCase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi
de 0,305 UI/mL.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Figura 4.12 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática CMCase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como
substratos.
De acordo com Bassos (2010), a atividade máxima de endoglucanase para T. ressei
9414 foi de 0,50 UI/mL. Comparando os resultados do experimento com o do autor,
evidencia-se a capacidade que o microrganismo (Penicillium chrysogenum) possui em
degradar a celulose do bagaço do coco quanto do pedúnculo de caju.
A Figura 4.13 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima Avicelase. As condições para produção da Avicelase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi
de 0,010 UI/mL.
Figura 4.13 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática Avicelase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como
substratos.
Como observado por Martín et al (2007) obtiveram uma produção de 0,10 UI/mL de
Avicelase com o fungo Penicillium echinulatum cultivado na presença de 0,5% de farinha de
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
trigo. Evidenciando-se que o microrganismo testado (Penicillium chrysogenum) nos
experimentos não apresentou boa atividade se comparado aos resultados dos autores.
A Figura 4.14 – ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima Xilanase. As condições para produção da Xilanase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi
de 0,644 UI/mL.
Figura 4.14 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática Xilanase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como
substratos.
De acordo com Siqueira, Siqueira et al, (2010) utilizando os microrganismo Mucor sp
apresentou atividade enzimática da Xilanase de 0,560 UI/mL e para o Penicilium citrinum a
atividade enzimática da Xilanase observada foi de 0,412 UI/mL. Desde modo ao comparar
esses resultados com os resultados obtidos no presente trabalho utilizando apenas o
Penicillium chrysogenum com atividade máxima de 0,644 UI/mL, mostra-se que o
microrganismo utilizado é um bom produtor de Xilanase, ou seja a enzima está hidrolisando a
xilana de maneira bem efetiva.
A Figura 4.15 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima FPase. As condições para produção da FPase foram no
tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima foi de 0,058
UI/mL.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Figura 4.15- Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática FPase para o
fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco e o pedúnculo de caju como
substratos.
De acordo com Wen et al, (2005) utilizando T. ressei observou atividade da celulase
total de aproximadamente 0,30 UI/mL em bagaço de cana-de-açúcar não tratado depois de 6
dias, valor bastante superior ao encontrado no experimento realizado.
Não houve determinação da atividade da Pectinase, uma das hipóteses é o baixo teor
de pectina encontrado no bagaço do coco que foi de 1,64% e para o pedúnculo de caju o valor
encontrado de pectina foi de 15,24%, mesmo com um alto teor de pectina encontrado e sendo
o indutor da atividade de poligalacturonase, mesmo havendo a mistura entre os dois resíduos
não foi possível a indução da enzima Pectinase, o fungo Penicillium chrysogenum não foi
capaz de hidrolisar a pectina. A ausência da enzima β-glicosidase pode estar ligada a falta de
ação deste microrganismo na clivagem da celobiose em unidades de glicose (Galbe e Zacchi,
2002).
Entre os produtores de celulases estão o gênero Aspergillus, Cladosporium,
Funsarium,
Geotrichum,
Myrothecium,
Paecilomyces,
Penicillium,
Clostridium
e
Trichoderma (Lynd et al, 2002).
A produção de enzimas do complexo celulolítico não está somente ligada à linhagem
do microrganismo, mas as técnicas e substratos utilizados no processo (Rugger et al, 2004).
Diversos fatores podem influenciar na produção do complexo celulolítico. Técnicas de
cultivo, modo de extração, a umidade utilizada, o pH, a concentração do inóculo, a
temperatura entre outros fatores.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
4.7.
Valores das ativadades enzimáticas em função da umidade e pH, usando o
Penicillium chrysogenum nas fermentações com o bagaço do coco como substrato.
A Tabela 4.6 apresenta o planejamento experimental e os resultados obtidos de
atividade celulolítica do extrato enzimático produzido pelo fungo Penicillium chrysogenum
por fermentação semi-sólida, em função da umidade e do pH, dos quais foram realizados
ensaios das atividade enzimáticas CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase usando o bagaço do
coco.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Tabela 4.6 - Planejamento fatorial (22) e resultados das atividades enzimáticas da CMCase, Avicelase, Xilanase e FPase produzidas pelo fungo
Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como substrato.
Experimentos
pH
Umidade(%)
A.E. Avicelase (UI/mL)
A.E. CMCase (UI/mL)
A.E. Xilanase (UI/mL)
A.E. FPase (UI/mL)
1
3
66
0,011 ± 0,003
0,067 ± 0,008
0,541 ± 0,008
0,031 ± 0,001
2
3
75
0,013 ± 0,001
0,029 ± 0,008
0,588 ± 0,011
0,032 ± 0,001
3
7
66
0,01 ± 0,002
0,176 ± 0,011
0,513 ± 0,003
0,032 ± 0,006
4
7
75
0,01 ± 0,002
0,233 ± 0,008
0,735 ± 0,001
0,032 ± 0,002
5*
5
70,5
0,018 ± 0,001
0,049 ± 0,002
0,611 ± 0,002
0,032 ± 0,006
6*
5
70,5
0,019 ± 0,001
0,055 ± 0,001
0,608 ± 0,006
0,032 ± 0,001
7*
5
70,5
0,020 ± 0,001
0,052 ± 0,003
0,619 ± 0,001
0,031 ± 0,002
*Ponto central
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.16 para atividade da Avicelase,
a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros não é significativa para um nível de
95%. O pH, a umidade e a interação entre os parâmetros não influenciaram de maneira
significativa para a produção dessa enzima nessas condições. Já para atividade da
CMCase como é representado na Figura 4.17 o pH influenciou de maneira significativa
para a produção desta enzima e a interação entre os parâmetros também, já a umidade
não influenciou significativamente.
Figura 4.16 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a
atividade Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco
como subtrato.
Figura 4.17 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a
atividade CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco
como subtrato.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
De acordo com o diagrama de Pareto da Figura 4.18 para atividade da Xilanase,
a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros foram significativa para um nível de
95%. Desde modo a umidade, o pH e a interação entre os parâmetros influenciaram de
maneira significativa para a produção dessa enzima. Já para atividade da FPase como
mostrado na Figura 4.19 nenhum dos parâmetros e nem a interação entre eles é
significativa para a produção desta enzima. Mostrando assim que a produção desta
enzima não é favorecida nestas condições.
Figura 4.18 - Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a
atividade Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco
como subtrato.
Figura 4.19- Gráfico de Pareto do pH, umidade e da interação entre eles, para a
atividade FPase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como
subtrato.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Os maiores valores atingidos para as atividades enzimáticas de CMCase, Fpase,
Avicelase e Xilanase foram obtidos em valores de umidade de 70,5 e 75% para o
bagaço do coco como sustrato. Confirmando novamente que a umidade é um parâmetro
importante para a produção das enzimas.
A Figura 4.20 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima Avicelase. As condições para produção da
Avicelase foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade
enzimática máxima foi de 0,020 , 0,018 e 0,019 UI/mL os valores correspondentes aos
pontos centrais, onde a umidade utilizada foi 70,5% e com pH 5.
Figura 4.20 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Avicelase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como
substrato.
A atividade de Avicelase também foi observada por Menezes et al (2009),
resultados com a enzima Avicelase mostrou pouca atividade desta enzima em relação ao
substrato testado. Sendo que a maior atividade alcançada foi com a linhagem Pleurotus
sajor-caju com 0,08 UI/mL, utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Se
comparar esses resultados com os resultados obtidos nos experimentos deste trabalho
utilizando o Penicillium chrysogenum os melhores valores da atividade Avicelase foram
0,018-0,020 UI/mL, comprovando-se que este microrganismo possui a capacidade em
degradar a celulose.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
A Figura 4.21 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima CMCase. As condições para produção da CMCase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática
máxima foi de 0,233 UI/mL o valor correspondente ao experimento 4, onde a umidade
utilizada foi 75% e com pH 7.
Figura 4.21 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
CMCase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como
substrato.
A atividade de CMCase também foi observada por Menezes et al (2009), de
acordo com os resultados obtidos as amostras apresentaram baixas atividades desta
enzima, sendo que a maior foi produzida pela linhagem Pleurotus tailandia com
atividade de 0,06 UI/mL, utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato. Assim
ao comparar esses resultados com os resultados obtidos nos experimentos deste trabalho
utilizando o Penicillium chrysogenum com atividade máxima de CMCase de 0,233
UI/mL, evidencia-se a capacidade que o microrganismo possui em degradar a celulose.
Desde
modo
as
enzimas
Avicelase
(exoglucanase)
e
Carboximetilcelulase
(endoglucanase) formam um sistema enzimático hidrolítico importante para a
degradação da celulose (Bayer e Lamed, 1992).
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
A Figura 4.22 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima Xilanase. As condições para produção da Xilanase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática máxima
foi de 0,735 UI/mL os valores correspondente ao experimento 4, onde a umidade
utilizada foi 75% e com pH 7.
Figura 4.22 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática
Xilanase para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como
substrato.
A atividade de Xilanase também foi observada por Menezes et al (2009), as
linhagens Pleurotus tailandia e Pleurotus sajor-caju apresentaram atividades de
Xilanase de 0,11 UI/mL quando utilizaram bagaço de cana-de-açúcar sendo que os
resultados não foram significativos. Desde modo ao comparar esses resultados com os
resultados obtidos no presente trabalho utilizando apenas o Penicillium chrysogenum
com atividade máxima observada foi de 0,735 UI/mL, mostra-se que o microrganismo
utilizado é um bom produtor de Xilanase, ou seja a enzima está hidrolisando a xilana de
maneira bem efetiva.
A Figura 4.23 ilustra o efeito das combinações de variáveis independentes pH e
umidade sobre a atividade da enzima FPase. As condições para produção da FPase
foram no tempo de 120 horas e na temperatura de 30 °C, a atividade enzimática
máxima foi entre 0,031 e 0,032 UI/mL, ou seja, não houve diferença entre os valores
encontrados nos experimentos realizados.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
Figura 4.23 - Superfície de resposta para a determinação da atividade Enzimática FPase
para o fungo Penicillium chrysogenum usando o bagaço do coco como substrato.
De acordo com Castro et al (2006) observaram atividade de FPase de 0,028
UI/mL, muito semelhante ao encontrado no presente trabalho. Uma hipótese para a
baixa atividade em papel de filtro pode ser justificada pela dificuldade de acesso das
enzimas ao substrato, uma vez que a área superficial é muito menor que a dos demais
substratos utilizados.
Não houve determinação das enzimas Pectinases e β-glicosidase para a
fermentação usando apenas o bagaço do coco como sustrato. O baixo teor de pectina
encontrado no coco não foi sufiente para induzir a produção da enzima Pectinase. Do
mesmo modo para atividade da enzimática β-glicosidase, pelo fato de ser uma enzima
intracelular, era necessário que houvesse o rompimento celular para que a enzima
pudesse atuar na conversão da celobiose em glicose.
4.8. Cinética do fungo isolado (Aspergillus fumigatus) e do Penicillium chrysogenum.
As cinéticas estabelecidas para o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) e
Penicillium chrysogenum ocorreram durante 10 dias. A cinética para o fungo isolado
(Aspergillus fumigatus) foi realizada para saber como era o comportamento do mesmo
frente ao meio de cultivo e qual enzima seria produzida por ele. A cada 24 horas foi
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
retirado um ponto para a determinação de proteína total (PT), açúcares redutores totais
(ART), CMCase, Avicelase e celulose residual.
As condições propostas são em decorrência da maior atividade enzimática para
os dois microrganismos, ou seja, a umidade de 66 e 75% foram onde apresentaram os
maiores picos das atividades, e o pH 5 foi levado em consideração ao encontrado na
literatura, pois é o melhor para o desenvolvimento do Penicillium chrysogenum. Do
ponto de vista prático foi melhor ter trabalhado com as umidade de 66% para o fungo
isolado (Aspergillus fumigatus) e de 75% para o Penicillium chrysogenum, pois, foram
os valores de umidade que apresentaram a maior produtividade das enzimas, além disso,
a atividade da água inibe o possível crescimento de outras espécies como bactérias e
leveduras (Oriol et al., 1988).
A Figura 4.24 ilustra o perfil de açúcares redutores totais, proteínas e celulose
residual quando utilizado o fungo isolado (Aspergillus fumigatus) da casca do coco,
durante 10 dias de fermentação.
Figura 4.24 - Perfil dos teores de açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose
residual produzidos pelo fungo isolado (Aspergillus fumigatus) durante 10 dias de
cultivo.
Para a cinética do fungo Penicillium chrysogenum foram determinados os teores
de açúcares redutore totais, proteína total, celulose residual e quantificados os teores das
enzimas Xilanase, FPase, CMCase e Avicelase.
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
A Figura 4.25 ilustra o perfil de açúcares redutores totais, proteínas e celulose
residual quando utilizado o fungo Penicillium chrysogenum, durante 10 dias de
fermentação.
Figura 4.25 - Perfil dos teores de açúcares redutores totais, proteínas totais e celulose
residual produzidos por Penicillium chrysogenum durante 10 dias de cultivo.
Com relação ao substrato, a resposta das células fúngicas aos diferentes
indutores varia dependendo da concentração e do tipo de indutor ou pela presença de
glicose ou outros açúcares presentes no meio de crescimento. Os indutores para a
síntese celulolítica têm duas funções, pode servi como fonte de carbono para o
crescimento celular, ou até mesmo para a síntese enzimática (Gong e Tsao, 1975). As
Figuras 4.24 e 4.25 demonstram a degradação da celulose em ambas as cinéticas,
observa-se o consumo do substrato pelos dois microrganismos ao longo dos processos,
em virtude do seu uso para o desenvolvimento dos mesmos, como observado a
degradação da celulose o que proporcionou a produção de outros metabólitos.
Com o objetivo de quantificar o teor de açúcares redutores totais provenientes da
possível degradação da celulose e posteriormente o consumo pelos dois fungos
utilizados no decorrer do cultivo, foi realizada a quantificação de açúcares redutores
totais. Embora tenha sido utilizado o bagaço do coco de mesma fonte, o microrganismo
usado poderia causar diferenças no açúcar redutor. Contudo, é importante salientar que
a concentração de açúcares redutores totais presentes no meio de cultivo diminui com o
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
passar das horas de cultivo em ambas as cinéticas, o que provavelmente está ligado ao
consumo dos açúcares presentes no meio de cultura como fonte de carbono. A redução
dos ART foi esperada, como observado na Figura 4.24 utilizando o fungo isolado
(Aspergillus fumigatus), após 72 houve uma redução e a partir de 168 h o teor de ART
se manteve estável. Para o fungo Penicillium chrysogenum representado pela Figura
4.25 o perfil de ART decresce de maneira bem acentuada entre 0 e 72 h , reduzindo-se
ainda de modo expressivo até 120 h, onde se mantém constante até 168 h, seu valor
decresce ao atingir 192 h e em seguida permanece constante. Em ambas as cinéticas, o
consumo do substrato é intenso, confirmando que além de ser um bom material para o
crescimento dos fungos, o bagaço do coco foi consumido para o seu desenvolvimento e
para o seu metabolismo.
Nas duas cinéticas realizadas foi possível observar o consumo das proteínas, em
ambas há uma redução do teor de proteína,utilizando o bagaço do coco como sustrato,
existe diferença no consumo das proteínas, isso em decorrência dos mecanismos de
ação dos microrganismos que são específicos, podendo variar conforme a cultura e o
ambiente. Embora os valores observados tenham sido diferentes em decorrência da ação
dos microrganismos serem diferentes, em especial para a hora zero, a redução na
concentração de proteínas nos meios pode estar ligada a utilização como fonte de
nitrogênio da proteína ou a possível ação de proteases, ou até mesmo relacionado com a
taxa de renovação de proteínas durante a esporulação, alguns fatores afetam a
esporulação, a redução da concentração de nutrientes, tensão de oxigênio ou
composição do meio, podendo estar ligada a produção desses enzimas. (Neto, 2012). Na
Figura 4.25 observa-se o aumento de proteína no tempo 96 horas isso pode indicar
síntese de proteínas (enzimas) para a degradação da celulose, observando o declíneo até
ficar constante.
A ordem de degradação das fontes de carbono pelo microrganismo vai depender
da energia que demande a degradação de cada fonte, ou seja, as primeiras a serem
degradadas demandam menor esforço energético do microrganismo (Fernández, 2009).
A Figura 4.26 representa o comportamento das duas enzimas produzidas pelo
fungo isolado (Aspergillus fumigatus) durante os 10 dias, a CMCase apresentou a maior
atividade (0,615 UI/mL) no segundo dia. Após 48 horas ocorreu uma redução bastante
acentuada até as 96 horas, haja visto que o microrganismo não está mais hidrolisando o
subtrato para quebrar a celulose. Para a enzima Avicelase a atividade máxima foi
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
alcançada em 96 horas com uma atividade de 0,022 UI/mL, e em seguida houve uma
redução na sua produção.
Figura 4.26 - Perfil de atividade de CMCase e Avicelase durante os 10 dias na
fermentação semi-sólida, utilizando o fungo isolado (Aspergillus fumigatus).
As enzimas carboximetilcelulase (endoglucanase) e avicelase (exoglucanase)
formam um sistema enzimático hidrolítico importante para a degradação da celulose
(Bayer e Lamed, 1992). Essas duas enzimas presentes na cinética em questão pode
comprovar o potencial de hidrólise do substrato que este fungo isolado (Aspergillus
fumigatus) possui em degradar a celulose, haja visto que a maior produtividade foi da
enzima CMCase no segundo dia, confirmando desde modo que a celulose do bagaço do
coco está induzindo a produção das enzimas celulolíticas constitutivas que iniciarão a
hidrólise da celulose, induzido a síntese de endoglucanases (CMCase). A redução das
atividades, possivelmente está ligado ao esgotamento de seu substrato, o polissacarídeo
celulósico. Uma outra hipótese é a repressão catabólica supostamente possa estar
acontecendo, ocasionando uma redução nas atividades dessas enzimas, a inibição pode
ser provocada por metabólitos ou ácidos produzido durante a fermentação.
Os açúcares agiriam como verdadeiros indutores, direta ou indiretamente,
influenciando a ligação de proteínas ao DNA, promovendo, assim, a expressão dos
genes para celulases. A presença de substratos facilmente assimiláveis, a repressão do
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
catabólito, o acúmulo do produto final ou fontes de carbono restritas podem inibir a
síntese destas enzimas (Ilmén et al., 1997).
A Figura 4.27 mostra o comportamento das quatro enzimas produzidas pelo
fungo Penicillium chrysogenum durante os 10 dias, no caso da CMCase a mesma
apresentou o maior valor no quinto dia, com atividade máxima de 0,431 UI/mL, após
120 horas ocorreu uma redução bastante acentuada até as 168 horas, haja visto que o
microrganismo não está mais hidrolisando a celulose. Para a enzima Avicelase a
atividade máxima foi alcançada em 96 horas com uma produção de 0,397 UI/mL e, em
seguida houve uma queda na sua produção entre 96 e 120 horas, para a Xilanase seu
pico máximo foi de 0,931 UI/mL em 96 horas havendo uma redução brusca até 120
horas. Para a FPase sua atividade máxima foi em 72 horas com uma produção de 0,470
UI/mL e depois houve uma redução da atividade da mesma.
Figura 4.27 – Perfil de Atividade das enzimas CMCase, Xilanase, Avicelase e FPase
durante os 10 dias na fermentação semi-sólida, utilizando o fungo Penicillium
chrysogenum e o coco como substrato.
Observa-se em ambas as cinéticas a ocorrência de um pico de produção
enzimática em curto período, nos tempos entre 72 e 120 horas. A redução das atividades
pode estar relacionada à desestabilização da enzima pelo efeito do pH, uma vez que se
torna difícil o controle do pH devido a formação de metabólicos secundários, o aumento
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
da temperatura em decorrência do metabolismo do microrganismo ou ainda à produção
de enzimas inibidoras pelo microrganismo, conforme já relatado por Palma et al.(2000).
O aumento da atividade enzimática em função do tempo de fermentação pode
ser explicado em razão da grande disponibilidade de açúcares redutores da matériaprima, necessários para o desenvolvimento do microrganismo. Entre 24 e 120 horas de
fermentação todas as enzimas apresentaram picos máximos na atividade enzimática e
logo após os picos a redução das mesmas. Durante o processo fermentativo as
endoglucanases hidrolisam preferencialmente as ligações internas no polímero da
celulose, produzindo oligossacarídeos de menor peso molecular. Após 120 horas houve
uma redução na produção de endoglucanase, fato possivelmente atribuído ao
esgotamento de nutrientes, ou por acúmulo de produtos inibidores da síntese enzimática
ou do crescimento celular. Um ponto importante a ser notado foi o fato dos valores de
endoglucanases terem sido menores do que as atividades encontradas para as celulases
totais, o que pode constituir que a atuação desta enzima é importante para a posterior
atuação das celulases totais.
Os resíduos da agricultura contêm de 20 a 30% de material hemicelulítico. Esses
resíduos, na forma natural, são fonte de xilana e xilo-oligômeros (Kulkarni et al., 1999)
favorecendo a atividade de xilanase. De acordo com o valor da hemicelulose do bagaço
do coco obtido que foi de 23,79% as Xilanases que são as enzimas responsáveis pela
hidrólise da xilana, o principal polissacarídeo constituinte das hemiceluloses, atuaram
de maneira bem expressiva. Os resultados obtidos, sugerem que a ação destas enzimas
ao hidrolisar a fração celulósica provocaram uma bertura das fibras, facilitando o acesso
das
endoxilanases
e
consequentemente,
uma
maior
conversão
da
fração
hemicelulosósica a açúcares, como a xilose, por exemplo.
A atividade máxima da Avicelase foi atingida no tempo de 96 horas de
incubação da cultura, com níveis de 0,397 UI/mL com posterior declíneo da atividade.
Isto sugere que a produção da Avicelase está diretamente ligada à cultura
metabolicamente ativa. Outra hipótese é a presença de glicose e outras fontes de
carbono, facilmente metabolizáveis, possam reprimir a síntese Avicelase (Castro, 2006).
Os produtos finais de uma dada via metabólica são frequentemente inibidores
das enzimas que catalisam os primeiros passos da via. Esse mecanismo é conhecido
como feedback negativo ou autoalimentação (Whitaker, 1994). As enzimas
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Capítulo 4 – Resultados e Discussão
normalmente têm um mecanismo de controle de expressão que pode ser estimulado ou
inibido por produtos do meio. Os produtos finais de uma dada via metabólica são
frequentemente inibidores de enzimas que catalisam os primeiros passos da via. Este
mecanismo é conhecido como a realimentação negativa (Santana et al., 2012). A
produção de enzimas no início é lento, em seguida, acelera até atingir o seu valor
máximo; depois disso, a concentração de produtos gerados são inibidos e as atividades
enzimáticas são reduzidas, o que também foi observado no presente estudo para o
resíduo testado.
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CAPÍTULO V
CONCLUSÕES
Capítulo 5 – Conclusões
5. Conclusões

A caracterização química e físico-química dos resíduos bagaço do coco e
pedúnculo de caju indicaram seu potencial como substrato para produção de
enzimas.

O fungo isolado (Aspergillus fumigatus) apresentou potencial na produção da
enzima CMCase, e enzima Avicelase usando apenas o bagaço do coco como
substrato.

O fungo Penicillium chrysogenum apresentou atividades enzimáticas CMCase;
FPase; Avicelase e Xilanase usando uma mistura de bagaço do coco e o
pedúnculo de caju, bem como utilizando apenas o bagaco de coco como
substratos.
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CAPÍTULO VI
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Capítulo 6 – Referências Bibliográficas
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