MANUAL DE
ANDROLOGIA
E MANIPULAÇÃO DE
SÊMEN EQUINO
PROF. DR. FREDERICO OZANAM PAPA
PROF. DR. MARCO ANTONIO ALVARENGA
DR. JOSÉ ANTONIO DELL’AQUA JR.
DR. GABRIEL AUGUSTO MONTEIRO
MS. YAMÊ F. R. SANCLER-SILVA
MS. CARLOS RAMIRES NETO
2014
05-12
ÍNDICE
1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO EQUINO
04
2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUÇÃO DO GARANHÃO
05
3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO GARANHÃO
3.1 PÊNIS E PREPÚCIO
3.2.TESTÍCULOS
3.3.EPIDÍDIMO, GLÂDULAS ANEXAS E CONDUTOS ESPERMÁTICOS
07
07
08
10
4. EXAME ANDROLÓGICO
4.1 INTRODUÇÃO
4.2 MATERIAL NECESSÁRIO
4.3 SEQUÊNCIA DO EXAME
12
12
12
13
5
14
14
ULTRASSONOGRAFIA APLICADA AO EXAME ANDROLÓGICO
5.1 INDRODUÇÃO
5.2 ANATOMIA ULTRASSONOGRÁFICA DO ESCROTO,
TESTÍCULO, EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO
5.3 EXAME ULTRASSONOGRÁFICO DO ESCROTO, TESTÍCULO,
EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO
17
6
25
7
ENDOSCOPIA APLICADA AO EXAME ANDROLÓGICO
14
COLHEITA DO SÊMEN
7.1 ANÁLISE DO SÊMEN
7.1.1 EXAMES IMEDIATOS
7.1.2 EXAMES MEDIATOS
7.1.3 CÂMARA DE NEUBAUER
7.2 PADRÕES DE PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS
7.3 PRINCIPAIS CAUSAS DAS PATOLOGIAS ESPERMÁTICAS
7.4 MODELO DE LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO
7.5 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE SÊMEN DE
GARANHÕES DESCRITOS POR VÁRIOS PESQUISADORES
28
29
29
29
30
32
35
38
8. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN
8.1 DILUIÇÃO
8.2 REFRIGERAÇÃO
8.3 INSEMINAÇÃO
40
40
40
40
9. CONGELAÇÃO DE SÊMEN
9.1 INTRODUÇÃO
9.2 MATERIAL NECESSÁRIO
9.3 SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO
9.4 LAUDO PARA SÊMEN CONGELADO
41
41
41
42
45
40
2
9.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA
PLASMÁTICA
9.5.1 COLORAÇÃO SUPRA-VITAL UTILIZANDO EOSINA
9.5.2 CHOQUE OSMÓTICO
9.5.3 SONDAS FLUORESCENTES
46
46
47
48
10. TÉCNICAS PARA MELHORAR A QUALIDADE DO SÊMEN FRESCO,
REFRIGERADO E CONGELADO DE GARANHÕES
10.1 REMOÇÃO DO PLASMA SEMINAL
10.2 SELEÇÃO ESPERMÁTICA
49
49
51
11.
53
AUTORES
12. REFERÊNCIAS
55
ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO
56
ANEXO 2- MONTAGEM DA BOTUBOX PASSO A PASSO
57
ANEXO 3- MONTAGEM DA BOTUTANIER PASSO A PASSO
58
ANEXO 4-COMO UTILIZAR O BOTU-IA
59
ANEXO 5- COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL
60
3
2.
ENDOCRINOLOGIA
GARANHÃO
DA
REPRODUÇÃO
DO
Para que os testículos possam produzir espermatozóides de maneira contínua é
necessário que o eixo hipotálamo – hipófise – gônadas, esteja em sincronia, de tal forma
que os hormônios envolvidos para esta finalidade sejam liberados em quantidades
adequadas.
O hipotálamo é uma região cerebral localizada no diencéfalo, responsável pela
liberação de GnRH. Este hormônio peptídico via sistema porta hipofisário vai até a
hipófise, onde é reconhecido pelas células lá presentes desencadeando a secreção das
gonadotrofinas (FSH e LH) que através corrente da sanguínea se dirigem até os testículos,
resultando na produção de esteróides (estrógeno e testosterona), que participam da
formação dos espermatozóides.
Os hormônios envolvidos na reprodução são liberados através de retroalimentação
positiva ou negativa, conforme a necessidade. Sua produção é estimulada ou inibida, de
maneira a se manter concentrações adequadas para a plena produção espermática.
Nos testículos há a presença de dois tipos de células. As células de Leydig que
produzem testosterona pelo estímulo do LH, testosterona esta que é “ligada” por uma
proteína ligadora de andrógenos (ABP) a luz das células de Sertoli (estimulada pelo FSH)
produtoras da ABP e responsáveis pelo controle da espermatogênese.
Conforme há um aumento das concentrações de testosterona circulante, ocorre
uma retroalimentação negativa no hipotálamo resultando numa diminuição dos pulsos de
liberação de GnRH desencadeando uma menor liberação de gonadotrofina (LH) que
diminui a produção de testosterona pelos testículos. Quando existe a necessidade de uma
maior produção deste hormônio ocorre uma retroalimentação positiva e os níveis
testosterona são novamente restabelecidos.
Outro hormônio que participa dos processos de regulação da secreção de GnRH é
a inibina produzida pelas células de Sertoli, ela promove uma maior ou menor liberação dos
pulsos de GnRH que diminuem ou aumentam a secreção do FSH afetando a produção da
ABP e da própria inibina.
É de grande importância o conhecimento deste mecanismo para um bom
diagnóstico de alterações reprodutivas que possam vir a afetar o macho prejudicando sua
função reprodutiva e qualidade espermática.
Segue abaixo o esquema do eixo hipotálamo-hipófise-gônadas.
5
NEUROENCDOCRINE AND ANATOMY AND FUNCTION. Proposed positive (+)
and (-) feedback control of hormone production and release in the stallion. VNO,
Vomeronasal organ: GnRH, gonadotropin-releasing hormone: LH, luteinizing hormone;
PRL prolactin; FSH, follicle-stimulating hormone; T, testosterone; E, estrogens; I,
inhibin; A, activin. Potencial external influences on hypothalamic secretion are also cited.
(Adaptado de Pickett, B.W., Amann, R.P., McKinnon, A.O., et al: Management of the
stallion for maximum reproductive efficiency. II. Animal Reproduction Laboratory
General Series Bulletin nº 05, Fort Collins, CO: Colorado State University,1989,p1)
(Equine Breeding Management and Artificial Insemination, Juan C. Samper, second
edition).
6
3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO
GARANHÃO
3.1
PÊNIS E PREPÚCIO
Fimose
Incapacidade de expor o pênis, podendo ser congênito ou adquirido, por traumas ou
infecções. Tratamento: cirúrgico.
Parafimose
Dificuldade de retração do pênis, principalmente devido a lesões de medula, lesões
do músculo retrator do pênis, estenose. Tratamento: limpeza de lesões no pênis, compressas
de água fria, aumento do diâmetro do óstio prepucial.
Balanopostite
Inflamação do pênis (balanite) e prepúcio (postite), frequentemente ocorre
simultaneamente balanopostite. Agentes causadores: P. aeroginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma,
Ureaplasma, Chlamydia, Protozoa , Vírus, , Sendo mais comum em garanhões as lesões
parasitárias causadas por Habronema, miíases ou traumatismos. Tratamento: Retirada da
causa, tratamento antibacteriano (infecções secundárias) com antibióticos sistêmicos de
eliminação pela urina, ivermectina (infecções parasitárias), organofosforado
(habronemose).
Hematoma peniano
Geralmente devido a ruptura da túnica albugínea, por traumas no momento da
cópula, frequentemente o hematoma ocorre no dorso do pênis, a identificação da patologia
é dada pela inspeção e palpação. Tratamento: o tempo de recuperação esta diretamente
envolvido com a evolução do quadro, hidroterapia (ducha 3 x ao dia), punção se necessário,
colocar suspensório, antiinflamatórios não esteroidais, antibioticoterapia
Edema prepucial
Traumatismos, picada de insetos ou ofídios. Tratamento: baseado nos agentes
causadores.
Laceração prepucial
7
Lesões traumáticas no prepúcio, dependendo da extensão e tempo de evolução,
deve ser realizada a sutura com plastia local para evitar alterações no óstio prepucial, se o
tempo de evolução for maior que 24 horas ferida já contaminada tratamento tópico
(limpeza, agentes desinfetantes, ducha e repelentes), cicatrização por segunda intenção.
3.2 TESTÍCULOS
Degeneração testicular
Condição adquirida decorrente de fatores que afetam a homeostase testicular.
Muitos deles envolvendo alterações da termorregulação testicular como picos febris, o
processo de degeneração são classificados em graus I, II e III, quanto maior o grau maior a
severidade da patologia. Podem também ser de origem medicamentosa (Anabolizantes e
corticoesteróides). O prognóstico é bom a não ser nos casos onde já houve perda de massa
testicular e formação de tecido conjuntivo. Tratamento: retirada da causa e tempo mínimo
de 60 dias.
8
Hipoplasia e aplasia testicular
A aplasia testicular é a ausência de um ou dos dois testículos é de rara incidência.
Já a hipoplasia (diminuição do tamanho testicular) uni ou bilateral é mais comumente
encontrada. Ambas as patologias são de origem genética, causadas por um gene recessivo
de penetrância incompleta. Tratamento: como é patologia de origem genética deve-se
afastar o animal da reprodução.
Para se diferenciar um quadro de hipoplasia testicular de uma degeneração
necessita-se de uma anamnese bem detalhada. Nos casos de degeneração os testículos
tinham tamanho normal, nas hipoplasias sempre foram pequenos e as alterações do
ejaculado não se alteram como no caso da Degeneração Testicular.
Orquite
Frequentemente causada por uma infecção ou traumatismo e associada a
epididimite.
Aguda: aparecimento súbito, presença de aumento de temperatura local, dor,
aumento de volume, perda da função, animal se locomove pouco. Causas infecciosas mais
comuns nos equinos são: P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp,
Staphilococcus spp., B. abortus, E. coli, Mycoplasma , Ureaplasma , Chlamydia,
Protozoa, Vírus. Tratamento: Ducha, antiinflamatório sistêmico (Sulfa +Trimetropin,
Enrofloxacina).
Crônica: aumento de volume, alteração da consistência e perda da sensibilidade
dolorosa acentuada.
Neoplasias testiculares
Os tumores testiculares são raros, os mais comumente diagnosticados em
garanhões são os seminomas (de células germinativas), sendo encontrados também os
tumores das células intersticiais (células de Leydig) e os tumores das células de Sertoli.
Diagnóstico: Acomete idosos, superfície dura e irregular, lesões circulares a
Ultrassonografia. Tratamento: retirada cirúrgica do testículo afetado.
Hérnia inguino-escrotal
Presença de conteúdo abdominal na bolsa escrotal, pode haver presença de alças
sem prejuízo do trânsito intestinal, entretanto pode ocorrer o encarceramento das alças com
parada do trânsito intestinal. Testículo aumentado e frio, dor aguda e intensa. Tratamento:
cirúrgico com retirada do testículo do lado acometido e fechamento do anel.
Rotação testicular
O testículo afetado mantém seu posicionamento horizontal em relação ao eixo
crânio-caudal do animal, porém com giro de 180o observado pela alteração de localização
da cauda do epidídimo em relação à parede abdominal. Tratamento: depende do grau de
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rotação, podendo dispensar intervenção desde que não haja interferência na qualidade
seminal do garanhão ou exigir o reposicionamento do testículo com utilização de sedação
ou até procedimento cirúrgico.
Torção Testicular
No testículo afetado, observa-se um giro no eixo longitudinal de modo que nos
casos de torção de 90° a cauda do epidídimo estará em posição lateral ou medial e nos
casos de torção de 180° a cauda do epidídimo estará em posição cranial. Dependendo do
grau de torção pode haver comprometimento circulatório e, nesses casos, o tratamento é
cirúrgico com a retirada do testículo afetado.
3.3. EPIDÍDIMO, GLÂNDULAS ANEXAS E CONDUTOS
ESPERMÁTICOS
EPIDÍDIMO:
a) Defeitos congênitos:
• Aplasia Segmentar: todo ou parte do epidídimo, vasos deferentes ou vesículas seminais
podem estar ausentes.
• Hipoplasia : geralmente acompanha a hipoplasia testicular.
b) Granuloma Espermático: obstruções congênitas dos ductos e se encontram na
cabeça do epidídimo. Os granulomas podem alcançar tamanho suficiente para obstruir
outros tubos eferentes.
c) Espermatocele: Dilatação cística do conduto do epidídimo, com acúmulo de
espermatozóides. Oclusão congênita ou adquirida. As espermatoceles progridem para
granulomas. O esperma condensado na espermatocele ou no granuloma tem uma cor
amarela e de consistência caseosa como pus na infecção por Corinebacterium spp.
d) Epididimite: Esta afecção às vezes coexiste com a orquite. A fibrose inflamatória
produz na fase crônica, o endurecimento e aumento de volume do epidídimo, sobretudo do
corpo. Pode haver aderência entre as capas parietal e visceral da túnica vaginal com
obliteração parcial ou total. Epididimites: mais frequente na cauda.
Infecções do epidídimo pelos agentes=> Strep Beta Hemolítico, P. aeroginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasm , Ureaplasma
, Chlamydia, Protozoa , Vírus.
Sintomas: podem ser agudos ou crônicos como dor, temperatura elevada, sensibilidade,
tumefação da cauda do epidídimo. Nódulos no conduto deferente, facilmente perceptíveis à
palpação=>obliteração=>azoospermia.
Quando os dois condutos estiverem afetados.
Geralmente a infecção atinge=>testículos e as vesículas seminais. Diminui a libido pelo
componente dor, podendo haver piospermia.
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Diagnóstico: exame bacteriológico, Ultrassonografia alterações a palpação.
Prognóstico: grave por agentes específicos , reservado devido obliteração dos condutos e
aspermia.
Tratamento: Específicos: sulfa+ trimetropin , Cloranfenicol .
CONDUTOS ESPERMÁTICOS:
a) Espermiostasia: Azoospermia de origem excretora, devido obliteração total ou
parcial das vias espermáticas, cuja etiologia pode ser: traumática, infecciosa e hereditária.
Lesões: cabeça epidídimo bastante espessa e saliente, o corpo é duro e com superfície
irregular, cauda distendida e saliente na base do testículo. Ao corte estas estruturas
apresentam material caseoso, seco, branco, aglomerado celular denso: numerosos
espermatozóides alterados e ou anormais, restos células epiteliais e grandes células
macrófagas.
Patogenia: Com o estreitamento das vias, congênito ou adquirido, o sêmen não pode ser
expulso e se acumula nos segmentos do epidídimo e depois nos tubos seminíferos inclusive
provocando alteração na espermatogênese. Geralmente ocorre espermofagia .
Sintomas: fertilidade baixa em 1 ou 2 anos , instalando-se a seguir a esterilidade. A libido é
mantida, a ejaculação é mínima e constituída por secreções vesico-uretrais
Prognóstico: negativo. Os de origem hereditária devem ser descartados. Unilaterais de
outras origens devem sofrer castração do testículo afetado.
b) Fístula Uretral: Traumas na porção do pênis=>hemospermia grave.
Diagnóstico: Exame de sêmen e Endoscopia.
Tratamento: Cauterização, Cirurgia e Tratamento com antibióticos e sulfas.
GLÂNDULAS ANEXAS:
a) Vesiculite: Inflamação aguda e crônica.
Causa de perda econômica prematura em touros: redução da qualidade do sêmen e da
motilidade pós-descongelação.
Idade pode ser fator predisponente .
Causa: Bactérias, Vírus, Chlamydia, Fungos e Protozoários, Staphilococcus spp.,
Streptococcus spp., Escherichia coli, Leptospira interrogans , Proteus mirabilis , Clamydia
psittaci, Candida guilliermondii, Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniae,
Ureaplasma.
Em geral não apresenta dor (micção, defecação e ejaculação). Sêmen: piospermia, sem
alteração da motilidade imediata, havendo diminuição da viabilidade após algum tempo.
Palpação: difícil diagnóstico de vesiculite, abscedação: rara, Ultrassom: difícil diagnóstico
pelas características da vesícula seminal => antes da cobertura repleta (anecóica), após
ejaculação => vazia.
Tratamento clínico: antibioticoterapia sistêmica após antibiograma, muitos antibióticos não
conseguem penetrar na luz da glândula em concentração terapêutica. Antibióticos precisam
ter alta solubilidade em lipídeos, baixo peso molecular, afinidade por proteínas plasmáticas,
pKa alto, pH alto (Sulfa +Trimetropin, Enrofloxacina, Cloranfenicol).
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Endoscopia: lavagem (5x) da glândula com solução salina e antibióticos (ticarcilina sódica
ou ampicilina sódica).
Remoção Cirúrgica: não é usada rotineiramente, podendo apresentar complicações pósoperatórias como: hemorragias, infecções e lesões nos nervos pélvicos (ligados à ejaculação).
4. EXAME ANDROLÓGICO
4.1
INTRODUÇÃO
O exame andrológico reflete as atuais condições reprodutivas de um macho. O
potencial reprodutivo do animal deve ser verificado sempre antes do inicio da estação de
monta, para diagnóstico de sub ou infertilidade, na ocorrência da puberdade, para realizar a
criopreservação de sêmen, antes de comercializações, etc.
A avaliação andrológica consiste na observação das condições semiológicas, bem
como as condições de sanidade, alterações genéticas, saúde geral, deficiências na cópula
por alterações locomotoras ou alterações do sistema genital (impotência coeundi) e
problemas espermáticos (impotência generandi).
O laudo de um exame andrológico nunca é definitivo (para o resto da vida
reprodutiva). Deve-se levar em consideração que o animal logo após o exame pode vir a
sofrer de alguma patologia que leve a depreciações de sua qualidade espermática, por isso o
laudo não deve ser emitido com uma validade superior a 60 dias (tempo de duração da
espermatogênese e do trânsito epididimário).
4.2. MATERIAL NECESSÁRIO
A)
B)
C)
D)
E)
F)
G)
H)
I)
J)
K)
L)
Ficha para anotações + caneta
Paquímetro
Luva de palpação
Vagina artificial
Copo coletor
Microscópio
Mesa aquecedora (37°C)
Lâminas e lamínulas
Câmara de Neubauer
Vidraria (proveta de 100 mL, tubo de ensaio, Becker)
Pipeta de Sahli ou micropipeta de 20 µl ou palheta de 0,5 mL
Corantes para patologia espermática
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4.3. SEQUÊNCIA DO EXAME
A) Identificação do animal:
• Nome, registro, idade, raça
B) Identificação do proprietário:
• Nome, endereço, telefone, nome da propriedade
C) Exame do animal:
•
•
•
Anamnese (animal estabulado ou a campo, quanto tempo se cobrir, doenças
anteriores, medicamentos aplicados, informações sobre a fertilidade)
Exame clínico geral (verificação dos parâmetros respiratório, cardíaco, digestivo,
aprumos, sensibilidade na coluna e membros)
Exame clínico específico do aparelho reprodutivo (padrões normais)
Prepúcio – sem nenhuma alteração, edema, lesões etc.
Pênis – sem nenhuma alteração, escaras, edema, hematoma, forma.
Glândulas anexas – Palpação retal e avaliação ultrassonográfica (somente deverá ser
realizada a palpação retal se ficar constatado quadro de piospermia ou hemospermia e
esta deve ser realizada com o animal devidamente sedado e contido).
Testículos e Bolsa escrotal – Observa-se bem o escroto, se não há feridas, bernes, edema,
varicocele (dilatações vasculares), então se palpa os testículos que no equino têm a
forma ovóide e posicionamento horizontal em relação ao animal. Devem ter mobilidade
dentro da bolsa, ausência de dor a palpação, simetria, consistência fibroelástica. Devem
ser feitas mensurações individuais de cada testículo, que demonstram com maior
exatidão a verdadeira massa testicular, devendo ser realizadas com o auxílio de um
paquímetro. Comprimento normal varia entre 5 e 12cm (do pólo proximal até o pólo
distal do testículo), largura normal varia entre 4 e 8 cm (medida latero-madial, na
porção média do testículo), altura normal varia entre 4 e 8 cm (medida infero-superior,
na porção média do testículo).
Epidídimos – Devem ser palpados verificando sua presença, sensibilidade, forma e
localização (cabeça acoplada ao polo cranial, corpo localizado na face medial dos
testículos e cauda geralmente bem definida na região caudal dos testículos, apresentado
consistência fibro-eslástica de tamanho variando de 1x1 à 3x3, conforme idade do
animal e frequência de ejaculados).
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5. ULTRASSONOGRAFIA APLICADA AO EXAME
ANDROLÓGICO EM GARANHÕES
5.1 INTRODUÇÃO
A ultrassonografia é um método diagnóstico não invasivo que fornece importantes
informações sobre a arquitetura interna de órgãos. Embora o exame ultrassonográfico do
trato reprodutivo de éguas seja utilizado há mais de 30 anos, este exame não é
rotineiramente utilizado na avaliação dos órgãos genitais de garanhões durante o exame
andrológico, sendo somente requerido quando há suspeita de algum processo patológico
específico.
A ultrassonografia do trato reprodutivo de garanhões é uma excelente ferramenta no
diagnóstico de inúmeras condições patológicas como granuloma espermático, epididimites,
criptorquidismo, varicocele, estruturas císticas do epidídimo, aumento da espessura da
túnica vaginal e neoplasias testiculares. Além disso, este exame permite aferições exatas de
medidas tais como altura, largura e comprimento, bem como área transversal e
circunferência na parte mais larga de cada testículo, medidas estas utilizadas para estimar
volume testicular e produção diária de espermatozóides.
5.2
ANATOMIA
ULTRASSONOGRÁFICA
DO
ESCROTO,
TESTÍCULO, EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO
Um garanhão normal possui dois testículos localizados na região inguinal, cada um
com formato elipsóide, orientados longitudinalmente no eixo horizontal com um cordão
espermático localizado crânio-dorsal (LOVE, 1992; TURNER, 1998). O funículo
espermático é recoberto pela túnica albugínea e contém a artéria testicular, plexo
pampiniforme e ducto deferente (Figura 1).
A artéria testicular forma ramificações sobre a superfície do testículo, que se
estendem para o parênquima testicular e retornam no plexo pampiniforme do funículo
espermático para o abdômen (TURNER, 1998). A região cranial do testículo é
ligeiramente mais elevada do que a porção caudal (LOVE, 1992).
O sangue é drenado do testículo pela veia central, podendo este vaso, muitas vezes,
ser visualizado no corte transversal (Figura 2), especialmente em testículos maiores
(LOVE, 1992). A veia central atravessa a túnica albugínea, ramificando-se para a formação
do plexo pampiniforme.
14
Ducto
Deferente
Funículo
Espermático
Artéria
Testicular
Corpo do
epidídimo
Cabeça do
Epidídimo
Veia central
Cauda do
Epidídimo
Túnica
Albugínea
Figura 1- Representação esquemática da orientação do testículo, epidídimo, funículo espermático e estruturas
ultrasonográficas importantes.
A avaliação ultrassonográfica de estase venosa dentro dos vasos do funículo
espermático, pode ter significado clínico na avaliação do suprimento sanguíneo testicular
(LOVE, 1992). Distensão anormal das veias do plexo pampiniforme é rara em garanhões,
sendo esta condição denominada varicocele (CHENIER, 2009).
15
Figura 2 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo
para avaliação da veia central. Na imagem ultrassonográfica (direita) de um testículo normal (corte transversal), a veia
central aparece como uma estrutura anecóica com formato circular (seta).
O epidídimo é um órgão alongado, enovelado, localizado na superfície do testículo
(SULLIVAN et al., 2005). Ele pode ser dividido anatomicamente em três segmentos:
cabeça, intimamente ligada à região crânio-dorsal do testículo; corpo, que se encontra
horizontalmente disposto na superfície dorso-lateral do testículo; cauda, responsável pelo
armazenamento dos espermatozóides, formado por um ducto epididimário com a forma
cilíndrica que se estende na região caudal do testículo (LOVE, 1992) que com auxílio do
ligamento espesso (ligamento da cauda do epidídimo), mantêm-se firmemente fixado ao
testículo. O ducto deferente é uma continuação do ducto da cauda do epidídimo (TURNER,
1998).
A túnica albugínea é uma forte cápsula fibrosa que está intimamente associada com
a superfície do testículo, produzindo delicada compressão do parênquima testicular. Os
septos que se estendem no parênquima, a partir do interior da cápsula, não juntam para
formar um mediastino visivelmente distinto (DYCE et al., 2005). Por isso, no garanhão não
é possível a distinção do mediastino testicular presente em outras espécies, como em
humanos, bovinos, suínos e caninos (CARTEE et al., 1986).
16
A túnica vaginal visceral está intimamente justaposta à túnica albugínea em torno
do testículo, epidídimo e funículo espermático. A próxima camada externa é a túnica
vaginal parietal que é a continuação do peritônio parietal. Entre as duas camadas vaginais
existe uma pequena quantidade de líquido peritoneal (TURNER, 1998).
5.3 EXAME ULTRASSONOGRÁFICO DO ESCROTO, TESTÍCULO,
EPIDÍDIMO E FUNÍCULO ESPERMÁTICO
O exame ultrassonográfico desta região normalmente é realizado com o animal em
estação e devidamente contido, tendo em vista que o examinador deverá colocar-se em uma
posição potencialmente perigosa em frente aos membros pélvicos do garanhão. A maioria
dos garanhões são mais facilmente manipulados após a colheita de sêmen, pois eles estão
mais relaxados e toleram melhor a manipulação (LOVE, 1992; TURNER, 1998;
CHENIER, 2009).
O transdutor linear ou setorial de 5.0 ou 7.5MHz irá fornecer imagens de boa
qualidade para avaliação dos órgãos genitais externos (TURNER, 1998; CHENIER, 2009).
A utilização de transdutor convexo ou linear fornece imagem de melhor qualidade para
avaliação do epidídimo (CHENIER, 2009). A aplicação de gel no local ou a utilização de
um distanciador (standoff pad), melhoram a qualidade da imagem por aumentarem o
contato com a pele (LOVE, 1992).
Para realização do exame dos testículos o examinador deve posicionar-se
lateralmente ao animal em estação, empurrando o testículo contralateral dorsalmente,
facilitando assim, a apreensão do funículo espermático do testículo a ser examinado (Figura
4).
Após manter o testículo na posição ventral do escroto a probe é colocada na posição
vertical, iniciando o escaneamento da região cranial para região caudal (LOVE, 1992).
17
Figura 5 – Exame ultrassonográfico dos testículos e epidídimos.
O funículo espermático é mais facilmente visualizado pela colocação da probe na
posição horizontal, bem próximo ao testículo (Figura 6).
18
Figura 6 – Exame ultrassonográfico do funículo espermático.
O plexo pampiniforme apresenta-se como uma imagem manchada heterogênea, e a
artéria testicular é identificada em cortes (CHENIER, 2009) com aspecto de queijo suíço
(LOVE, 1992; Figura 7).
19
Figura 7 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado para avaliação
do funículo espermático. Na imagem ultrassonográfica (direita) a artéria testicular é identificada como estruturas
anecóicas em cortes (seta branca), e o plexo pampiniforme como uma estrutura heterogênea envolvendo a artéria (seta
preta).
Em um posicionamento transversal é possível distinguir vasos sanguíneos do
funículo espermático e a cabeça do epidídimo. A veia central pode ser vista em alguns
casos e não deve ser considerada patológica. À medida que a probe é deslocada
caudalmente os vasos do funículo espermático são perdidos de vista, e a veia central tornase mais reduzida em diâmetro (LOVE, 1992; Figura 8).
Figura 8 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo
para avaliação da veia central. Na imagem ultrassonográfica (corte longitudinal), a veia central aparece como uma
estrutura anecóica (setas), que diminui em diâmetro à medida que segue para a região caudal.
O corpo do epidídimo pode ser mais identificado na superfície dorso-lateral do testículo,
sendo, melhor observado quando, colocado em contraste com os vasos do funículo espermático, e
torna-se menos perceptível quando a probe é deslocada caudalmente (LOVE, 1992; Figura 9). Duas
manchas brancas (reflexo especular) são observadas na região dorsal e ventral da superfície do
corpo do epidídimo (LOVE, 1992).
20
Figura 9 – O esquema à esquerda demonstra que o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado na superfície
dorso-lateral do testículo para avaliação do corpo do epidídimo. Na imagem ultrassonográfica o corpo do epidídimo
(setas) apresenta-se hipoecóico em relação ao parênquima testicular normal.
A cauda do epidídimo é identificada quando a probe é colocada na posição caudal
ao testículo com os feixes voltados na direção cranial (Figura 10). O lúmen do ducto
epididimário pode ser visualizado na cauda do epidídimo, devido ao seu maior tamanho
nesse local. A textura do epidídimo varia de anecóica para hipoecóica com relação ao
parênquima testicular (TURNER, 1998).
21
22
23
Figura 10 – O esquema demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência na imagem à esquerda e 7,5 MHz de
frequência na imagem à direita) foi colocado para avaliação da cauda do epidídimo. Na imagem ultrassonográfica,
observa-se a cauda do epidídimo (setas) hipoecóica em relação ao parênquima testicular. A presença de líquido na
cavidade vaginal facilita o exame.
Em certas posições é possível visualizar ramos da artéria testicular (Figura 11),
sendo esses vasos maiores e mais proeminentes próximo à cauda do epidídimo. O
parênquima testicular normal possui textura homogênea (LOVE, 1992).
24
Figura 11 – O esquema à esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequência) foi colocado no testículo,
possibilitando a vizualização dos ramos da artéria testicular (setas).
7. ENDOSCOPIA APLICADA AO EXAME ANDROLÓGICO
EM GARANHÕES
Classicamente a avaliação reprodutiva de garanhões tem sido realizada com a associação de
exames do sistema reprodutivo em conjunto à avaliação do sêmen. Ao longo de vinte anos um
grande número de métodos diagnósticos se tornaram disponíveis para facilitar essa avaliação. Esses
métodos permitem uma análise mais crítica da capacidade reprodutiva desses animais, como a
endoscopia que permite uma avaliação mais detalhada do trato genital interno.
O exame endoscópico do trato genital interno de garanhões revela anormalidades murais e
luminais indetectáveis por outros meios. É um importante procedimento para diagnóstico e
tratamento de algumas afecções do trato reprodutivo interno de garanhões, e é indicado na
investigação de certas perturbações na qualidade seminal, particularmente: hemospermia
piospermia.
Para a realização do exame completo do trato urogenital de garanhões, incluindo a
visualização da uretra peniana, uretra pélvica, glândula vesicular e bexiga urinária, é indicada a
utilização de videoendoscópio flexível de no mínimo 100 cm de comprimento e com um diâmetro
não maior do que 10 mm.
25
O exame é realizado com o cavalo em estação, devidamente contido e sedado. Antes do
procedimento o pênis deve ser higienizado com água corrente ou solução fisiológica, para
minimizar a contaminação do trato urinário, e a utilização de luvas estéreis é recomendada aos que
manuseiam o equipamento. São necessárias no mínimo três pessoas para a realização do exame: a
primeira deve segurar a cabeça do cavalo e prezar pela segurança das demais; a segunda é
responsável por segurar o pênis, inserir o endoscópio na uretra e progredir caso necessário; e a
terceira a responsável por manipular o aparelho, injetar ar e outras substâncias quando pertinente.
A progressão do endoscópio no interior da uretra deve ser cuidadosa, de forma lenta e
suave, para permitir um exame minucioso, e minimizar traumas que possam alterar a aparência da
mucosa. O pênis pode ser manuseado com auxílio de uma compressa e tração constante deve ser
aplicada. Após a introdução do endoscópio a distensão da uretra com ar é necessária para uma
melhor visualização do lúmen e estruturas adjacentes e uma breve inspeção de toda uretra deve ser
realizada, antes que apareçam áreas de hiperemia causadas pela presença do aparelho, que possam
ser confundidas com processos inflamatórios pré-existentes.
A mucosa uretral possui coloração rósea pálida, e contém numerosas dobras longitudinais.
Sua aparência e a técnica de avaliação são semelhantes as do esôfago. A vascularização do tecido
submucoso torna-se mais evidente conforme o endoscópio progride em direção à bexiga. Quando o
aparelho alcança o arco isquiático, o operador consegue perceber o trajeto curvilíneo que o
equipamento realiza e a imagem endoscópica torna-se invertida. Ocorre um alargamento da uretra e
as aberturas dos múltiplos ductos das glândulas bulbouretrais podem ser visualizadas em duas
fileiras ao longo do teto da uretra pélvica, que na imagem endoscópica, situa-se ventralmente.
Imediatamente após estas aberturas encontra-se uma elevação da mucosa, que consiste no colículo
seminal. Este é o local onde terminam os ductos deferentes e se abrem as glândulas vesiculares.
Quatro aberturas podem estar presentes, quando os ductos das glândulas vesiculares e dos ductos
deferentes se abrem de maneira independente. Duas aberturas são vistas quando ocorre união prévia
de um ducto deferente e um ducto da vesícula seminal correspondente, formando um ducto comum,
denominado ducto ejaculatório (Figura 1 A, B e C).
As aberturas das glândulas vesiculares podem ser canuladas neste local com um cateter de
polietileno de pequeno diâmetro, permitindo a coleta de amostra do conteúdo dessas glândulas, bem
como a instilação de medicamentos no interior das mesmas .
26
Ampolas
Vesículas
Seminais
Próstata
Bulbouretrais
A
B
C
FIGURA 1. A) Ilustração das quatro glândulas sexuais acessórias presentes no garanhão. B)
Esquema das aberturas das glândulas sexuais acessórias na uretra pélvica visualizadas por
endoscopia. Em azul as aberturas dos ductos das glândulas bulbouretrais, em verde as aberturas dos
ductos da próstata, em vermelho e amarelo o colículo seminal, local onde se abrem os ductos
ejaculatórios (formado pela união dos ductos das vesículas seminais às ampolas dos ductos
deferentes). C) Esquema de um corte transversal do colículo seminal. Em vermelho os ductos das
vesículas seminais, em amarelo os ductos das ampolas dos ductos deferentes e em azul o resquício
do útero masculino.
A endoscopia é o exame de eleição para estabelecimento do diagnóstico definitivo de
vesiculite seminal, uma vez que permite a visualização do lúmen da glândula e a coleta de amostras
para cultura bacteriana e antibiograma. Além disso, a endoscopia também é uma ferramenta útil no
diagnóstico da causa de hemospermia gerada por defeitos uretrais, como fissuras, ulcerações,
constrições, e varicosites, bem como uretrite, que são diagnósticos diferenciais de vesiculite
seminal. Essas lesões comumente localizam-se na região do arco isquiático ou imediatamente antes
dela. Geralmente os defeitos uretrais possuem comunicação com o estrato cavernoso ou esponjoso e
podem ser melhor observados após estímulo sexual, uma vez que há o preenchimento desses tecidos
por sangue.
Dentre as quatro glândulas sexuais acessórias, apenas a vesícula seminal possui acesso
endoscópico (Figura 2 A e B), devido ao seu ducto complacente e amplitude do lúmen. A lavagem
do lúmen vesical seguido de infusão de antibiótico específico é uma opção de tratamento de
vesiculite seminal no garanhão (Figura 2 C e D).
27
FIGURA 2. A) Imagem endoscópica do momento em que a abertura de um dos ductos ejaculatórios
é cateterizada para posterior introdução do endoscópio na vesícula seminal. B) Aspecto de uma
vesícula seminal normal. C e D) Aspecto de duas vesículas seminais apresentando conteúdo
purulento decorrente de vesiculite seminal.
7. COLHEITA DO SÊMEN
A colheita do sêmen é efetuada por auxílio de vagina artificial, onde o animal deve
ter um condicionamento prévio para que este monte em uma égua em cio ou em manequim.
•
•
Colheita com vagina artificial: a vagina artificial modelo Botucatu é composta de um
tubo rígido, uma mucosa de látex, um copo coletor protegido de luz e alterações de
temperatura. (Anexo1). A vagina deve preenchida com água quente, para permanecer
com temperatura de 42-45°C para colheita. O animal condicionado saltando sobre o
manequim, deve ter o pênis desviado e introduzido na vagina artificial. A constatação
da ejaculação pode ser verificada com as seguintes características:
Movimento da cauda para cima e para baixo, contração dos músculos perianais,
sapatear e fluxo pulsátil uretral da ejaculação.
28
7.1. ANÁLISE DO SÊMEN
7.1.1 EXAMES IMEDIATOS
Logo após a colheita o sêmen deve ser analisado segundo suas características
macro e microscópicas.
•
•
•
•
•
•
Volume = Podendo variar de 20 á 100ml
Cor = desde branco acizentado até um branco leitoso.
Densidade = Varia do tipo aquoso até leitoso e está diretamente relacionado
com a concentração espermática
Odor = “Sui-generis”
Motilidade espermática = Se faz uma pequena gota de sêmen entre lâmina e
lamínula aquecidas a 37°C e realiza-se a visualização em microscópio com
aumento de 200 vezes. A motilidade espermática é analisada segundo uma
escala de porcentagem variando de 0 a 100% (Motilidade Total=MT,
porcentagem de células móveis). Caso a amostra esteja muito concentrada
deve-se realizar uma diluição em meio diluidor (por ex. Botu-sêmen), esta
diluição pode ser 1:1 ( Motilidade ideal ≥ 70%)
Vigor espermático = Concomitantemente com a motilidade espermática se
avalia o vigor espermático na escala de 0 a 5 (velocidade com que o
espermatozoide se desloca, quanto maior a velocidade maior o valor).
(Vigor ideal ≥ 3)
7.1.2. EXAMES MEDIATOS
São realizados no momento da colheita, entretanto podem ser analisados
posteriormente.
•
Concentração espermática = Retira-se do volume ejaculado uma
alíquota de 20µl utilizando-se uma pipeta de Sahli ou micropipeta e coloca-se
em um tubo de ensaio contendo 1ml de água destilada aquecida ou 1 gota de
sêmen em 19 gotas de água destilada. Após boa homogeneização, monta-se
uma Câmara de Neubauer (ver esquemas), preenchendo seus 2 retículos,
conta-se todos os espermatozoides presentes em 5 quadrados de cada retículo
(vide exemplo), sendo que a variação entre cada uma dos lados da câmara
(retículos) não pode ser mais que 10% (se for maior repete-se a operação).
Após a operação calcula-se a média aritmética, o valor encontrado é
representado pela letra (n).
29
7.1.3 CÃMARA DE NEUBAUER
30
A concentração espermática média para um garanhão adulto colhido na vagina
artificial é de 0,1-0,2x109 espermatozóides por ml. (100 a 200 milhões/ml)
Ex:. De um dos lados da Câmara de Neubauer = Retículo
=
Esquema da contagem dos sptz :
diagonal (quadrados pretos) ou
cantos + centro (círculos azuis).
Contáveis
Não contáveis
Neste exemplo temos 12 espermatozóides azuis que deverão ser contados para
efeito de cálculo, os mesmos localizam-se nos quadrados cinzas e sobre as linhas, relativos
aos cinco quadrados representados, levando-se em consideração o posicionamento da
cabeça. Espermatozóides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado não são
contados.
Após a contagem das células espermáticas (n),utilizamos a seguinte fórmula para
cálculo da concentração espermática.
n
Concentração espermática =
1
10
x
5*
*
25
espermatozóides/mm3
x
1
20
n = Número médio de células contadas nos dois lados da Câmara de Neubauer
1 = Altura entre a lamínula e a Câmara de Neubauer em mm
10
*5=
Média ( ) de 5 quadrados de 1º retículo + 5 quadrados do 2º retículo
x
5 x 1 = 5 quadrados contados x a área do quadrado 1 mm2
25
25
1
= Diluição realizada (1 gota de sêmen em 19 gotas de água dest. ou 10µL de
20
sêmen em 190µL de água dest.)
O resultado encontrado é referente a concentração de espermatozóides no
ejaculado por mm3, para converter esse dado para mL, basta multiplicá-lo por 103 (1000).
31
Ex:. Foram contadas 100 células de um lado câmara=retículo (em cinco
quadrados) e 104 células do outro lado (variação entre os lados menor que 10%), tirase a média aritmética, o n = 102 (espermatozóides), colocando-se na fórmula,
adotando a diluição de 1/20, temos:
102
Concentração espermática =
1
10
x
5
25
, resolvendo a equação
x
1
20
Concentração espermática = 102 x 103 espermatozóides por mm3, convertendo
para ml (x103), a concentração espermática desse touro foi de 102 x 106 espermatozóides
por ml.
“Dica” Sempre que a diluição efetuada for de 1/20, basta multiplicar o n (número
médio contado nos retículos) por milhão (106 )e tem-se direto a concentração por ml. No
exemplo passado n = (102) multiplicado por 106, tem-se 102 x 106 espermatozóides por
ml. (102 milhões/ml)
•
Preparo de material para análise de Patologia espermática =
Coloca-se uma gota de sêmen em uma lâmina e realiza-se um esfregaço, fixase o esfregaço em metanol e cora-se a lâmina com corantes Ex:. Karras
modificado por Papa et al. (1998) (2 minutos no Rosa Bengala, lava-se a
lâmina em água corrente fraca, então põe-se 1 min no Tanino, lava-se
novamente e 30 segundos no Azul Vitória, lava-se a lâmina, deixa secar,
observa-se em microscopia de luz (óptica) aumento de 1000x). Conta-se 200
células, percorrendo a lâmina de forma homogênea como mostra o esquema
abaixo e classificando os espermatozóides conforme suas patologias, obtendo
no final as porcentagens de espermatozóides normais e de cada patologia.
Esquema de como se deve percorrer a lâmina para leitura de patologia
espermática.
7.2 PADRÕES DE PATOLOGIA ESPERMÁTICA
As patologias espermáticas são divididas em Defeitos Maiores, relacionados com a
infertilidade e Defeitos Menores não interferem diretamente sobre a fertilidade.
32
•
DEFEITOS MAIORES
1. Acrossomo:
2. Patologia da cabeça:
Subdesenvolvida ..............................................................
Isolada patológica ............................................................
Estreita na base................................................................
Piriforme..........................................................................
Pequena anormal .............................................................
Contorno anormal ............................................................
“Pouch formation” ...........................................................
3. Gota proximal:
4. Formas teratológicas:
5. Defeito de peça intermediária:
(Desfibrilação, fratura, edema, pseudogota) ........................
6. Patologia da cauda:
Fortemente dobrada ou enrolada.........................................
Dobrada com gota..............................................................
Enrolada na cabeça............................................................
7. Formas duplas:
•
DEFEITOS MENORES
1. Patologia da cabeça:
Delgada ............................................................................
Gigante, curta, larga, peq. normal....................................
Isolada normal...................................................................
2. Patologia da cauda e implantação:
Retro e abaxial, oblíquo.....................................................
Dobrada ou enrolada.........................................................
3. Gota Citop. Distal:
Esquema das patologias espermáticas encontradas:
33
D5 = disforme
E2 = gota distal
D6a e b = ruturada
E3 = gota presa na cauda
D7 = repregueada
E4 = gota presa na PI
D8 = tipo axial
E5 = fortemente dobrada
D9a e b = tipo fibrilar
E) = Cauda
E1 = gota proximal
Elementos figurados do sêmen
(Modificado de Mies Filho,1982).
E6 = espiraliforme
E7 = enrolada cabeça
E8 = rudimentar
F) = formas duplas
a) espermatozóides normais
b) gotas livres
c) anormalidades primárias
d a h) anormalidades secundárias
d) cabeças isoladas
e) gotas proximais
f) gotas distais
g) cauda dobrada com gota
h) acrossomas livres
i) formações ciliares (medusas)
k) células epiteliais de descamação
l) células linhagem espermática =
casos de degeneração testicular
m) hemácias
n) piócitos
7.3 Principais causas das patologias espermáticas
A) CABEÇA
Acrossomo = As alterações no acrossomo como: forma irregular, enrugado ou
destacado, podem ser devido ao choque térmico, manipulação indevida ou senilidade.
A presença de um grânulo no acrossomo, o denominado Knobbed sperm, pode
ser origem hereditária ou relacionado a degeneração testicular e está ligado diretamente
com a infertilidade do animal quando encontrado em grande quantidade.
O Pouch formation, (diadema defect) caracterizado pela presença de vacúolos na
região equatorial da cabeça não mais no acrossomo, formando um colar na cabeça do
espermatozóide são invaginações da membrana nuclear devido a rarefação da cromatina,
apresentam relação direta com a presença de hipoplasia ou degeneração testicular.
Alterações na forma da cabeça como: estreita na base, piriforme, lanciforme,
anã, são patologias de origem testicular podendo ser oriundas de hipoplasia ou degeneração
testicular. Sendo mais comum em cavalos cabeças subdesenvolvidas nos casos de
Degeneração Testicular,
35
B) COLO
Defeitos de inserção como: Abaxial, paraxial e retroaxial são devido a presença
de “goteira”, falhas na formação do espermatozoide. A localização da “goteira” definirá o
tipo da inserção. A inserção abaxial (mais encontrada nos equinos e considerada como
normal para cavalos), pode não afetar a fertilidade, pois o espermatozoide tende a se
adaptar com o movimento e conseguir um deslocamento compatível com a fertilização. As
inserções paraxial e retroaxial apresentam uma maior relação com a infertilidade pois
impossibilitam o deslocamento necessário do espermatozoide para a fecundação.
Gotas citoplasmáticas proximais ou distais são restos de citoplasma que são o
nutriente do espermatozoide durante o trânsito epididimário. O espermatozoide durante sua
maturação pelo epidídimo permanece três dias na cabeça do epidídimo ainda com a
presença da gota, posteriormente fica um dia no corpo e finalmente seis dias na cauda onde
deve se desprender desta gota; teorias afirmam que existem enzimas ativadoras no
epidídimo, que dissolveriam a gota. A presença de gotas em grade quantidade pode ser
devido: 1) animal imaturo, que começou a produção a pouco tempo, nestes casos colheitas
seriadas resolvem, um animal que está há muito tempo em descanso sexual também pode
vir a apresentar gotas, devido a um diminuição no trânsito epididimário, da mesma forma
colheitas periódicas levam ao desaparecimento da patologia; 2) disfunção epididimária
devido a alterações de temperatura (deficiência na termorregulação) levando a um
desequilíbrio iônico Na+ e K+, causando alterações no ciclo de maturação; 3) degeneração
testicular, levando a disfunção epididimária; 4) hipoplasia testicular, por se tratar de uma
patologia hereditária a gota sempre irá aparecer no ejaculado.
C) PEÇA INTERMEDIÁRIA
Corkscrew defect (defeito em saca rolha), devido a degeneração do plasmalema,
afetando a região das mitocôndrias que fica com aspecto rugoso, podendo dificultar a saída
da gota e mais grave afetando a conformação das microfibrilas que podem se soltar
patologia vista em animais idosos.
Cabeça destacada (isolada), “goteira” rasa quando se forma podendo ser
decorrente de problema de inserção paraxial ou de origem genética.
Forma duplas da PI e/ou cauda, origem hereditária.
D) CAUDA
Enrolada, fortemente enrolada, dobrada e fortemente dobrada, são devidas a
uma diminuição no número de microfibrilas 3 ou 4 (Dag defect) neste caso sendo de caráter
hereditário, estes animais apresentam elevado nível de Zn no sêmen. Outra causa da
apresentação de defeitos de cauda no espermatozóides pode ser devido a choque osmótico
ou térmico e disfunções de epidídimo.
E) OUTRAS ANORMALIDADES
Aglutinação de cabeça (head aglutination), os espermatozóides chegam em
blocos ao epidídimo, e neste local há presença de antiaglutininas que promovem a
separação das células, uma disfunção epididimária pode levar ao desenvolvimento desta
patologia.
36
Espermatozóides subdesenvolvidos, animais imaturos ou processos interferindo
na espermatogênese (de animais maduros) havendo a liberação no ejaculado de células
primordiais espermatócitos, espermatogônias, espermátides.
Medusa, restos ciliares do epidídimo por disfunção epididimária, geralmente nos
casos de recuperação de degeneração testicular.
Pseudogota, semelhante a gota citoplasmática, porém situada na porção média da
PI, e apresentando tamanho maior que a gota tradicional devido ao envolvimento de 1 ou 2
camadas de mitocôndrias.
37
7.4 MODELO DO LAUDO DE EXAME ANDROLÓGICO
fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA BOTUCATU
Dep. de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
18618 - 000 - Botucatu/ SP - Rubião Junior - Fone/FAX (14)6802 6249/6326
A.)
CERTIFICADO ANDROLÓGICO
IDENTIFICAÇÃO DO REPRODUTOR
Nome:
Raça:
Proprietário:
Endereço:
B.)
EXAME CLÍNICO
1. Histórico:
2. Geral:
3. Sistema Genital Prepúcio:
Idade:
Propriedade:
Testículos:
Registro:
Pênis:
Esquerdo
Direito
Dimensões (comp., larg. alt.)cm
Simetria
Forma
Posição
Consistência
Sensibilidade Dolorosa
Mobilidade
Epidídimo
Genitália interna:
4. Comportamento sexual (libido):
C.)
ESPERMIOGRAMA
I. Método de coleta: Vagina Artificial
Data:
Horário:
II. Características do ejaculado:
1. Volume ejaculado :
ml
5. Motilidade
:
2. Cor
:
6. Vigor (0-5)
:
6
3
3. Aspecto
:
7. Concentr. (x10 /mm ) :
4. Turbilhonamento : 8. Total esperm. (x109) :
III. Características morfológicas (anexo I):
a. Defeitos maiores: %
b. Defeitos menores:
%
Total:
%
IV. Outros elementos:
(1. Medusa, 2. Células primordiais, 3. Células gigantes, 4. Leucócitos, 5. Hemácias, 6.
Não detectados
Células epiteliais, 7. Cristais de urina, 8. Bactérias.)
D.) OBSERVAÇÃO:
E.) CONCLUSÃO:
------------------------------------------------
Local, ........... Data, .../..../......
Méd. Veterinário Responsável
CRMV
fmvz-unesp
7.6 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DE SÊMEN
GARANHÕES DESCRITOS POR VÁRIOS PESQUISADORES
Características
Espermatozóides
normais (%)
Cabeças anornais
Cabeças destacadas
Gota citoplasmatica
proximal
Gota citoplasmatica
distal
Peça intermediária
anormal
Cauda anormal
Dowsett and Pattle Pickett et al
Não relatado
51 ( 15 )
Jasko et al
52.5 (20.1 )
7.1 (5.9 )
2.6 ( 4.8 )
13.1 ( 10.3 )
9(8)
5(6)
3(5)
6.4 ( 6.9 )
1.3 ( 1.7 )
15.5 ( 11 )
8.1 ( 11.7 )
3(4)
13.5 ( 11.4 )
Não relatado
11 (11)
7.4 ( 7.1 )
10.9 ( 9.2 )
20 (13 )
2.4 ( 3.9 )
DE
8. METODOLOGIA BÁSICA PARA REFRIGERAÇÃO DE
SÊMEN
8.1 DILUIÇÃO:
•
•
•
•
•
•
Diluir sêmen com meio á base de Leite (BotuSêmen/Botupharma), contendo como
antibióticos de preferência uma associação de Amicacina e Penicilina cristalina,
podendo ser utilizada a gentamicina.
Diluir no mínimo o sêmen fresco com 2 partes de meio (Ideal 3:1 Meio: Sêmen).
Utilizar dose inseminante com 1 bilhão de espermatozóides viáveis.
Diluir a uma concentração entre 20 e 50 de milhões de espermatozoides por mL.
Envasar em recipiente plástico BOTU-IA (Botupharma) (ANEXO 4) com a menor
quantidade de ar possível.
OBS: Para garanhões que não refrigeram bem a utilização do diluente BotuTurbo
(Botupharma) é uma opção adequada, devendo com este diluente o transporte ser
realizado a 5°C.
8.2 REFRIGERAÇÃO:
•
Colocar em recipiente adequado. Lembrando-se que quando do resfriamento até 5°C
deve-se utilizar Containers adequados como o Equitainer ou seus similares nacionais
Botutainer (Anexo3) e Botuflex (Anexo1), seguindo regras indicadas pelo fabricante
para montar o sistema. Este sistema permite manter a temperatura de 5°C por um
período máximo de 48 horas
40
As inseminações com sêmen fresco devem ser realizadas utilizando-se entre 500 a
1000x106 sptz viáveis.
As amostras com sêmen refrigerado devem conter 1000x106 sptz viáveis .
G) Câmara de Neubauer
H) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20 µl (10 a 100 µL)
I) álcool polivinílico ou bolinhas de metal ou vidro para lacrar palhetas
J) diluente para congelação (BOTUCRIO®)
K) uma geladeira (no local) a 5°C para estabilização
L) termômetro
M) caixa de isopor 37 a 45L (45cm Comprimento x 36cm Largura x 38cm Altura)
N) grade para as palhetas (local onde são colocadas as palhetas p/ estabilização), (modelo
Botupharma)
O) suporte para manter a grade de palhetas acima do nível do N2 (modelo Botupharma)
P) botijão de N2 (no local)
Q) Banho-Maria
9.3 SEQUÊNCIA PARA CONGELAÇÃO
a) PREPARO DO LABORATÓRIO
Antes de iniciar a colheita do sêmen para congelação, preparar os materiais no
laboratório ou sala onde será realizada a congelação. Aferir a geladeira se está entre 4 e
6°C, podendo também utilizar o sistema (Botutainer ou Botuflex para refrigeração a
5ºC). Descongelar os diluentes e colocá-los no banho Maria a 37°C, separar um tubo de
ensaio ou Eppendorf com 19 gotas de água destilada ou 190µL de água destilada para a
concentração espermática que será acrescida de uma gota (01) ou 10 µL de sêmen
respectivamente, caracterizando uma diluição de 1:20 (uma parte de sêmen para 19 partes
de água destilada).
b) COLHEITA DO SEMÊN
O sêmen pode ser colhido com a vagina artificial, modelo (modelo Botupharma) .
- Análise dos parâmetros macro e microscópicos do sêmen.
-
Cálculo do número de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100
milhões de espermatozoides viáveis. Desta forma para o cálculo do número de
palhetas basta dividir por 100 o número total de espermatozoides viáveis do
ejaculado.
-
Ex: Um ejaculado de 50 mL com motilidade total de 80% e concentração
espermática de 100 milhões por mL. Total de espermatozoides viáveis neste
ejaculado: 50 mL x 100 milhões x 80% = 4 bilhões de espermatozoides viáveis
dividido por 100 milhões = 40 palhetas.
42
-
Centrifugação: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com sêmen diluído
na proporção de 1:1 com BotuSemen (Botupharma) 600xg ou 2200 rpm por 10
minutos (Ex. centrífuga da Fanem/Baby/n°2 por 10 minutos).
-
Cálculo do volume final de ressuspensão: cada palheta contém 0,5mL, ou seja,
multiplicar o número de palhetas por 0,5 que é o volume final da suspensão com o
diluente de congelação.
-
Ressuspensão: Após a parada da centrífuga, o sobrenadante de cada frasco deve ser
imediatamente desprezado e os “pellets” devem ser ressuspendidos no diluidor de
congelação Botu-Crio® (Botupharma), previamente aquecido e calculado.
-
Envasamento: Deve ser feito em palhetas de 0,5 mL.
-
Estabilização: 20 minutos em refrigerador a 5 oC.
-
Resfriamento rápido: 15 a 20 minutos em vapor de nitrogênio, mantendo entre 3 e
6 cm acima do nível do nitrogênio líquido, em caixa isopor térmica tampada (37 a
45 litros).
-
Congelação: imersão das doses no nitrogênio líquido.
-
Descongelação: Sempre se retira uma palheta da partida congelada para avaliação
do procedimento. Esta palheta pode ser descongelada em Banho-maria a 46°C por
20 segundos e em seguida imergir a 37 ºC. Aguardar de 1 a 2 minutos pós
descongelação a temperatura de 37 ºC para avaliação definitiva. Colocar o conteúdo
de uma dose (0,5 ou 0,25 mL) num eppendorf de 1,5 a 2,0 mL e mantê-lo no
Banho-seco a 37ºC ou sobre a mesa aquecedora para análise dos parâmetros.
-
Análise do sêmen pós-descongelação: Retirando-se a palheta do Banho-maria,
deve-se secá-la bem com pano ou toalha de papel, para evitar que alguma gota de
água entre em contato com o sêmen, posiciona-se a bolha para ponta da palheta e
corta-se com uma tesoura na porção onde se localiza o lacre (álcool polivinílico).
Verifica-se a motilidade, vigor, a concentração e faz-se um esfregaço, para análise
da patologia espermática ou utiliza-se uma preparação com 40µl de solução de
trabalho para fluorescência com 10µl de sêmen. Caso não possua microscópio de
epifluorescência, a amostra congelada poderá ser enviada a Faculdade para análise.
Recomenda-se os seguintes requisitos para que uma dose congelada esteja
apta inseminação artificial.
Motilidade total
≥ 50%
Vigor ≥ 3
Porcentagem de patologia espermática aceita:
Defeitos menores
≤ 20%
Defeitos maiores ≤ 20%
Defeitos Totais
≤ 40%
43
CUIDADOS NA INSEMINAÇÃO COM SÊMEN CONGELADO
•
Programe o momento da ovulação com hCG e ou GnRH (deslorelina).
•
Inseminar entre 12 horas antes até no máximo 6 horas após a ovulação.
•
Não diluir a dose inseminante, pois isto pode ser altamente lesivo e provocar
dano osmótico.
• Sempre que houver dúvidas sobre a manipulação do sêmen pós-descongelação,
consulte um profissional mais experiente para orientá-lo (a).
44
fmvz-unesp
Espermatozóides vermelhos: Membrana Citoplasmática lesada
Espermatozóides brancos: Membrana Citoplasmática íntegra
Espermatozóides com caudas enroladas: Membrana Citoplasmática íntegra.
Espermatozóides com caudas retas: Membrana Citoplasmática lesada.
Obs. Não esquecer as caudas dobradas ou enroladas ejaculadas. Fazer o teste com formol-salina
para descartar os espermatozóides com defeitos ejaculados.
10. TÉCNICAS PARA MELHORAR A QUALIDADE DO
SÊMEN FRESCO, REFRIGERADO E CONGELADO DE
GARANHÕES
Na espécie equina a seleção dos reprodutores é realizada através de avaliações
fenotípicas, como a conformação do animal e sua performance atlética, diferente da espécie
bovina onde se avalia os parâmetros reprodutivos para que um touro se torne reprodutor.
Desta forma existe muito interesse em reproduzir garanhões que são considerados
subférteis.
Diante disso, foram desenvolvidas várias técnicas visando aumentar a qualidade
seminal de garanhões ou então a sua resistência à refrigeração e congelação. São exemplos
destas técnicas a remoção do plasma seminal e a seleção espermática.
10.1 REMOÇÃO DO PLASMA SEMINAL
O plasma seminal dos garanhões com baixa resistência espermática à refrigeração
possui fatores deletérios à viabilidade espermática, sendo necessário nestes animais realizar
a remoção do plasma seminal, para aumentar a qualidade do sêmen após a refrigeração.
Estudo realizado por Ramires-Neto et al. (2012) demonstrou que quando se remove o
plasma seminal de garanhões com baixa resistência espermática à refrigeração, aumenta-se
a qualidade seminal após 24 horas de refrigeração à 15oC.
Existem diversas técnicas para se concentrar espermatozoides do ejaculado de
garanhões, sendo a mais comumente utilizada é a centrifugação. Contudo, estudos
demonstraram haver efeitos deletérios da centrifugação sobre a viabilidade dos
espermatozoides, uma vez que a força e tempo de centrifugação podem interferir
negativamente na motilidade, integridade e taxa de recuperação espermática.
Para realizar a remoção do plasma seminal através da centrifugação convencional o
sêmen deve ser acrescido de diluente a base de leite desnatado na proporção 1:1.
Posteriormente realiza-se o processo de centrifugação. A melhor intersecção entre tempo e
força de centrifugação que apresenta maior taxa de recuperação espermática com
espermatozoides íntegros é 600xg durante 10 minutos.
Posteriormente a centrifugação, o sobrenadante deve ser desprezado utilizando um
cateter acoplado a uma seringa ou uma bomba de vácuo e o pellet ressuspendido com o
meio extensor desejado. Sempre que houver uma compactação muito grande do pellet
formado deve-se diminuir nas coletas futuras a força de centrifugação ou utilizar de outras
técnicas como a filtração e o cushion visando minimizar o excessivo empacotamento dos
espermatozoides.
Uma alternativa para remover plasma seminal do ejaculado, minimizando as lesões
aos espermatozoides, é a centrifugação com cushion. Este método visa maximizar a
recuperação de espermatozoides de sêmen centrifugado de garanhões, pois utiliza forças de
49
movimentos leves tocando o filtro em uma placa de petri de 15 cm (B) e devido ao tamanho
dos poros e a capilaridade, os espermatozoides ficam retidos no filtro e o plasma seminal
passa através dele (C) .
10.2 SELEÇÃO ESPERMÁTICA
A seleção espermática é uma técnica que vem sendo largamente utilizada para
aumentar a qualidade e fertilidade do sêmen fresco de garanhões e a resistência de seus
espermatozoides à refrigeração e congelação. Esta técnica consiste em separar os
espermatozoides com motilidade progressiva e sem alterações de morfologia do resto do
ejaculado e para isso é realizado uma centrifugação em gradiente de densidade.
Previamente à seleção espermática, um total de 1 x 109 espermatozoides devem ser
concentrados em 5 mL de diluente comercial à base de leite desnatado, para isso pode-se
utilizar a centrifugação convencional, a centrifugação com cushion ou a filtração em
SpermFilter.
Após isso, 5 mL do gradiente de densidade (Equipure ou Androcol) deve ser
adicionado em um tubo falcon de 15 mL. Os 5 mL com o sêmen concentrado deve ser
cuidadosamente adicionado neste mesmo tubo, acima do gradiente de densidade. Para isso,
pode-se utilizar um pipeta pauter, deslizando vagarosamente o sêmen através das paredes
do tubo. É realizada uma centrifugação de 400 xg por 20 minutos e após isso os
espermatozoides sem alterações morfológicas e com motilidade progressiva ficam
depositados no fundo do tubo falcon. O restante do ejaculado fica retido acima do gradiente
de densidade. Com o auxilio de uma pipeta de 1mL deve-se remover o pellet com os
espermatozoides selecionados e diluí-lo com o meio apropriado.
51
11. AUTORES
Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa - Professor Titular do
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da
FMVZ, UNESP Botucatu - SP- PhD e Pós-Doutorado em
Reprodução Animal - Hannover- Alemanha.
Email: [email protected]
Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga - Professor Adjunto do
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária da
FMVZ, UNESP Botucatu - SP PhD em Reprodução Animal - Pós Doutorado-Universidade do Colorado - USA
Email: [email protected]
Dr. José Antonio Dell'Aqua Junior - Médico Veterinário,
Mestrado, Doutorando e Pós-Doutorando na área de Reprodução
Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP
Email: [email protected]
Dr. Gabriel Augusto Monteiro - Médico Veterinário, Residência,
Mestrado, Doutorado e Pós-doutorando na área de Reprodução
Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP
Email: [email protected]
Ms. Yamê F. R. Sancler da Silva - Médica Veterinária, Residência,
Mestrado e Doutoranda na área de Reprodução Animal FMVZ,
UNESP Botucatu - SP
Email: [email protected]
Ms. Carlos Ramires Neto - Médico Veterinário, Mestrando na área
de Reprodução Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP
Email: [email protected]
53
É VEDADA A CÓPIA OU MESMO UTILIZAÇÃO EM CURSOS
DE REPRODUÇÃO EQUINA DESTE MANUAL, SEM PRÉVIA
AUTORIZAÇÃO DOS AUTORES.
11. REFERÊNCIAS
McKINNON, O.J. ; VOSS,
Philadelphia,London, 1993.
J.L.
Equine
Reproduction,
Lea
&
Febiger,
MIES FILHO, A. Reprodução dos Animais, 6ª Edição Sulina, Porto Alegre-RS.
CARTEE, R.E.; POWE, T.A.; GRAY, B.W.; HUDSON, R.S.; KUHLERS, D.L.
Ultrasonographic evaluation of normal boar testicles. Am J Vet Res, v.47, n.12, p.25432544, 1986.
CHENIER, T.S. Anatomy and physical examination of the stallion. In SAMPER, C.S.
Equine breedins management and artificial insemination. 2 Ed, p.1-17, 2009.
DYCE, K.M.; SACK, W.O.; WENSING, C.J.G. Tratado de anatomia veterinária, 3 ed,
2005, 567p.
HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. In: Reprodução Animal. 7.ed. Barueri:Manole, 2004
LOVE, C.C. Ultrasonographic evaluation of the testis, epididymis, and spermatic cord of
the stallion. Vet Clin North Am Equine Pract. n.8, v.1, p.167-182, 1992.
PAPA, F.O.; ALVARENGA, M.A.; CARVALHO, I.M.; BICUDO, S.D.; RAMIRES,
P.R.N.; LOPES, M.D. Coloração espermática segundo karras modificado pelo emprego do
barbatimão (Stryphnodendrum barbatiman). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e
Zootecnia, v.40, p.115-23, 1988.
PAPA, F.O., MELO, C.M.; FIORATTI E.G.; DELLA’QUA, J.A.; ZAHN, F.S.;
ALVARENGA, M.A. Freezing of stallion epididymal sperm. Animal Reproduction
Science, v.107, p.293-301, 2008.
SAMPER, J.C. Management and fertility of mares bred with frozen semen. Animal
Reproduction Science, v. 68 p. 219-228, 2001.
RAMIRES NETO, C.; MONTEIRO, G. A. ; SOARES, R. F. ; PEDRAZZI, C. ;
DELL`AQUA, J.A.; PAPA, F. O.; ALVARENGA, M.A. Effect of Removing Seminal
Plasma Using a Sperm Filter on the Viability of Refrigerated Stallion Semen. Journal of
Equine Veterinary Science, v. 33, p. 40-43, 2012.
SAMPER, J.C; PYCOCK, J.F.; MCKINNON, A.O. Current Therapy in Equine
Reproduction.1st.Ed, Saunders, Philadelphia, PA, 2007.
TURNER, R.M. Ultrasonography of the genital tract of the stallion. In: REEF, V.B. Equine
Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998.
SULLIVAN, R.; SAEZ, F.; GIROUARD, J.; FRENETTE, G. Role of exosomes in sperm
maturation during the transit along the male reproductive tract. Blood Cells, Molecules, &
Diseases, v.35, p.1-10, 2005.
TURNER, R.M. Ultrasonography of the genital tract of the stallion. In: REEF, V.B. Equine
Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998.
55
ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO
PPASSA PASSO PASSO
ACONDICIONAR AS DOSES DE
SÊMEN DENTRO DA BOTUFLEX
COLOCAR O GELO NA BOTUFLEX
TEMPERATURA= 15ºC UTILIZE 1
GELO
IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE
CONGELADOS POR NO MÍNIMO 48 HORAS
TEMPERATURA= 5ºC
UTILIZE 2 GELOS
INTRODUZIR A BOTUFLEX
NA CARTOLINA
ACOPLAR A TAMPA
BOTUFLEX NA CARTOLINA
PRONTA PARA ENVIO
ANEXO 3 - MONTAGEM DA BOTUTAINER
PASSO A PASSO
COLOCAR O RECIPIENTE TERMO
PROTETOR DENTRO DA BOTUTAINER
COLOCAR OS GELOS DENTRO DA
BOTUTAINER
IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE
CONGELADOS POR NO MINIMO 48 HORAS
ACONDICIONAR AS DOSES DE SEMEN
DENTRO DO RECIPIENTE TÉRMICO
DOSES DE SEMEN E GELOS
ACONDICIONADOS DENTRO DO
RECIPIENTE TÉRMICO
BOTUTAINER FECHADO E PRONTO
PARA ENVIO DO SEMEN
58
ANEXO 4
COMO UTILIZAR O BOTU-IA?
FAÇA A DILUIÇÃO DO SEMEN
COM O DILUENTE UTILIZANDO A
GRADUAÇÃO DO BOTU-IA
QUANDO
SE
UTILIZA
O
BOTU-IA
PARA
TRANSPORTE DE SEMEN, PODE-SE RETIRAR O AR
EXCEDENTE DO FRASCO
NO MOMENTO DA INSEMINAÇÃO
CORTE A PONTA DO BOTU-IA
ACOPLE A PONTA DO BOTU-IA
NA PIPETA
COM A PIPETA NO INTERIOR DO UTERO DA ÉGUA POSICIONE O BOTU-IA PARA CIMA E
PRESSIONE O FRASCO PARA INTRODUZIR O SÊMEN.
ANEXO 5 COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL
2
2
1
3
7
4
5
6
4
FIG.1) COMPONENTES DA V.A.: (1)
Tubo Rígido, (2) Mucosa de Latex, (3)
Mucosa Plástica, (4) Anéis de Latex, (5)
Camisa interna, (6 e 7) Copo coletor e
tampa respect.
FIG.2) INTRODUZIR A MUCOSA DE
LATEX NO TUBO RÍGIDO E
PRENDÊ-LA COM ANÉIS (N°4,FIG.1),
PARA QUE NÃO VAZE A ÁGUA.
FIGS.3 e 4) INTRODUZIR A MUCOSA DE PLÁSTICO EXTERNAMENTE A MUCOSA
DE LATEX E PRENDÊ-LA.
FIGS.5 e 6) ACOPLAR O COPO COLETOR NA MUCOSA PLÁSTICA, FIXANDO-A
COM A TAMPA.
Obs. CORTAR DOIS (2) ANÉIS DA MUCOSA DE LATÉX APROX. 4 CM, PARA FIXÁLA NO TUBO RÍGIDO (nº4, FIG.1).
ANTES DE FIXAR O COPO COLETOR NA MUCOSA PLÁSTICA, INTRODUZIR A
CAMISA PLÁSTICA DENTRO DO COPO (nº5 FIG.1).
.