UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
Curso de Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas
Área de Insumos e Medicamentos
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI- Helicobacter DA RESINA,
DO ÓLEO ESSENCIAL E DA MISTURA DE α E β AMIRINAS DE
Protium heptaphyllum MARCH.
MARISA CLAUDIA ALVAREZ
Dissertação
de
Mestrado
apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade
São Francisco - USF
Bragança Paulista - SP
2006
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UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Área de Insumos e Medicamentos
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTI- Helicobacter DA RESINA,
DO ÓLEO ESSENCIAL E DA MISTURA DE α E β AMIRINAS DE
Protium heptaphyllum MARCH.
MARISA CLAUDIA ALVAREZ
Dissertação
de
Mestrado
apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências
Farmacêuticas da Universidade
São Francisco - USF
Orientador:
Prof. Dr. José Pedrazzoli Jr.
Bragança Paulista - SP
2006
QW 154
A475a
Alvarez, Marisa Claudia.
Avaliação da atividade anti-Helicobacter da resina,
do óleo essencial e da mistura de α e β Amirinas de Protium
heptaphyllum March / Marisa Claudia Alvarez. -Bragança Paulista, 2006.
94 p.
Dissertação (mestrado) – Programa de Pós- Graduação
em Ciências Farmacêutica da Universidade São Francisco.
Orientação de: José Pedrazzoli Junior.
1. Helicobacter pylori. 2. Protium heptaphyllum March.
3. Atividade antimicrobiana. I. Pedrazzoli Junior, José.
II. Título.
Ficha catalográfica elaborada pelas Bibliotecárias do Setor de
Processamento Técnico da Universidade São Francisco.
UNIVERSIDADE SÃO FRANCISCO
Curso de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas
Área de Insumos e Medicamentos
TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIHelicobacter DA RESINA , DO ÓLEO ESSENCIAL E DA
MISTURA DE α E β AMIRINAS DE Protium heptaphyllum
MARCH.
NOME DO ALUNO: MARISA CLAUDIA ALVAREZ
NOME DO ORIENTADOR: JOSÉ PEDRAZZOLI Jr.
DATA DA DEFESA
COMISSÃO EXAMINADORA:
____________________________
Nome José Pedrazzoli Jr.
CPF
Instituição USF
____________________________
Nome Marcelo Lima Ribeiro
CPF
Instituição USF
__________________________
Nome Marcelo Lancellotti
CPF
Instituição UNICAMP
FICHA CADASTRAL
Nome: Marisa Claudia Alvarez
CPF: 230561298-26
Data de Nascimento: 2 de Junho de 1966
Endereço: Rua Coronel Osório 111, Apto. 401; Centro. CEP: 12900-150
Bragança Paulista - SP
Linha de Pesquisa: Obtenção, padronização e controle de qualidade de
insumos e medicamentos.
Projeto que está vinculado: Avaliação da atividade anti- Helicobacter de
produtos naturais.
Palavras Chaves: Helicobacter pylori, Protium heptaphyllum March,
atividade antimicrobiana.
Financiamentos: CAPES
Data de Matrícula: Março 2004.
Data de Conclusão: Junho 2006.
Graduação: Universidad Nacional de Córdoba (UNC), Córdoba, Argentina.
Ano: 1991
Vínculo Profissional
1. Bolsista: ( x ) sim
CAPES
2. Vínculo atual:
(
) não
Trabalho realizado na Unidade
Integrada de Farmacologia e
Gastroenterologia (UNIFAG) no
Laboratório de Microbiologia e
Biologia
Molecular,
da
Universidade São Francisco.
Apoio Financeiro
CAPES.
A Carlos ,
pelo estímulo e generosidade de espíritu.
Aos meus filhos, Santiago e Malena
pelo seu amor incondicional.
AGRADECIMIENTOS
Ao Prof. Dr. Sérgio de Mendonça, pela maneira gentil e competente com que
norteou os meus estudos.
Aos Profs. Dr. José Pedrazzoli Jr., Dr. Marcelo Lima Ribeiro, Dr. Marcelo
Lancellotti e Dra. Alessandra Gamberro, pela atenção e disponibilidade em
participar da avaliação de este trabalho e pelas valiosas sugestões realizadas.
Ao Prof. Dr. Vietla
Rao do departamento de Farmacologia e Fisiologia da
Universidade Federal do Ceará, pelas amostras cedidas para a realização
deste trabalho.
À Eloá, Anita Paula, Kelly, Rafael, Waldemar, Amanda, Fernanda, Marta,
Demetrius e Daniel por terem me facilitado à integração, pela alegria e boa
disposição e pelos agradáveis momentos compartilhados no laboratório.
À Eloá pelo auxilio no tratamento dos camundongos e pela sua amizade.
A Waldemar pelo auxilio na extração de DNA e a técnica de PCR em tempo
real.
À Marta pelo seu auxilio no sacrifício dos camundongos e determinação de
atividade mieloperoxidase.
Aos meus pais, Norma e Carlos, pelo amor, estímulo e apoio em todos os
momentos da minha vida.
Ao meu esposo Carlos, pela paciência, compreensão e estímulo constantes.
À Eugenia Bernardi, amiga de todas as horas, pelos conselhos, incentivo e
artigos.
A todas as pessoas que direta e indiretamente contribuíram para o
desenvolvimento deste trabalho.
A CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
È melhor perder se que nunca embarcar,
Melhor tentar se que nunca intentar...
Saber que se pode, querer que se possa
Esquecer os medos, jogá-los para fora
Pintar sua cara da cor da esperança
Tentar o futuro com seu coração.
LISTA DE ABREVIATURAS
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E GRÁFICOS
RESUMO
I – INTRODUÇÃO ........................................................................................ 1
II - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................... 3
1- MICRORGANISMO .......................................................................... 3
1.1 Características microbiológicas .............................................. 4
1.2 Morfologia .................................................................................. 4
1.3 Determinantes de patogenicidade ........................................... 5
1.4 Diversidade genética ................................................................ 8
2- EPIDEMIOLOGIA ............................................................................. 11
3- PREVALÊNCIA ................................................................................ 13
4- TRANSMISSÂO................................................................................ 15
4.1 Transmissão fecal-oral ............................................................. 15
4.2 Transmissão oral-oral............................................................... 16
5- DIAGNÓSTICO .................................................................................. 16
5.1 Técnicas que requerem endoscopia ....................................... 17
5.1.1 Cultura.............................................................................. 17
5.1.2 Histologia......................................................................... 18
5.1.3 Teste rápido da ureáse ................................................... 19
5.1.4 PCR................................................................................... 20
5.1.4.1 PCR ...................................................................... 20
5.1.4.2 PCR em tempo real ............................................ 21
5.2 Técnicas não endoscópicas..................................................... 21
5.2.1 Detecção de anticorpos.................................................. 21
5.2.2 Teste respiratório da uréia ............................................. 22
6- TRATAMENTO .................................................................................. 22
6.1 Esquemas terapêuticos ............................................................ 23
6.2 Resistência aos antimicrobianos............................................. 24
7- ESTUDOS in vivo ............................................................................. 26
7.1 Estudos de tratamentos antimicrobianos ............................... 26
8- PRODUTOS NATURAIS: ALTERNATIVA TERAPÊUTICA.............. 28
8.1 Plantas medicinais e fitoterapia ............................................... 29
8.2 Química de produtos naturais.................................................. 32
8.3 Protium heptaphyllum March. ................................................. 32
III – OBJETIVOS.......................................................................................... 36
IV – MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 37
1-OBTENÇÃO DOS PRODUTOS NATURAIS DE Protium
heptaphyllum March..........................................................................37
1.1 Análise fitoquímica................................................................... 38
2 - LINHAGENS DE Helicobacter pylori ............................................. 38
2.1 Caracterização microbiológica................................................ 40
3- TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE ÀS DROGAS ............................. 41
3.1 Difusão em discos de papel ................................................... 41
3.2 Método de Microdiluição ........................................................ 42
3.2.1 Determinação de CIM por espectrofotometria ............ 45
3.2.2 Ensaio de microdiluição em pH 4 ............................... 46
4- ANÁLISE in vivo ............................................................................. 46
4.1 Animais ................................................................................... 46
4.2 Modelo experimental.............................................................. 46
4.3 Avaliação das lesões ulcerativas.......................................... 48
4.4 Cultura bacteriana dos estômagos dos camundongos ...... 48
4.5 Extração de DNA .................................................................... 49
4.6 Amplificação por PCR em tempo real................................... 50
4.7 Determinação de atividade mieloperoxidase ....................... 51
5- ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS.......................................... 52
V – RESULTADOS ...................................................................................... 53
1- TESTES DE SUSCEPTIBILIDADES ÀS DROGAS............................ 53
1.1 Difusão em discos...................................................................... 53
1.2 Concentração Inibitória Mínima e Bactericida Mínima............ 54
1.3 Determinação de CIM por espectrofotometria ......................... 59
1.4 Influência do pH ácido nas propriedades anti-Helicobacter
dos compostos ......................................................................... 63
2 - ENSAIOS in vivo............................................................................ 64
2.1 Avaliação das lesões ulcerativas...............................................64
2.2 Quantificação de H.pylori por PCR em tempo real.................. 65
2.3 Cultura dos microrganismos presentes nas biopsias
gástricas .................................................................................... 67
2.4 Atividade mieloperoxidase ........................................................ 67
VI – DISCUSSÂO......................................................................................... 69
VII – CONCLUSÕES.................................................................................... 80
VIIl – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................... 81
LISTA DE FIGURAS, TABELAS E GRÁFICOS.
Figura 1: Cultura de Helicobacter pylori (página 18)
.
Figura 2: Análise histológica da biopsia gástrica, com coloração de prata, onde
se observa a presença de H. pylori. (página 19)
Figura 3: Teste da urease. (página 20)
Figura 4: Folha de P. heptaphyllum. (página 33)
Figura 5: Resina de P. heptaphyllum. (página 33)
Figura 6: Esquema de preparação da microplaca. (página 44)
Figura 7: Efeito das diferentes concentrações de amoxicilina nas linhagens
26695, Hardenberg, 713 e 84, determinadas por espectrofotometria. (página
61)
Figura 8: Efeito das diferentes concentrações da mistura de α e β amirinas de
Protium heptaphyllum March, nas linhagens 713, 638, 637, e 39F. (página 61)
Figura 9: Efeito das diferentes concentrações da resina de Protium
heptaphyllum March., nas linhagens 713, 638, 637, e 39F. (página 62)
Figura 10: Efeito das diferentes concentrações do óleo essencial de Protium
heptaphyllum March., nas linhagens 713, 638, 637, e 39F. (página 62)
Tabela 1: Ocorrência de H. pylori em diferentes doenças gástricas. (página 12)
Tabela 2: Distribuição das linhagens de H.pylori, de acordo com a sua
resistência aos antimicrobianos de uso tradicional. (página 40)
Tabela 3: Índice de lesões ulcerativas, esquema proposto por Gamberini et
al.,(1991). (página 48)
Tabela 4: Halos de inibição para a linhagem 26695 obtidos para o óleo, a
resina e a mistura das α e β amirinas de Protium heptaphyllum March. (página
53)
Tabela 5: Atividade antibacteriana do óleo essencial de P.heptaphyllum frente
a H. pylori determinada por microdiluição. (página 54)
Tabela 6: Atividade antibacteriana da resina de P.heptaphyllum frente a H.
pylori determinada por microdiluição. (página 54)
Tabela 7: Atividade antibacteriana da mistura de α e β amirinas de
P.heptaphyllum frente a H. pylori determinada por microdiluição. (página 55)
Tabela 8: Determinação da concentração bactericida mínima (CBM) e
concentração inibitória mínima (CIM) da mistura de α e β amirinas e da resina
de Protium heptaphyllum March. por microdiluição. (página 57)
Tabela 9: Determinação da concentração bactericida mínima (CBM) e
concentração inibitória mínima (CIM) para o óleo essencial de Protium
heptaphyllum March. por microdiluição. (página 58)
Tabela 10: Determinação da concentração bactericida mínima (CBM) e
concentração inibitória mínima (CIM) para amoxicilina por microdiluição.
(página 60)
Tabela 11: Influência do pH na CBM da resina para as linhagens SS1,
Hardenberg, 26695 e BH13. (página 63)
Tabela 12: Influência do pH na CBM da mistura de α e β amirinas para as
linhagens SS1, Hardenberg, 26695 e BH13. (página 63)
Gráfico 1: Curva padrão relacionando o crescimento bacteriano (log de ufc/ ml)
com as leituras de turbidez. (página 59)
Gráfico 2: Índice de lesões ulcerativas. (página 65)
Gráfico 3: Colonização gástrica dos camundongos tratados com a mistura de α
e β amirinas e controle. Determinação da densidade bacteriana por PCR em
tempo real. (página 66)
Gráfico 4: Efeito da mistura das α e β amirinas na atividade da
mieloperoxidase no tecido gástrico dos camundongos infectados com H. pylori.
(página 68)
LISTA DE ABREVIATURAS
µ: micro
BHI: Brain heart infussion
cag Pai: Ilha de patogenicidade
CBM: Concentração bactericida mínima
ufc: Unidades formadoras de colônias
CIM: Concentração inibitória mínima
CLO: Campylobacter like organism
DMSO: Dimetil sulfoxido
DNA: Acido desoxirribonucleico
ELISA: Enzyme immuno linked assay
FDA: Food and Drug Adminidstration
Ig A: Inmunoglobulina A
IgG : Inmunoglobulina G
Ig M: Inmunoglobulina M
ILU: índice de lesões ulcerativas
LPS: Lipopolissacarido
MALT: Mucosa Associated Limphoid Tissue
McF: Mac Farland
MH: Mueller Hinton
MPO: Mieloperoxidase
nm: nanometro
OMS: Organização Mundial da saúde
pb: Pares de bases
PBS: Solução salina tamponada
PCR: Polymerase Chain Reaction
SS1: Sidney Strain 1
TTC: Cloreto de trifenil tetrazolium
RESUMO
O Helicobacter pylori é o principal agente etiológico de infecções
gastrintestinais em adultos e crianças, e tem sido implicado na patogênese
de gastrites agudas e crônicas, de úlceras pépticas e duodenais e no
carcinoma gástrico. Os esquemas terapêuticos utilizados na erradicação da
bactéria consistem em combinar dois antimicrobianos com um inibidor da
bomba de prótons, entretanto, o índice de resistência desta bactéria no
Brasil tem influenciado negativamente a eficiência da erradicação,
estimulando a busca de alternativas terapêuticas baseadas na fitoterapia.
Neste estudo avaliamos in vitro e in vivo à atividade anti-Helicobacter da
resina, do óleo essencial e da mistura de α e β amirinas de Protium
heptaphyllum March. Estas substâncias foram analisadas qualitativamente
pelo método de difusão em discos e, em seguida, foram quantificadas as
concentrações
mínimas
inibitórias
e
bactericidas
pelo
método
de
microdiluição. O ensaio in vivo foi realizado em camundongos C57BL/6
infectados com H.pylori SS1 e tratados por via oral com a mistura de α e β
amirinas (720 mg/kg/dia) durante 7 dias. Todas as 26 cepas ensaiadas in
vitro, tiveram o crescimento inibido na concentração de 160 µg/ml, tanto
com a mistura de α e β amirinas quanto com a resina. O óleo essencial,
entretanto, apresentou efeito bactericida em torno de 2000 µg/ml. A
diminuição do pH não afetou a atividade anti-Helicobacter destes produtos.
Os ensaios in vivo com a dose e o esquema terapêutico utilizado, não
demonstraram atividade de erradicação da bactéria, mas comprovaram seu
efeito terapêutico no tratamento de lesões ulcerosas.
ABSTRACT
Helicobacter pylori is considered the main etiological agent of gastrointestinal
infections occurring in adults as well as in children, and it has been implicated in
the pathology of acute and chronic gastritis, peptic and duodenal ulcerations
and gastric carcinoma. Present treatments used to eradicate the bacteria are
based on the combination of two antibiotics and a proton pump inhibitor,
however, the resistant index for this bacterium in Brazil has negatively affected
the eradication efficacy, encouraging the search of alternative therapeutics
based on phytotherapy. In this work, we analyzed in- vitro and in- vivo anti Helicobacter activity of the resin, the essential oil and the α and β amiryns
mixture of Protium hepthaphyllum March. For this purpose, we first performed a
qualitative screening using the diffusion disc method, followed by the
quantitative determination of minimal inhibitory and bactericidal concentrations
by microdilution test. The in-vivo assay used C57BL/6 mice infected with SS1
H. pylori strain that were treated orally with the mixture of α and β amiryns (720
mg/kg/day) for 7 days. All H. pylori strains were inhibited at 160 µg/ml by resin
or α and β amiryns mixture. The essential oil showed activity, at a level of 2000
µg/ml. The acid pH did not affect inhibition activity of tested substances. In-vivo
assay, in the dose and in the treatment schedule used, did not eradicate SS1 H.
pylori, but showed healing properties.
I - INTRODUÇÂO
Helicobacter pylori é o principal agente etiológico de infecções
gastrintestinais em adultos e crianças, e tem sido implicada na patogênese da
gastrite ativa e crônica, como também na úlcera péptica e no carcinoma
gástrico. A gravidade dos sintomas depende de interações complexas entre as
bactérias e o hospedeiro, como a virulência da linhagem infectante, a
constituição genética e a idade do hospedeiro, fatores ambientais e hábitos
alimentares (BERGONZELLI et al., 2003).
O microorganismo modifica o epitélio gástrico através da toxicidade
bacteriana e pelo dano provocado pela reação inflamatória. A infecção, caso
não tratada, persiste por toda a vida do paciente (PAJARES, 1995).
Atualmente, os tratamentos anti-Helicobacter pylori se baseiam na
combinação de um inibidor da bomba de prótons e dois antibióticos, o que é
conhecido como terapia tríplice. Entretanto, em alguns pacientes a infecção
reaparece, e em diferentes partes do mundo a resistência aos antimicrobianos
tem aumentado e continua a crescer, sendo esta uma das principais causas de
falta de erradicação dos microorganismos pelo tratamento. Outro fator
importante para a falência terapêutica é o não cumprimento do tratamento pelo
paciente, devido aos efeitos colaterais que os medicamentos podem provocar
como, diarréia, perda do apetite e perda de peso corporal. O desenvolvimento
de um medicamento que apresentasse atividade gastroprotetora, atividade antiHelicobacter e pouco ou nenhum efeito colateral seria de grande importância
como alternativa terapêutica (PETERSON & GRAHAM, 1998).
Até o século XIX, os recursos terapêuticos eram constituídos
predominantemente por plantas e extratos vegetais, utilizados de forma
empírica e transmitidos por comunicação oral dentro das populações humanas.
O efeito antimicrobiano de várias ervas é conhecido desde a
antiguidade, sendo atribuídas as propriedades antimicrobianas às frações que
contem os óleos essenciais, existindo evidência documentada desta atividade
para a uma grande variedade de bactérias, fungos, protozoários e vírus
(COWAN, 1999; SIMÔES et al., 2003).
Protium heptaphyllum March, da família Burseraceae, conhecida
popularmente como almécega, produz uma resina oleosa denominada breu
branco, goma limão e almécega do Brasil. Esta planta é encontrada
principalmente na região amazônica e do Nordeste brasileiro, onde é
amplamente utilizada na medicina popular como analgésico, antiinflamatório,
antineoplásico, contraceptivo, cicatrizante e expectorante. A análise fitoquímica
da resina revelou a presença de vários monoterpenos e triterpenos
pentacíclicos, entre os quais a mistura de α e β amirinas (OLIVEIRA et al.,
2004a).
Recentemente foi publicado que a resina também possui propriedades
gastroprotetoras in vivo (OLIVEIRA et al., 2004b) e a possibilidade de
apresentar atividade anti-Helicobacter devido a grande quantidade de terpenos,
substâncias reconhecidamente associadas a este efeito, poderia recomendar a
futura utilização deste composto no tratamento de erradicação desta bactéria.
ll - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1- MICRORGANISMO
A bactéria, hoje conhecida como Helicobacter pylori, tem sido o objeto
de intensas pesquisas desde seu primeiro cultivo a partir de uma biópsia
gástrica em 1982. Desde o começo, este microorganismo tem provocado o
interesse de diversos profissionais da área da saúde, entre médicos,
farmacêuticos, biólogos e até pesquisadores na área da oncologia. A
possibilidade de que uma bactéria pudesse causar gastrites, úlceras pépticas e
com o tempo câncer, era um conceito difícil de aceitar. Entretanto, a evidência
do envolvimento de um microrganismo no desenvolvimento de úlceras em
animais de experimentação já era de conhecimento dos pesquisadores desde o
século anterior. A presença de organismos espiralados, conhecidos como
espiroquetas, já havia sido previamente informada em 1893. Durante a década
de 1940 foram identificadas espiroquetas nas amostras gástricas humanas, e a
maioria parecia estar presente em pacientes com úlceras gástricas. Entretanto,
o interesse dos pesquisadores em associar uma bactéria como o agente causal
de úlcera diminuiu devido aos relatos da literatura da época que destacaram
uma provável associação entre vírus e úlcera péptica. STEER e colaboradores
renovaram o interesse na associação entre úlcera e bactéria em 1975, mas
falharam no isolamento e identificação dos microrganismos que observaram,
assumindo como contaminação do endoscópio (HEATLEY, 1995).
Em 1983, WARREN e MARSHALL relataram à presença de uma
bactéria espiralada em pacientes com úlceras pépticas e gastrites crônicas,
evidenciando a similaridade entre estes microrganismos e o gênero
Campylobacter, dando lhes a denominação de Campylobacter like organism.
Posteriormente o microrganismo recebeu da denominação de Campylobacter
pyloridis, para logo depois ser corrigido gramaticalmente para Campylobacter
pylori.
Trabalhos posteriores, entretanto, evidenciaram diferenças bioquímicas e
moleculares entre esta bactéria e o gênero Campylobacter, e finalmente em
1989 foi reconhecida como um novo gênero, Helicobacter. Assim, ao
Helicobacter pylori, foram incluídos o Helicobacter felis e o Helicobacter
mustelae (HEATLEY, 1995), sendo que atualmente este gênero possui mais de
uma dezena de espécies.
1.1 Características microbiológicas.
Helicobacter pylori é um bacilo espiral Gram negativo, de crescimento
lento, microaerofílico. Apresenta mobilidade pela presença de flagelos
unipolares, que podem estar presentes na quantidade de quatro a seis flagelos.
Sua principal característica bioquímica é a abundante produção de enzima
urease, que tem um papel importante na fase inicial de colonização do epitélio
gastrintestinal, já que a mesma produz a hidrólise da uréia, alterando deste
modo o pH da mucosa gástrica, tornando-a mais adequada para sua
sobrevivência. Esta enzima tornou-se um importante marcador da presença do
microorganismo (PETERSON & GRAHAM, 1998).
1.2 Morfologia.
O microrganismo existe em duas formas morfológicas diferentes, uma
forma espiral, considerada como ativa e a forma cocóide, associada como
provável estrutura de resistência em condições adversas. Em sua forma
espiral, a bactéria possui de 3 a 5 µm de comprimento e aproximadamente 0,5
µm de diâmetro. Esta morfologia é tida como a forma viável do
microorganismo. A forma cocóide não é cultivável, mas é metabolicamente
ativa e que acumula polifosfatos como reserva de energia e de fósforo, e tem a
propriedade de reduzir os corantes de tetrazolium (CELLINI et al., 1994; COLE
et al.,1997). A forma cocóide é a forma predominante em condições de
incubação bacteriana por períodos prolongados na água, sugerindo que a
infecção através do sistema de água poderia ser possível em países em
desenvolvimento.
A transformação da forma espiral na forma cocóide pode ser induzida
por outras condições, como aumento na concentração de oxigênio, pH alcalino,
aumento da temperatura, incubação prolongada, bem como tratamento com
omeprazol ou antibióticos como amoxicilina pelo paciente.
Embora a forma espiral de H. pylori seja, normalmente, considerada
como a responsável pela patogenicidade, ambas as formas podem ser
encontradas no estômago e duodeno humano. A forma cocóide da
Helicobacter pylori é encontrada aderida às células epiteliais gástricas
severamente afetadas e são prevalentes nas margens dos tumores gástricos,
sendo observadas em 93 % das biopsias de pacientes com adenocarcinoma.
Entretanto, o papel da forma cocóide na patogênese bacteriana permanece
incerto (COLE et al., 1996).
1.3 Determinantes de patogenicidade.
Os fatores que permitem aos patógenos microbianos se estabelecer em
um hospedeiro são denominados como fatores de colonização, e normalmente
contribuem para a patogenicidade bacteriana. No caso do Helicobacter pylori, a
sobrevivência no ambiente gástrico é atribuída a características especiais,
sendo a capacidade de colonizar a superfície do epitélio gástrico abaixo da
camada de muco a de maior relevância (McGOWAN et al., 1996).
Alguns fatores de virulência do Helicobacter pylori, relacionados com a
colonização gástrica, ao dano tecidual e a sobrevivência deste no hospedeiro já
estão bem estabelecidos, como flagelos, a enzima urease e algumas adesinas.
(ANDERSEN et al., 2001).
A morfologia espiralada do H. pylori e os movimentos provocados pelos
flagelos unipolares permitem a rápida travessia do lúmen do estômago e a
penetração da mucosa. Os flagelos, que são essenciais para a mobilidade
bacteriana, têm aproximadamente 30µm de comprimento e 2,5 nm de
espessura. A constituição dos mesmos apresenta a estrutura típica de
bicamada fosfolipídia de membrana (DUNN et al., 1997).
Helicobacter pylori é um dos maiores produtores de urease entre as
espécies bacterianas. A urease é uma das enzimas chaves na patogênese e
possui um peso molecular de 550 kDa, consistindo de três subunidades, Ure A,
Ure B e Ure C. Esta enzima é necessária para que H. pylori mantenha um
micro ambiente de pH neutro ao redor da bactéria, hidrolisando a uréia da
mucosa gástrica, resultando na produção de dióxido de carbono e amônia,
responsável pela neutralização do pH, necessária para a sobrevivência no
meio naturalmente ácido do estômago. A amônia resultante também é utilizada
como fonte de nitrogênio para a síntese de proteínas necessárias para que
ocorra a aderência bacteriana (EATON et al.,1995). A urease é fortemente
inmunogênica e quimiotáxica para os fagócitos.
Outra importante enzima isolada de H. pylori é a superóxido dismutase,
responsável
pela
quebra
de
superóxido
produzido
por
leucócitos
polimorfonucleares e macrófagos, evitando deste modo a morte bacteriana
(SPIEGELHALDER et al.,1993) A enzima catalase protege o microrganismo
dos efeitos do peróxido de hidrogênio liberado pelos fagócitos. Tanto a catalase
como a urease são excretadas pelo H. pylori ao meio ambiente circundante e o
protegem da resposta imune humoral (ANDERSEN et al., 2001).
Durante os estágios iniciais da infecção o Helicobacter pylori deve evitar
os efeitos do acido gástrico, sendo este o provável motivo da infecção aguda
transcorrer com hipocloridia. O mecanismo pelo qual a bactéria atinge este
objetivo deve envolver possíveis mediadores, como as proteínas inibidoras de
ácido que bloqueiam a secreção de ácido pelas células parietais, o
lipopolisacarideo (LPS) e as citoquinas (PETERSON & GRAHAM, 1998).
A habilidade deste microrganismo se unir especificamente ao epitélio
gástrico é chamada de tropismo tecidual; esta propriedade impede que o
microrganismo seja arrastado durante a troca celular, a secreção de muco ou
pela mobilidade gástrica. Esta aderência é realizada através de adesinas
específicas e receptores presentes no epitélio gástrico. A expressão variável
das adesinas nas diferentes linhagens bacterianas explica a variação na
aderência das diferentes cepas de H. pylori, bem como as diferenças na
disponibilidade de receptores específicos no hospedeiro sugerem uma possível
explicação para as diferenças na susceptibilidade a infecção. (DUNN et al,
1997; PETERSON & GRAHAM, 1998).
O H. pylori sobrevive com dificuldade em ambientes com pH ácidos e
alcalinos, e foi demosntrado que o microrganismo possui a enzima P typeATPase que catalisa o intercambio de NH4+/H+ sendo esta atividade
responsável pela prevenção de uma alcalinização excessiva gerada pela
hidrolise da uréia, catalisada pela enzima urease (PETERSON & GRAHAM,
1998).
O LPS é uma família de glicolipideos que são encontrados na parede
celular das bactérias Gram-negativas, incluído o H. pylori.
O LPS,
principalmente através do Lipídeo A que é um dos constituintes, estimula a
liberação de citoquinas e possui propriedades endotóxicas. Entre outras ações
do LPS podem ser incluídas a interferência com as células epiteliais gástricas,
que pode levar a perda da integridade da camada mucosa; inibição da síntese
de mucina; e estimulação da secreção de pepsinogeno. Apesar das
propriedades toxigênicas o lipídeo A de H. pylori é menos potente que o
mesmo lipídio em outras bactérias Gram-negativas, o que sugere uma
adaptação do H. pylori para uma longa existência no estômago. A presença da
enzima mucinase provavelmente contribui para a ruptura da barreira mucosa e
as fosfolipases digerem a membrana rica em fosfolipídios das células mucosas.
A citotoxina de vacuolização VacA produz vacúolos nas células epiteliais
gástricas e tem sido relacionada com a presença de úlceras pépticas, gastrites
severas e a perda de integridade da mucosa.
O Helicobacter pylori produz uma série de proteínas de superfície
independentes do LPS, que possuem propriedades quimiotáxicas para
monócitos e neutrófilos, atraindo-os para a lâmina própria e ativando suas
propriedades inflamatórias. Dentre estas proteínas incluem-se a proteína
ativadora de neutrofilos HpNap, expressada pelo gene napA e as porinas, que
são imunologicamente ativas (DUNN et al., 1997; PETERSON & GRAHAM,
1998 ; MURRAY et al., 2000).
Os microrganismos ativamente móveis atravessam o muco gástrico e
aderem às células epiteliais. A lesão tecidual localizada é mediada por
subprodutos da urease, mucinase e atividade da citotoxina que induz a lesão
das células epiteliais e, juntamente com a urease e o lipopolisacarídeo
bacteriano estimula a resposta inflamatória. A bactéria é protegida da
fagocitose e da destruição intracelular pela produção de superóxido-dismutase
e catalase. Também produz hemolisinas fosfolipase e álcool-desidrogenase,
embora o papel dessas substancias na doença ainda não esteja definido
(MURRAY et al., 2000).
1.4 Diversidade genética.
A presença do Helicobacter pylori está associada com diversas
doenças que apresentam diferentes graus de severidade, tais como gastrite
crônica, úlcera péptica, linfoma MALT (Mucosa Associated Limphoid Tissue) e
carcinoma gástrico distal. A diversidade sintomática pode estar ligada à idade e
a fatores genéticos do hospedeiro, juntamente com fatores ambientais, tais
como a dieta inadequada e a administração contínua de alguns medicamentos,
como os antiinflamatórios não esteroidais (GO et al.,1996; VAN DOORN et
al.,1997; AXON,1999; MARAIS et al., 1999).
As bactérias, como todos os sistemas biológicos, estão em um contínuo
estado de evolução e sua genética é alterada sutilmente nas gerações
seguintes. Diversas gerações bacterianas habitam o estômago humano e as
mesmas evoluem separadamente em cada hospedeiro, sendo muito difícil
encontrar duas linhagens geneticamente idênticas em hospedeiros diferentes,
com a exceção de indivíduos que pertençam à mesma família ou a instituições
onde uma linhagem específica tenha sido transmitida de um individuo a outro
(AXON, 1999).
Estudos genéticos comprovam que as linhagens de Helicobacter pylori
apresentam grande diversidade. Esta diversidade reflete o modo de vida desta
bactéria e sua interação com o hospedeiro humano. Uma vez tendo sucesso na
colonização de um indivíduo, a infecção permanece de forma crônica por toda
a vida, em um isolamento geográfico que permite a fixação de algumas
mutações e polimorfismos, que confiram alguma vantagem adaptativa, ou
mesmo por deriva genética, determinando uma grande diversidade genética
entre cepas que colonizem diversos indivíduos.
A geração de diversidade envolve pontos endógenos de mutação e
recombinação. As porcentagens de mutação nos microrganismos não são
constantes entre as populações bacterianas, mas estão sujeitas às mudanças
no meio ambiente, e dentro de populações grandes são poucas as células que
alcançam altas porcentagens de mutação.
No caso do H. pylori, a maioria das cepas possui este fenótipo de
hiper-mutação que favorece a aparição de variantes na presença de pressão
seletiva. Um exemplo da eficiência adaptativa da mutação de ponto é um
rápido desenvolvimento, na população bacteriana, de um alto nível de
resistência aos antibióticos usados comumente, como é o caso da
claritromicina (BLASER & ATHERTON, 2004).
Helicobacter pylori é altamente competente para adquirir DNA de outras
linhagens de H. pylori. Análises das seqüências deste microrganismo mostram
uma alta taxa de recombinação entre as linhagens, que é evidenciada pela
presença de grandes quantidades de seqüências de DNA repetitivas
(HOFREUTER et al., 1998).
Em 1997, TOMB e colaboradores, publicaram o seqüenciamento
completo do cromossomo de Helicobacter pylori. Os autores escolheram a
seqüência do genoma da linhagem 26695, isolada de um paciente com
gastrite. Em 1998, HANCOCK e colaboradores concluíram o genoma de outra
linhagem de H. pylori, denominada J99, isolada de um paciente norteamericano com úlcera duodenal.
Os genomas das linhagens 26695 e J99 contêm 1.667.967 e 1.643.831
pares de bases (pb), respectivamente (MARAIS, 1999), que compõe
aproximadamente 1600 genes. Destes, só 55% estão presentes em outros
microrganismos, sendo os 45 % restantes exclusivos de H.pylori. (AXON,
1999).
Estudos que compararam as seqüências gênicas do H. pylori concluíram que,
na organização do genoma, a ordem dos genes das duas linhagens estudadas
é muito semelhante, sendo que aproximadamente 7 % são exclusivos de cada
uma das linhagens (ALM et al. ,1999).
A virulência do H. pylori e sua habilidade para provocar dano no
hospedeiro parecem depender da natureza do cromossomo, em particular do
segmento que codifica para a toxina de vacuolização, e do que aparenta ser
uma inserção de DNA exógeno, a citotoxina associada à ilha de
patogenicidade, ou cagPAI (AXON, 1999).
Os microrganismos que possuem esta seqüência causam inflamação
mais severa no hospedeiro, e acredita-se que a mesma esteja envolvida na
exportação de macromoléculas importantes para as interações entre parasita e
hospedeiros.
As linhagens que possuem o gene cagA são mais prevalentes em
pacientes com úlceras pépticas que naqueles que apresentam o quadro
sintomático de gastrite. Outros genes que também se relacionam com a
presença de ulcerações são o cagE e o iceA (VAN DOORM et al.,2000).
A toxina de vacuolização VacA é uma proteína secretada pelo H.pylori
através de um sistema de secreção codificado pela ilha de patogenicidade
CagPAI que causa a vacuolização de células, tanto in vitro como in vivo. Esta
toxina apresenta ativação em pH ácido e resistência a degradação pela
pepsina (AXON,1999).
Os genes que codificam os fatores de virulência têm sido sugeridos
como possíveis marcadores genéticos (GRAHAM & YAMAOKA, 2000; ITO et
al., 2000), entretanto diversos estudos revelaram que as freqüências dos genes
vacA, iceA e cagA, em pacientes portadores de doenças gástricas,
apresentaram variações dependentes da população estudada.
YAMAOKA e colaboradores compararam as freqüências gênicas em
pacientes portadores de úlcera péptica, câncer gástrico e gastrite, provenientes
da Colômbia, EUA, Coréia e Japão. Estes autores observaram que as
freqüências dos genótipos diferem nas populações de cada um dos paises
estudados. Além disso, não foi encontrada associação entre as doenças
analisadas e a presença dos alelos (YAMAOKA et al.,1999). Em estudo
posterior os mesmos autores analisaram a freqüência dos genótipos em quatro
grupos étnicos diferentes, negros, hispânicos, brancos e vietnamitas,
identificando diferenças substanciais entre estes grupos, e concluíram que as
variações existentes sugerem a necessidade de estudos específicos para cada
população (YAMAOKA et al., 2000).
No Brasil, a análise de linhagens obtidas através de biópsias gástricas
quanto à resistência primária para os antibióticos utilizados no tratamento para
a erradicação do H. pylori apresentou diferentes graus de resistência quando
comparados com os obtidos em outras populações. Ao revelar diferenças nas
linhagens brasileiras em comparação com outros paises, os autores reforçaram
a importância de se realizar estudos específicos da bactéria H. pylori,
provenientes da população brasileira (MENDONÇA et al., 2000).
2- EPIDEMIOLOGIA
A infecção causada pelo Helicobacter pylori na mucosa gástrica é
considerada a infecção crônica que ocorre em humanos com maior freqüência
(GRAHAM, 2000). Aproximadamente metade da população mundial está
infectada com H. pylori, tornando esta bactéria um dos principais patógenos da
espécie humana e um grave problema de saúde publica (INTERNATIONAL
AGENCY FOR RESEARCH ON CANCER, WORLD HEALTH ORGANIZATION,
1994; AMERICAN DIGESTIVE HEALTH FOUNDATION, 1997).
A Tabela 1 fornece dados representativos com relação as diferentes
doenças gastroduodenais mais estudadas, onde se pode observar uma
associação entre a doença e a presença da bactéria H. pylori.
Tabela 1: Ocorrência de H. pylori em diferentes doenças gástricas.
Doença
N° de estudos
N °de
Revisados
pacientes
Presença de H. pylori (%)
estudados
Variação media
Dispepsia não-ulcerosa
9
1293
33-87
51
Gastrite crônica
15
1411
62-94
83
Histologia gástrica normal
15
569
0-14
4
Úlcera duodenal
12
620
60-100
92
Úlcera gástrica
12
312
44-90
69
Fonte:
FERNANDEZ,1999.
As evidências experimentais e clínicas que permitem estabelecer uma
relação patogênica entre a presença de Helicobacter pylori e estas doenças
podem ser diretas ou indiretas (FERNANDEZ, 1999). Entre as evidências
diretas incluem-se: a inoculação experimental em humanos que resulta na
produção de gastrite; a inoculação em animais de experimentação resultando
em gastrite crônica; e a terapia antimicrobiana que, quando adequada, elimina
a infecção com conseqüente regressão da gastrite. Entre as causas indiretas
destacam-se: o H. pylori somente coloniza o epitélio gástrico e não outros
tecidos e associa-se intimamente com as células epiteliais de origem gástrica e
raramente com células epiteliais esofágicas; o H. pylori associa se só com
certos tipos de inflamação gastroduodenal e não com todos os tipos
conhecidos; a infecção desencadeia uma resposta imune sistêmica-humoral
específica; a terapia antimicrobiana adequada diminui os níveis de anticorpos
específicos e a inflamação; e a presença do Helicobacter está associada com a
hipocloridria e a gastrite epidêmica (FERNANDEZ, 1999).
3 - PREVALÊNCIA
A infecção provocada por este microrganismo ocorre mundialmente e,
aparentemente, todas as populações estão afetadas em maior ou menor grau
(HEATLEY, 1995).
Apesar da ocorrência mundial, observam-se diferenças significativas
dentro e entre os diferentes países. Em geral a prevalência da infecção é
menor
nos
países
desenvolvidos
que
daqueles
em
desenvolvimento
(MITCHELL, 2001).
As pessoas infectadas desenvolvem gastrite crônica, sendo que uma
vez adquirida a infecção, esta não é erradicada espontâneamente. Entretanto,
apesar da alta prevalência, somente uma pequena proporção dos indivíduos
infectados desenvolverá uma doença clinicamente significativa, como úlcera
péptica
ou
câncer
gástrico.
Aproximadamente
1
em
5-6
indivíduos
desenvolverá úlcera péptica na sua vida e menos do 1 % desenvolverá câncer
gástrico (GO, 2002).
A freqüência da infecção parece ser maior quanto mais elevada for à
faixa etária. Nos países desenvolvidos, a infecção é pouco freqüente na
infância e aumenta na população adulta, fato relacionado com as significativas
melhorias nas condições de saneamento básico ocorrido na metade do século
passado, portanto, os pacientes com idade superior aos 50 anos adquiriram a
infecção na infância, quando as condições de saneamento não eram boas. Nos
países em desenvolvimento o microrganismo ainda é adquirido precocemente
durante a primeira infância e com altas freqüências, fenômeno possivelmente
associado
à
presença
de
condições
socioeconômicas
e
ambientais
inadequadas, como ocorre na China, onde a taxa de infecção chega a 70 %
entre os adolescentes, e na Nigéria, onde a prevalência atinge 58 % de
crianças soropositivos com um ano de idade, chegando a 91 % após dez anos
(THOMAS
&
PRETOLANI,
1994).
Adicionalmente,
MITCHELL
(1999)
apresentou resultados de estudos epidemiológicos em países desenvolvidos,
obtendo taxa de infecção entre 0 á 5% em crianças com idade inferior a 10
anos.
No Brasil, estudos realizados com crianças e adolescentes na faixa
etária entre 1-18 anos, de nível socioeconômico baixo da cidade de Belo
Horizonte, revelaram uma prevalência de 34,1 %, sendo esta porcentagem
similar entre meninos e meninas (35,8 % e 32,3 %, respectivamente). Estes
estudos ainda verificaram um aumento da freqüência conforme a idade dos
indivíduos analisados, sendo de entre 16,4% na faixa entre 1 e 2 anos e de
64,3 % entre 15 e 18 anos (OLIVEIRA et al.,1994). Comparativamente, foram
verificadas porcentagens próximas em países como Chile e Índia, também em
desenvolvimento. Na mesma faixa etária observou-se uma porcentagem
marcadamente inferior em países como França, Bélgica e Inglaterra, e taxas
mais altas em países como Nigéria, Índia e Argélia (OLIVEIRA et al., 1994).
Em 1999, o estudo foi repetido com 213 voluntários de baixo nível
socioeconômico residentes na área metropolitana de Belo Horizonte e
apontaram uma prevalência de 81,7 % (OLIVEIRA et al., 1999). Outro estudo
realizado com habitantes de Nossa Senhora do Livramento, interior do estado
do Mato Grosso, revelou uma freqüência de 77,5% de crianças e adolescentes
contaminados e 84,7 % de adultos (SOUTO et al., 1998).
PEREZ-PEREZ
e
colaboradores
(2004)
revisaram
os
dados
epidemiológicos publicados entre Abril de 2003 e Março de 2004 e confirmaram
tanto a diferença da prevalência da infecção por H. pylori entre países
desenvolvidos e em desenvolvimento, quanto em relação às características
étnicas e aos fatores socioeconômicos entre as pessoas morando no mesmo
país. Estes autores concluíram que a transmissão intrafamiliar apresenta-se
como um fator de grande importância, tanto nos países desenvolvidos como os
em desenvolvimento.
4- TRANSMISSÂO
Diversos estudos epidemiológicos evidenciaram os dois principais
fatores de risco para adquirir o Helicobacter pylori: a primeira infância e o nível
sócio econômico de baixa renda, tanto em países desenvolvidos como em
desenvolvimento. Apesar disso, na ausência de um reservatório extra-humano,
o caminho exato para a transmissão de pessoa para pessoa ainda não foi
determinado. As vias de infecção aceitas atualmente incluem a oral-oral e a
fecal-oral. Além da mucosa gástrica, a boca parece ser um outro santuário
importante para este microrganismo, e a via oral-oral, o mecanismo mais usual
de transmissão entre as crianças e os adultos jovens de todo o mundo. Nas
condições de baixa higiene, especialmente nos países em desenvolvimento,
deve considerar se a via de transmissão fecal-oral (DELTRENRE & DE
KOSTER, 2000).
A bactéria também pode ser transmitida através de endoscópios e
pinças endoscópicas não esterilizadas adequadamente (KATOH et al, 1993;
FERNANDEZ, 1999). O fato de a bactéria possuir a capacidade de sobreviver
por um determinado tempo no suco gástrico, transforma o vômito em um
possível meio de propagação (THOMAS & PRETOLANI, 1994; HEATLEY,
1995). Alguns trabalhos relataram à ocorrência da bactéria em placas dentarias
e nas fezes, evidenciando a saliva e as condições sanitárias, respectivamente,
como fatores de transmissão (CELLINI et al, 1994; THOMAS & PRETOLANI,
1994; HEATLEY, 1995; PAJARES, 1995).
4.1 Transmissão fecal-oral
Em 1992, THOMAZ e colaboradores, descreveram pela primeira vez o
isolamento do microrganismo em fezes de crianças e adultos contaminados.
Posteriormente, outros trabalhos citando a presença do microrganismo nas
fezes também foram descritos (KELLY et al., 1994; NOTARNICOLA et al,
1996), possibilitando que as fontes de água fossem consideradas como um
importante meio de transmissão, de modo particular nos países em
desenvolvimento, onde o tratamento dos efluentes não é adequado, o que
potencializaria a contaminação através das fezes (HEATLEY,1995).
Estudos posteriores mostram que a bactéria não sobrevive à passagem
estômago-duodeno, sendo a bile responsável pela morte do microrganismo, e
portanto, a sua sobrevivência no intestino e nas fezes parece pouco provável
(MITCHELL, 1999).
Outros estudos, com o objetivo de examinar o rol da transmissão fecaloral, investigaram a associação entre a prevalência da infecção por H. pylori e
o vírus da Hepatite A, vírus que é transmitido principalmente pela via fecal–oral,
na China. Não foi possível estabelecer uma associação entre ambas infecções,
evidenciando a falta de correlação entre H.pylori e Hepatite A, e contraria a
hipótese da transmissão fecal-oral (MITCHELL, 2001).
4.2 Transmissão oral-oral
A transmissão oral-oral está relacionada com indícios de que a bactéria
possa ser transmitida via saliva e através do suco gástrico (MITCHELL, 1999).
CELLINI e colaboradores em 1994, isolaram de pacientes uma mesma
linhagem de H. pylori da placa dentaria e de biopsia gástrica, evidenciando o
vômito e o refluxo esofágico como vetores de propagação do microrganismo.
Outros estudos indicam a presença superior a 58 % de H. pylori no suco
gástrico de pacientes infectados (VAROLI et al.,1991; MITCHELL,1999). Desde
então, uma maior atenção está sendo dispensada á provável transmissão
gastro-oral, o que torna o vômito um potente agente de transmissão da
infecção (MITCHELL et al, 1992; AXON, 1995).
5- DIAGNÓSTICO
Existe uma variedade de testes disponíveis para diagnosticar a infecção
por H. pylori. Exame histológico do tecido gástrico, cultura bacteriana, teste
rápido da urease, sondas de DNA e análise por PCR para estudar o tecido
gástrico requerem exame endoscópico e são considerados invasivos.
Entretanto, o teste respiratório da uréia, os testes sorológicos, a análise por
PCR da saliva e a excreção urinaria de amônia N15 são testes não invasivos
por não requererem endoscopia. A escolha do teste usado para diagnosticar a
infecção dependerá, na maioria dos casos, das informações clínicas, da
disponibilidade do teste no local e do custo final dos exames (DUNN et al,
1997). Os testes não invasivos são mais convenientes para o paciente,
entretanto não permitem o isolamento e cultura da bactéria, e deste modo, não
possibilitam a avaliação da susceptibilidade aos agentes antimicrobianos
(HEATLEY, 1995; BATISTA et al, 2003; TRABULSI & ALTHERTUM, 2004).
5.1 Técnicas que requerem endoscopia
No exame endoscópico, muitos indivíduos com gastrite associada a H.
pylori podem ter uma aparência normal da mucosa. A distribuição do
microrganismo e do quadro inflamatório associado ocorre por zonas, o que
pode levar a um erro de amostragem, resultando em falsos negativos da
biopsia, cultura e do teste rápido da urease. Como recomendação mínima,
duas biópsias devem ser retiradas da mucosa gástrica à partir de 5 cm do
piloro e múltiplas secções devem ser examinadas por histologia (DUNN et al,
1997).
5.1.1 Cultura
A cultura do H. pylori apresenta duas vantagens: permite a realização
de testes de susceptibilidade, e os isolamentos obtidos podem ser
caracterizados em detalhe. Apesar da sensibilidade da cultura em laboratórios
especializados ser superior à 95 %, o crescimento da bactéria pode ser afetado
por diversos fatores, como o número de biópsias analisado , o meio de cultura
utilizado, a duração e a temperatura do transporte e o próprio método de
cultivo. Além disso, é possível que resíduos de glutaraldeído presentes na
pinça de coleta de biopsia interfiram com a viabilidade do H. pylori.
Para o desenvolvimento da cultura bacteriana, alguns cuidados devem
ser tomados quanto ao ambiente de crescimento do H. pylori, que deve ser
obrigatoriamente microaerofílico (McNULTY et al., 1988; ELIZALDE et al, 1998;
GOLD et al.,1999).
Na Figura 1 observa-se a imagem da cultura de H. pylori numa placa de agar
sangue. As colônias apresentam uma morfologia característica com aspecto
brilhante e transparente.
Figura 1: Cultura de Helicobacter pylori
Fonte: www. helicobacterspain.com
5.1.2 Histologia
Helicobacter pylori pode ser visualizado a alta magnificação no
microscópio óptico com a coloração convencional de hematoxilina - eosina ou
de Giemsa modificada. As bactérias estão localizadas na camada mucosa,
aderidas na superfície do epitélio, e são encontradas no fundo, dentro das
criptas. Às vezes, a técnica pode dar resultados falsos negativos devido à
pouca quantidade de bactérias presentes na amostra. Além da detecção da
bactéria, a análise histopatológica permite avaliar o tipo e a intensidade da
inflamação (HEATLEY,1995; MEGRAUD, 1997; DUNN et al.,1997).
Figura 2: Análise histológica da biopsia gástrica, com coloração de prata,
onde se observa a presença de H. pylori.
Fonte : www.hpylori.com.au
5.1.3 Teste rápido da urease
A observação de que H. pylori produz grandes quantidades da
enzima urease, levou ao desenvolvimento de métodos para a determinação
indireta do microrganismo na biópsia do tecido gástrico. A sensibilidade dos
testes baseados na urease é dependente da carga bacteriana no estômago.
(DUNN et al.,1997).
A enzima urease hidrolisa a uréia, originando como produtos, gás
carbônico e amônia, esta última responsável pela alteração do pH do ambiente
próximo à bactéria. O resultado da atividade enzimática pode ser observado
através de um indicador de pH, que altera a coloração do meio, de amarelo à
rosa, indicando a presença da bactéria (Figura 3). O teste é de baixo custo,
rápido e fácil de ser realizado (MEGRAUD, 1997). Falsos positivos podem
ocorrer devido à presença de outros microrganismos produtores de urease,
como também podem ocorrer falsos negativos em pacientes que estão sendo
tratados com inibidores da bomba de prótons, tais como, omeprazol,
lanzoprazol ou pantoprazol (GLUPCZYNSKI & HIRSCHL, 1994).
Figura 3: Teste rápido de urease
Fonte: www.hpylori.com.au
5.1.4 PCR
5.1.4.1 PCR
A reação de PCR (Polymerase Chain Reaction) para detecção de H.
pylori em amostras de biopsia gástrica é outro método de alta sensibilidade.
Além disto, esta técnica tem a vantagem de permitir a detecção dos fatores de
virulência, como cagA, alelos de vacA, iceA ,etc. (RAUTELIN et al., 2003).
Entretanto, alguns fatores podem diminuir a sensibilidade do teste, como a
escolha dos primers, a preparação da amostra, a densidade bacteriana, e a
manipulação técnicas do procedimento de PCR. Uma das vantagens desta
técnica é a possibilidade de tornar o diagnóstico de H. pylori um procedimento
não invasivo, através da detecção do microrganismo a partir de fluídos não
gástricos, como a saliva ou até mesmo nas fezes (DUNN et al.,1997). Esta
técnica é muito utilizada em estudos epidemiológicos ligados á identificação de
reservatórios ambientais, e também em trabalhos que pretendem determinar o
mecanismo de transmissão desta bactéria (WESTBLOM,1997).
O alto custo desta técnica e a correlação nem sempre exata com a viabilidade
da bactéria são suas principais desvantagens.
5.1.4.2 PCR em tempo real
Esta técnica, desenvolvida a partir da técnica de PCR convencional,
associou a detecção de fluorescência para a determinação do ciclo que uma
determinada reação atinge uma quantidade de DNA amplificado, seguida da
correlação com uma curva padrão construída a partir de concentrações de
DNA inicialmente conhecidas. Esta combinação permite tornar a técnica de
PCR, capaz de quantificar o DNA existente em diversas amostras. Apesar de
existirem muitos fluoróforos para serem utilizados nesta técnica, muitos autores
destacam a utilização do corante SYBR Green I, que se intercala na cadeia de
DNA, pelo relativo baixo custo e por permitir o controle de qualidade da reação
de amplificação (GULIETTI et al., 2001).
Em 2003, MIKULA e colaboradores desenvolveram um método para
detectar e quantificar baixos níveis de infecção por H. pylori. Os autores
definiram as condições experimentais para reação de PCR em tempo real,
onde amplificaram um fragmento de 26-kDa de um gene espécie-específico de
Helicobacter pylori, o SSA. Os autores conseguiram determinar quantidades a
partir de 5 células bacterianas por amostra de biopsia.
5.2 Técnicas não endoscópicas
5.2.1 Detecção de anticorpos
A infecção da mucosa gástrica com H.pylori resulta em resposta imune
sistêmica e local, incluindo a elevação dos níveis de IgG e IgA no soro e níveis
elevados da IgA secretora e IgM no estômago, permitindo deste modo o
desenvolvimento de testes sorológicos para a detecção da bactéria. Os testes
sorológicos têm se mostrado especialmente válidos na hora de fazer o
screening de grande número de indivíduos em estudos epidemiológicos. Estes
testes são não invasivos e são relativamente rápidos, simples de realizar, e de
baixo custo, quando comparados às técnicas que requerem endoscopia. Além
disso, não apresentam interferências por compostos como bismuto, inibidores
da bomba de prótons, ou antimicrobianos (DUNN et al.,1997). Geralmente, o
teste
é
realizado
a
través
da
técnica
de
ELISA
(Enzyme-Linked
Immunoabsorbent Assay) ou aglutinação por látex. Podem ocorrer resultados
falso-negativos em crianças, idosos, ou em indivíduos imunodeprimidos por
não desenvolverem reação imunológica contra a infecção (LUZZA et al., 1995;
ATHERTON et al.,1997;). A sorologia tem um papel limitado na confirmação da
erradicação do H. pylori, pois na maioria dos pacientes são necessários de 6 a
12 meses para que o título de IgG seja reduzido à 50 % ou valores inferiores
aos observados antes do tratamento (PRASAD, 1995 ; DUNN et al., 1997).
5.2.2 Teste respiratório da uréia
O principio do teste respiratório da uréia é similar aos outros testes
baseados na enzima urease. A uréia é fornecida em kits e utilizada como
substrato em uma solução isotopicamente marcada com
13
C ou
14
C. O ar
expirado pelo paciente, após algum tempo de ingestão da solução, é coletado.
A enzima urease do H. pylori, caso este microrganismo esteja presente no
paciente, hidrolisa a uréia marcada e produz, como derivado da reação,
bicarbonato marcado que é exalado como CO2. Este gás expirado pode ser
analisado em laboratórios especializados para a detecção da presença do
carbono marcado, o que indicaria a ocorrência da reação da enzima urease, e
conseqüentemente, presença do H. pylori. No entanto, podem ocorrer falsos
positivos devido a hidrolise da uréia por bactérias da cavidade orofaríngeana
ou falsos negativos, caso o exame seja realizado uma semana após o uso de
bismuto, antimicrobianos, ou após cirurgia gástrica (HEATLEY, 1995;
ATHERTON, 1997; DUNN et al.,1997).
6 - TRATAMENTO
O tratamento da infecção causada pelo Helicobacter pylori tem sido
objeto de um extenso número de pesquisas, sendo que os mesmos podem
interferir na infecção e produzir uma supressão temporária e uma aparente
erradicação do microrganismo. Como definição de erradicação foi estabelecida
a ausência de H. pylori por mais de 4 semanas após a finalização do
tratamento, para serem evitados falso-negativos derivados da utilização de
inibidores de bomba de prótons, que podem diminuir a quantidade de bactérias
na mucosa gástrica, interferindo com a sensibilidade do método (HEATLEY,
1995).
A utilização de monoterapias no tratamento de erradicação não é
recomendada atualmente, pois o uso de um único antibiótico associado ou não
com bismuto mostrou-se ineficaz. Os esquemas terapêuticos mais recentes
combinam dois antimicrobianos, usualmente metronidazol, claritromicina,
amoxicilina, tetraciclina ou furazolidona, juntamente com um inibidor de bomba
protônica, como omeprazol, lanzoprazol, ou pantoprazol, ou um antagonista de
receptor de H2 (ranitidina, cimetidina), ou componentes de bismuto (BUCKLEY
et al., 1996; GRAHAM et al.,1996).
Preconiza-se a terapia combinada de duas, três até quatro drogas. Na
maioria dos esquemas terapêuticos é utilizada a amoxicilina, pois esta
apresenta
excelente
difusão
no
suco
gástrico,
atingindo
nele
altas
concentrações (FERNANDEZ, 1999). Em 1992, o Comitê Organizador da
Primeira Semana Européia de Gastroenterologia, realizada em Atenas, propôs
a utilização de três esquemas terapêuticos para a erradicação do H. pylori
(LEE, 1993). Nos Estados Unidos, o FDA (Food and Drug Administration)
aprovou os esquemas terapêuticos que incluem as terapias triplas com
subsalicilato de bismuto (Evaluating clinical studies of antimicrobials in the
Division of Anti-infective Drugs Products: Indication 25, Helicobacter pylori).
6.1 Esquemas terapêuticos.
Devido ao alto número de pessoas infectadas com o H. pylori no
mundo, e a importância da possível evolução desta infecção crônica, torna-se
essencial a existência de tratamentos eficazes para a erradicação do
microrganismo. Várias conferências foram realizadas para a definição de um
consenso para o estabelecimento de diretrizes de tratamento da infecção em
diferentes regiões do mundo, como Europa, América, Ásia, Japão e Canadá. A
maioria de consensos estabeleceu uma primeira linha de opção terapêutica
baseada em dois antibióticos, entre eles, claritromicina, amoxicilina ou
metronidazol, associados a um inibidor da bomba de prótons, num regime de
administração de 7 a 14 dias. As dosagens destas drogas diferem sutilmente
entre as diretrizes dos Americanos, Asiáticos e os Europeus. Foi sugerido que
a escolha dos antibióticos para associação inclua a claritromicina e amoxicilina,
devido à alta incidência em vários países de linhagens resistentes ao
metronidazol. Este tratamento de primeira linha alcança uma porcentagem de
erradicação de 80%, e a principal causa de falha parece ser a resistência aos
antimicrobianos. Quando o tratamento de primeira linha falha é recomendável
tentar uma terapia quádrupla baseada em tetraciclina, metronidazol, compostos
de bismuto e agentes anti-secretores durante 7 a 14 dias. Esta terapia parece
ser efetiva ainda nos casos de linhagens resistentes ao metronidazol e alcança
bons níveis de erradicação (CANDELLI et al., 2005).
Durante o 1° Encontro do Núcleo Brasileiro para o estudo do H. pylori,
realizado em Campinas em 1997, foi recomendado à classe médica a
prescrição de dois esquemas terapêuticos iniciais para a erradicação da
bactéria: terapia tripla com omeprazol, claritromicina e amoxicilina, e uma outra
opção, mais econômica e com indicações favoráveis para a utilização em
crianças e adolescentes, com subcitrato de bismuto, tetraciclina e furazolidona
(CARVALHAES et al., 1997).
Foram sugeridos, também, três esquemas terapêuticos no caso de retratamento: inibidor de bomba protônica, azitromicina, amoxicilina e subcitrato
de bismuto; uma outra opção utilizando o inibidor de bomba protônica
associado à subcitrato de bismuto, tetraciclina e metronidazol ou inibidor de
bomba protônica com claritromicina e amoxicilina (CARVALHAES et al., 1997).
6.2 Resistência aos antimicrobianos.
Desde a descoberta do H. pylori e da associação do microrganismo com
diversas doenças gástricas, muitos estudos foram realizados para a
determinação da susceptibilidade e resistência aos diversos antimicrobianos
conhecidos. Nos ensaios realizados in vitro, as linhagens de Helicobacter pylori
apresentaram susceptibilidade para algumas penicilinas, como cefuroxima,
mas não a todas, como por exemplo a cefalexina; as cefalosporinas; os
macrolídeos; tetraciclinas; nitroimidazóis; nitrofuranos, quinolonas, sais de
bismuto e inibidores da bomba de prótons; e foram resistentes aos
antagonistas H2. Entretanto, numerosas divergências existem entre a
susceptibilidade dos antimicrobianos in vitro e a resposta do paciente ao
tratamento (DUNN et al., 1997).
A resistência do H. pylori aos antimicrobianos é a principal dificuldade
encontrada para o sucesso da erradicação e pode envolver diferentes
mecanismos, entre eles o impedimento da penetração do antimicrobiano, a
alteração molecular do alvo, o efluxo ativo da droga, e inativação do composto
(MEGRAUD, 1997).
A prevalência da taxa de resistência ao metronidazol entre as linhagens
de H. pylori é altamente variável. Nos paises desenvolvidos a taxa de
resistência varia entre 11-70%. Esta resistência é ainda mais prevalente nos
países em desenvolvimento, onde mais de 95% dos isolados são resistentes.
Em contraposição, a resistência à claritromicina geralmente não é maior que
10%, sobretudo nos países onde os macrolídeos não são amplamente usados
para outras doenças da população. Uma exceção foi relatada no Peru, onde
50 % das linhagens de H. pylori isoladas foram resistentes a claritromicina
(DUNN et al., 1997).
Nos Estados Unidos, a resistência aos antimicrobianos utilizados nas
terapias convencionais alcança valores entre 20 e 50% para o metronidazol e
entre 7% e 14 % para claritromicina (GRAHAM, 1996). Na Europa, a
resistência varia entre 0% e 15% para claritromicina e entre 10% e 50 % para
metronidazol (MEGRAUD, 1998).
No Brasil, estudos realizados por MENDONÇA e colaboradores (2000),
que analisaram linhagens de H. pylori obtidas de biopsias gástricas quanto á
resistência primária a estes antimicrobianos, observaram-se graus de
resistência diferentes, em comparação com dados obtidos em outras
populações. Neste estudo foi relatada a ocorrência de 42% de resistência ao
metronidazol, 29% para amoxicilina, 7% para claritromicina, 7% para
tetraciclina e 4% para furazolidona. Também foram observadas linhagens
resistentes para dois ou três agentes antimicrobianos.
Um estudo posterior, realizado pelo mesmo grupo, relatou uma
associação entre a resistência primaria aos antimicrobianos e a falência
terapêutica (ECCLISSATO et al., 2002). As diferenças existentes entre as
linhagens, nos diferentes países, reforçam a importância dos estudos
específicos de H. pylori provenientes de diferentes populações.
7- ESTUDOS in vivo
As tentativas iniciais para estabelecer modelos animais para a infecção
por H. pylori em camundongos, ratos e coelhos não foram satisfatórios. Embora
os camundongos imunodeficientes pudessem ser transitoriamente colonizados
com H. pylori, estes modelos tinham aplicações restritas. Modelos alternativos
foram desenvolvidos usando animais que foram tanto infectados por espécies
relacionadas ao Helicobacter ssp., como macacos; como aqueles que podiam
ser infectados experimentalmente com H. pylori, incluindo os porcos
gnotobioticos e cachorros. Subseqüentemente, foi descoberto que alguns
roedores eram susceptíveis a infecção, permitindo o desenvolvimento de um
modelo animal mais acessível (FERRERO & FOX, 2001). Assim, em 1995,
MARCHETTI e colaboradores, reportaram o primeiro modelo experimental
usando
camundongos
imuno-competentes.
Os
autores
conseguiram
estabelecer uma infecção transitória nos animais, usando linhagens de H. pylori
de origem clínica que não tinham sido extensamente subcultivadas. Dois anos
mais tarde, em 1997, LEE e colaboradores desenvolveram uma linhagem de H.
pylori capaz de infectar camundongos, permitindo uma colonização em uma
alta densidade e por um período prolongado.
7.1 Estudos de tratamento antimicrobiano.
A necessidade de novos regimes de antibióticos no tratamento da
infecção humana por H. pylori e a falta de correlação da eficácia dos mesmos
in vivo e in vitro, propiciou a utilização de modelos animais para a avaliação
pré-clínica da eficiência dos antibióticos. Foi evidenciado que as infecções
causadas
por
Helicobacter
em
camundongos
e
porcos
respondem
favoravelmente aos tratamentos multidrogas utilizados para erradicar as
infecções por H. pylori em humanos. Foi evidenciado, também, que as
monoterapias têm um baixo índice de eficácia frente à infecção por
Helicobacter nos hospedeiros animais, havendo portanto, uma correlação com
a experiência em pesquisas clínicas com humanos, mostrando a validade
destes modelos para os estudos terapêuticos (FERRERO & FOX, 2001).
VAN DOORN e colaboradores (1999) utilizando camundongos C57BL/6
e BALB/c, e as linhagens SS1 e SPM326, ambas adaptadas ao modelo de
camundongos, relataram que a inflamação induzida por H. pylori é dependente,
tanto da linhagem bacteriana quanto do hospedeiro.
MABE e colaboradores (1999) testaram à capacidade de seis
catequinas isoladas de chá erradicar o H. pylori de gerbils previamente
infectados. O microrganismo foi erradicado em um porcentagem de 10 ao 36 %
dos animais tratados com as catequinas.
Outros autores testaram à atividade anti-Helicobacter de uma
formulação da erva Kampo (medicina tradicional japonesa), tanto in vitro
quanto in vivo usando camundongos C57BL/6 (YAN et al., 2002). A erva kampo
inibiu o crescimento de H. pylori in vitro na dose 2,5 mg/ml. Entretanto, nos
ensaios in vivo quando os animais foram tratados com uma dose de 1000
mg/kg antes e depois da inoculação com H. pylori, só houve uma disminuição
significativa na densidade bacteriana nos animais tratados prévio a infecção
quando comparados com o grupo controle.
TOMINAGA e colaboradores (2002) testaram à ação anti-Helicobacter
de novas quinolonas usando como modelo animal gerbils infectados. As AM
quinolonas diminuíram o número de microrganismos viáveis
erradicação completa.
sem atingir a
XIAO e colaboradores (2003) evidenciaram a capacidade do suco de
cranberry de diminuir a densidade do H. pylori de camundongos C57BL/6
previamente infectados. Entretanto o nível de erradicação foi de 20 %.
8- PRODUTOS NATURAIS: ALTERNATIVA TERAPÊUTICA
Devido ao alto índice de resistência com relação à terapêutica
tradicional utilizada na erradicação do H. pylori, métodos alternativos vêm
sendo amplamente estudados com a finalidade de aumentar a eficácia de
erradicação da bactéria, fornecendo uma alternativa de tratamento para os
pacientes que não erradicaram o microrganismo utilizando as terapias
clássicas de erradicação, sugeridas anteriormente. Além disso, as terapias
triplas em algumas ocasiões causam efeitos adversos, como náusea, vômito,
dor epigástrica, desconforto abdominal e diarréia, provocando a interrupção do
tratamento por parte dos pacientes, e o reaparecimento da infecção em alguns
pacientes. Por esta razão, é importante procurar novas e efetivas drogas antiH. pylori, sendo as plantas uma fonte lógica de novos compostos.
(BERGONZELLI et al., 2003; NARIMAN et al., 2004; FUNATOGAWA et al.,
2004; AHMED et al., 2005).
A procura de poderes curativos nas plantas é uma idéia da antiguidade.
Pessoas de todos os continentes têm aplicado cataplasma e ingerido infusões
de plantas indígenas, desde a pré-história. Existe evidência de que o homem
de Neanderthal, 60.000 anos atrás, usou plantas como o hollyhock. Estas
plantas são amplamente usadas na etnomedicina ao redor do mundo.
Historicamente, os resultados obtidos têm misturado cura e alivio dos sintomas,
como também uma alta porcentagem de envenenamentos. Atualmente, entre
um quarto a metade dos medicamentos produzidos nos Estados Unidos,
apresentam sua origem em plantas, sendo que poucos são receitados como
antimicrobianos, apesar de serem fonte confiável como antimicrobianos e
antifúngicos (COWAN, 1999).
De uso quase exclusivo na terapêutica medicamentosa até a década de
1950, os remédios vegetais foram sendo substituídos nas farmácias pelos
antibióticos (compostos sintéticos).
Embora muitos compostos derivados de plantas medicinais possam ser
sintetizados em laboratório, tal síntese é frequentemente tão complexa que os
rendimentos são baixos e a produção economicamente inviável. Por outro lado,
alguns compostos também originados de plantas não podem ser ou nunca
foram quimicamente sintetizados.
8.1 Plantas medicinais e Fitoterapia.
Historicamente, as plantas medicinais sempre foram objeto de estudo
na área da farmacognosia, uma vertente da farmacologia, onde são
examinadas as características das drogas ou das bases medicamentosa de
origem natural, utilizadas como matéria prima para a preparação de
medicamentos (DI STASI, 1996).
O termo Fitoterapia deriva de duas palavras gregas, a saber: phyton,
que significa planta, e therapeia, que encerra a idéia de tratamento. Fitoterapia
é o método de tratamento de enfermidades que emprega vegetais frescos,
drogas vegetais, ou ainda, extratos vegetais preparados com esses dois tipos
de matérias primas. Etimologicamente, fitoterapia significa tratamento por meio
das plantas (OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
As mesmas árvores, arbustos e ervas empregados pelos povos antigos
para tratar doenças e amenizar dores e incômodos continuam a ser valorizados
na atualidade. Com o desenvolvimento da fitoterapia, muitos dos princípios
físicos, químicos e propriedades farmacológicas das plantas medicinais e dos
produtos naturais encontram-se bem estabelecidos, auxiliando no processo de
desenvolvimento de novos fármacos (DI STASI, 1996; OLIVEIRA & AKISUE,
2000).
Os vegetais fazem parte da vida do homem desde seus primórdios
como fonte de alimentos, de materiais para o vestuário, habitação, utilidades
domésticas, defesa e ataque, na produção de meios de transporte, como
utensílios para manifestações artísticas, culturais e religiosas, e como meio
restaurador da saúde. Sua importância, medida pela intensidade de seu uso,
tem assumido, nos diversos estágios de desenvolvimento da sociedade, altos e
baixos (SCHENKEL, GOSMANN e PETROVICK, em SIMÔES, 2001).
Houve uma época em que a fitoterapia parecia estar morrendo com o
desenvolvimento da indústria química – farmacêutica. Mas em 1978, a
Organização Mundial da Saúde (OMS) deu inicio a um programa que enfatizou
o uso de plantas medicinais. O estudo dessas plantas começou a ser
incentivado devido a vários fatores, como o baixo poder aquisitivo da maior
parte da população, que procurava uma medicina alternativa a menores custos
e medicamentos destituídos de efeitos colaterais (OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
Nos dias de hoje representam uma das alternativas entre as diversas fontes de
insumos necessários à existência da sociedade, tendo como principal
vantagem o fato de serem uma fonte renovável e, em grande parte, controlável
pelo gênio humano (SCHENKEL, GOSMANN e PETROVICK, em SIMÔES,
2001).
A fitoterapia define diferentemente plantas medicinais, drogas vegetais
e princípios ativos de origem vegetal. Considera-se planta medicinal todo
vegetal que contém em um ou vários de seus órgãos substâncias que podem
ser empregadas para fins terapêuticos, ou que sejam precursores de
substancias utilizadas para tais fins (OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
Drogas vegetais são todos os vegetais, parte deles ou produtos,
derivados diretamente deles que, após sofrerem processos de coleta, preparo
e conservação, possuam composição e propriedades que possibilitem o seu
uso no estado bruto, componente de um medicamento, ou como necessidade
farmacêutica (OLIVEIRA et al.,1991).
Uma das características da droga corresponde à presença de princípios
ativos, que são substancias quimicamente definidas presentes nas matérias primas e nos fitoterapicos responsáveis pela atividade, ou seja, pelos efeitos
terapêuticos desses materiais (OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
A produção de drogas vegetais emprega tanto espécies silvestres como
vegetais cultivados. A seleção e cultivo de plantas medicinais vêm sofrendo
impulso relativamente grande no Brasil e em outros países, apesar das
dificuldades encontradas para ser obter uma droga confiável e de qualidade
(OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
Existem vários problemas relacionados à obtenção de drogas vegetais,
e entre eles podemos citar; a seleção de uma espécie vegetal, que pode
apresentar, dentro de certos limites, diferenças morfológicas, fisiológicas e
bioquímicas, permitindo assim a seleção de formas de valor superior; o cultivo
de plantas medicinais, onde são considerados os fatores que influem ou
interferem na vida do vegetal e, portanto, na apresentação da composição
química: temperatura, umidade, tipo de solo, idade da planta, clima, altitude,
entre outros; colheita, onde o teor de princípio ativo de uma planta medicinal
varia de órgão para órgão, com a idade, época da colheita, época da floração,
manuseio e mesmo com o período do dia no qual é efetuado (DI STASI, 1996;
OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
Para a obtenção de princípios ativos adequados, esses fatores podem
influenciar significativamente no produto final (OLIVEIRA et al., 1991). O
preparo ou tratamento, secagem, estabilização, conservação e tempo também
são considerados fatores que influenciam na obtenção de drogas vegetais
(OLIVEIRA et al., 1991; SIMOES et al., 2000).
Uma das principais características da droga corresponde à presença de
princípios ativos, que são naturalmente encontrados nas espécies vegetais, se
apresentam como substancias quimicamente definidas e obtidas de produtos
de origem natural que se encontram presentes na matéria prima vegetal e nos
fitoterápicos, sendo responsáveis pela atividade farmacodinâmica, ou seja,
pelos
efeitos
terapêuticos
ou
atividades
biológicas
apresentadas
determinado organismo vivo (DI STASI, 1996; OLIVEIRA & AKISUE, 2000).
em
8.2 Química de produtos naturais.
A pesquisa que utiliza plantas medicinais faz uso de métodos químicos
para obter, tanto o isolamento, como a purificação de novos compostos e,
assim, determinar corretamente sua estrutura seguida de síntese total ou
parcial da substancia isolada. Os avanços obtidos na área químicofarmaceútica, nestes últimos anos, assim como a descoberta de novas drogas,
encontra-se claramente dependente dos avanços da pesquisa científica com
base nas plantas medicinais.
A complexidade e abrangência da química, envolvendo produtos
naturais, compreendem desde o isolamento e purificação dos metabólitos
vegetais na fase preparativa, até a determinação estrutural dos novos
compostos. A associação entre a fase preparativa, como a cromatografia
gasosa, e a analítica, que inclui infravermelho e espectrometria de massas, são
indispensáveis para a correta determinação e identificação de novas drogas
provenientes de produtos naturais. (DI STASI,1996).
A composição química das espécies vegetais, principalmente das
plantas de origem tropical, ainda não foi descrita em sua totalidade. Diversos
constituintes de origem natural ainda não foram isolados e estudados
quimicamente, entretanto, outros compostos de origem natural que já foram
quimicamente isolados e definidos ainda não foram estudados com relação a
possível atividade biológica (DI STASI, 1996; HOSTETTMANN et al., 2003).
8.3 Protium heptaphyllum
Muitas espécies vegetais se notabilizam pela gama variada de
substâncias triterpenoídicas presentes nos seus órgãos, onde devem
desempenhar diferentes papéis. Alguns gêneros da família Bursereaceae
(Elaphirium, Icica, Canarium e Protium) são produtores de resinas oleosas.
Estas resinas são conhecidas genericamente como elemi e são constituídas de
triterpenos tetracíclicos, como os ácidos elemadienólico e elemadienônico, e
pentaciclicos, como α e β amirinas, maniladiol e breína entre outros.
O óleo essencial extraído da resina de almécega tem atividade
antiinflamatória comprovada. Sua composição química tem sido estudada por
técnicas de cromatografia gasosa acoplada á espectrometria de massas
(CG_EM) e ressonância magnética nuclear de hidrogênio e carbono (RMN H e
RMN
13
C), tendo sido constatada a presença de monoterpenos, tais como
limoneno,
terpinoleno,
α-pineno
entre
outros;
além
de
compostos
fenilpropanoides (LOPES CITO et al., 2003; SIANNI et al., 1999).
A espécie Protium heptaphyllum é uma árvore de aproximadamente 20
metros de altura (Figura 4), sendo encontrada na região amazônica e em
alguns estados do Nordeste no Brasil, tais como Bahia, Ceará, Piauí, e também
em outros países da América do Sul, como Colômbia, Paraguai, Suriname e
Venezuela.
Seu tronco exuda uma resina oleosa, de coloração branco –
avermelhada, conhecida como almécega, breu branco, almécega do Brasil ou
goma limão (Figura 5).
Fonte: fmd/fieldmuseum.org
Fonte: portalamazonia.globo.com
Figura 4: Folha de P. heptaphyllum.
Figura 5: Resina de P. heptaphyllum
Sua utilização é amplamente difundida, sendo usada na medicina popular
como analgésico, antiinflamatório, antineoplásico, contraceptivo, cicatrizante e
expectorante; na indústria do verniz; na calafetagem de embarcações, e em
rituais religiosos, na forma de incenso (MAIA et al., 1999; SIANNI et al., 1999;
LOPES CITÒ et al., 2003).
Em 1999, SIANNI e colaboradores estudaram os efeitos farmacológicos
dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação das folhas e da resina de
várias espécies de Protium, relatando a presença de monoterpenos e
compostos fenilpropanoides no óleo obtido da resina. Entre as atividades
farmacológicas foram relatadas; a capacidade de inibir a extravasação de
proteínas, a inibição da acumulação de eosinófilos em cavidade pleural em
modelo animal e a inibição da produção de óxido nítrico. Nenhum dos óleos
testados apresentou efeito antinoceptivo. Entretanto, LOPES CITÒ e
colaboradores (2003), encontraram uma boa atividade citotoxica do óleo
essencial.
Estudos realizados por OLIVEIRA e colaboradores (2004a) avaliaram a
resina de Protium heptaphyllum March. em modelos experimentais de úlcera
gástrica e inflamação e observaram que a administração oral da mesma
prevenia o dano gástrico causado pelo etanol ou pelo etanol acidificado com
HCl. O mesmo grupo de pesquisadores (2004b) comprovou, em outro estudo,
que a mistura de α e β amirinas da mistura de triterpenóides isoladas da resina
de Protium possuem atividade gastroprotetora, e sugeriram que o mecanismo
da mesma envolveria, em parte, a ativação de neurônios aferentes capsaicina
sensível.
No
ano
2005,
estes
autores
demonstraram
a
atividade
hepatoprotetora desta mistura frente à hepatotoxicidade induzida pelo
acetaminofeno.
Estudos recentes efetuados por LIMA-JUNIOR e colaboradores (2006),
relataram o possível efeito antinoceptivo da mistura de α e β amirinas, o qual
envolveria um mecanismo através de receptores opióides, sugerindo o seu uso
para tratar dores viscerais de origem intestinal e pélvica.
Assim, os resultados obtidos por estes autores proporcionam uma base
científica para o uso popular desta substância e incentivam a avaliação de uma
possível atividade anti-Helicobacter que pudesse agregar valor terapêutico ao
efeito gastroprotetor já comprovado.
Ill - OBJETIVOS
Objetivo geral
Avaliar a atividade anti-Helicobacter da resina, do óleo essencial e da mistura
de α e β amirinas de Protium heptaphyllum March.
Objetivos específicos
1. Avaliar qualitativamente a atividade inibitória in vitro para a bactéria
Helicobacter pylori de produtos naturais provenientes de Protium
heptaphyllum March.
2. Determinar quantitativamente a Concentração Inibitória Mínima (CIM) e
a Concentração Bactericida Mínima (CBM) para estes produtos.
3. Avaliar a influência do pH ácido na atividade anti-Helicobacter dos
produtos analisados.
4. Avaliar a atividade antimicrobiana e terapêutica in vivo através de
modelo murino utilizando-se camundongos C57BL/6.
lV- MATERIAL E MÉTODOS
1- OBTENÇÃO DOS PRODUTOS NATURAIS DE Protium heptaphyllum
March
A resina, o óleo essencial e a mistura de α e β amirinas de Protium
heptaphyllum March. foram cedidas gentilmente pelo Prof. Dr. Vietla Rao do
departamento Farmacologia e Fisiologia da Universidade Federal do Ceará.
A resina exudada do tronco de Protium heptaphyllum March foi coletada
na área municipal de Timon, no estado do Maranhão, Brasil; sendo
devidamente identificada pela Botânica Roseli Farias de Melo Barros. Uma
amostra da planta coletada foi depositada com o número 18247 no Herbário
Graziela Barroso, pertencente à Universidade Federal do Piauí, Teresina,
Brasil.
A resina crua, com cerca de 410g, foi dissolvida em uma mistura de
metanol/diclorometano, em uma proporção de 4:1; filtrada, sendo o solvente,
em seguida, evaporado em um rotavapor até serem obtidas 408 g de uma
resina amorfa branca, correspondendo a 99,5 % do total da resina original.
Uma parte deste material, correspondente a 12 g, foi submetida à
cromatografia em coluna de sílica gel de 5,5 cm de largura por 38 cm de
comprimento. A coluna foi eluída com hexano (100%, 625 ml); hexano-acetato
de etila (98:2, 875 ml); (95:5, 1000 ml); (9:1, 3750 ml); (8:2, 3225ml); (7:3, 1750
ml) e acetato de etila (100%, 500 ml). As frações eluídas com hexano-acetato
de etila (95:5) renderam 5,43g (45 %) da mistura de α e β amirinas (frações
1+2). Estes compostos foram identificados na mistura por cromatografia em
camada delgada. A identificação estrutural destas substâncias foi confirmada
por análise espectral de 1H e
13
C-NMR, baseado no método desenvolvido por
Olea e Roque, e por comparação com dados da literatura.
A taxa de α e β amirinas nesta mistura foi 63:37, calculada por 1H-NMR,
dividindo a área da sinal dos H olefínicos δ = 5,14 (α amirina) e δ = 5,20 (β
amirina), pela sinal da área em δ = 3,24 (dd, J = 11 e 5 Hz), atribuídos a H-3
nos dos triterpenos e multiplicado por 100 (OLIVEIRA et al., 2004).
1.1 Análise fitoquímica.
A análise fitoquímica da resina revelou a presença de triterpenoides
pentacíclicos em uma proporção de 56%, identificados por espectrometria de
massas, para o qual foi utilizado um espectro de massas de 1H e 13C-NMR.
Os compostos identificados foram a mistura de α e β amirinas em uma
proporção de 45,25%, breína e maniladol 9,5 % e uma pequena quantidade de
lupeone.
Foi obtido da resina, por hidrodestilação, uma porcentagem de 0,7 % de óleo
essencial (VIEIRA-JUNIOR et al., 2003; OLIVEIRA et al., 2004).
2- LINHAGENS DE Helicobacter pylori.
As linhagens de Helicobacter pylori utilizadas no presente estudo
pertencem ao Banco de linhagens do Laboratório de Microbiologia e Biologia
Molecular da Unidade Integrada de Farmacologia e Gastroenterologia
(UNIFAG), da Universidade São Francisco (USF). As mesmas foram isoladas
de biópsias coletadas por endoscopia digestiva alta de pacientes com
diagnóstico de gastrite, úlcera péptica e câncer gástrico, que deram seu
consentimento, em projetos já finalizados e aprovados por Comitê de Ética
Médica. Estas linhagens foram escolhidas considerando-se seu padrão de
sensibilidade ou resistência frente aos antimicrobianos de uso tradicional
(Tabela 2).
Neste estudo, além dos isolados clínicos anteriormente citados,
foram incluídas duas linhagens de referência internacional que já tiveram o
genoma completamente seqüenciado, a 26695 e a J99 (TOMB et al., 1997),
além de um isolado de origem holandesa, resistente para amoxicilina,
denominada Hardenberg (GERRITS et al., 2002), e uma cepa padronizada que
infecta camundongos, denominada SS1 ou Sidney Strain 1 (LEE et al. 1997).
As linhagens foram conservadas em uma solução de caldo BHI (brothbrain infusion, MERCK-Germany) e 30 % de glicerol (MERCK-Germany),
mantidas a uma temperatura de – 70 °C em biofreezer, e foram reativadas por
inóculo em placas de Petri preparadas com agar Columbia (Merck-Germany)
adicionado de 10 % de sangue de carneiro desfibrinado, 10 mg/L de
vancomicina (Sigma-USA), 20 mg/L de ácido nalidíxico (Sigma-USA), 10 mg/L
de anfotericina B (Sigma – USA) e 40 mg/L de TTC (Cloreto de 2, 3, 5, trifenil
tetrazolium, Sigma-USA), conforme descrito por QUEIROZ et al, 1987 e
MENDONÇA et al., 2000.
As placas foram semeadas com 50 µl de cada estoque bacteriano e
incubadas a 37 °C em condições de microaerofilia, (5-6 % de O2, 8-10 % de
CO2, 80-85% de N2) com 95 % de umidade relativa por um período de 48-72 h.
Passado esse tempo, foram adicionadas às placas com crescimento, 100 µl de
caldo Brucella esterilizado (Merck-Germany), sendo o cultivo espalhados com
alça de Drigalski e novamente incubadas nas condições anteriormente
descritas por outras 48 h. Este procedimento foi realizado com o objetivo de se
obter um maior número de unidades formadoras de colônias (ufc).
Tabela 2: Distribuição das linhagens de H.pylori, de acordo com a sua
resistência aos antimicrobianos de uso tradicional.
Resistentes aos antimicrobianos
Sensíveis
Amoxicilina Claritromicina Furazolidona Metronidazol Tetraciclina
Hard
446
637
50
241
637
BH 13
495
667
118
638
640
50
638
241
646
663
84
675
446
713
118
495
39f
132
664
SS1
219
660
241
26695
446
J99
495
99
BH 27
650
2.1 Caracterização Microbiológica
A morfologia das bactérias, obtidas por cultivo em meio sólido, foi
observada ao microscópio óptico após coloração de Gram, e as amostras que
apresentaram morfologia característica de H. pylori foram confirmadas através
da realização dos testes bioquímicos que comprovam a produção de urease,
catalase e oxidase.
Para o teste da urease, uma amostra de cada cultura em meio sólido foi
adicionada a 3 ml de meio de uréia (uréia 2%, vermelho de fenol 0,05%, azida
sódica 0,02 %, Probac- SP). Estes inóculos foram incubados por 2 h a 37°C em
estufa de cultura. Na presença da enzima urease, a uréia do meio é degradada
a amônia, alterando o pH do meio, com a conseqüente mudança de cor pela
presença do indicador vermelho de fenol, passando de amarelo a rosa.
A atividade da enzima catalase foi constatada através da transferência de
colônias bacterianas para uma lâmina de vidro, na qual tinha sido adicionada
0,1 ml de solução de peróxido de hidrogênio a 3 %. Na presença da enzima se
produz a liberação de O2, verificada pela aparição imediata de bolhas.
Para o teste da oxidase, as colônias bacterianas foram transferidas para
papéis de filtro adicionados com uma solução a 1 % de Tetrafenil-pfenildiamina, aceptor artificial de elétrons (Difco, USA). A oxidação deste
reagente é verificada pela aparição de uma mancha azul ou marrom no papel.
3- TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE ÀS DROGAS.
3.1 Difusão em discos de papel
O teste consiste na semeadura da linhagem bacteriana na superfície de
um meio de cultura sólido, colocado numa placa de Petri, na que se depositam
os discos de papel que contém as substâncias em estudo.
Placas de Petri com meio de cultura de Mueller Hinton (MH), adicionadas
com 5% de sangue de carneiro desfibrinado foram inoculadas com 100µl da
suspensão bacteriana da linhagem 26695, ajustada para o tubo 2 da escala de
MacFarland, que corresponde aproximadamente a 6 x 10 8 ufc/ ml.
A suspensão bacteriana foi preparada em solução tampão de fosfatos pH 7,4
(PBS) e foi espalhada com alça de Drigalski na superfície da placa de Petri.
Os discos de papel de filtro estéreis, de 7mm de diâmetro, semelhantes
aos discos de antibióticos comercializado, porém sem principio ativo, foram
impregnados com 10µl da solução da substância avaliada.
As placas foram deixadas por 30 minutos à temperatura ambiente do
laboratório para uma difusão radial da droga no meio de cultura, estabelecendo
um gradiente de concentrações decrescentes a partir do disco.
Completado o tempo de 30 minutos, incubaram-se as placas a 37°C, nas
condições de microaerofilia durante 72 h. Após esse período os halos de
inibição de crescimento bacteriano foram medidos com paquímetro e os
resultados foram expressos em milímetros.
Esta metodologia foi utilizada como screening inicial dos compostos para
estabelecer se os mesmos apresentavam atividade anti-Helicobacter pylori. Os
testes foram realizados em duplicata e o resultado se expressa como a média
dos valores obtidos.
3.2 Método da Microdiluição
Esta técnica consiste em fazer diluições seriadas da sustância a testar em
caldo de cultura, depois do qual se acrescenta um volume determinado da
suspensão bacteriana padronizada com a escala de MacFarland.
O procedimento é realizado em microcubetas plásticas que possuem 96
poços, distribuídos em 12 colunas com 8 fileiras cada uma. Depois de realizada
a inoculação da placa se procede à incubação a 37°C, nas condições de
microaerofilia por 72 h.
Completado este período, se procede a determinação da concentração
inibitória mínima (CIM), que se define como a menor concentração da
substância capaz de inibir o crescimento bacteriano. Isto é manifestado pela
falta de turvação no meio de cultura, o que revela a inibição do crescimento
bacteriano. A determinação pode ser realizada a olho nu ou por leituras de
densidade óptica em espectrofotômetro.
É possível também, através deste método, determinar a
concentração bactericida mínima (CBM), que é a menor concentração de
substância capaz de produzir a morte bacteriana de 99,9% do inóculo
realizado.
Para
efetuar
esta
determinação,
são
padronizados de cada poço da microcubeta para uma
transferidos
volumes
placa de Petri de 15
mm de diâmetro, preparada com BHI agar, adicionada de 5 % de sangue de
carneiro desfibrinado, 2 mg/l de anfotericina B e 40 mg/L de TTC, sendo a
transferência realizada com micropipetas multicanal ou replicador automático.
As placas são incubadas a 37°C, em condições de microaerofilia durante 48 h.
Na leitura das placas a CBM é anotada como a menor concentração da
substância que não apresentou crescimento bacteriano.
A vantagem desta metodologia é que permite testar até 12 linhagens
diferentes e até pelo menos 6 concentrações distintas da droga em estudo, e
utiliza pequenas quantidades tanto do meio de cultura quanto da suspensão
bacteriana e principalmente das substâncias analisadas.
As amostras do óleo essencial, da resina e da mistura das α e β amirinas
foram solubilizadas em dimetilsulfoxido (DMSO) (Merck-germany), e quando
necessário, procedeu se a sonicação das amostras por no máximo 30 min a 25
°C em sonicador ultra-sônico, para auxiliar na dissolução dos compostos.
Na primeira etapa dos testes foram feitas diluições das soluções
concentradas para atingir as seguintes concentrações finais: 500, 100,10 e 1
µl/ml. Estas diluições foram feitas em tubos eppendorf estéreis pela adição de
quantidade suficiente de caldo Brucella, suplementado com 10 % de soro fetal
bovino (Cultilab - SP), assim como dos diferentes volumes das substâncias
avaliadas para se atingir as concentrações pré-estabelecidas.
A Figura 6 apresenta um modelo esquemático da placa utilizada para a
microdiluição, com a respectiva disposição das substâncias e linhagens
bacterianas em um ensaio típico. Brevemente, foram dispensados 50 µl de
cada diluição nos 12 poços correspondentes na primeira fileira E, e assim
sucessivamente para as outras diluições. A fileira A é o controle de inóculo, o
que nos permite avaliar a viabilidade das linhagens, apenas sendo adicionado
50 µl de caldo de Brucellas suplementado com 10 % do soro fetal bovino; a
fileira B corresponde ao controle do meio de cultura, a próxima fileira C é o
controle das sustâncias que serão testadas, e a fileira D é o controle de
crescimento das linhagens na presença de DMSO.
As suspensões bacterianas foram preparadas em PBS. As mesmas foram
ajustadas ao tubo 2 da escala de MacFarland e foram mantidas em banho de
gelo durante todo o procedimento.
Com as microcubetas carregadas com as diferentes soluções, foram
acrescentados 5 µl de cada suspensão bacteriana nos poços, respeitando-se
os correspondentes controles negativos, nas fileiras B e C, que correspondem
aos controles do meio de cultura e às soluções com as drogas a testar.
Cepas bacterianas
1
2
3
A
4
5
6
7
8
9
10
11 12
Controle positivo (meio + bactérias)
Controle negativo (meio + produtos testados)
1a diluição
2a diluição
3a diluição
4a diluição
5a diluição
6a diluição
B
C
D
E
F
G
H
Figura 6: Esquema de preparação da microplaca.
Após este procedimento as placas foram incubadas por 72 h a 37 °C, em
condições de microaerofilia. Depois deste período foram transferidos 2 µl de
cada poço para uma placa de Petri preparada com meio BHI adicionado de 2
mg/l de anfotericina B e 40 mg/L de TTC. As placas foram incubadas durante
48 h a 37 °C nas condições anteriores, após as quais foram registrados os
resultados.
3.2.1 Determinação da CIM por espectrofotometria.
Um método rápido e útil de se obter estimações do número de células
bacterianas é através das medições de turbidez.
Uma suspensão celular aparece turva na visão, porque as células
dispersam a luz que atravessa a suspensão. Quanto maior o número de células
presentes na suspensão, maior será a quantidade de luz dispersada, e por
tanto maior será a turbidez. A turbidez pode ser medida com aparelhos como
os fotômetros ou espectrofotômetros, que incidem um feixe de luz através de
suspensões celulares e detectam a quantidade de luz emergente não
dispersada. Os comprimentos de onda mais comumente usados para efetuar
medições de turbidez bacteriana são 540 nm, 600 nm e 660 nm, todos dentro
do espectro de luz visível. As leituras realizadas se expressam em unidades de
densidade óptica (DO).
No caso de organismos unicelulares, as unidades de densidade óptica,
dentro de determinados limites, são proporcionais ao número de células, e, por
conseguinte, as medidas de turbidez podem ser usadas como substitutos dos
métodos diretos de contagem bacteriana. Entretanto, antes de usar a turbidez
como medida do número de células, é necessário realizar uma curva padrão,
relacionando o número de células bacterianas com as medidas de densidade
óptica.
Para poder determinar os valores da CIM realizadas por esta técnica de
microdiluição em microplacas foi utilizado um leitor de microplacas (THERMO
LAB SYSTEM, MULTISCAN, MCC/B40 FISCHER).
Na primeira etapa foi realizada uma curva de calibração, relacionando
as densidades óticas a um comprimento de onda de 620 nm, com suspensões
bacterianas de diferentes concentrações em PBS. Foi realizado um pool de 12
linhagens suspendidas em PBS, na qual se misturaram suspensões que tinham
sido padronizadas para o tubo 4 da escala de MacFarland, o que corresponde
aproximadamente a uma concentração de 1,2 x 109 UFC/ ml. Foram realizadas
diluições com PBS para atingir as concentrações de 1,2 x 108, 6 x 107, e 3 x
107, na microplaca.
3.2.2 Ensaio de microdiluição em pH 4.
Com o objetivo de avaliar o efeito do pH ácido na propriedade antiHelicobacter da mistura de α e β amirinas, foi realizada a CBM em condições
de pH 4.
O ensaio foi realizado do mesmo modo que descrito anteriormente, com
a modificação de que o pH do meio BHI foi ajustado a pH 4, utilizando uma
solução de HCl 0,1N. Os valores de pH foram verificados com um eletrodo para
este fim (ORION). Foi realizado de forma paralela o mesmo ensaio a pH 4
acrescentado de 10 mM de uréia (MERCK-Germany), com o objetivo de
simular as condições gástricas.
4- ANÁLISE in vivo
4.1 Animais
Para o ensaio com animais, foram utilizados camundongos C57BL/6,
pesando entre 20–30 g, com quatro semanas de vida, adquiridos do Centro
Multiinstitucional de Bioterismo da Universidade Estadual de Campinas
(UNICAMP). Os animais foram acondicionados em gaiolas plásticas individuais
e mantidos no Biotério da Universidade São Francisco (USF), com ciclos
artificiais claro-escuro de 12 h. Os animais se serviram ad-libitum de água e
ração.
4.2 Modelo experimental de infecção por Helicobacter pylori em
camundongos C57BL/6.
Foram preparadas suspensões da linhagem SS1, as quais foram
obtidas a partir de inóculos feitos em placas de Petri com meio de cultura BHI
adicionado de antibióticos (QUEIROZ et. Al 1997 e MENDONÇA et al. 2000).
As colônias foram colhidas com swab estéril e suspendidas em 800 µl PBS. As
mesmas foram comparadas visualmente com o tubo N° 10 de MacFarland,
para obter suspensões com mais de 3 x 10 9 ufc/ml.
Alíquotas de 200 µl de suspensão de Helicobacter pylori foram
administradas através de sonda orogastrica aos camundongos C57BL/6, por
três vezes em dias alternados (VAN DORN et al., 1999; EATON et al., 2001).
Após 6 semanas de inoculação dos camundongos, estes foram divididos em 2
grupos de 5 animais, o grupo controle e o grupo tratado com a mistura de α e β
amirinas. Em ambos os grupos foram injetados diariamente por via
intraperitoneal omeprazol (100 mg/kg), durante 7 dias. O grupo tratado
recebeu, a cada 12 h, a mistura de α e β amirinas na dose de 360 mg/Kg e o
grupo controle recebeu o veículo no volume de 10 µl/g, por via oral, através de
sonda orogástrica. Além destes dois grupos se manteve outro com animais
sadios, ou seja, sem a infecção por Helicobacter pylori, grupo controle
negativo. A mistura de α e β amirinas foi dissolvida em tween 80 a 3% em água
destilada. O veiculo consistiu em uma solução aquosa de tween 80 a 3 %.
Após 36 h do último tratamento, os animais foram sacrificados, seus
estômagos foram dissecados, lavados com solução fisiológica e abertos ao
longo da curvatura maior. Os estômagos foram divididos em partes iguais, e as
amostras foram guardadas para realizar os ensaios de mieloperoxidase, PCR
em tempo real e cultura bacteriana.
As amostras foram pesadas, colocadas em tubos e conservadas em
freezer a – 70°C. As amostras destinadas à cultura foram estocadas em
solução de transporte, que consistiu de caldo de brucellas adicionado de 5 %
de albumina sérica bovina e 10% de glicerol. As amostras analisadas por PCR
(Polimerase Chain Reaction) foram previamente submetidas a uma extração de
DNA.
4.3 Avaliação das lesões ulcerativas.
Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical 36 h após de
finalizado o tratamento. Os estômagos foram retirados e abertos ao longo da
maior curvatura e lavados em solução de cloreto de sódio 0,9 %. Antes de
proceder à amostragem, foram contadas e avaliadas as lesões ulcerativas, de
acordo com o esquema proposto por GAMBERINI et al. (1991).
O índice de lesões ulcerativas (ILU) foi calculado pela somatória dos
parâmetros descritos na Tabela 3.
Tabela 3: Índice de lesões ulcerativas, esquema proposto por GAMBERINI e
colaboradores, (1991).
Parâmetro analisado
Valor
Perda de pregas da mucosa
1 ponto
Descoloração da mucosa
1 ponto
Edema
1 ponto
Hemorragias
1 ponto
Petequias
até 10 petequias
2 pontos
mais de 10 petequias
3 pontos
Úlceras
até 1 mm
N* x 2 pontos
Úlceras
maiores que 1 mm
N* x 3 pontos
Úlceras perfuradas
N* x 4 pontos
N refere-se ao numero de lesões observadas
4.4 Cultura bacteriana dos estômagos dos camundongos
As amostras gástricas dos camundongos foram maceradas e diluídas em
PBS 1:10 e 1:100, antes de serem semeadas em placas de Petri preparadas
com agar Columbia, adicionado de 5 % de sangue de carneiro desfibrinado e
10 mg/L de vancomicina (Sigma - USA), 20 mg/L de ácido nalidíxico (SigmaUSA), 10 mg/L de anfotericina B (Sigma – USA), 5 mg/L de trimetroprima
(Sigma - USA) e 40 mg/L de TTC (Cloreto de 2,3,5, trifenil tetrazolium, Sigma USA), concentração padrão de antibióticos para meio seletivo e placas com
excesso de antibióticos para a preparação de meio super seletivo, contendo
100 mg/L de vancomicina (Sigma- USA), 20 mg/L de ácido nalidíxico (Sigma USA), 10 mg/L de anfotericina B (Sigma – USA), 100 mg/L de trimetroprima
(Sigma - USA) e 40 mg/L de TTC (Cloreto de 2,3,5, trifenil tetrazolium, Sigma USA). Foram transferidos 50 µl dos macerados e 100 µl das diluições na
placas, e espalhados suavemente com alça de Drigalsky. As placas foram
incubadas em jarras com o gerador de microaerofilia Microaerobac (Probac do
Brasil) e incubadas a 37 °C em estufa de cultura durante 7 dias. Após esse
período de tempo as colônias formadas nas placas foram contadas e ajustadas
conforme a massa gástrica utilizada na maceração.
4.5 Extração de DNA
Foram adicionados 300 µl da solução tampão de digestão (tris HCl 50
mM, pH8,0, EDTA 1mM e Tween 0,5 %) a cada tubo contendo a amostra da
biópsia, sendo posteriormente misturados por inversão e incubados a 37 °C
overnight. No dia seguinte foram adicionados 400 µl de solução PCI (Fenol:
Cloroformo: Álcool isoamílico. 25:24:1) e os tubos foram misturados por
inversão durante 1 minuto. Em seguida, foram centrifugados a 13.000 rpm
durante 5 minutos sendo o sobrenadante transferido paro outro tubo onde
foram acrescentados 400 µl da solução CI (Cloroformo: Álcool isoamílico, 24:1).
Após isto, os tubos foram misturados por inversão e centrifugados durante 5
minutos a 13.000 rpm, sendo os sobrenadantes transferidos para novos tubos,
repetindo-se a extração com CI. Depois de realizada a extração, se adicionou
600 µl de isopropanol e 100 µl NaAc 3 M para produzir a precipitação do DNA,
misturando-se suavemente e centrifugando a 4 °C a 10.000 rpm durante 10
minutos. Os sobrenadantes foram descartados e os sedimentos foram lavados
com etanol 70° gelado a – 20 °C. Em seguida, as soluções foram centrifugadas
a 13.000 rpm durante 12 minutos, sendo os sobrenadantes descartados. Os
tubos foram incubados durante 15 minutos a 37°C, com as tampas abertas
para evaporação do álcool. O material genético foi dissolvido com 150 µl água
bidestilada estéril.
O DNA extraído foi analisado através de eletroforese em gel de agarose
0,8 %. Alíquotas desse material foram misturadas a uma solução contendo azul
de bromofenol 0,25 % e glicerol 40 %, as mesmas foram aplicadas no gel. A
corrida eletroforética foi realizada com tampão TBE 1X (Tris-HCl 89mM; Acido
bórico 89 mM; EDTA 2mM pH 8,0) e submetida a uma diferença de potencial
de 80 V a 100V/110 M.A (5V/cm), durante 30 minutos. Depois de transcorridos
30 minutos o gel foi retirado da cuba e transferido para ser corado em um
recipiente contendo brometo de etideo (5µg/ml) durante 20 minutos a
temperatura ambiente, sendo visualizado em transiluminador de luz ultravioleta
de onda curta.
4.6 Amplificação por PCR em tempo real
As amostras de DNA obtidas foram submetidas ao ensaio de PCR em
tempo real, o qual foi realizado em um equipamento iCycler IQTM (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA), sendo a obtenção dos dados e sua análise realizada
através do software Real-Time Detection System (Bio-Rad).
A PCR em tempo real mede a sinal fluorescente, que é proporcional a
quantidade de DNA amplificado. O ponto mais confiável para quantificar o DNA
é o número de ciclo no qual a fluorescência do produto de PCR começa a ser
maior que a linha de base definida.
A linha de base de fluorescência representa o número de ciclo no qual o
corante, unido ao produto da PCR, gera um sinal aproximado de 3 desvios
padrão por cima da linha de base. Um nível arbitrário de linha de base é
inversamente proporcional ao logaritmo da quantidade inicial de DNA da
amostra. Assim, quanto maior a quantidade de DNA, menor será o número de
ciclos de PCR necessários para alcançar a linha de base (GIULIETTI et al.,
2001).
O
HpNAp é um gene específico de H. pylori que codifica para a
produção de uma proteína ativadora de neutrófilos. Esta proteína é um fator de
virulência que estimula, em neutrófilos, a alta produção de radicais de oxigênio
e estimula a adesão a células endoteliais. O fragmento de 90 pb do gene
(amplicon) foi amplificado pela reação de PCR em tempo real, que utilizou o
corante SYBR Green I, que se liga em dupla cadeia de DNA. A reação com
volume final de 50 µl foi preparada com 25 µl de iQTM SYBR® Green super mix
(Bio-Rad),
50nM
de
cada
primer,
sendo
o
Sense:
GAATGTGAAAGGCACCGATT e o antisense: TCCTT TCAGCGAGATCATCA
e 1 µL do DNA extraído.
Os ciclos da reação utilizados foram: desnaturação a 95 °C durante 5
minutos, seguida de 45 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos,
anelamento a 65 °C por 30 segundos e extensão dos primers a 72 °C por 30
segundos. Após esta reação foi realizada uma análise da curva de melting
point da dupla fita dos amplicons, que consistiu em 40 ciclos com
decrescimentos de 1 °C de 45 segundos cada um, começando aos 95° C. Os
ensaios foram realizados em placas de 96 - well, e foi realizado em duplicata.
Em todas as reações de amplificação foram incluídos controles positivos, que
consistiram em amostras de DNA genômico de H. pylori das cepas de
referência 26695 e J99, bem como controles negativos de DNA isolados de
amostras de biópsias gástricas de camundongos (C57BL/6) não infectados por
H. pylori.
Para determinar os limites de detecção de esta reação, foram
realizadas diluições seriadas de DNA de H. pylori em um intervalo de 10-1 a 106
fg. A eficiência da reação foi determinada pela realização de curvaspadronizadas de diferentes diluições 1/10 de DNA de H. pylori, numa solução
contendo 200 ng de DNA humano, sendo cada amostra processada em
triplicata.
4.7 Determinação da atividade mieloperoxidase.
A atividade mieloperoxidase (MPO), é utilizada como marcador da
infiltração de neutrofilos. As amostras gástricas dos camundongos foram
analisadas pelo método de Bradley.
As amostras foram homogeneizadas em 500 µl de solução tampão 50
mM
de
fosfato
de
potássio
pH
6,
adicionadas
de
0,5%
de
hexatetradeciltrimetilamonio de bromo (HTAB) (SIGMA CHEMICAL CO.) e
foram maceradas, sendo o volume final completado com HTAB para 1000µl.
Os tubos contendo os macerados foram misturados em vortex e centrifugados
a 4 °C durante 10 minutos.
Um volume de 50 µl de cada sobrenadante foi transferido com
micropipeta para uma placa de Elisa, onde foram acrescentados 200 µl do
substrato O-dianisidine, procedendo-se à leitura das absorbâncias em um leitor
de microplacas (THERMO LAB SYSTEM, MULTISCAN, MCC/B40 FISCHER),
em um comprimento de onda de 460 nm. As leituras foram registradas a cada
30 segundos, por um período de 3 minutos.
Uma unidade de atividade MPO é definida como a que degrada 1 µmol
de peroxidase por minuto a 25 °C. As determinações foram realizadas em
triplicatas e os resultados foram expressos como a média das determinações.
5- Análise estatística dos dados
As diferenças estatísticas entre os grupos foram determinadas pelo
teste ANOVA seguido do teste de DUNNETT, (p<0,05). Os valores obtidos
por PCR em tempo real para o número de células bacterianas em ambos os
grupos foram analisados pelo teste t (p<0,05).
V - RESULTADOS
1. TESTES DE SUSCEPTIBILIDADE ÀS DROGAS.
1.1 Difusão em discos
Para detectar a possível presença de atividade anti - Helicobacter pylori
da resina, do óleo e da mistura de α e β amirinas isoladas da espécie Protium
heptaphyllum March foi utilizada a técnica qualitativa de difusão em discos. Os
resultados obtidos por esta técnica nos permitiram obter uma primeira
avaliação da capacidade dos mesmos de inibir in vitro a bactéria.
A linhagem utilizada neste screening preliminar foi a 26695 e os
resultados se mostram na Tabela 4. A concentração dos discos foi de 1000
µg/ml para cada composto. Foram medidos os halos de inibição, que se
expressam em milímetros, e os mesmos representam à média dos resultados
obtidos em dois ensaios.
Tabela 4: Halos de inibição para a linhagem 26695 obtidos para o óleo, a
resina e a mistura das α e β amirinas de Protium heptaphyllum March.
Halo de Inibição (mm)
Óleo
39
Resina
26
α e β amirinas
29,5
Estes resultados mostraram que, tanto a resina quanto os compostos
obtidos dela apresentam uma boa atividade anti - Helicobacter in vitro, sendo o
óleo, o composto que apresentou o maior halo de inibição.
1.2 Concentração Inibitória Mínima e Bactericida Mínima.
Com o objetivo de determinar a concentração bactericida mínima para
os compostos que no screening preliminar de difusão em discos apresentaram
atividade anti - Helicobacter, foi realizada uma primeira etapa que consistiu em
diluições seriadas em log10 dos compostos, estando os resultados dos ensaios
de microdiluição apresentados nas Tabelas 5, 6 e 7. Neste primeiro ensaio
foram testadas 10 linhagens frente a o óleo e oito linhagens para a resina e a
mistura. O intervalo de concentrações utilizados para o óleo foi de 1 a 1000 µg /
ml, sendo para a resina e a mistura das α e β amirinas de 1 a 500 µg / ml.
A concentração bactericida mínima para o óleo essencial de
P.heptaphyllum foi de 1000 µg/ml para 40 % das linhagens testadas e de 100
µg/ml para 20 %, não sendo inibidas as demais linhagens nas concentrações
utilizadas. Além disso, tanto a resina como a mistura das α e β amirinas
apresentaram uma CBM de 100 µg / ml para todas as linhagens avaliadas
nesta primeira etapa.
Tabela 5: Atividade antibacteriana do óleo essencial de P.heptaphyllum frente a
H. pylori, determinada por microdiluição.
Linhagens
J99
118
219
50
84
495
Hard
BH 13
26695
446
1000µg/ml
-
-
+
-
+
+
-
+
-
-
100 µg/ml
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
10 µg/ml
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1 µg/ml
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ crescimiento, - sem crescimiento
Tabela 6: Atividade antibacteriana da resina de P.heptaphyllum frente a H.
pylori, determinada por microdiluição.
Linhagens
26695
SS1
Hard
650
667
241
646
660
500 µg/ ml
-
-
-
-
-
-
-
-
100 µg/ ml
-
-
-
-
-
-
-
-
10 µg/ ml
+
+
+
+
+
+
+
+
1 µg/ ml
+
+
+
+
+
+
+
+
+ crescimiento, - sem crescimiento
Tabela 7: Atividade antibacteriana da mistura de α e β amirinas
de P.heptaphyllum frente a H. pylori determinada por microdiluição.
Linhagens
26695
SS1
Hard
650
667
241
646
660
500 µg/ ml
-
-
-
-
-
-
-
-
100 µg/ ml
-
-
-
-
-
-
-
-
10 µg/ ml
+
+
+
+
+
+
+
+
1 µg/ ml
+
+
+
+
+
+
+
+
+ crescimiento, - sem crescimiento
Com o objetivo de aprimorar o intervalo de concentração das
substâncias que foram capazes de apresentar atividade bactericida foram
realizados os ensaios de microdiluição em diluições seriadas por log2.
De um total de 26 cepas ensaiadas frente à mistura de α e β amirinas,
56 % apresentaram uma CBM entre 100-110 µg/ml e 23 % das linhagens
apresentaram uma CBM de 160 µg/ml. No caso da resina os resultados obtidos
foram semelhantes, mostrando uma CBM de 100-140 µg/ml para 58 % das
linhagens e uma CBM de 160 µg/ml para 19 % das mesmas.
As concentrações inibitórias mínimas, em alguns casos, apresentaram
uma diferença de apenas um ponto de diluição, sinalizando a ausência de
tolerância para estes compostos (Tabela 8).
A avaliação da atividade do óleo essencial frente a 20 linhagens
apresentou uma CBM maior que 2000 µg/ml para 40 % das cepas, entretanto,
para 25 % a CBM foi de 1000 µg/ml e para o 20 % foi de 2000 µg/ml.
As concentrações inibitórias mínimas (CIM) para este composto
apresentaram o mesmo valor que a CBM, com a exceção de duas linhagens, a
646 e a 713, que apresentaram uma CIM 4 vezes menor do que a CBM
(Tabela 9).
Os resultados evidenciaram que a atividade do óleo essencial foi
menor, mostrando que não houve correlação entre as metodologias de difusão
em discos e o ensaio de microdiluição, quanto ao óleo essencial, já que apesar
do mesmo ter apresentado um halo de inibição considerável, a avaliação no
ensaio de microdiluição apresentou para a maioria das linhagens uma CBM
entre 1000 - maiores que 2000 µg / ml.
Tabela 8: Determinação da concentração bactericida mínima (CBM) e
concentração inibitória mínima (CIM) da mistura de α e β amirinas e da resina
de Protium heptaphyllum March por microdiluição.
Linhagem
39 f
660
640
713
SS1
446
84
99
26695
HARD
118
663
638
637
J99
667
650
241
646
664
675
50
219
BH13
495
132
Faixa
µg/ml
6,8-110
10-160
Mistura de α e β
amirinas
CBM µg/ml
CIM
µg/ml
>110
100
110
110
100
55
110
110
110
110
110
110
55
110
55
100
100
100
100
160
160
160
160
>160
160
160
110
50
55
110
55
27,5
110
110
27,5
110
110
55
55
110
27,5
S/D
S/D
S/D
100
S/D
S/D
S/D
S/D
>160
S/D
160
Resina
Faixa
µg/ml
8,7-140
10-160
CBM
µg/ml
CIM µg/ml
>140
100
140
140
100
140
140
70
100
160
140
140
70
140
100
100
100
100
100
160
160
160
160
>160
>160
160
70
50
S/D
70
100
140
70
70
50
160
140
70
70
70
100
S/D
S/D
S/D
100
160
160
160
160
160
S/D
160
S/D Sem determinar
Tabela 9: Determinação da concentração bactericida mínima (CBM) e
concentração inibitória mínima (CIM) para o óleo essencial de Protium
heptaphyllum March. por microdiluição.
Linhagem
Faixa
µg/ml
Óleo essencial
CBM
CIM
µg/ml
µg/ml
J99
1000
1000
118
219
50
84
HARD
BH13
26695
446
39 f
132
640
713
99
663
660
637
667
BH 27
646
100
>2000
1000
1000
1000
2000
1000
100
>2000
>2000
>2000
2000
2000
>2000
>2000
2000
500
>2000
>2000
s/d
>2000
1000
1000
500
2000
1000
s/d
>2000
>2000
>2000
500
2000
>2000
>2000
1000
500
>2000
500
2000 - 67,5
1.3 Determinação da CIM por espectrofotometria.
Com a realização da curva padrão, foi possível verificar que na faixa de
concentrações utilizadas para medir a turbidez, a relação entre as
concentrações e as densidades ópticas apresentou proporcionalidade.
CURVA DE CALIBRAÇÂO
Densidade ótica a 620 nm
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
0
2
4
6
8
10
Log de UFC/ML
Gráfico 1 : Curva padrão relacionando o log de ufc/ ml e as leituras de turbidez.
Y = 0,0355*X - 0,01236
r = 0,94
Foi realizado o ensaio de microdiluição para determinar a CIM e a CBM
para a amoxicilina (Sigma), em um intervalo de concentrações de 0,12 – 4
µg/ml frente a 6 linhagens, entre elas a Hardenberg, cepa resistente para este
antibiótico, a J99, linhagem sensível, a 26695, a 84, a 663 e a 713.
A CIM foi determinada pelo método espectrofotométrico e foi definida como a
concentração na qual ocorreu uma diminuição pronunciada e sustentada no
valor da densidade ótica (DO).
Do mesmo modo anteriormente descrito, foi determinada a CIM para as
outras linhagens frente à resina, mistura de α e β amirinas, e o óleo essencial.
Os resultados mostram que algumas linhagens apresentaram diminuição das
densidades ópticas (DO), evidenciando a CIM para os diferentes compostos
(Tabelas 9 e 10, Figuras 6, 7 e 8).
Tabela 10: Determinação da concentração bactericida mínima (CBM)
e concentração inibitória mínima (CIM) para amoxicilina por microdiluição.
AMOXICILINA
Linhagens
Harden
Intervalo
0,12- 4
µg/ml
CBM
µg/ml
>4
CIM
µg/ml
>4
26695
0,5
0,5
J99
<0,12
<0,12
84
1
0,5
713
0,5
<0,5
663
0,5
<0,5
Determinação de CIM por espectrofotometria
Densidade ótica
( 620 nm)
0,25
0,2
26695
Hardenberg
0,15
713
0,1
84
0,05
0
0
1
2
3
4
5
Concentração de Amoxicilina ( ug/mL)
Figura 7: Efeito das diferentes concentrações de amoxicilina nas linhagens
26695, Hardenberg, 713 e 84, determinadas por espectrofotometria.
Determinação de CIM por espectrofotometria
Densidade ótica
(620 nm)
0,35
0,3
0,25
0,2
713
638
0,15
637
0,1
39f
0,05
0
0
20
40
60
80
100
120
Mistura de a e b amirinas ( ug/mL)
Figura 8: Efeito das diferentes concentrações da mistura de α e β amirinas de
Protium heptaphyllum March, nas linhagens 713, 638, 637, e 39F.
Densidade ótica
(620 nm)
Determinação de CIM por espectrofotometria da
RESINA
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
638
713
637
39f
0
50
100
150
Concentração da Resina (ug/mL)
Figura 9: Efeito das diferentes concentrações da resina de Protium
heptaphyllum March., nas linhagens 713, 638, 637, e 39F
Determinação CIM espectrofotometria òleo
essencial
Densidade ótica
(620 nm)
0,3
713
0,25
663
0,2
Hard
BH13
0,15
0,1
0,05
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Concentração óleo essencial (ug/mL)
Figura 10: Efeito das diferentes concentrações do óleo essencial de Protium
heptaphyllum March., nas linhagens 713, 638, Hard, e 39F
1.4 Influência do pH ácido na propriedade anti-H. pylori da resina e das
mistura das α e β amirinas.
Para determinar a influência das características do meio estomacal nos
compostos avaliados, as CBM foram realizadas, além das condições neutras,
em condições ácidas.
A diminuição de pH de 7,4 para 4 não modificou os valores de CBM para
nenhum dos compostos ensaiados (Tabela 11 e 12). Foi observado, entretanto,
um crescimento menor tanto nos controles como nos compostos.
Os ensaios realizados em condições ácidas foram repetidos na
presença de uréia, com o objetivo de simular as condições gástricas. A adição
de uréia numa concentração de 10 mM, não modificou os valores de CBM.
Tabela 11: Influência do pH na CBM da resina para as linhagens SS1,
Hardenberg, 26695 e BH13.
Linagem
SS1
Hard
26695
BH13
pH 7
100
160
100
>160
Resina
pH 4
pH 4 + urea
100
100
160
160
100
100
>160
>160
Tabela 12: Influência do pH na CBM da mistura de α e β amirinas para as
linhagens SS1, Hardenberg, 26695 e BH13.
Linhagem
SS1
Hard
26695
BH13
Mixtura de α e β amirinas
pH 7
pH 4
pH 4 + urea
100
100
100
110
110
110
110
110
110
>110
>110
>110
2- ENSAIOS in vivo
2.1 Avaliação das lesões ulcerativas
Os animais foram divididos em três grupos; controle positivo, com
animais que receberam o veículo 10µl/g; controle negativo, com animais sem
infecção, e grupo tratado, com animais que receberam a mistura de α e β
amirinas na dose de 360 mg/kg.
Os índices de lesões ulcerativas observados foram de 10,8 para o
grupo controle positivo; 2 para o grupo controle sem infecção e 2,6 para o
grupo tratado, evidenciando com estes resultados, no caso do grupo controle
positivo, as lesões produzidas pelo Helicobacter pylori, e no grupo tratado, a
atividade antiinflamatória e gastroprotetora das α e β amirinas.
A análise estatística dos resultados, pelo teste ANOVA, evidenciou
diferencias significativas (p<0,05) quando foram comparados o grupo controle
positivo com o grupo sem infecção, bem como quando foi comparado o grupo
tratado com o grupo controle positivo.
Gráfico 2: Índice de lesões ulcerativas observadas.
2.2 Quantificação de Helicobacter pylori por PCR em tempo real
Neste estudo utilizamos a amplificação por PCR em tempo real de um
fragmento de 90 pb do gene HpNap para detectar e quantificar a infecção por
Helicobacter pylori.
Inicialmente, foi realizada uma curva padrão, a partir de diluições
seriadas em log10, cobrindo o intervalo de 10
-1
a 106 fg do DNA cromossômico
de H. pylori.
Neste intervalo de concentrações, o coeficiente de correlação obtido foi
maior que R2 = 0,99, indicando que as reações foram altamente reproduzíveis e
eficientes. A especificidade da reação foi determinada pela análise da curva de
melting, sendo que em todas as diluições foi observado apenas um produto de
amplificação.
O número de células bacterianas e a quantidade de DNA presente em
cada amostra foram quantificados por interpolação dos valores de Ct
correspondentes na curva padrão. Os resultados da PCR em tempo real para a
amplificação do gene HpNap não mostrou diferenças significativas entre o
grupo controle e o grupo tratado, sendo ambos os grupos considerados
positivos para a infecção por H. pylori, evidenciando a ausência de atividade de
erradicação pelo tratamento da mistura de α e β amirinas.
A quantidade de células bacterianas por grama de tecido foi quantificada
por PCR em tempo real, sendo os ensaios realizados em duplicata, e os
resultados obtidos para o grupo controle positivo foram de 1.4 x 105 cel/g,
sendo obtidos para o grupo dos animais tratados valores de 2.7 x 105 cel/g.
A análise estatística dos valores obtidos, realizado através do teste t,
quando comparadas as medias dos dois grupos, tratados versus controles,
mostrou que não houve diferenças significativas (p<0.05) entre ambos os
log do n de bact/g de tecido.
grupos.
10
8
6
4
2
0
Grupo A: Controle positivo
Grupo B: Tratados
Grupo A
Grupo B
Gráfico 3: Colonização gástrica dos camundongos tratados com a mistura de α
e β amirinas e sem tratar. Determinação do n° de bactérias por grama de
tecido, determinado por PCR em tempo real.
2.3 Cultura dos microrganismos presentes nas biópsias gástricas
O cultivo de microrganismos a partir de biópsias gástricas dos
camundongos C57BL6 não apresentou o Helicobacter pylori, tanto nas
amostras provenientes dos controles, quanto das biopsias provenientes dos
animais tratados com a mistura das α e β amirinas, tanto nas placas com
concentrações seletivas quanto nas superseletivas, devido à presença de
muitos outros microrganismos contaminantes, possivelmente relacionados com
o hábito coprófago dos camundongos.
2.4 Atividade mieloperoxidase.
A atividade mieloperoxidase das amostras dos tecidos dos animais
infectados com H. pylori e tratados com o veículo, considerado grupo controle
positivo, foi de 0,77± 0,27 unidades / mg de tecido. Após uma semana de
tratamento com a mistura das α e β amirinas, na dose de 360 mg/kg, a MPO
reduziu na proporção de 88,5 %.
*p<0,05quando comparado com o controle negativo
#p<0,05 quando comparado com o controle positivo
Gráfico 4: Efeito da mistura das α e β amirinas na atividade mieloperoxidase no
tecido gástrico dos camundongos infetados com H. pylori. Os resultados são
expressos como unidades por mg de tecido. Cada valor representa a media ±
erro padrão da media (n= 3).
VI - DISCUSSÂO
A bactéria hoje conhecida como Helicobacter pylori foi descoberta por
WARREN e MARSHALL em 1983. Esses autores puseram em evidência a
associação entre gastrite e a presença, no estômago de seres humanos, de
uma bactéria espiralada e propuseram que ela fosse responsável pelo
desenvolvimento de doenças gástricas.
A infecção por H.pylori é uma enfermidade transmissível que induz
progressivamente ao dano do estômago, sendo considerada como problema
de saúde pública (GRAHAM et al., 1997). As variáveis críticas que predizem
um aumento na prevalência são o estrato socioeconômico de baixa renda, as
condições sanitárias inadequadas, o consumo de água contaminada ou sem
tratamento adequado, e a presença de crianças na família. Estas condições
são normalmente encontradas em países em desenvolvimento, incluído o
Brasil, onde de fato ocorre uma alta prevalência da infecção por Helicobacter
pylori (GRAHAM et al., 1991).
A escolha de um tratamento de erradicação deve considerar os efeitos
adversos provocados, a sensibilidade antimicrobiana das linhagens na região,
a simplicidade de acompanhamento para o paciente, e os custos (GO et al.
1999). Apesar da existência de alguns bons tratamentos, estes ainda
apresentam um ou mais problemas relacionados com os aspectos citados,
permanecendo a procura por uma opção que apresente aproximadamente 90
% de erradicação. Os tratamentos sugeridos e atualmente disponíveis incluem
um inibidor da bomba de prótons ou um tratamento com bismuto, sempre
associado a dois antibióticos (CARVALHAES et al. 1997; HARRIS, 1998; DE
BOER et al., 2000; GRAHAM et al., 2000).
Os tratamentos baseados nas terapias tríplices com bismuto não são
caros e conduzem a um alto índice de cura (BREUER et al., 1998; LAHEIJ et
al. 1999; De BOER et al. 2000). Entretanto, a grande quantidade de
comprimidos que os pacientes têm que ingerir ao longo do dia limita seu uso,
somado aos efeitos adversos dos mesmos, o que reduz a tolerabilidade e
compromete o cumprimento do tratamento (CHIBA et al.,1999). Como
conseqüência, vários protocolos recomendam como tratamento de primeira
linha o tratamento tríplice com o inibidor da bomba de prótons (PENTSON,
1996) (MASTRICH CONSENSUS REPORT, 1997), o que oferece conveniência
e tolerabilidade, porém por um alto custo e com a possibilidade de propiciar o
aumento do nível de resistência aos antibióticos (AL-ASSI et al. 1994;
MEGRAUD, 1998). Esta é uma das razões que sugerem a realização de
ensaios avaliando a susceptibilidade regularmente nas diversas regiões do
mundo, e deste modo permitir aos médicos escolher o tratamento de acordo
aos padrões de resistência de cada área geográfica em particular (HARTZAN
et al., 1997), evitando assim tratamentos ineficazes. Em estudo realizado por
MENDONÇA e colaboradores (MENDONÇA et al., 2000), observou-se um
preocupante número de pacientes com linhagens resistentes para amoxicilina,
claritromicina,
furazolidona
e
tetraciclina
em
uma
região
do
Brasil.
Posteriormente, esta resistência foi associada com a falência terapêutica para
alguns esquemas utilizados no Brasil (ECCLISSATO et al., 2002), podendo
estar relacionado ao uso destes antimicrobianos para outras infecções do
aparelho gastrintestinal ou trato respiratório, especialmente em crianças,
permitindo a seleção de mutantes resistentes de H. pylori por simples
vantagem adaptativa, uma vez que a dosagem não seria suficiente para sua
total erradicação.
As plantas têm sido tradicionalmente usadas por populações de todos
os continentes no controle de diversas doenças e pragas. O mercado atual de
fitofármacos e fitoterápicos é da ordem de US$ 9 a 11 bilhões por ano, sendo
que mais de 13.000 plantas são mundialmente usadas como fármacos ou fonte
de fármacos (CASTRO FRANÇA, 2003).
A idéia primordial na indicação do uso de fitoterápicos na medicina
humana não é a de substituir medicamentos registrados e já comercializados,
mas sim, aumentar as opções terapêuticas dos profissionais de saúde,
ofertando medicamentos equivalentes, também registrados, talvez mais
baratos, com espectro de ação mais adequados e com indicações terapêuticas
complementares às medicações existentes, mas em estrita obediência aos
preceitos éticos que regem o emprego de xenobióticos na espécie humana. A
evidencia anedótica e o uso tradicional das plantas como medicamentos
fornece a base para sugestão de que os óleos essenciais e os extratos das
plantas poderiam ser úteis em condições médicas específicas (SIMÔES et al.,
2003). Neste estudo, foram investigadas as atividades antibacterianas da
resina, do óleo essencial e da mistura das α e β amirinas de Protium
heptaphyllum March.
Para avaliar a susceptibilidade dos compostos frente ao Helicobacter
pylori são descritos na literatura quatro métodos para análise microbiológica: o
método da diluição em agar, o método da microdiluição, a macrodiluição e o
método de difusão com discos de papel impregnados, sendo o método de
diluição em agar considerado como padrão-ouro para a análise de
suscetibilidade dos antimicrobianos utilizados na terapêutica convencional,
estando esta escolha relacionada principalmente com a facilidade em se obter
o crescimento bacteriano em meio sólido, ainda mais se considerando a
dificuldade desta bactéria para crescer em meio líquido.
Apesar do método de difusão em discos ser realizado em meio de
cultura sólido e, por isso, facilitar o desenvolvimento e a análise dos resultados,
o mesmo apresenta algumas desvantagens importantes, como a baixa
reprodutibilidade e o aspecto qualitativo dos resultados.
A primeira parte deste estudo consistiu de uma avaliação preliminar,
pelo método de difusão em discos, do óleo essencial, da resina e da mistura
das α e β amirinas. Este ensaio tinha como objetivo a identificação de alguma
potencialidade antimicrobiana. Estas sustâncias apresentaram halos de
inibição, o que nos motivou a continuar nosso estudo utilizando o método de
microdiluição para estabelecer os valores de CIM e CBM para cada composto.
As concentrações inibitórias e bactericidas mínimas obtidas pelo
método de microdiluição para a resina e a mistura de α e β amirinas foram
similares, oscilando entre 160 e 100 µg/ml. Os resultados mostraram que estes
compostos foram efetivos tanto para as linhagens de H. pylori resistêntes
quanto para as linhagens sensíveis aos antimicrobianos de uso tradicional.
Estes resultados sugerem que, provavelmente, a atividade anti-Helicobacter
destes compostos esteja relacionada com a presença, na resina, de altas
concentrações dos triterpenóides pentacíclicos, que atinge um valor de 56 %
do total, sendo que a mistura das α e β amirinas compreende uma
porcentagem de 45,25 % da mesma. Como fora relatado por vários autores, os
terpenos ou terpenóides possuem atividade inibitória ao crescimento para
diversas bactérias, fungos, vírus e protozoários. Em 1977, por exemplo, foi
publicado que 60 % dos derivados de óleos essenciais eram ativos contra
fungos, sendo que 30 % dos mesmos apresentavam atividade inibitória para
bactérias (COWAN, 1999).
O mecanismo de ação dos terpenos ainda não esta claramente
elucidado, porém especula-se que envolva a destruição ou impeça a formação
das
membranas
mediada
por
compostos
lipofílicos
(COWAN,
1999;
BERGONZELLI et al., 2003), podendo apresentar capacidade bactericida e
bacteriolítica.
A capsaicina, um terpenóide presente em pimentas, ingrediente da
comida das culturas da América Central, possui uma ampla aplicação de
atividades
biológicas
em
humanos,
afetando
os
sistemas
nervoso,
cardiovascular e digestivo, e sendo também usado como analgésico. A
capsaicina, apesar de ser possivelmente prejudicial para a mucosa gástrica
humana, apresenta atividade bactericida para o Helicobacter pylori (JONES et
al., 1997; COWAN, 1999).
Entretanto, a determinação da concentração inibitória e bactericida
mínima do óleo essencial de Protium heptaphyllum neste estudo obteve valores
entre 1000 a maiores que 2000 µg/ml, muito superiores aos determinados para
os outros compostos avaliados. Estes resultados evidenciaram a falta de
correlação entre o método de difusão em discos e a microdiluição, para o óleo
essencial, pois apesar deste composto apresentar um halo de inibição
considerável quando testado frente à linhagem 26695, indicando um potencial
de atividade semelhante aos demais compostos, quando ensaiado por
microdiluição
apresentou
valores
de
CIM
e
CBM
mais
elevados.
Provavelmente estes resultados estejam relacionados às características físicoquímicas do óleo quanto ao seu coeficiente de difusão, e sua volatilidade,
sendo exatamente esta a sua principal característica.
Como fora mostrado por BERGONZELLI e colaboradores (2003)
quando testaram 60 óleos essenciais pelo método de difusão em discos, a
eficácia dos mesmos quando ensaiados em meio sólido depende do solvente
usado para aumentar a solubilidade dos óleos no meio de cultura, observando
também diferenças entre os níveis de inibição do crescimento e a capacidade
bactericida dos óleos essenciais avaliados. Os resultados obtidos por estes
autores evidenciaram a impossibilidade de predizer os resultados em meio
líquido, a partir dos resultados conseguidos através do ensaio de difusão em
discos.
Outros autores avaliaram a atividade antimicrobiana e antifúngica de
diversos óleos essências, e também de drogas de uso tradicional, pelo método
de difusão em discos e diluição em agar, não podendo estabelecer uma
correlação entre ambos (XIA et al. 1994; HACHEM et al. 1996; ERGIN e
ARIKAN, 2002). GLUPCZYNKI e colaboradores (1991), quando compararam a
correlação entre o teste de difusão por gradiente E-test, diluição em agar e
difusão em discos para diferentes antimicrobianos, obtiveram uma boa
correlação entre os dois primeiros métodos, porém uma discrepância entre os
resultados obtidos por difusão em discos.
Estudos recentes avaliaram a atividade antimicrobiana de óleos
essenciais, extratos de plantas e seus principais componentes, utilizando os
métodos de macrodiluição, microdiluição e diluição em agar (MABE et al.,
1999; OHNO et al., 2003).
MABE e colaboradores (1999) observaram a atividade anti- Helicobacter pylori
das
catequinas,
compostos
pertencentes
à
família
dos
flavonóides
provenientes do chá verde, e o efeito terapêutico das mesmas com relação ao
dano da mucosa gástrica provocado por este microrganismo. Estes autores
informaram a forte atividade in vitro frente a esta bactéria das catequinas
avaliadas, principalmente do galato de epicatequina que apresentou uma CIM50
de 8 µg/ml.
OHNO e colaboradores (2003) avaliaram a atividade antimicrobiana
para o H. pylori de treze óleos essenciais pelo método de microdiluição, os
quais inibiram completamente a bactéria, destacando-se o extraído do capim
limão por apresentar melhor atividade, com valor de CIM próximo de 100 µg/ml.
Estes autores também avaliaram a possibilidade do microrganismo desenvolver
resistência aos óleos, concluindo que, pelo menos neste estudo, este aspecto
indesejado não fora observado.
FUNATOGAWA e colaboradores (2004) estudaram a capacidade
antibacteriana frente ao Helicobacter pylori dos taninos hidrolisáveis derivados
de plantas medicinais. Os resultados obtidos por estes autores revelaram a
forte atividade dos taninos monoméricos, sendo em alguns casos mais ativos
que as catequinas.
Em outro trabalho realizado por NARIMAN e colaboradores (2004), que
avaliaram a atividade in vitro de seis extratos de plantas de origem iraniana,
observaram atividade anti-Helicobacter com valores de CIM entre 31,25 até
250 µg /ml, sendo identificados como compostos principais, um flavonóide e
uma xantina.
Influência do pH ácido na atividade anti- Helicobacter
Para avaliar o comportamento dos compostos em estudo no meio
gástrico, foram reavaliados os mesmos parâmetros em testes que simulavam
as condições encontradas no estômago, como pH 4 na presença e ausência de
uréia. Os resultados obtidos mostraram que a diminuição do pH não alterou os
valores obtidos para CBM, indicando que o meio ácido gástrico não
comprometeria a atividade esperada das substâncias, nos testes in vivo que
seriam realizados.
FUNATOGAWA e colaboradores (2004) também reavaliaram a
atividade antibacteriana de dois taninos derivados de plantas medicinais,
submetendo-os em um tratamento com ácido. O tratamento não afetou
significativamente
a
atividade
antibacteriana
observada
previamente.
Entretanto, OHNO e colaboradores (2003) relataram que, os efeitos
bactericidas dos óleos essências por eles testados, entre eles os extraídos do
capim limão, melaleuca, orégano, lavanda e menta, foram surpreendentemente
maiores em pH ácido. Resultado semelhante foi observado por BERGONZELLI
e colaboradores (2003), quando estudaram a influência da diminuição do pH na
atividade bactericida dos óleos de sementes de cenoura, capim limão e white
grapefruit, pois observaram que a atividade potencial anti-Helicobacter poderia
ser aumentada no meio gástrico.
Ensaios in vivo
Após os resultados encorajadores de atividade inibitória e bactericida
para o H. pylori, tanto da resina quanto da mistura de amirinas nos ensaios invitro, mesmo em pH ácido, estas substâncias foram avaliadas em modelo
murino utilizando-se camundongos C57BL/6, para se observar o potencial
erradicador e gastroprotetor. Os resultados obtidos quanto ao índice de lesões
ulcerativas dos estômagos dos animais sacrificados, um indicador de
gastroproteção, observou-se que o índice das lesões fora menor nos animais
que receberam o tratamento com a mistura das α e β amirinas, comprovando
os resultados obtidos por OLIVEIRA e colaboradores (2004), quando avaliaram
a
atividade
gastroprotetora
e
antiinflamatória
da
resina
de
Protium
heptaphyllum March., em outros dois modelos, tanto em úlcera induzida por
etanol em outro induzido por etanol acidificado. Estes autores relataram que o
tratamento com a resina reduziu o dano gástrico em ambos os modelos e
observaram que o efeito foi dose dependente. Do mesmo modo, em outro
estudo realizado por estes autores, ficou constatado que a mistura das α e β
amirinas possuem atividade gastroprotetora, sendo sugerido que essa
atividade envolva, pelo menos em parte, a ativação de neurônios aferentes
sensíveis para capsaicina.
De maneira geral, a erradicação do Helicobacter pylori é difícil de ser
atingida in vivo, mesmo para os compostos de uso tradicional que possuem
atividade antibacteriana comprovada in vitro para o Helicobacter pylori. Mesmo
assim, é necessária a determinação tanto da atividade in vitro quanto da
eficácia da substância in vivo quando são realizadas as avaliações
farmacológicas dos agentes antimicrobianos para o tratamento da infecção por
H. pylori. No presente estudo, a mistura de α e β amirinas não foi capaz de
erradicar a bactéria no estômago dos animais infectados, na dose
administrada, mesmo sendo administrada em animais tratados com inibidor de
bomba de prótons, simulando o que é utilizado clinicamente na terapia de
erradicação. Deve ser ressaltado, entretanto, que a substância não foi
administrada em conjunto com qualquer outro medicamento que apresentasse
atividade antimicrobiana, como os utilizados nas terapias tríplices de
tratamento. Foi observado, entretanto, que embora o ensaio utilizado não tenha
atingido o objetivo de erradicar ou reduzido à quantidade de H. pylori, a mistura
α e β amirinas apresentou redução do infiltrado de neutrofilos nos estômagos
dos camundongos infectados, outro indicativo de atividade gastroprotetora.
Alguns estudos também relataram à dificuldade de erradicação do
Helicobacter pylori em estudos in vivo, mesmo para substâncias com
comprovada
atividade
antimicrobiana in vitro,
quando analisados
em
separadamente (MERTENS et al.,1989; CHIBA et al., 1992,). OHNO e
colaboradores (2003), ao realizar os ensaios in vivo para avaliar a atividade
antimicrobiana do capim limão, observaram uma diminuição do número de
bactérias no estômago dos camundongos, sendo que o H. pylori só foi
completamente erradicado em um dos dez animais ensaiados.
YAN e colaboradores (2002), ao estudarem in vitro e in vivo a atividade
antibacteriana de uma formulação da erva Kampo HET, observaram que a
formulação administrada oralmente, na dose de 1000mg/Kg por 7 dias
anteriores a infecção por H. pylori, conseguiu reduzir a quantidade da bactéria
presente no estômago dos animais, sendo que, quando a mesma foi
administrada em combinação com amoxicilina ou claritromicina, simulando uma
terapia tripla associativa, conseguiu erradicar completamente a bactéria nos
camundongos.
MABE e colaboradores (2003) estudaram a atividade das catequinas in
vivo em gerbils previamente infectados, tendo observado que as catequinas
apresentaram atividade antibacteriana, porém com nível de erradicação menor
que o desejado, de 10 % a 36,4 %.
TOMINAGA e colaboradores (2002), ao estudarem a ação in vivo de
uma nova quinolona, observaram a diminuição significativa no número viável
do H. pylori nos estômagos de gerbils infectados, entretanto, não foi alcançada
a erradicação completa, mas evidenciando-se uma atividade antibacteriana
semelhante ou maior que a observada quando amoxicilina ou claritromicina
foram administradas como único tratamento.
Neste estudo, os animais foram tratados seis semanas após terem sido
infectados com a linhagem SS1 de Helicobacter pylori, sendo este o período de
tempo adequado para que os animais desenvolvessem gastrite associada com
a infecção. Os resultados de avaliação do efeito gastroprotetor neste modelo
apresentaram uma diminuição no número de lesões ulcerativas e, também,
uma diminuição da atividade mieloperoxidase, após o tratamento com a mistura
de amirinas.
Quanto à avaliação da atividade erradicadora foram utilizados dois
indicadores; o cultivo a partir de biópsias gástricas e a amplificação de uma
seqüência específica para a bactéria por PCR. Entretanto, com relação ao
primeiro indicador, não foi possível determinar se houve ou não uma
diminuição de células bacterianas viáveis, pois, apesar da utilização de meios
de cultura seletivos, ocorreram um grande número de contaminações por
outros microrganismos, que impediram a contagem de possíveis colônias de H.
pylori. Esta interferência pode estar relacionada com o hábito de coprofagia,
normalmente observado em camundongos.
Quanto ao segundo indicador de erradicação, ou seja, a quantificação do
DNA de H. pylori específico referente a 90 pb do gene HpNap por PCR em
tempo real, vários estudos sugerem a capacidade de esta técnica ser utilizada
para detectar e quantificar a presença de DNA de Helicobacter pylori nas
amostras das biopsias gástricas (MIKULA et al., 2003, OZPOLAT et al., 2000,
LASCOLS et al., 2003). MIKULA e colaboradores (2003) validaram este
método para a análise quantitativa de baixos níveis de infecção bacteriana em
camundongos imunizados e infectados experimentalmente, sugerindo que a
PCR em tempo real poderia ser de utilidade na avaliação de novas drogas antiH. pylori e vacinas. RIBEIRO e colaboradores, em comunicação pessoal,
observaram que a sensibilidade do ensaio de PCR em tempo real foi maior que
aquela obtida pelos métodos utilizados como rotina em laboratórios, como,
teste rápido de urease, cultivo a partir de biópsias e exame histológico de
biópsias coradas com hematoxilina-eosina ou Giemsa, comprovando o descrito
também pelos autores citados.
Entretanto, neste estudo, a aplicação desta técnica mostrou que não
ocorreram diferenças estatisticamente significativas entre os grupos tratados e
controle, evidenciando a presença de H. pylori ou, mais precisamente, de seu
DNA nos estômagos dos camundongos. Este resultado indica que, em ambos
os grupos, ainda estavam presentes as bactérias nos estômagos, entretanto,
não permite a diferenciação quanto à viabilidade ou não destas, pois podiam se
tratar de bactérias que adquiriram a forma cocóide, característica de ambientes
não adequados ao desenvolvimento do microrganismo, pois o período entre o
final do tratamento e o sacrifício dos camundongos, que foi de 24 horas,
permitiria esta possibilidade. Deve-se, ainda, ser destacado que muitos autores
relacionam a forma cocóide com a morte bacteriana, inclusive sendo
observadas estas formas quando a bactéria foi submetida ao cultivo com
amoxicilina in vitro (CELLINI et al. 1994; BERRY et al., 1995; COLE et al.,
1997; KUSTERS et al., 1997).
Estudos adicionais, portanto, serão necessários para ser avaliado se a
presença do DNA de Helicobacter pylori, após o tratamento, estaria relacionada
com a viabilidade das bactérias, ou não. Além disso, mesmo que estas
bactérias estivessem viáveis, estas substâncias poderiam apresentar atividade
anti-Helicobacter in vivo em combinações com os demais medicamentos
existentes, da mesma forma que o utilizado atualmente em terapias triplas,
onde se percebe um efeito positivo de sinergismo, com mecanismo ainda
desconhecido. Do mesmo modo, novas abordagens que incluíssem doses
maiores da mistura das α e β amirinas poderiam ser avaliadas, pois o efeito
esperado poderia ser dose-dependente e a toxicidade da substância é baixa,
não sendo detectada em ensaios realizados por OLIVEIRA e colaboradores
(2004) em doses de até 5 g/Kg de peso dos camundongos, não sendo possível
a determinação do valor da LD50. No presente estudo, a administração oral do
composto não provocou efeitos adversos in vivo, como diarréia, perda de
apetite, peso corporal ou incremento na mortalidade dos animais.
No presente estudo observamos a atividade anti-Helicobacter in vitro da
resina e da mistura de α e β amirinas provenientes de Protium heptaphyllum
March. Os resultados obtidos concordam com a literatura, sugerindo que
compostos de origem natural possam ser utilizados para o desenvolvimento de
novos medicamentos, de forma a agregar simultaneamente atividade antiHelicobacter e gastroproteção. A mistura de α e β amirinas estudada, além da
atividade anti-ulcerogênica in vivo e anti-Helicobacter in vitro apresentadas, foi
capaz de inibir o crescimento de cepas resistentes para os antimicrobianos
utilizados na terapêutica convencional, sugerindo que o mecanismo de ação
seja diferente daqueles conhecidos e, por isso, possa ser utilizada no futuro em
terapias auxiliares ao tratamento, especialmente nos casos de falência dos
esquemas propostos.
Para concluir, a mistura das α e β amirinas na dose utilizada, e não
combinada com outros antimicrobianos, através dos testes utilizados não
conseguiu verificar a erradicação ou a diminuição, de forma significativa, no
número de bactérias Helicobacter pylori no estômago de camundongos
previamente infectados, entretanto, foi observado um efeito terapêutico
gastroprotetor
microrganismo.
para
o
dano
da
mucosa
gástrica
induzido
por
este
Vll - CONCLUSÕES
1. A resina, o óleo essencial e a mistura de α e β amirinas de Protium
heptaphyllum March. apresentaram atividade anti-Helicobacter in vitro.
2. O óleo essencial de Protium heptaphyllum March apresentou atividade
anti-Helicobacter na concentração entre 1000 e 2000 µg/ml.
3. A resina e a mistura de α e β amirinas de Protium heptaphyllum March
apresentaram atividade anti-Helicobacter no intervalo de concentrações
de 100 - 160 µg/ml.
4. As pequenas variações observadas entre os valores mínimos inibitórios
e bactericidas sugerem que não ocorra o efeito de tolerância do H.pylori
para as substâncias avaliadas.
5. A atividade anti-Helicobacter da resina e da mistura de α e β amirinas
não foi alterada pelo pH ácido in vitro.
6. A mistura de α e β amirinas não erradicou nem diminuiu a quantidade
do Helicobacter pylori in vivo, nas doses e na estratégia utilizada.
7. A mistura de α e β amirinas diminuiu o índice das lesões ulcerativas
gástricas dos camundongos C57BL/6 infectados.
8. A mistura de α e β amirinas diminuiu a infiltração de neutrófilos nos
estômagos dos animais infectados.
9. A mistura de α e β amirinas administrada por via oral não apresentou
reações adversas, como diarréia, perda de peso, perda de apetite ou
mortalidade dos animais.
Vlll- BIBLIOGRAFIA
AL-ASSI MT, RAMIREZ FC, LEW GM, GENTA RM, GRAHAM DY.
Claritromycin, tetracicline and bismuth: a new non-metronidazole therapy for
Helicobacter pylori infection. Am J Gastroenterology, 1994, 89:1203-5.
ALI SM, KHAN A, AHMED I, MUSADDIQ M, AHMED K, POLASA H,
VENKATESWAR RAO L, HABIBULLAH C, SECHI L, AHMED N. Antimicrobial
activities of Eugenol and Cinnamaldehíde against the human gastric pathogen
Helicobacter pylori. Annals of Clinical Microbiology and Antimicrobials,
4:20, 2005.
ALM RA, TRUST TJ. Analysis of the genetic diversity of Helicobacter pylori: the
tale of two genomes. J. Mol. Med., 77(12):834-46,1999.
ATHERTON JC, PEEK RM, THAM KT, COVER TL, BLASER MJ. Clinical and
patologycal importance of heterogenicity in vac A, the vacuolating cytotoxin
gene of Helicobacter pylori. Gastroenterology, 112:92-99,1997
AXON ATR. Are all helicobacters equal? Mechanisms of gastroduodenal
pathology and their clinical implications. Gut 45, S1:11-14,1999.
BATISTA RS et al., Manual de Infectologia, 1 ed. Rio de Janeiro:
Revinter,317-8, 2003.
BERGONZELLI GE, DONNICOLA D, PORTA N, CORTHESY-THEULAZ E.
Essential oils as components of a diet- based approach to management of
Helicobacter infection.
Antimicrobial
Agents and Chemotherapy, 47
(10):3240-3246, 2003.
BERRY V, JENNINGS K, WOODNUTT G. Bactericidal and morphological
effects of amoxicillim on Helicobacter pylori. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 39 (8):1859-1861, 1995.
BLASER M, Helicobacter pylori and gastric disease. BMJ, 316:1507 -1510,
1998.
BLASER MJ, ATHERTON JC. Helicobacter pylori persistence: biology and
disease. J. Clinical Invest., 113(3):321-333, 2004.
BREUER T, GOODMAN KJ, MALATY HM, SUDHOP T, GRAHAM DY. How do
clinicians practicing in the US manage Helicobacter pylori infection. Am J
Gastroenterol 1998;93:553-6
BUCKLEY M, CULHANE A, DRUMMB, KEANE C, MORAN AP, O´CONNOR
HJ, COLLINS J, KELLEHER D, MCAVINCHEY D, SLOAN J, O´MORAIN C.
Guidelines
for
the
management
of
Helicobacter
pylori-related
upper
gastrointestinal diseases. Irish Helicobacter pylori Study Group.; Ir J Med Sci.,
165 Suppl 5:1-11,1996.
CANDELLI M, NISTA E, CARLONI E, PIGNATARO G, ZOCCO MA, CAZZATO
A, DI CAMPLI C, FINI L, GASBARRINI G, GASBARRINI A. Treatment of H.
pylori infection: A review. Current Medicinal Chemistry, 12: 375-384, 2005.
CASTRO FRANÇA S. Abordagens biotecnologicas para a obtenção de
substancias ativas. In: Farmacognosia : da Planta ao medicamento.7:123146, 2003.
CARVALHAES A, MAGALHAES AFN, CORDEIRO F ET AL. Terapêutica e
epidemiologia da infecção por “H. pylori”: recomendações do primeiro
seminário promovido pelo núcleo brasileiro para o estudo do “Helicobacter
pylori”. GED., 16:99-100, 1997.
CELLINI L, ALLOCATTI N, ANGELUCCI D, IEZZI T, DI CAMPLI E, MARZIO L,
DAINELLI B. Coccoid Helicobacter pylori not culturable in vitro reverts in mice.
Microbiol. Immunol., 38(11):843-850, 1994.
CHIBA N, HUNT RH. Drug therapy of Helicobacter pylori infection: a meta
analysis. In ; Scarpignato C, Bianchi-PorroG. Eds. Clinical Pharmacology and
therapy of Helicobacter pylori infection. Prog Basic Clin Pharmacol Vol. 111,
Basel Karger, 1999; 227-68
COLE SP, CIRILLO D, KAGNOFF MF, GUINEY DG, ECKMANN L. Coccoid
and spiral Helicobacter pylori differ in their abilities to adhere to gastric epithelial
cells and induce interleukin-8 secretion. Infect. Immun., 65(2):843-6, 1997.
COWAN MM. Plants products as antimicrobial agents. Clinical Microbiology
Reviews, 12(4):564-582, 1999.
De BOER WA, TYGAT NJ. Treatment of Helicobacter pylori infection. BMJ
2000; 320:31- 4.
DI STASI LC e colaboradores. Plantas medicinais: arte e ciência. Um guia de
estudo interdisciplinar. UNESP, 1996.
DUNN
BE,
COHEN
H,
BLASER
MJ.,
Helicobacter
pylori.
Clinical
Microbiologiology Reviews, 10(4):720-741, 1997.
DELTENRE M, DE KOSTER E. How come I’ve got it? (A review of Helicobacter
pylori transmission). Eur. J. Gastroenterol Hepatol., 12 (5): 479-82, 2000.
EATON KA, KRAKOWA S. Avirulent urease-deficient Helicobacter pylori
colonises gastric epithelial explants in vivo. Scand J Gastroenterol., 30:434437, 1995.
ECCLISSATO C, MARCHIORETTO MA, MENDONÇA S, GODOY AP,
GUERSONI RA, DEGUER M, PIOVESAN H, FERRAZ JG, PEDRAZZOLI J.
Increased primary resistance to recommended antibiotics negatively affects
Helicobacter pylori erradication. Helicobacter., 7 (1): 53-9,2002.
ELIZALDE JI, GOMEZ J, GINES A, LLACH J, PIQUE JM, BORDAS JM,
MARCO F, TERES J. Biopsy fórceps desinfection tecnique does not influence
Helicobacter pylori culture. Am. J. Gastroenterol., 93(9):1450-2, 1998.
ERGIN A, ARIKAN S. Comparison of microdiluition and disc diffusion methods
in assessing the in vitro activity of fluconazole and Melaleuca alternifolia (tree
tea) oil against vaginal candida isolates. J. Chemother., 14(5):465-72, 2002.
FERNANDEZ H. Genero Helicobacter . In: Microbiologia, TRABULSI LR et al.
SP, Atheneu, 3 ed.,263-267,1999.
FERRERO RL, FOX JG. In vivo modeling of Helicobacter – Associated
gastrointestinal diseases. In: Helicobacter pylori: Physiology and Genetics.
45:565-582, ASM Press, Washington DC, 2001.
FUNATOGAWA K, HAYASHI S, SHIMOURA H, YOSHIDA T , HATANO T, ITO
H, HIRAI Y. Antibacterial Activity of Hydrolysable Tannins Derived from
Medicinal Plants against Helicobacter pylori. Microbiol. Immunol., 48 (4), 251261, 2004.
GAMBERNINI MT, SKOURPA LA, SOUCCAR C, LAPA AJ. Inhibition of gstric
secretion by a water extract from Baccharis triptera Mart. Mem Inst. Oswaldo
Cruz, 86 (Supp. 2):137-139, 1991.
GLUPCZYNSKI Y, LABBE M, HANSEN W, CROKAERT F, YOURASSOWSKY
E. Evaluation of the E- test for Quantitative Antimicrobial Susceptibility testing of
Helicobacter pylori. Journal of Clinical Microbiology, 29 (9):2072-2075, 1991.
GO MF, KAPUR V, GRAHAM DY, MUSSER JM. Population genetic analysis of
Helicobacter pylori by multilocus enzyme electrophoresis: extensive allelic
diversity and recombinational population structure. J. Bacteriol., 178 (13):39348, 1996.
GO MF, VAKIL N. Helicobacter pylori infection. Clin Perspect Gastroenterol;
2:141-53, 1999.
GO MF. Review article: natural history and epidemiology of Helicobacter pylori
infection. Aliment Pharmacol Ther. , 16 (suppl. 1):3-15, 2002.
GRAHAM DY, DE BOER WA, TYTGAT GN. Choosing the best antihelicobacter
pylori
therapy:
effect
of
antimicrobial
resistance.
Am
J
Gastroenterol., 919(6):1072-6,1996.
GRAHAM DY. Editorial. Can therapy ever be denied for Helicobacter pylori
infection? Gastroenterology; 113:S4-S8, 1997.
GRAHAM DY, OSATO MS, HOFFMAN J, et al. Furazolidone combination
therapies for Helicobacter pylori infection in the United States. Aliment
Pharmacol Ther; 14:211-5, 2000.
GRAHAM DY, YAMAOKA Y. Disease-specific helicobacter pylori virulence
factors: the unfulfilled promise. Helicobacter, n S3-9;discus.S27-31, Suppl.1,
2000.
GRAHAM DY. Therapy of helicobacter pylori: current status and issues.
Gastroenterology, 118: S2-S8, 2000.
GUERRITS
MM,
SCHUIJFFEL
D,
VAN
ZWET
AA,
KUIPERS
EJ,
VANDENBROUCKE- GRAULS CM, KUSTERS JG. Alterations in penincilinbinding protein 1ª confer resistance to beta-lactam antibiotics in Helicobacter
pylori. Antimicrob Agents Chemother.; 46 (7): 2229-33, 2002.
GULIETTI A, OVERBERG L, VALCKX D, DECALLONE E, BOUILLON R,
MATHIEU C. An over view of real- time quantitative PCR: Applications to
quantify cytokine gene expression. Methods, 25:386-401, 2001.
HACHEM CY, CLARRIDGE JE, REDDY R, FLAMM R, EVANS DG, TANAKA
SK, GRAHAM DY. Antimicrobial susceptibility testing of Helicobacter pylori.
Comparison of E- test, broth microdilution, and disk diffusion for ampicillin,
clarithromycin, and metronidazole. Diagn. Microbial. Infect. Dis., 24 (1):37-41,
1996.
HANCOCK RE, ALM R, BINA J, TRUST T. Helicobacter pylori : a surprisingly
conserved bacterium. Nat. Biotechnol., 16 (3):216-7,1998.
HARTZEN SH, ANDERSEN LP, BREMMELGAARD A, COLDING H, et al.
Antimicrobial susceptibility testing of 230 Helicobacter pylori strins: Importance
of medium, inoculum, and incubation time. Antimicrob Agents Chemother.,
41:2634-9, 1997.
HARRIS A. Current regimens for treatment of Helicobacter pylori. Br Med Bull.,
54:195-205, 1998.
HEATLEY, RV. The Helicobacter pylori handbook. 1 Ed. Osney Mead:
Blackwell Science,1995.
HOSTETTMANN K, QUEIROZ EF, VIEIRA PC. Principios ativos de plantas
superiores. São Carlos: UFSCar, 4v, 2003.
International Agency for research on Cancer, World Health organization.
Infection with Helicobacter pylori. In: Schistosomes, liver
flukes and
Helicobacter pylori. LYON:IARC.,177-202,1994.
ITO Y, AZUMA T, ITO S, SUTO H, MIYAJI H, YAMAZAKI Y, KATO T, KOHLI Y,
KEIDA Y and KURIYAMA M. Sequence analysis and clinical significance of ice
A gene from Helicobacter pylori strains in Japan. J. Clin. Microbiol., 38:483488, 2000.
JONES N, SHABIB S, SHERMAN P. Capsaicin as an inibitor of the growth of
the gastric pathogen Helicobacter pylori. FEMS Microbiology Letters,
146:223-227, 1997.
KELLY SM, PITCHER MC, FARMERY SM, GIBSON GR. Isolation of
Helicobacter pylori from feces of patients with dyspepsia in the United Kingdom.
Gastroenterol., 107 (6):1671-4, 1994.
KUSTERS J, GERRITS M, VAN STRIPJ A, VANDENBROUCKE- GRAULS C.
Coccoid forms of Helicobacter pylori are the morphologic manifestation of cell
death. Infection and Inmunity, 65(9): 3672-3679, 1997.
LAHEIJ RJF, VAN ROSSUM LGM, JANSEM JBMJ, STRAATMAN H,
VERBEEK ALM. Evaluation of treatment regimens to cure Helicobacter pylori
infection, a meta-analysis. Aliment Pharmacol Ther. ; 113:S99-S106, 1999.
LASCOLS C, LAMARQUE D, COSTA JM, BERGMAN C, LE GLAUNEC JM,
DEFORGES L, SOUSSY CJ, PETIT JC, DELCHIER JC, TANKOVIC J. Fast
andaccurate quantitative detection of helicobacter pylori and identification of
claritromycin resistance mutations in H. pylori isolates from gastric biopsy
specimens by real - time PCR. Journal of Clinical Microbiology, 41
(10):4573-4577, 2003.
LEE A, FOX J, HAZELL S. Pathogenicity of Helicobacter pylori: a Perspective.
Infection and Immunity, 61 (5):1601-1610, 1993.
LEE A, O´ROURKE J, UNGRIA MC, ROBERTSON B, DASKALOPOULOS G,
DIXON M. A standarized mouse model of Helicobacter pylori infection:
introducing the Sidney Strain. Gastroenterology, 112(4); 1386-1397, 1997.
LIMA JUNIOR R, OLIVEIRA F, GURGEL L, CALVACANTE I, SANTOS K,
CAMPOS D. VALE C, SILVA R, CHAVES M, RAO V, SANTOS F.Attenuattion
of visceral nociception of α e β amirin a triterpenoid misture, isolated from the
resin of protium heptaphyllum, in mice. Planta Med., 2006.
LOPES CITÓ AMG, SOUZA A, DANTAS LOPES J, CHAVES M, COSTA F,
ALVES DE SOUZA S, MOURA DE AMARAL M. Resina de Protium
heptaphyllum March (Burceraceae): Composição Química do óleo essencial e
avaliação citotóxica frente à Artemia salina leach. Anais Assoc. Brás. Quim,
52 (2): 74-76, 2003.
LUZZA F, MALETTA M, IMENEO M, MARCHEGGIANO A, IANNONI C,
BIANCONE L, PALLONE F. Salivary-specific inmunoglobulin G in the diagnosis
of Helicobacter pylori infection in dyspeptic patients. Am. J. Gastroenterol.,
90(10): 1820-3, 1995.
MABE K, YAMADA M, OGUNI I, TAKAHASHI T. In vitro and in vivo activities of
tea catechins against Helicobacter pylori. Antimicrob. Agents Chemother.,
43(7):1788-91, 1999.
MAIA RM, BARBOSA PR, CRUZ FG, ROQUE NR, FASCIO M. Triterpenos da
resina de Protium heptaphyllum March (Burseraceae): caracterização em
misturas binárias. Química Nova, 23(5): 623-626, 2000.
MARAIS A, MONTEIRO L, MEGRAUD F. Microbiology of Helicobacter pylori.
Curr. Top. Microbiol. Immunol., 241:103-22, 1999.
MARCHETTI M, ARICÓ B, BURRONI D, FIGURA N, RAPPUOLI R, GHIARA P.
Development of mouse model of Helicobacter pylori infection that mimics
human disease. Science, 267:1655-1658, 1995.
MARSHALL BJ, WARREN JR. Unidentified curved bacilli in the stomach of
patients with gastritis and peptic ulceration. Lancet 1:1311- 4, 1984.
MARSHALL BJ, DUNDON WG, BEESLEY SM, SMYTH CJ. HELICOBACTER
PYLORI: A CONUNDRUM OF GENETIC DIVERSITY. Microbiology 144:2925-
39, 1998.
MATTOS RG, ECCLISSATO CC, MENDONÇA S, RIBEIRO ML, PEDRAZZOLI
Jr. J. Application of quantitative real- time PCR approach for Helicobacter pylori
detection. (In Press), 2006.
MCGOWAN CC, COVER T, BLASER MJ. Helicobacter pylori and gastric
acid:biological and therapeutic implications. Gastroenterology, 110:926-38,
1996.
MEGRAUD F. Resistance of Helicobacter pylori to antibiotics. Aliment.
Pharmacol. Ther., 11(1):43-53, 1997.
MEGRAUD F. Epidemiology and mechanism of antibiotic resistance in
Helicobacter pylori. Gastroenterology, 115(5): 1278-82, 1998.
MENDONÇA S, ECCLISATTO C, SARTORI MS, GOSDOY APO, GUERZONI
RA, DEGGER M, PEDRAZZOLLI JJ. Prevalence of Helicobacter pylori
resistance to metronidazole,
claritromycin,
amoxicillin,
tetracycline
and
furazolidone in Brazil. Helicobacter, 5:79-83, 2000.
MIKULA M, DZWONEK, JAGUSZTYN- KRYNICKA K, OSTROWOSKY J.
Quantitative detection for low levels of Helicobacter pylori infection in
experimentally infected mice by real-time PCR. Journal of Microbiological
Methods, 55:351-359, 2003.
MITCHELL HM, LI YY, HU PJ, LIU Q, CHEN M, DU GG, WANG ZJ, LEE a,
HAZELL SL. Epidemiology of Helicobacter pylori in southern China:
Identification of early childhood as the critical period for adquisition. J. Infect.
Dis., 166(1):149-153, 1992.
MITCHELL HM. The epidemiology of Helicobacter pylori. Curr. Top. Microbiol.
Immunol., 241:11-30, 1999.
MITCHELL HM. Epidemiology of infection In: Helicobacter pylori: Physiology
and Genetics. 2:7-18, ASM Press, Washington DC, 2001.
MURRAY
RP,
ROSENTHAL
SK,
KOBAYASKI
SG,
PFALLER
AM.
Microbiologia Médica. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p 212-214,
2000.
NARIMAN F, EFTEKAR F, HABIBI Z, FALSAFI T. Anti-Helicobacter pylori
activities of six Iranian plants. Helicobacter, 9 (2):146-151, 2004.
NOTARNICOLA M, LINSALATA M, CARUSO MG, CAVALLINI A, DI LEO A.
Low density lipoprotein receptors and polyamine levels in human colorectal
adenocarcinoma. Gastroenterol., 30(6):705-9,1995.
OHNO T, KITA M, YAMAOKA Y, IMAMURA S, YAMAMOTO T, MITSUFUJI S,
KODAMA T, KASHIMA K, IMANISHI J. Antimicrobial activity of essentiasl oils
against Helicobacter pylori. Helicobacter, 8 (3):207-215, 2003.
OLIVEIRA F, AKISUE G, AKISUE MK. Farmacognosia. Atheneu: São Paulo,127, 1991.
OLIVEIRA AM, QUEIROZ DM, ROCHA GA, MENDES EN. Seroprevalence of
Helicobacter pylori infection in children of low socioeconomic level in Belo
Horizonte, Brazil. Am. J. Gastroenterol., 89 (12):2201- 4, 1994.
OLIVEIRA AM, ROCHA GA, QUEIROZ DM, DE MOURA SB, RABELLO AL.
Seroconversion for Helicobacter pylori in adults from Brazil. Trans. R. Soc.
Trop. Méd. Hyg., 93 (3):261-3, 1999.
OLIVEIRA F, GOKITI A. Fundamnetos de Fármacobotánica. 2 ed., Atheneu:
São Paulo,157-162, 2000.
OLIVEIRA FA, VIEIRA-JUNIOR G, CHAVES M, ALMEIDA F, SANTOS K,
MARTINS F, SILVA R, SANTOS F, RAO V. Gastroprotective effect of the
mixture of α e β amirin from Protium heptaphyllum: Role of capsaicin-sensitive
primary afferent neurons. Planta Med., 70:1-3, 2004a.
OLIVEIRA F, VIEIRA-JUNIOR G, CHAVES M, ALMEIDA F, FLORENCIO M,
LIMA-Jr R, SILVA R, SANTOS F, RAO V. Gastroprotective and antiinflamatory
effects of resin from Protium heptaphyllum in mice and rats. Pharmacological
Research, 49:105 -111, 2004b.
OLIVEIRA F, CHAVES M, ALMEIDA F, LIMA Jr R, SILVA R, MAIA J, BRITO G,
SANTOS F, RAO V. Protective effect of α e β amirin, a triterpene mixture from
Protium heptaphyllum (Aubl) March. Trunk wood resin, against acetaminophen-
induced liver injury in mice. Journal of Ethnopharmacology 98:103-108,
2005.
OZPOLAT B, ACTOR J, MEI RAO X, LEE S, OSATO M, GRAHAM DY,
LACHMAN L. Quantitation of Helicobacter pylori in the stomach using
Quantitative Polymerase Chain Reaction Assays. Helicobacter 5 (1):13 -21,
2000.
PAJARES JM. Helicobacter pylori infection: its role in chronic gastritis,
carcinoma and peptic ulcer. Hepato- Gastroenterol., 42:827- 41, 1995.
PENTSON JG.Review article:clinical aspects of Helicobacter pylori eradication
therapy in pectic ulcer disease. Aliment. Pharmacol. Ther ., 10:469-86, 1996.
PEREZ-PEREZ G, ROTHENBACHER D, BRENNER H. Epidemeology of
Helicobacter pylori Infection. Helicobacter, 9, supplement 1:1-6, 2004.
PETERSON WL, GRAHAM DY. Helicobacter pylori. In: Gastointestinal and
Liver disease, p.604-619, 6th ed., 1998, WB Saunders Co., Philadeiphia,
Pennsylvania, USA.
QUEIROZ DMM, MENDES EN, ROCHA GA. Indicator médium for isolation of
Campylobacter pylori. J. Clin. Microbiol. 25:2378-9, 1987.
RAUTELIN H, LEHOURS P, MEGRAUD F. Diagnosis of Helicobacter pylori
Infection. Helicobacter ,8, suppl. 1: 13-20, 2003.
SCHENCKEL EP, GOSMANN G, PETROVICK PR. Produtos de origem vegetal
e o desenvolvimento de medicamentos In: Farmacognosia : da Planta ao
medicamento.15:372-400, 2003.
SHIBATA K, ITO Y, HONGO A, YASOSHIMA A, ENDO T, OHASHI M.
Bactericidal activity of a New Antiulcer agent, Ecabet sodium, against
Helicobacter pylori, under acidic conditions. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 39(6):1295-1299, 1995.
SIANNI AC, RAMOS MFS, LIMA Jr. O, RIBEIRO DOS SANTOS R,
FERNANDEZ EF, SOARES ROA, ROSAS EC, SUSUNAGA GS, GUIMARAES
AC, ZOGHBI MGB, HENRIQUES MGM. Evaluation of the antiinflamatoryrelated activity of essential oils from leaves and resin of species of Protium. J.
of Ethnopharmacology, 66:57-69, 1999.
SIMÔES CMO, SCHENKEL EP, GOSMANN G, MELLO JCP, MENTZ LA.,
PETROVICK PR. Farmacognosia: da planta ao medicamento. Editora
UFSC, Florianópolis SC, 2003. 821 p.
SOUTO FJ, FONTES CJ, ROCHA GA, DE OLIVEIRA AM, MENDES EN,
QUEIROZ DM. Prevalence of Helicobacter pylori infection in a rural área of the
state of Mato Grosso, Brazil. Mem. Inst. Oswaldo Cruz., 93 (2);171-4, 1998.
SPIEGELHALDER C, GERSTENECKER B, KERSTEN A, SCHILTZ E, KIST
M.Purification of Helicobacter pylori superoxie dismutase and cloning ans
sequence of gene. Infect. and Immunity, 61 (12):5315-5325, 1993.
The Maastrich consensus report. Current European concepts in the
management of Helicobacter pylori infection. Gut.;41:8-13, 1997.
THOMAZ JE, GIBSON GR, DARBOE MK, DALE A, MEAVER LT. Isolation of
Helicobacter pylori from humam faeces. Lancet, 14,340 (8829):1194-5, 1992.
THOMAS JE, PETROLANI S. Epidemiology of infection in the year of
Helicobacter pylori 1994. The European Helicobacter pylori Study Group, 6-
11, 1994.
TOMB JF, WHITE O, KERLAVAGE A, et al., The complete genome sequence
of thew gastric pathogen Helicobacter pylori. Nature, 388: 539-47, 1997.
TOMINAGA K, HIGUCHI K, HAMASAKI N, HAMAGUCHI M, TAKASHIMA,
TANIGAWA T, WATANABE T, FUJIWARA Y, TEZUKA Y, NAGAOKA T,
KADOTA S, ISHII E, KOBAYASHI K, ARAKAWA T. In vivo action of novel alkyl
methyl alkaloids against Helicobacter pylori. Journal of Antimicrobial
Chemotherapy, 50:547-552, 2002.
TRABULSI LR, ALTHERTHUM F. Microbiologia, 4ta ed. São Paulo: Atheneu,
353-8, 2004.
VAN DOORN LJ, QUINT W, SCHEEBERGER P, TYTGAT GM, DE BOER WA.
The only good Helicobacter pylori is a dead Helicobacter pylori. Lancet, 5; 350
(9070):71-5, 1997.
VAN DOORN LJ, FIGUEREIDO C, SANNA R, BLASER MJ, QUINT WG.
Distinct variants of Helicobacter pylori cagA are associated with vacA subtypes.
J. Clin. Microbiol., 37(7): 2306-11, 1999.
VAN DOORN N, NAMAVAR F, SPARRIUS M, STOOF J, VAN REES, VAN
DOORN LJ, VANDENBROUCKE-GRAULS C. Helicobacter pylori associated
gastritis in mice is host and strain specific. Infection and Immunity, 67
(6):3040-3045, 1999.
VAN DOORM LJ, SCHNEEBERGER PM, NOUHAM N, PLAISIER A, QUINT W,
BOER W. Importance of Helicobacter pylori cagA and vacA status for the
efficacy of antibiotic treatment. Gut, 46:321-326, 2000.
VAROLI O, LANDINI MO, LAPLACA M, TUCCI A, CORINALDESI R, PAPARO
GF, STANGHELLINI V, BARBARA L. Presence of Helicobacter pylori in gastric
juice. Am. J. Gastroenterol., 86 (2): 249, 1991.
WESTBLOM TU. Molecular diagnosis of Helicobacter pylori. Immunol. Invest.,
26(1-2): 163-74, 1997.
XIA H, KEANE CT, BEATTIE S, O´MORAIN CA. Standardization of diffusion
test and its clinical significance for susceptibility testing of metronidazole against
Helicobacter pylori. Antimicrobial Agents Chemother., 38(10):804-11,1999.
XIAO SD, SHI T. Is cranberry juice effective in the treatment and prevention of
Helicobacter pylori infection of mice? Chinese Journal of Digestive Disease,
4:136-139, 2003.
YAMAOKA Y, KODAMA T, KITA M, IMANISHI J, KASHIMA K, GRAHAM DY.
Relation between clinical presentation, Helicobacter pylori density, interleukin 1
beta and 8 production, and cagA status. Gut , 45 (6):804-11,1999.
YAN X, KITA M, MINAMI M, YAMAMOTO T, KURIYAMA H, OHNO T,
IWAKURA Y, IMANISHI J. Antibacterial effect of Kampo herbal formulation
Hochu-Ekki-to (Bu-Zhong-Yi-Qi-Tang) on Helicobacter pylori infection in mice.
Microbiol. Immunol., 46(7):475-482, 2002.
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