Anais do XX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do V Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
22 e 23 de setembro de 2015
CÓDIGO DE BARRA DE DNA NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES DE CUPINS
COABITANTES DE NINHOS EPÍGEOS
Amanda Ferreira David
Faculdade de Ciências Biológicas
Centro de Ciências da Vida
[email protected]
Resumo: A importância dos cupins na aeração e
ciclagem de nutrientes do solo é bem conhecida, no
entanto, pouco se sabe sobre os hábitos e interações entre espécies que coabitam ninhos
epígeos. Assim, este trabalho teve por objetivo identificar através do código de barra de DNA as espécies que coabitam termiteiros epígeos em áreas
de pastagem. A hipótese deste trabalho é que dados moleculares das espécies de cupins brasileiros,
em especial os que coabitam ninhos epígeos, não
estão representados no GenBank (NCBI).
Os
cupins foram coletados em 24 ninhos e identificados
através de chaves taxonômicas, e sete deles confirmados com dados moleculares (gene mitocondrial
da citocromo oxidase subunidade I, gene coI). DNA
das amostras de cupins foi extraído e o gene coI foi
amplificado por PCR e, posteriormente, sequenciado para comparação com o GenBank. Foram
encontrados cupins representantes de duas
famílias, três subfamílias e onze gêneros. Com base
nos dados moleculares, apenas duas amostras,
Procornitermes araujoi e Silvestritermes holmgreni,
já haviam sido depositadas no GenBank e puderam
ser confirmadas com 98% e 99% de similaridade,
respectivamente. Cinco amostras só tiveram a confirmação da subfamília ou do gênero, uma vez que
estamos descrevendo pela primeira vez a sequência
de seus genes coI e não encontramos no banco
nenhuma amostra similar, confirmando nossa
hipótese. Curiosamente, uma de nossas amostras
identificadas por taxonomia clássica como S.
euamignathus apresentou 99% de identidade com
S. holmgreni indicando a possibilidade de se tratar
de uma mesma espécie. Estudos estão sendo conduzidos para revisar a taxonomia dessas duas espécies.
Palavras-chave: térmita; taxonomia molecular; cupim
Edmilson Ricardo Gonçalves
Grupo de Pesquisa: Ecologia, Biologia Molecular e Filogenia de cupins e formigas
Centro de Ciências da vida
[email protected]
Área do Conhecimento: Ciências Biológicas – Biologia Molecular
1. INTRODUÇÃO
Segundo a taxonomia, térmitas são classificados na Classe Insecta, Ordem Isoptera. Possuem
nove Famílias: Archotermopsidae, Hodotermitidae,
Kalotermitidae, Mastotermitidae, Rhinotermitidae,
Serritermitidae, Stolotermitidae, Stylotermitidae e
Termitidae. Somente a Família Termitidae possui
divisão em Subfamílias, o restante é classificado
diretamente em gêneros e espécies. Existem aproximadamente 2882 espécies de cupins distribuídas
principalmente nas regiões zoogeográficas neártica,
neotropical e australiana [1]. Destas espécies, mais
de 200 são encontradas no Brasil [2].
Cupins são um dos insetos em maior quantidade no mundo sendo classificados como insetos
sociais, os quais, juntamente com a Ordem Hymenoptera (formigas, vespas e abelhas), possuem uma
organização social, contribuindo para seu sucesso
evolutivo. A divisão da organização social recebe o
nome de castas e, nos cupins, há quatro: operários
e soldados (ambos os sexos, inférteis), rei e rainha
(férteis). Existe apenas uma rainha na colônia e ela
é responsável pela reprodução no ninho inteiro. [3].
Há também a família Apicotermitinae que é caracterizada por não possuir a casta dos soldados, por
isso é vantajosa a coabitação com espécies que
possuam soldados que possam proteger ambas
espécies [4]. Os soldados, responsáveis pela
proteção do ninho, normalmente são maiores que
os operários e com mandíbulas reforçadas. Os
operários são responsáveis pelas tarefas a mais
que restam, como o cuidado dos ovos, reconstrução
do ninho após um ataque de predador e busca de
alimento para a colônia. O rei e a rainha são responsáveis pela reprodução e consequente reposição de indivíduos na colônia. A rainha é quem
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define a casta de cada ninfa por meio de seus
ferormônios [4].
Sua importância ecológica está, principalmente,
na ciclagem de biomassa (que corresponde a maior
quantidade) nos locais em que são encontrados. O
papel na manutenção do Cerrado brasileiro é de
extrema importância, já que é o meio de sobrevivência de muitas espécies que habitam este
bioma. A construção de galerias ajuda na ciclagem
de nutrientes e possibilita, em algumas espécies, o
acesso a fungos, além de realizar papel semelhante
ao das minhocas na aeração do solo [4].
O sistema de código de barra vem sendo usado
há onze anos e revolucionou a catalogação de espécies em todo o mundo [5]. Porém, há uma
deficiência de sequências depositadas no banco de
dados utilizado (Blatsn, do NCBI) quando se trata de
térmitas.
Estudos permitiram concluir que o uso da taxonomia molecular auxilia e complementa a taxonomia
clássica e outros tipos de identificação, como o
cariótipo [6]. Para a identificação, o gene mitocondrial citocromo oxidase subunidade I é utilizado em
vários estudos como padrão de vários Filos, entre
eles, o Arthropoda [7].
2. Material e Métodos
2.1 Coleta e armazenamento das amostras de
cupim
As coletas dos cupins foram previamente
realizadas por alunos de Iniciação Científica em projetos passados. As amostras foram identificadas em
vidrarias com o número do ninho e em que região
foi encontrado. Os cupins foram mantidos em álcool
80% no freezer para conservação do tecido até que
fosse realizada a extração de DNA. Os cupins que
foram selecionados seguiram o critério de que provavelmente sua sequência não estaria depositada
no banco de dados. A região de Campinas/SP foi
escolhida para o estudo e os locais de coleta foram
georreferenciados a fim de estabelecer um panorama da distribuição dessas espécies (figura 1).
Figura 1. Localização geográfica da região em
que os cupins foram coletados.
2.2.
Extração e purificação de DNA
A extração de DNA foi realizada a partir do
tecido macerado de um único cupim em tubo de
microcentrífuga na presença de tampão de extração
[8]: 10 mM de Tris HCl (pH 7,5), 100 mM de EDTA,
0.6% de SDS, 400 mM de NaCl e 60 µg de Proteinase K. Depois de homogeneizado o tecido do inseto
em tampão de extração, a solução foi incubada em
banho-maria a 55ºC durante 8 horas e transferidas
para o freezer até o momento de purificar o DNA. A
purificação do DNA foi realizada com o kit GE
Healthcare illustra™ tissue & cells genomicPrep
Mini Spin, de acordo com as especificações do Fabricante (General Electric Company, 2007).
2.3.
Amplificação do gene coI e sequenciamento de DNA
O gene mitocondrial COI (Citocromo oxidase, subunidade I) de cupins foi obtido por
amplificação com o método de PCR (Polymerase
Chain Reaction) utilizando primers conforme
quadro I.
As condições para amplificações na utilização de todos os primers (COIR e COIL, HCO e
LCO, LepR1 e LepF1) foram realizadas em volume
final de 25µL e colocadas em tubo coletor de 0,5mL,
sendo esse volume composto por 2,5µL de tampão
10x, 18,4µL de água para PCR, 1µL de MgCl2 a
25mM, 1µL de DNA da amostra (aproximadamente
20ng), 1µL de dNTP 5mM, 0,3µL dos primers já citados anteriormente, todos com concentração final
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de 2,0pmoles cada, e, por fim, a adição de 0,5µL de
taq polimerase (5 unidades por microlitro). As condições de amplificação foram: um ciclo de dois
minutos a 94ºC; cinco repetições de ciclos a quarenta segundos a 94ºC, quarenta segundos a 45ºC e
um minuto a 72ºC; trinta e seis ciclos de quarenta
segundos a 94ºC, quarenta segundos a 53ºC e um
minuto a 72ºC; e por fim um único ciclo de cinco
minutos a 72ºC. Esse protocolo foi determinado como padrão para todos os primers por unificar todos
os protocolos em um só, economizando tempo..
cado, e purificados de acordo com o protocolo do kit
Quadro I – Sequência dos primers para amplificação
por PCR dos genes mitocondriais coI (Citocromo
Oxidase subunidade I).
condições utilizadas foram determinadas acordo
GE Healthcare illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel
Band Purification Kit. Algumas amostras foram
tratadas com ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup,
fabricado pela Affymetrix®, o qual prepara o DNA
para sequenciamento sem o processo de purificação pelo kit, mas remove os primers e nucleotídeos inutilizados da amostra, preservando-a. As
com as especificações do fabricante Affymetrix®.
Após as purificações de fragmento, o DNA foi quan-
Gene
COI
COI
COI
COI
COI
COI
Sendo:
Primer Sequências
Fonte
5' ATA CCT CGA
HCO
CGW TAT TCA
[9]
GA 3'
5' GGT CAA CAA
LCO
ATC ATA AAG
[9]
ATA TTG G 3'
5’ ACT TSA GGG
CO1R
[7]
TGY CCR AAG 3’
5’ ACW AAY CAY
CO1L AAR GAY ATT GG
[7]
3’
5’ ATT CAA CCA
LepF
ATC ATA AAG
[10]
ATA TTG G 3’
5’ TAA ACT TCT
LepR
GGA TGT CCA
[10]
AAA AAT CA 3’
W = T ou A; Y = T ou C; S = C ou G; R = G ou A
Os resultados das amostras foram corados
com BlueGreen de acordo com as especificações
de fabricante (LGC Biotecnologia) e submetidos a
eletroforese em gel de agarose com tampão T.A.E.
1x (Tris-Acetato-EDTA). Inicialmente, é aplicada
uma corrente de 50V por 15 minutos para que o
DNA entre no gel uniformemente, depois disso a
corrente é aumentada para 100V por mais 15 minu-
tificado em aparelho nanovue (GE Healthcare) ou
por comparação com amostras conhecidas em gel
de agarose. Amostras de DNA entre 10 a 20ng/µL
foram enviadas para sequenciamento pelo método
de Sanger no laboratório LACTAD (UNICAMP). As
amostras foram sequenciadas pelo menos duas
vezes, tanto a fita reversa quanto a direta, para uma
análise final mais precisa.
2.4. Análise das sequencias de DNA
Os resultados do sequenciamento foram analisados com o Software Sequence Scanner, versão
1.0 (Affymetrix) para verificar a qualidade das leituras da sequência do DNA. Para o alinhamento de
ambas as sequências (direta e reversa) e como resultado obter uma única sequência final, foi utilizado
o software Geneious 6.0 e essa sequência foi comparada com sequências depositadas no banco de
dados
GenBank
com
o
software
(www.ncbi.gov).
tos para que os fragmentos de DNA fiquem organizados separadamente. Os produtos de amplificação
3. Resultados e discussão
bem-sucedidos foram extraídos do gel de agarose,
isolando o fragmento que contenha o DNA amplifi-
3.1. Amostras de cupins
BLASTn
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Após identificação por taxonomia clássica (dados da Professora Luciane Kern Junqueira), foram selecionadas amostras representando diferentes grupos taxonomicos, sendo que as espécies só eram repetidas quando
coletadas de áreas diferentes da região de
Campinas, dentre elas, o aeroporto de Viracopos e Souzas. No total foram escolhidas 24 espécies coabitantes, todas de cupins construtores de ninhos em pastagens. A maioria das
amostras estava em bom estado de conservação, porém, algumas amostras não obtiveram sucesso na amplificação por PCR. Para
esse problema, foram escolhidas outras
amostras da mesma espécie e da mesma área.
3.2. Extração de DNA e amplificação por PCR
As extrações de DNA foram efetuadas de
acordo com o protocolo descrito em literatura [8] e
as purificações foram realizadas com o kit GE
Healthcare illustra™ tissue & cells genomicPrep
Mini Spin, de acordo com as especificações do Fabricante (General Electric Company, 2007).
As amplificações necessitaram de ajustes
de condições nas concentrações e quantidades dos
reagentes desde o começo do projeto até serem
adequadas para que os três tipos de primers amplificassem o maior número possível de amostras.
Também foi utilizado um programa com condições
padrões para todos os primers (Quadro II).
3.3. Sequenciamento de DNA e comparação com
o banco de dados.
Das 24 amostras trabalhadas, apenas 5 obtiveram sucesso no sequenciamento de ambos os
lados do DNA (reverso e direto). Algumas amostras
obtiveram a sequência completa de um lado
apenas, porém, não apresentavam resultado satisfatório na sequência que compõe o outro lado, necessitando, portanto, de novas reações de sequenciamento.
Dentre as amostras sequenciadas com
sucesso para as duas fitas, todas são da Família
Termitidae, sendo que apenas uma espécie (Orthognathotermes mirin) pertence à subfamília Ter-
mitinae. As outras 4 espécies (Rynchotermes nasutissimus,
Silvestriermes
euamignathus,
Procornitermes araujoi e Cyrilliotermes strictinasus) são
da subfamília Syntermitinae, já relatada como uma
subfamília com poucos representantes em comparação com outras subfamílias, como por exemplo
Nasutitermitinae e Termitinae [1].
A sequência completa e corrigida, chamada
de contig, foi colocada no site do NCBI para comparação com outras sequências já contidas no banco de dados. Os resultados do BLASTn (NCBI)
estão representados no Quadro 3.
Quadro 3. Classificação por taxonomia clássica
e molecular e grau de similaridade com espécies
descritas no GenBank.
Amostra
taxonomia clás-
Taxonomia molecular de
sica
acordo com GenBank e
grau de similaridade
CH165
CH171
Orthognathitermes
Orthognathotermes
mirin
tus, 90%
adunc-
Rynchotermes
Cornitermes cumulans, 87%
nasutissimus
CH194
CH215
Silvestritermes
Silvestritermes
holmgreni,
euamignathus
98%
Procornitermes
Procornitermes araujoi, 99%
araujoi
CH298
Cyrilliotermes
Embiratermes
strictinasus
97%
neotenicus,
De acordo com a literatura científica, apesar da
porcentagem de similaridade entre as sequências ser
alta em todos os casos (Quadro 3), só podemos
assumir que seja a mesma espécie depositada no
banco quando o valor de similaridade estiver entre 98 e
99% [11]. No caso da espécie P. araujoi, podemos
constatar que se trata da mesma espécie por obter
99% de similaridade no banco de dados. Já as outras
espécies não podemos assumir que seja a mesma
espécie, pois valores abaixo de 98% indicam que
sejam do mesmo gênero, subfamília ou família.
No caso da amostra CH194, identificada por
taxonomia clássica como Silvestritermes euamignathusi
e confirmado por comparação com a coleção de
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térmitas no museu da USP, a taxonomia molecular
apresentou dados divegentes. De acordo com os dados
moleculares, a amostra CH194 seria Silvestritermes
holmgreni e não s. Euamignatus. De acordo com o
curador do museu da USP essas duas espécies
apresentam como única diferença a localização do
ninho, sendo que S. Euamignatus constrói ninhos no
solo enquanto S. Holmgreni constrói ninho arborícola.
Segundo os especialistas em cupins desse museu, tais
dados ainda necessitam de melhores estudos. Para
verificar se realmente são duas espécies diferentes, o
pesquisador do museu da USP, que também é o
curador da coleção, nos cedeu algumas amostras para
que pudéssemos sequenciar e concluir se são duas ou
apenas uma espécie com hábitos diferentes a partir da
taxonomia molecular.
Foram realizados sequenciamentos com o
gene coI e com o espaçador de genes ribossomais ITS.
Os dados com a região ITS (cerca de 600 pares de
bases) revelaram 99,8% de similaridade entre as
espécies S. Euamigantus e S. Holmgreni indicando
tratar-se de uma mesma espécie. Novos estudos,
envolvendo novas amostras, serão conduzidos para
comprovar esses dados e clarear a taxonomia desses
grupos.
Os resultados encontrados confirmaram
nossa hipótese inicial de que poucas amostras brasileiras encontram-se depositadas no GenBank e a necessidade de novos trabalhos descrevendo sequencias de
DNA de cupins da nossa fauna, permitindo a identificação dos térmitas de maneira precisa. Os resultados
também apontaram erros na classificação atual envolvendo o gênero Silvestritermes, onde hoje as espécies
S. Euamigantus e S. Holmgreni, tidas como duas
espécies diferentes, tratam-se, provavelmente de uma
única espécie.
5. REFERÊNCIAS
[1] Constantino, R. Termite Catalog. 1998. Disponível
em: <http://164.41.140.9/catal/>. Acesso em: 07 maio 2015.
[2] Eleotério, E. S. R. Levantamento e identificação de
cupins (insecta: isoptera) em área urbana de
Piracicaba, sp. 2000. 101 f. Tese (Mestrado) Curso de Ciências, Tecnologia de Madeiras, Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiróz",
Piracicaba, 2000. Cap. 1.
[3]
Ruppert, E. E.; Barnes, R. D.; Fox,
R.S. Zoologia
dos
invertebrados: uma
abordagem funcional-evolutiva. 7. ed. São Paulo, SP: Roca, 2005.
[4] Cancello, E. M.; Schlemmermeyer, T. Isoptera.
Biodiversidade do Estado de São Paulo, Brasil:
Síntese do conhecimento ao final do século XX.
Invertebrados Terrestres, p. 81–91, 1999.
[5] Bergsten, J., Bilton, D. T., Fujisawa, T., Elliott,
M., Monaghan, M. T., Balke, M., … Vogler, A. P.
(2012). The effect of geographical scale of
sampling on DNA barcoding. Systematic biology, 61(5), 851–69.
[6] Bergamaschi, S., Dawes-Gromadzki, T. Z., Luchetti, A., Marini, M., & Mantovani, B. (2007).
Molecular taxonomy and phylogenetic relationships among Australian Nasutitermes and Tumulitermes genera (Isoptera, Nasutitermitinae) inferred from mitochondrial COII and 16S sequences. Molecular phylogenetics and evolution, 45(3), 813–21.
[7] Folmer, O., Black, M., Hoeh, W., Lutz, R., & Vrijenhoek, R. (1994). DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates.
Molecular marine biology and biotechnology,
3(5), 294–9.
[8] Donnan laboratories, 2001. Extraction of DNA
from tissue High salt method. Disponível em:
http://www.liquidplastics.co.uk/Donnan-Labs.
Acessado em: 18/02/2014.
[10] Booth, W., Brent, C. S., Calleri, D. V., Rosengaus, R. B., Traniello, J. F. a., & Vargo, E. L.
(2011). Population genetic structure and colony
breeding system in dampwood termites (Zootermopsis angusticollis and Z. nevadensis nuttingi). Insectes Sociaux, 59(1), 127–137.
[11] HEBERT, P.D.N.; CYWINSKA, A.; BALL, S.L.
& DE WAARD, J.R. (2003a).Biological identifications through DNA barcodes. Philosophical
Transactions of The Royal Society B 270: pp.
313 – 321, 2003.
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Quadro II – Resultado das amplificações realizadas com primers HCO/LCO, CO1L/CO1R e LF/LepR.
Quadro II. Resultado dos testes com os três primers utilizados. As espécies foram identificadas pela pesquisadora Dra. Luciane Kern Junqueira com o auxilio de chaves de classificação de cupins com base em características morfológicas.
Amostra Taxonomia Clássica Resultado da am-­‐
Resultado da amplifi-­‐
plificação com HCO cação com Co1R + + LCO Co1L Resultado da amplifi-­‐
cação com LepR 1 + LepF 1 -­‐ 4 Cornitermes cumulans -­‐ 53 Labiotermes longilabius -­‐ 83 Cornitermes cumulans + -­‐ -­‐ 124 Labiotermes longilabius -­‐ -­‐ -­‐ 138 Labiotermes longilabius -­‐ -­‐ -­‐ 152 Labiotermes longilabius -­‐ -­‐ -­‐ 155 Grigiotermes sp.1 + 165 Orthognathotermes mirim -­‐ 171 Rynchotermes nasutissimus -­‐ -­‐ -­‐ + -­‐ + -­‐ -­‐ -­‐ + 194 Silvestritermes euamignathus 205 Embiratermes festivelus -­‐ -­‐ -­‐ 215 Procornitermes araujoi -­‐ -­‐ -­‐ 298 Cyrilliotermes strictnasus + -­‐ -­‐ 302 Dentispicotermes conjunctus + -­‐ -­‐ 312 Embiratermes heterotypus -­‐ + -­‐ 328 Orthognathotermes insignis -­‐ -­‐ + 413 Embiratermes festivelus -­‐ -­‐ -­‐ 466 Cornitermes cumulans -­‐ -­‐ + 534 Procornitermes triacifer -­‐ -­‐ + 553 Heterotermes sulcatus -­‐ -­‐ -­‐ 564 Rynchotermes nasutissimus + -­‐ -­‐ 567 Grigiotermes sp.2 -­‐ -­‐ -­‐ Heterotermes longiceps -­‐ -­‐ + 627 + -­‐ -­‐