INSTITUTO DE ENSINO E PESQUISA - IEP
Programa de Pós-Graduação em Medicina e Biomedicina
HUGO VIEIRA FRÓES
APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE (PCR) E
ELISA NA DETECÇÃO DA PARACOCCIDIOIDOMICOSE EM BOVINOS
BELO HORIZONTE
2012
HUGO VIEIRA FRÓES
APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE (PCR) E
ELISA NA DETECÇÃO DA PARACOCCIDIOIDOMICOSE EM BOVINOS
Dissertação apresentada ao programa de
pós-graduação do Instituto de Ensino e
Pesquisa – IEP do Grupo Santa Casa de
Belo Horizonte, como requisito parcial
para a obtenção do título de Mestre em
Medicina e Biomedicina.
Orientadora: Rachel Basques Caligiorne
Co-orientador: Alfredo Miranda Góes
BELO HORIZONTE
2013
FOLHA DE APROVAÇÃO
APLICAÇÃO DAS TÉCNICAS DE REAÇÃO EM CADEIA POLIMERASE (PCR) E
ELISA NA DETECÇÃO DA PARACOCCIDIOIDOMICOSE EM BOVINOS
___________________________________________________________________
Aluno: Hugo Vieira Fróes
Prof(a). Orientador: Dra. Rachel Basques Caligiorne
Prof. Co-Orientador : Dr. Alfredo Miranda Góes
___/___/_____
Data
BANCA EXAMINADORA:
Dra. Clara Araujo Veloso Amaral
Dra. Viviane Cristina Fernandes dos Santos
"Crescer não é evoluir, crescer é ficar maior. Evoluir é ficar melhor."
(autor desconhecido)
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por me ajudar em todos os dias de minha vida, me dando força e
vontade para vencer todos os desafios que surgem.
À minha orientadora Dra. Raquel Basques Caligiorne, por acreditar e confiar em
mim, no meu trabalho e me apoiar em todos os momentos que precisei.
Ao Dr. Alfredo Miranda Góes, por me abrir as portas do seu laboratório para a minha
pesquisa e e estar sempre disponível para tirar minhas duvidas.
Ao Dr. Dawidson Assis Gomes, pela amizade e orientação.
À Dra. Giliane e seus alunos, que me ajudaram a enriquecer meu projeto.
À minha esposa Eliane e meu filho Davi, por todo o amor, carinho e alegria que
trouxeram a minha vida. Por estarem ao meu lado durante todo este processo e me
ajudarem a me divertir quando era possível e trabalhar quando era necessário.
Ao meu pai Hugo e minha mãe Conceição, por serem a fonte da minha inspiração e
felicidade, por me darem tanto amor e bom exemplo e me tornarem alguém capaz
de seguir meu próprio caminho com tranquilidade e responsabilidade.
Aos meus familiares Marconi, Francinele, Solange e Lenda, por todo o carinho e
suporte quando precisei.
À Lilian , pela paciência, amizade e ajuda em todos os momentos.
À Viviane, Elis, Elisa, Daniela, Laura, Fabiana, Pedro, Humberto, Catherine e
Betinha, por toda a ajuda no laboratório e pela amizade.
Aos amigos Diogo, Enéas, Aline, Dr. Ronaldo Nagem, Dr. Ricardo Fujiwara.
Ao Dr. Rodrigo Resende e à Dra. Silvia Guatimosim por todo o suporte e ajuda.
À Fabiana, Cidiane e Claudia, pela amizade e por me auxiliarem sempre durante o
mestrado.
Aos professores da pós-graduação que foram muito importantes para chegar até
aqui, pelo conhecimento adquirido e pela qualidade das disciplinas.
A todos os funcionários da pós-graduação da Santa Casa que de alguma forma
contribuíram para o meu sucesso.
Aos meus colegas de curso Marcos, Catharina, Ludmilla, Sthefanie, Bryele,
Pollyana, Raquel, Odilon, Breno, Patricia, Nibia, Claudio, Leonardo, Adriana.
Ao Rodrigo Bimbati da Exon Biotec por reconhecer a importância desse titulo e me
dar a liberdade para buscá-lo. A todos vocês muito obrigado.
RESUMO
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose crônica, causada pelo fungo
Paracoccidioides brasiliensis, um organismo sapróbio e termodimórfico. É endêmico
da América Latina, sendo mais prevalente no Brasil, nos Estados de Minas Gerais,
São Paulo e Rio de Janeiro. Este fungo foi isolado pela primeira vez por Adolpho
Lutz, em 1908. No entanto, apresenta-se como um assunto de relevante
preocupação e desafio para os micologistas no que se refere ao conhecimento de
seu nicho ecológico, uma vez que o conhecimento da ecologia, reprodução e do
micro-habitat ocupado pelo organismo em questão, em ambiente natural, ainda são
incertos. Há poucos estudos que demonstram a possibilidade do fungo de infectar
bovinos. Dessa forma, o presente trabalho teve como finalidade discutir sobre as
metodologias adequadas para o diagnóstico eficiente e seguro para a PCM em
bovinos, entre eles, ELISA (Enzyme-lynked immunosorbent assay) e PCR (Reação
em cadeia de polimerase), utilizando como antígenos a proteína recombinante Pb27r
e antígeno MEXO, que são excretados pelo fungo. Para a realização deste estudo
considerou-se a importância da pecuária na economia brasileira e mundial e,
principalmente, a importância em saúde pública pela possível disseminação da PCM
em produtos derivados de bovinos. A partir dos resultados preliminares, utilizando
136 amostras biológicas de bovinos, o presente trabalho demonstrou a possibilidade
de aplicação dos testes utilizados como ferramenta para estudos epidemiológicos da
PCM e na identificação dos animais infectados. Porém, para que isso se torne
realidade, há de se considerar a necessidade de maiores estudos quanto ao
assunto, principalmente pelo fato de que 65% (n= 61) das amostras de soro bovino
adulto apresentaram reação positiva no teste de ELISA realizado, enquanto os soros
fetais bovinos não apresentaram tal reatividade. Assim maiores estudos que levem
em consideração o real estado de saúde dos animais e o seu real contato com P.
brasiliensis são necessários para melhor padronização e confiabilidade dos testes.
Palavras-chave:
Paracoccidioidomicose,
diagnósticos, bovinos.
Paracoccidioides
brasiliensis,
ABSTRACT
Paracoccidioidomycosis (PCM) is a chronic mycosis caused by Paracoccidioides
brasiliensis, a saprobic and dimorphic fungus. It is prevalent in rural workers in
several Latin American countries, mainly in Brazil, the country with the most endemic
areas for this disease in the world. This fungus was isolated for the first time by
Adolpho Lutz in 1908. However, it appears as a relevant concern and challenge for
the mycologists, because of the lack of knowledge of their ecology, reproduction and
the micro-habitats occupied by this fungus on environment, since despite several
searches. There are few studies that demonstrate the ability of the fungus to infect
cattle. Thus, this project aims to discuss the appropriate methodology for effective
and safe diagnosis for PCM in cattle, among ELISA (Enzyme-lynked immunosorbent
assay), Western blotting (Eletrotransference protein) and PCR (polymerase chain
reaction), using as antigen the recombinant antigen Pb27r, and PbAg. To achieve
this objective we considered the importance of livestock in Brazilian economy and
around the world, besides the importance of public health by the possible spread of
PCM by milk. Based on preliminary results, using 136 biological materials, this study
demonstrates the potential application of the tests used as a tool for epidemiological
studies of PCM and for the identification of infected animals. For this, we should also
consider the need for further studies on the subject, especially by the fact that all
serum samples showed a positive reaction to the tests, including serum that was
considered negative for this mycosis. So, for the improvement of methodologies used
in this study we need to search more about this issue, mainly because 65% (n= 61) of
the adult bovine serum samples presented positive reaction on realized tests, while
the fetal bovine serum samples didn’t present reactivity on the realized tests. So,
more studies are necessary to know more about the real health state of the animals
and if they are really infected with this mycosis, with this knowledge we will be able to
improve the standardization and the reliability of the tests.
Keywords: Paracoccidioidomycosis, Paracoccidioides brasiliensis, diagnostic,
cattle.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema representando o ciclo evolutivo e as formas de infecção pelo P.
brasiliensis ......................................................................................................................... 16
Figura 2: Lesões em mucosa de boca, olhos e nariz, típicas da PCM................................16
Figura 3: Distribuição geográfica da PCM na América Latina ............................................17
Figura 4: Foto do tatu galinha, Dassypus novemcytus .......................................................19
Figura 5: Foto do tatu-bola, Cabassous centralis ...............................................................20
Figura 6: Observação microscópica da levedura com múltiplos brotamentos. Aumento
1000x ................................................................................................................................. 21
Figure 7: Amplificação exponencial dos genes na PCR .................................................... 22
Figura 8: Quadro demonstrando a comparação da reatividade ao antígeno Pb27r em soros
de pacientes com diferentes micoses e tuberculose ......................................................... 25
Figura 9: Coleta de fragmentos de tecidos das 14 vacas da fazenda do município de
Itabirito,MG...........................................................................................................................31
Figura 10: Gel corado pela prata, apresentando os fragmentos amplificados pela técnica
de PCR–out. ........................................................................................................................43
Figura 11: Gel corado pela prata, apresentando os fragmentos amplificados pela técnica
de PCR–nested....................................................................................................................44
LISTA DE QUADROS
Quadro 1: Ciclos de amplificação da PCR-OUT e nested-PCR .........................................35
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Comparação da leitura das densidades óticas, frente ao antígeno Pb27r, nas
diferentes diluições dos soros bovinos................................................................................36
Gráfico 2: Comparação da leitura das densidades óticas, frente ao antígeno MEXO, nas
diferentes diluições dos soros bovinos................................................................................37
Gráfico 3: Comparação da leitura das densidades óticas para todas as 136 amostras de
soros bovinos, comparando os antígenos MEXO e Pb27r..................................................38
Gráfico 4: Comparação da leitura das densidades óticas para todas as 136 amostras de
soros
bovinos,
comparando
os
antígenos
MEXO
e
Pb27r.
Resultado
em
porcentagem........................................................................................................................39
Gráfico 5: Comparação da porcentagem de animais positivos e negativos para o teste de
ELISA utilizando o antígeno Pb27r......................................................................................40
Gráfico 6 : Porcentagem de animais positivos para o teste de ELISA utilizando a proteína
Pb27r e Mexo.......................................................................................................................41
Gráfico 7: Porcentagem de animais positivos para os testes de ELISA ( utilizando a
proteína Pb27r e Mexo) e PCR............................................................................................42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Protocolo da reação de amplificação do DNA.....................................................34
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
PCM .................................................................................................. Paracoccidioidomicose
BSA............................................................................................................. Soro fetal bovino
PCR........................................................................................ Reação em cadeia polimerase
CF....................................................................................................Fixação de complemento
CIE ..................................................................................................Contraimunoeletroforese
DNA ................................................................................................Ácido desoxirribonucleico
DNTP ................................................................................................ Dinucleotideo trifosfato
ELISA .....................................................................Ensaio imunoenzimático de absorbância
Gp43............................................................................................................. Proteína 43 KDa
H2SO4 2N ......................................................... .............................. Ácido sulfúrico 2 Normal
ID ...................................................................................................................... Imunodifusão
IgG ............................................................................................................ Imunoglobulina G
kDa .................................................................................................................... Kilo dawtons
KOH ..................................................................................................... Hidróxido de potássio
nm ...................................................................................................................... Nanômetros
mL ............................................................................................................................. Mililitros
MgCl2 .................................................................................................... Cloreto de magnésio
Pb27r ..................................................................................... Proteina 27 kDa recombinante
Taq .....................................................................Enzima Termus aquáticos DNA polimerase
L ............................................................................................................................. Microlitro
SUMÁRIO
1.Introdução.........................................................................................................................15
1.1 O fungo Paracoccidioides brasiliensis...........................................................................18
1.2 Diagnóstico da PCM .....................................................................................................20
1.3 Sorologia da PCM..........................................................................................................23
1.4 A Proteína recombinante - Pb27r e o antígeno MEXO..................................................25
1.5 A PCM em bovinos........................................................................................................26
2. Justificativa.......................................................................................................................28
3. Objetivos.........................................................................................................................29
3.1. Objetivo geral................................................................................................................29
3.2. Objetivos específicos....................................................................................................29
4. Metodologia......................................................................................................................30
4.1. Obtenção das amostras................................................................................................30
4.2. ELISA (enzyme-lynked immunosorbent assay)…………………………........................31
4.3. Padronização das diluições dos soros para o ensaio com o antígeno Pb27r
e MEXO................................................................................................................................33
4.4. Extração de DNA de amostras de tecidos...................................................................33
4.5. Reação em cadeia da polimerase (PCR).....................................................................34
4.6. Eletroforese em gel de Acrilamida...............................................................................35
5. Resultados.......................................................................................................................36
5.1. Padronização das diluições dos soros para o ensaio com o antígeno Pb27r...............36
5.2. Padronização das diluições dos soros para o ensaio com o antígeno MEXO..............37
5.3. Comparação dos resultados de ELISA, utilizando os antígenos MEXO e Pb27r.........38
5.4.Comparação dos resultados da PCR nas diferentes amostras....................................43
6. Discussão.........................................................................................................................45
7. Conclusões......................................................................................................................49
8. Estudos prospectivos.......................................................................................................50
9. Referências bibliográficas................................................................................................51
10. Apêndice 1.....................................................................................................................57
10.1 Banco de dados de ELISA (cut-off)..............................................................................59
10.2 Banco de dados de ELISA...........................................................................................59
11. Anexo 1..........................................................................................................................63
12. Anexo 2..........................................................................................................................68
15
1.INTRODUÇÃO
A paracoccidioidomicose (PCM) é uma micose crônica, causada pelo fungo
Paracoccidioides brasiliensis. Este fungo é um organismo sapróbio, ou seja, vive no solo
absorvendo nutrientes oriundos da matéria orgânica em decomposição. O ar é o veículo de
dispersão de seus esporos. A transmissão se dá quando a terra contaminada é revolvida,
permitindo assim que os esporos fúngicos sejam inalados pelo indivíduo que está em
contato direto com o solo (LACAZ, 1991).
Após a inalação, os esporos vão se alojar nos pulmões. O período de incubação
pode variar de um mês até muitos anos. Há formação de um granuloma em torno das
leveduras constituído por células gigantes e células epitelióides (MARTINEZ, 1997;
QUEIROZ-TELLEZ & ESCUISSATO, 2011). A maioria dos linfócitos presente no
granuloma é do tipo T-auxiliares (CD4+), com poucas células T-citotóxicas (CD8+),
sugerindo um maior envolvimento das T-auxiliares na patogênese das lesões e no controle
da doença (MOSCARDI-BACCHI et al., 1989), o que justifica o destaque da PCM como
uma das importantes micoses oportunistas em pacientes imunossuprimidos.
Uma vez estabelecida, a PCM pode se apresentar-se sob duas formas clínicas
distintas (FIGURA 1): A forma aguda ou subaguda (juvenil) que se caracteriza pela rápida
disseminação do fungo para órgãos do sistema retículo-endotelial, com hipertrofia do baço,
fígado, linfonodos e disfunção da medula óssea.
16
Figura 1. Esquema representando o ciclo evolutivo e as formas de infecção pelo P. brasiliensis.
A forma crônica, que representa mais de 90% dos casos em adultos, sendo mais
frequente em indivíduos do sexo masculino na faixa etária de 29 a 49 anos, envolve um
lento e progressivo envolvimento pulmonar (FRANCO et al., 1987; RESTREPO et al.,
1989; BRUMMER, CASTANEDA e RESTREPO, 1993).
Foto: Rachel B.Caligiorne
Figura 2: Paciente com lesões em mucosa de boca, olhos e nariz, típicas da PCM.
Anteriormente denominada de blastomicose Sul-Americana, a PCM foi descrita
pela primeira vez no Brasil em 1908, por Adolpho Lutz, com contribuições posteriores de
Splendore e Almeida (LACAZ, 1982; HAMDAN & ROCHA, 1987; LONDERO & MELO,
1998). Diversos outros termos foram utilizados para descrever esta doença, como
17
blastomicose
sul-americana,
doença
de
Lutz-Splendore-Almeida,
granulomatose
paracoccidióidica, granuloma paracoccidióidico, granulomatose blastomicóide tropical,
granuloma ganglionar maligno de origem blastomicótica (LACAZ, 1991).
A PCM é considerada a mais importante micose profunda da América Latina
(AGUDELO et al., 2009) e a oitava mais comum causa de morte por doenças infecciosas e
parasitarias (TOBÓN et al., 2012). Há uma estimativa da incidência da doença entre um a
três por 100.000 habitantes de áreas endêmicas da América Latina (MARTINEZ, 1997).
Apesar da notável importância desta doença, aqui no Brasil, ela é de Notificação
Compulsória somente nos Estados de Mato Grosso, Minas Gerais e São Paulo (TOBÓN et
al., 2012).
O Brasil acumula 80% dos casos descritos da doença (QUEIROZ-TELLEZ &
ESCUISSATO, 2011), seguido da Colômbia, Venezuela e Guatemala (Figura 03)
(MARTINEZ, 1997; LONDERO & MELO, 1998).
Figura 3: Distribuição geográfica da PCM na América Latina.
Fonte: SHIKANAI-YASSUDA et al. (2006)
As áreas endêmicas situam-se em regiões de florestas tropicais ou subtropicais
com temperaturas médias entre 14–20ºC, precipitações pluviométricas entre 800mm a
2.000mm e umidade relativamente alta (HAMDAN & ROCHA, 1987; LONDERO & MELO,
1998). A doença apresenta uma distribuição regional heterogênea, destacando Minas
Gerais como área endêmica de elevada incidência, assim como São Paulo e Rio de
Janeiro (FAVA & FAVA-NETO, 1998; LACAZ, 1991; NOGUEIRA et al., 2006). Sugere-se
18
que nas áreas endêmicas haja uma taxa de prevalência de infecção pelo P. brasileinsis de
50 a 75% na população adulta (QUEIROZ-TELLEZ & ESCUISSATO, 2011).
Segundo Shikanai-Yasuda e colaboradores (2006) é possível observar notáveis
alterações na frequência, nas características demográficas da população atingida e na
distribuição geográfica da PCM, principalmente pelas decorrentes aberturas de novas
fronteiras agrícolas, com a derrubada de florestas, sobretudo nas regiões Centro-Oeste e
Norte, atingindo marcadamente a Amazônia. Ajello & Polonelli (1985) apontaram casos de
paracoccidioidomicose em países não endêmicos, como Estados Unidos, Japão e Europa.
Isto se deve ao aumento de viagens internacionais, imigração e ecoturismo nos últimos
anos.
1.1 O fungo Paracoccidioides brasiliensis
O
fungo
Paracoccidioides
brasiliensis
apresenta
comportamento
dimórfico,
desenvolvendo-se sob a forma miceliana à temperatura ambiente (entre 14 e 28ºC) e sob a
forma leveduriforme a 37ºC. Nos tecidos humanos, o fungo tem forma esférica, medindo de
2 a 30 µm de diâmetro, com parede duplamente refringente (LACAZ, 1991). Sua
esporulação múltipla resulta no típico aspecto de “roda de leme”, considerado
patognomônico da doença. As características do fungo sugerem que o micélio seja a sua
forma de vida saprofítica, podendo sugerir que sua produção de esporos infectantes ocorre
em solo e em detritos vegetais (OLIVEIRA et al., 1997; MARTINEZ, 1997; BAGAGLI et al.,
2006 e 2008). Atualmente, o uso de métodos moleculares demonstrou que o P. brasiliensis
pode não ser uma espécie simples e sim, um complexo de subespécies, dentre elas a:
PS1 (presente no Brasil, Argentina, Paraguai, Peru e Venezuela); PS2 (P. lutzzi, no Brasil
e Venezuela); PS3 (restrito à Colombia) (QUEIROZ-TELLEZ & ESCUISSATO, 2011).
O homem era tido como o único hospedeiro do P. brasiliensis, até o reconhecimento
de tatus (Dasypus novemcitus), naturalmente infectados em regiões endêmicas para esta
micose (LACAZ, 1991; LONDERO & MELO, 1998; CONTI-DÍAZ, 2007). Vidal e
colaboradores (1995), através dos métodos de imunodifusão dupla, SDS-PAGE e
imunoeletroforese, verificaram a presença da glicoproteína 43kDa, específica do fungo, no
baço e fígado do tatu (Dassypus novemcinctus) (Figura 4).
19
Figura 4: Foto do tatu galinha, Dassypus novemcytus
Fonte: (http://www.brasilescola.com/animais/tatu-galinha.htm
O fungo também foi isolado de restos de origem vegetal (LACAZ, 1949), de comida
de cachorro no Brasil e a partir do trato intestinal de morcegos (MONTENEGRO et al.,
1996). Segundo TOBÓN et al. (2012), já foi possível isolar P. brasilienses de forragem
animal e fezes de morcegos. De acordo com Neves et al., (2006) há possibilidades de que
o habitat do P. brasiliensis seja o solo, entretanto, desde o primeiro relato de PCM por Lutz
(1908), há poucos isolados a partir dessa fonte.
Para Nishikaku et al. (2008), os tatus possuem uma alta incidência de infecção com
PCM e poderia, portanto, ser um reservatório para o fungo, desempenhando um papel
importante no ciclo biológico do patógeno (Figura 5). Além da relação confirmada entre o
tatu e o P. brasiliensis, Garcia e colaboradores (1993) também conseguiram isolar o fungo
a partir de fezes de pingüins da Antártica uruguaia e, em 2002, foi relatado o primeiro
achado confirmado de PCM em um cão da raça Doberman, de vida estritamente urbana. O
diagnóstico baseou-se no exame histopatológico e, posteriormente confirmou-se por
técnica imunohistoquímica, utilizando-se anticorpo policlonal específico anti P. brasiliensis
(MARQUES, 2003).
Costa e colaboradores (1995) capturaram 96 animais silvestres e comprovou com
valores estatisticamente significantes que os maiores índices de positividade para
paracoccidioidina foram observados em animais de hábitos terrestres, das famílias
Felidaee, Procyonidae, da ordem Carnivora, em relação àqueles de hábitos de vida
arbórea da ordem Primates. Em outros estudos, também utilizando a paracoccidioidina
20
intradermica,
observou-se
reatividade
em
humanos,
ovelhas,
vacas
e
cavalos,
demonstrando que o fungo P. Brasiliensis pode estar bem mais disseminado na natureza
do que se sabe (QUEIROZ-TELLEZ & ESCUISSATO, 2011).
Entre os vários relatos de PCM em animais, observa-se uma falta de
reprodutibilidade nos estudos impedindo, portanto, a confirmação dos casos (NEVES et al.,
2006). Cabe ressaltar que os estudos epidemiológicos da PCM em diferentes espécies de
animais silvestres e domésticos podem contribuir de maneira significativa para a
elucidação do verdadeiro habitat do P. brasiliensis.
Figura 5: Foto do tatu-bola, Cabassous centralis
Fonte: (http://animalesdelmundo.wordpress.com/)
1.2 Diagnóstico da PCM
Para que um diagnóstico seja considerado eficiente, ele deve apresentar elevada
sensibilidade e especificidade e o mínimo de resultados falso-positivos e falso-negativos
(DEL NEGRO et al., 1991). O diagnóstico para a PCM pode ser cruzado com
leishmaniose, lupus eritrematoso, tuberculose, sífilis e câncer, além de ser confundida com
outras micoses como a coccidioidomicose, a esporotricose e a blastomicose (LOPES et al.
2009). Portanto, os exames histopatológicos e o cultivo do agente causal são importantes
para a conclusão do diagnóstico. Pode-se coletar o material proveniente de biópsia de
pele, mucosa, de aspirados ganglionares, escarros e outros. A biópsia deve ser dividida
21
em três fragmentos. O primeiro deve ser conservado em formol a 10% para os exames
histopatológicos; o segundo é cultivado em ágar-Sabouraud contendo cloranfenicol,
incubado ás temperaturas de 28 e 37ºC; o terceiro fragmento deve ser tratado com
Hidróxido de potássio (KOH) para observação à fresco de formas leveduriformes com
múltiplos brotamentos nos tecidos, como demonstrado na Figura 6 (SIDRIM & MOREIRA,
1999).
Figura 6: Observação microscópica da levedura com múltiplos brotamentos. Aumento 1000x.
Fonte: http://www.doctorfungus.org
A biologia molecular tem sido cada vez mais utilizada para o diagnóstico de micoses
sistêmicas, principalmente nos casos em que os pacientes são imunossuprimidos, onde
não é possível de se detectar anticorpos específicos para o diagnóstico dessas doenças. A
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) tem sido uma importante ferramenta de
diagnóstico, uma vez que é capaz de detectar o DNA circulante do agente causal a níveis
baixíssimos, chegando a picogramas/mL de DNA da amostra clínica (GOLDANI e SUGAR,
1998; BIALEK et al., 2000; LINDSLEY et al., 2001). Além disso, trata-se de uma técnica
menos invasiva, pois pode detectar o DNA do agente em pequenos fragmentos de biopsia,
ou escarro ou mesmo pouca quantidade de sangue total.
De forma simplificada, a PCR constitui-se de três fases. Inicia-se o processo da
separação térmica da cadeia dupla do DNA, à temperatura de 94 graus Celcius (0C),
resultando em duas cadeias complementares; assim separadas, à temperatura de 58680C, elas são aneladas com os iniciadores específicos, os quais correspondem às curtas
22
sequências de DNA complementar ao trecho específico de DNA da cadeia alvo. A partir
deste anelamento inicial, a enzima DNA polymerase continua a extensão da cadeia cópia à
temperatura de 720C. As cópias "filhas", assim obtidas passam a constituir-se em modelo
para a obtenção de milhões de cópias, que poderão ser vistas pela eletroforese em gel de
agarose. Essa metodologia oferece maior sensibilidade diagnóstica que métodos
histológicos de rotina (MARQUES, S.A. 2003, p.144) (Figura 7).
Figure 7: Amplificação exponencial dos genes na PCR.
Fonte: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html
Vários grupos de pesquisas, no Brasil e em toda a América latina, vêm se
empenhando na padronização da PCR para o diagnóstico da PCM. Alguns autores vêm
utilizando diferentes regiões do DNA ribossômico (MOTOYAMA et al., 2000), outros têm
demonstrado que é possível utilizar regiões do gene que expressa a proteína Gp43 como
alvo específico para a PCR (GOMES et al., 2000; MORAIS et al., 2000; SANO ET AL.,
2002; SEMIGHINIA et al., 2002; CHARBEL, LEVI e MARTINS, 2006). E ainda,
NASCIMENTO e colaboradores (2004) demonstraram que os microsatélites podem ser
importantes marcadores para a detecção do DNA do P. brasiliensis.
23
1.3 Sorologia da PCM
Testes sorológicos têm servido, por várias décadas, como auxílio no diagnóstico e
tratamento da paracoccidioidomicose. São utilizados para diagnóstico de PCM os
seguintes testes sorológicos: tubo de precipitação, imunodifusão, fixação de complemento
(CF),
imunodifusão
dupla,
contraimunoeletroforese
(CIE),
imunofluorescência,
radioimunoensaio, inibição da hemaglutinação passiva, ensaios imunoenzimáticos, como o
ELISA, Melisa, Dot-Blot, Western-Blot e, mais recentemente inibição de ELISA
(CAMARGO, 2008).
Os métodos sorológicos são extremamente importantes para o diagnóstico das
micoses sistêmicas. A sorologia tem sido relevante no diagnóstico de candidíase,
aspergilose, histoplasmose, coccidioidomicose, blastomicose e, principalmente na PCM,
onde tem sido bem desenvolvida (CAMARGO & ALBORNOZ, 1990; CAMARGO et al.,
1991).
Em 1961, o pesquisador FAVA-NETO extraiu o primeiro antígeno polissacarídeo do
P. brasiliensis, demonstrando a utilidade de provas sorológicas e cutâneas no diagnóstico
da PCM. Em 1994, TABORDA & CAMARGO padronizaram um diagnóstico sorológico
utilizando a glicoproteína de 43 kDaltons, ou gp43.
Inúmeras publicações têm explorado o diagnóstico da paracoccidioidomicose
através de ensaios sorológicos, como a imunodifusão, hemaglutinação, ELISA e WesternBlot, utilizando o antígeno gp43 (ALMEIDA et al.,2002; MALUF et al.,2003; MARQUES-DASILVA et al., 2003). Em 2008, REIS e colaboradores demonstraram a aplicabilidade do
antígeno recombinante Pb27r, tanto na proteção quanto no diagnóstico da PCM.
A paracoccidioidina, assim como a histoplasmina e a cromomicina, é uma
preparação de antígenos brutos específicos para PCM e pode ser bem aplicada nas
pesquisas de levantamento epidemiológico em regiões endêmicas, sem valor de
diagnóstico das doenças. De acordo com SARAIVA et al. (1996), pacientes com PCM
podem não responder ao teste intradérmico com paracoccidioidina, isso reflete o estado de
anergia do paciente. Esta anergia é parcialmente revertida após alguns meses de
tratamento, porém, a persistência de negatividade tem sido associada à gravidade da
doença. Pacientes com testes intradérmicos positivos têm melhor prognóstico e o teste
torna-se um bom parâmetro para o acompanhamento do tratamento.
24
Dos métodos imunoenzimáticos, o enzyme linked immunosorbent assay (Elisa) tem
obtido espaço à medida que o domínio da técnica se dissemina (MARQUES, 2003). A
técnica imunoenzimática – ELISA, utilizado pela primeira vez por PONS et al. (1972), é um
sistema de elevada sensibilidade, relativamente simples de se executar, que resulta em
dados quantitativos e é altamente sensível (CAMARGO, 2008). Com o objetivo de detectar
anticorpos contra o P. brasiliensis em cães soropositivos e soronegativos para
leishmaniose, utilizou-se as técnicas de ELISA e o teste de imunodifusão utilizando gp43 e
exoantígeno, respectivamente. A maior positividade foi observada no teste de ELISA,
devido a sua maior sensibilidade (SILVEIRA et al., 2006).
FAGUNDES (2002) citado por Marques, S.A. (2003), investigou pelas técnicas
sorológicas tipo Elisa e por imunodifusão, 282 cães. Detectou-se 35% de positividade
sorológica que foram submetidas à confirmação com a técnica de Western-blot,
demonstrando-se bandas bem definidas e específicas.
Outro método utilizado para diagnóstico da PCM é o Western-Blot (CAMARGO et
al., 1989; BLOTTA & CAMARGO, 1993). Esta técnica utiliza a transferência das bandas
dos antígenos de interesse para uma membrana de nitrocelulose. Dessa forma, após a
incubação individual com os soros diluídos e com os conjugados marcados com
peroxidase, lêem-se visualmente as bandas que foram gravadas (MARTINS et al. 1997).
Apesar de grandes avanços nas técnicas sorológicas para PCM, que apresentam
grande sensibilidade ou especificidade, existem problemas de ordem econômica que
impedem a implantação destas técnicas em laboratórios da rede pública de saúde com a
finalidade de fornecer resultados à população carente, principal alvo da doença. Desta
forma, o teste de imunodifusão (ID) representa o teste mais acessível e, portanto,
exeqüível em qualquer laboratório de rotina. A ID tem sido amplamente utilizada nos
laboratórios, tanto no Brasil como em toda a América Latina, pois trata-se de um método
de grande especificidade (em torno de 98%) e de uma sensibilidade razoável (em torno de
84%), além de um baixo custo operacional (SIDRIM & MOREIRA, 1999).
Entretanto, o teste apresenta uma limitação: a preparação do antígeno por
diferentes laboratórios sem uma padronização de antígeno de referência pode gerar
conflitos ao comparar resultados de diferentes laboratórios. Além disso, a técnica pode
apresentar resultados falso-negativos (NEVES et al., 2003) e em caso de suspeita da
doença é preciso realizar outros testes que possam fechar o diagnóstico, como o exame
direto e o cultivo do fungo.
25
1.4 A Proteína recombinante - Pb27r e o antígeno MEXO
Antígenos derivados de P. brasiliensis podem induzir uma atividade policlonal de
linfócitos B, a qual é caracterizada pelo aumento do número de células secretoras de
imunoglobulinas, hipergamaglobulinemia e aumento de imunocomplexos (CHEQUER-BouHABIB et al., 1989).
Nos estudos de Ortiz (1996), a análise da proteína recombinante de 27kDa, por
Immunoblot, mostrou reatividade específica contra soros de 40 dos 44 (91%) pacientes
com paracoccidioidomicose. Segundo o autor, não houve reação cruzada com os soros de
pacientes com outras micoses, nem soros dos pacientes com tuberculose, como pode ser
observado na figura baixo (Tabela 1).
Figura 8: Quadro demonstrando a comparação da reatividade ao antígeno Pb27r em soros de pacientes com
diferentes micoses e tuberculose.
Fonte: ORTIZ, 1996.
DI´EZ et al. (2003) utilizaram os antígenos 87kDa e 27kDa recombinante e
perceberam
que
em
termos
de
especificidade
do
ELISA,
quando
utilizados
individualmente, a 27kDa foi muito superior ao 87kDa. Em relação aos soros de pacientes
com outras doenças e de indivíduos saudáveis, a combinação 27kDa-87kDa provou ser
específica no ELISA como a 27kDa quando utilizada isoladamente.
SANTOS
et
al.
(2012), utilizando os antígenos MEXO e Pb27r observaram uma variação nas
imunoglobulinas de pacientes com paracoccidioidomicose crônica, antes, durante e após o
tratamento. O antígeno MEXO é um antígeno de superfície, específico de P. brasiliensis
que é secretado. Embora seja considerado menos específico que o antígeno Pb27, os
26
autores observaram que os ensaios de ELISA, utilizando o MEXO separaram o grupo de
pacientes positivos do grupo de pacientes negativos para a paracoccidioidomicose.
1.5 A PCM em bovinos
O sistema imunológico de bezerros encontra-se completamente desenvolvido ao
nascimento, mas só funcionará eficientemente depois de algumas semanas de vida. A
elevada incidência de doenças nesse período é atribuída às particularidades do sistema
imunológico desses animais, com a necessidade de ingestão de imunoglobulinas colostrais
para obtenção de resistência no início da vida (COSTA et al 2004).
Segundo BITTAR et al. (2004), a imunidade protetora dos bovinos não está
diretamente relacionada aos níveis de anticorpos, porque os anticorpos totais são
produzidos contra antígenos do parasita e contra antígenos do hospedeiro como resultado
de resposta inflamatória. Neste estudo os autores avaliaram o perfil fenotípico de linfócitos
de bovinos de três raças distintas, com o intuito de observar a existência de variações de
CD4, CD8 e CD21. Os autores observaram que a existência de um perfil fenotípico
diferencial de linfócitos circulantes deve ser considerada nos estudos da imunidade celular
desencadeada por doenças infecto-parasitárias em bovinos, uma vez que essas diferenças
podem ser relevantes para o padrão de resposta imune apresentado por esses animais.
GUTIERREZ et al. (1974), realizaram reação intradérmica com antígeno
polissacarídico de P. brasiliensis em 293 bovinos na Colômbia e relataram positividade em
apenas 6 animais. As amostras de soro dos bovinos não apresentaram reatividade nos
exames de fixação de complemento e precipitação. Após induzirem à PCM em três
bovinos por via intra-testicular, da COSTA et al. (1978), durante um período de 5 meses de
observação, perceberam que os bovinos revelaram-se suscetíveis à PCM e a doença
experimental não revelou tendência à disseminação ou cura espontânea. Além disso,
perceberam também que a resposta imunológica, tanto celular quanto humoral, foi mais
tardia que a verificada em outros animais experimentalmente infectados. Ao tentarem
padronizar técnicas de diagnóstico, notaram que a resposta imunológica humoral foi
revelada principalmente pela reação de fixação do complemento, portanto, não foi possível
demonstrar a presença de anticorpos humorais pela reação de dupla difusão em gel de
ágar.
27
SILVEIRA e colaboradores (2005) avaliaram a resposta imune humoral em bovinos
imunizados com P. brasiliensis e realizaram um estudo soro-epidemiológico da
paracoccidioidomicose em bovinos. Para avaliar a resposta imune humoral das amostras
de sangue, utilizaram as técnicas de imunodifusão e ELISA, utilizando o exoantígeno e
gp43, respectivamente. Com este estudo concluiu-se que bovinos imunizados com P.
brasiliensis podem provocar resposta imune humoral contra a gp43, permanecendo com
títulos elevados de anticorpos.
28
2.
JUSTIFICATIVA
Apesar da existência de estudos que demonstrem a presença do fungo no ambiente
e a possibilidade de infectar bovinos, ainda existem poucos trabalhos em torno da
detecção do fungo em sangue e soro de bovinos, para fins de diagnóstico da
paracoccidioidomicose. Ainda não temos publicações que esclareçam sobre os parâmetros
sorológicos dos bovinos infectados, assintomáticos para a PCM, ou mesmo aqueles
normais, que receberam o antígeno e que podem apresentar resultados positivos para a
doença. Estes dados poderiam nos orientar no momento da padronização de sorologia e
de biologia molecular para fins de diagnóstico.
O presente estudo teve a finalidade de discutir sobre as metodologias adequadas
para o diagnóstico eficiente e seguro para a PCM em bovinos, tendo em vista a
importância da pecuária na economia brasileira e mundial e, principalmente, a importância
em saúde pública. A motivação partiu do diagnóstico confirmado de PCM em uma vaca de
uma fazenda da região de Itabirito, MG. A vaca apresentava lesões de feridas na região
mamária e o exame histológico apresentou a levedura típica de P. brasiliensis.
Infelizmente, quando foi confirmado o diagnóstico da PCM a vaca já havia sido sacrificada,
o que dificultou a coleta de amostras biológicas para posteriores estudos.
Este episódio motivou o estudo da PCM nesta mesma fazenda, com coletas de
sangue e soro de outras 14 vacas com sintomas semelhantes de PCM. Este estudo
apresenta alguns testes, imunológicos e moleculares, com a finalidade de padronizar os
diagnósticos para a PCM em bovinos.
Além de se considerar os poucos estudos científicos da doença nesse grupo de
animais, levou-se em conta, principalmente, a sua importância para a saúde pública e para
a economia do país, já que o consumo de carne e leite bovinos pela sociedade brasileira e
mundial é elevado e cresce a cada ano.
29
3. OBJETIVOS
3.1.
Objetivo geral
Avaliar a aplicação das técnicas de ELISA e PCR no diagnóstico da PCM em bovinos.
3.2.
Objetivos específicos
. Desenhar os iniciadores que se anelam em regiões dos genes da proteína Pb27r;
. Extrair DNA de tecidos de vacas com suspeita de paracoccidioidomicose da fazenda no
município de Itabirito, MG, para realização da PCR específica para esta espécie;
. Realizar a técnica de ELISA em amostras de soro de todos os bovinos, para detecção do
anticorpo específico, utilizando o antígeno recombinante Pb27 e MEXO;
. Analisar os resultados.
30
4.
METODOLOGIA
4.1.
Obtenção das amostras
Este estudo iniciou-se a partir da confirmação de uma mastite causada pelo P.
brasiliensis em uma vaca da raça holandesa, de uma fazenda do município de Itabirito,
MG. Não houve como coletar nenhum material desta vaca, uma vez que ela foi sacrificada
antes da realização das coletas.
Desta forma, foram obtidas amostras de soro e tecidos de outras 14 vacas da
mesma fazenda, que também foram sacrificadas por estarem doentes, mas sem
confirmação do diagnóstico da paracoccidioidomicose. As coletas dos tecidos foram
realizadas no Frigorifico da Fazenda, pelos próprios veterinários da fazenda, no momento
do abate das vacas (Figura 8).
Esta coleção de soros e tecidos foi estocada no Banco de amostras de bovinos do
Laboratório de Micologia da Santa Casa de Belo Horizonte. Estas amostras estão
armazenadas a 20ºC negativos.
Para a realização de um inquérito sorológico por ELISA de vacas de outras
fazendas dentro do Estado de Minas Gerais, foram obtidos 122 soros de bovinos,
gentilmente cedidos pela coleção de soros bovinos do Laboratório de Virologia, do
ICB/UFMG. Esta soroteca foi formada a partir de coletas em todo o Estado de Minas
Gerais, para pesquisa soro-epidemiológica de viroses que acometem o rebanho do Estado.
As amostras de soros foram divididas em alíquotas de 3mL e congeladas a 20ºC
negativos, para análises de ELISA.
Para a padronização da técnica de ELISA foram utilizadas 10 amostras de soro das
vacas da fazenda no município de Itabirito, MG.
Para a padronização da técnica de PCR foram utilizadas 14 amostras de tecidos das
vacas da fazenda no município de Itabirito, MG.
31
Figura 9: Coleta de fragmentos de tecidos das 14 vacas da fazenda do município de Itabirito, MG.
4.2.
ELISA (enzyme-lynked immunosorbent assay)
Conforme técnica descrita em SANTOS et al (2012), as placas de microtitulação
MaxiSorpTM Surface (NUNCTM Brand Products, Rochester, NY, USA) contendo 96 poços
foram sensibilizadas com 1μg/100μl dos antígenos Pb27r e MEXO, solúveis em tampão
carbonato/bicarbonato 0,05M pH 9.6, overnight à 4ºC. Em seguida, as placas foram
lavadas por 5 vezes com PBS-tween e bloqueadas através da incubação durante 1 hora a
37ºC com 200μl de solução de PBS-caseína 1,6%.
Obs: Os antígenos MEXO e PB27r são produzidos no Laboratório de Imunologia, do
Departamento de Bioquimica e Imunologia, ICB-UFMG e foram fornecidos para o
desenvolvimento deste estudo.
Após o bloqueio, as placas foram novamente lavadas por 5 vezes e, posteriormente
foram adicionados nos poços, 100μL das diluições (em PBS-caseína 0,25%) dos soros
teste, controle negativo e controle positivo dos bovinos. Acrescentado o anticorpo primário,
as placas foram incubadas por 1 hora a 37ºC e, em seguida, lavadas por 10 vezes para
posterior adição de 100μl do anticorpo secundário marcado com a enzima peroxidase
(Anti-bovine IgG –whole molecule – peroxidase antibody produced in rabbit, Sigma,
Missouri, USA) na diluição de 1:10.000 de PBS-caseína 0,25%. As placas, após
novamente serem incubadas por 1 hora a 37ºC e lavadas 10 vezes, passaram pelo
processo de revelação, no qual foram adicionados 100 μL da solução reveladora contendo
TMBplus. As revelações foram interrompidas em 10 minutos com 50μL de H2SO4 2N.
A leitura dos resultados foi realizada no aparelho leitor de ELISA utilizando o filtro de
450nm. Todos os ensaios realizados foram acompanhados de controles sem antígenos,
sem soros e apenas com o conjugado.
Foi utilizado o programa GraphPad Prism 5 para análise dos dados obtidos através
do leitor de ELISA.
32
Nestes ensaios preliminares da padronização da técnica de ELISA, não houve
nenhum parâmetro clinico ou histológico para determinar os animais positivos ou negativos
para a paracoccidioidomicose. Desta forma os resultados da PCR, conjuntamente com as
médias dos maiores e menores valores de absorbância do teste de ELISA foram
considerados para determinar os valores de Cut-off para os antígenos Pb27r e MEXO.
33
4.3. Padronização das diluições dos soros para o ensaio com o antígeno Pb27r e MEXO
Para a determinação das diluições dos soros bovinos para o ensaio de ELISA
usando os antígenos MEXO e Pb27r, os soros de 10 vacas da fazenda do município de
Itabirito foram diluídos nas proporções 1/50; 1/100 e 1/200 em PBS-caseína 0,25%.
4.4.
Extração de DNA de amostras de tecidos
Para extração de DNA das amostras de tecidos das vacas foi utilizado o kit EZ-10
Spin Column Genomic DNA minipreps kit for blood (Ludwig, Porto Alegre, Brasil), seguindo
as especificações do fabricante.
O procedimento seguiu os seguintes passos:
 Um fragmento de tecido foi incubado em um microtubo contendo 300 uL de tampão
TBP (definição do fabricante) e 2μL de proteinase K a 10 mg/mL, a 370C por 16
horas. Em seguida a amostra foi homogeneizada no vortex e centrifugada a 3000g
por 3 minutos. O sobrenadante foi descartado e lavado por 3 vezes com TBP
(definição do fabricante).
Após a ultima lavagem com TBP e descarte do
sobrenadante, adicionou-se 500 μL do tampão TBM (definição do fabricante).
Homogeneizou-se 1 minuto no vórtex e adicionou novamente 3μL de proteinase K a
10 mg/mL. Foi realizado um período de incubação de 30min a 55 oC no banho seco.
Em seguida foi centrifugado por 2 minutos a 5000g;
 O sobrenadante foi recuperado em um novo microtubo limpo, contendo 260 μL de
etanol absoluto e transferido todo o conteúdo obtido anteriormente para a coluna do
kit encaixada no tubo coletor;
 A mostra coletada foi centrifugada a 8000g por 1 minuto e o filtrado foi descartado.
Foram adicionados 500μL do tampão de lavagem, em seguida foi realizada uma
centrifugação a 8000rpm por 1 min;
 A coluna foi centrifugada por 1 min a 8000g para retirar o restante do tampão e
secar a membrana da coluna. Foram adicionados 50μL do tampão de eluição
aquecido a 500C, incubado por 2 min e centrifugado por 1 minuto a 10000g. A
amostra final foi identificada e armazenada a -20 C;
34
4.5.
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Com a finalidade de amplificar um fragmento de 156 pares de bases do gene da proteína
Pb27r, foi realizada a reação de nested-PCR, utilizando iniciadores desenhados pelo
programa Primer3 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) e descritos abaixo:
Primer PB227 (P1) -
5’ – CCG ACT TTG AAG GAG TCA GC – 3’
Primer PB225 (P2) - 5’ – GCA CAC CAT TCC CGC ATA CA – 3’
Primer PB411: (P3) - 5’ – TTT GAC CTT CTG ACC GTT GA – 3’
Primer PB444: (P4) - 5’ – CTT TTC ACG CAG GAT CCA TT – 3’
Inicialmente foi realizada a PCR-Out utilizando os iniciadores PB227 e PB444,
amplificando uma região de 217pb. Em seguida, utilizando o fragmento gerado pela PCROut como alvo do anelamento dos iniciadores PB255 e PB411, foi realizada a NestedPCR, que amplifica um fragmento de 156pb. A concentração dos reagentes e os ciclos de
amplificação para as duas reações de PCR são idênticas (Tabela 2 e Quadro 1).
Tabela 1: Protocolo da reação de amplificação do DNA.
Reagentes
H2O
ultrapura
estéril
Tampão
MgCl2
DNTP
P1 ou P2
P4 ou P3
Taq
DNA
Volume TOTAL
Iniciadores:
Conc. Inicial
-
Conc. Final
-
X1
13,9L
X 20
264,1uL
10X
50 mM
10 mM
12Mol
12Mol
5UI/L
-
1X
1,0 mM
0,2 mM
0,3 Mol
0,3 Mol
1,5UI/L
-
2,0L
0,4L
0,4L
0,5L
0,5L
0,3L
2,0L
20,0L
38L
7,6L
7,6L
9,5L
9,5L
5,7L
P1 foward P4 reverse - PCR out
P2 forward P3 reverse – PCR in (nested)
342L
35
Obs: A PCR-nested foi realizada utilizando 1 μL do produto da amplificação (amplicon) da
PCR out de cada amostra, diluído a 1:10 (5 μL do amplicon em 45 μL de H2O ultrapura
estéril).
Quadro 1: Ciclos de amplificação da PCR-OUT e nested-PCR.
Nº DE
ETAPA DA
CICLOS
AMPLIFICAÇÃO
1
35
1
PCR – OUT
nested - PCR
Desnaturação
95ºC - 5 minutos
95ºC - 5 minutos
Anelamento
60ºC – 30 segundos
60ºC – 30 segundos
Extensão
72ºC – 30 segundos
72ºC – 30 segundos
Desnaturação
95ºC – 30 segundos
95ºC – 30 segundos
Extensão
72ºC – 7 minutos
72ºC – 7 minutos
As reações de amplicação foram realizadas na máquina MJ Research, Programable
thermal controller - Inc. PTC – 100TM .
As amostras amplificadas, segundo a programação acima, foram visualizadas em
gel de agarose a 1% em tampão TAE 1X, juntamente com corante SYBR Safe (DNA gel
stain, Invitrogen, Eugene, Oregon, USA). A corrida foi realizada em 30 minutos a 85 volts.
Para marcação do peso molecular, foram os marcadores de peso molecular de 1000 e 100
bp (Invitrogen, Eugene, Oregon, USA).
4.6.
Eletroforese em gel de Acrilamida
Para o preparo do gel, foram utilizados 8 mL de Gel de Bis Acrilamida 7% , 240 L
persulfato de potássio e 10 L Temed. A corrida eletroforética foi realizada a 220 v, 150 W
por 1 hora e meia, em cuba, contendo tampão TBE (Tris- Borato EDTA) 1X, e o gel foi
corado com Nitrato de Prata 2%.
36
5. RESULTADOS
5.1. Padronização das diluições dos soros para o ensaio com o antígeno Pb27r.
Conforme apresentado na figura 10, os soros diluídos na proporção de 1/50 em PBS
apresentaram leituras de absorbância mais definidas, com picos de densidade ótica
acentuados.
Comparação das diluições dos soros
utilizando o antígeno recombinante Pb27r
OD (450NM)
0.3
1/50
1/100
1/200
0.2
0.1
0.0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10 11
Amostras
Legenda: Soro nas diluições 1:50, 1:100, 1:200 – conjugado na diluição 1:30 -
Gráfico 1: Comparação da leitura das densidades óticas, frente ao antígeno Pb27r, nas diferentes diluições
dos soros bovinos.
37
5.2. Padronização das diluições dos soros para o ensaio com o antígeno MEXO
Conforme apresentado na figura 11, os soros diluídos na proporção de 1/50 em PBS apresentaram
leituras de absorbância mais definidas, com picos de densidade ótica acentuados.
Comparação das diluições dos soros
utilizando o antígeno MEXO
OD (450NM)
0.4
1/50
1/100
1/200
0.3
0.2
0.1
11
9
10
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0.0
Amostras
Legenda: Soro nas diluições 1:50, 1:100, 1:200 - conjugado na diluição 1:30
Gráfico 2: Comparação da leitura das densidades óticas, frente ao antígeno MEXO, nas diferentes diluições
dos soros bovinos.
38
5.3. Comparação dos resultados de ELISA, utilizando os antígenos MEXO e Pb27r
A figura 12 representa a distribuição das densidades óticas dos soros das 136 vacas, analisados
pelo método de ELISA, utilizando os antígenos MEXO e Pb27r.
2.5
OD (450NM)
2.0
1.5
1.0
0.5
27
rP
b
M
ex
o
0.0
Gráfico 3: Comparação da leitura das densidades óticas para todas as 136 amostras de soros bovinos,
comparando os antígenos MEXO e Pb27r.
39
A figura 13 representa a distribuição das densidades óticas dos soros das 136 vacas analisados
pelo método de ELISA, utilizando o antígeno MEXO. Os dados são representados em
porcentagem.
Dentre as 136 amostras testadas, 64% (n= 87) apresentaram uma leitura acima do Cut-off e 36%
(n= 49) apresentaram uma leitura abaixo do Cut-off.
MEXO
2.5
OD (450NM)
2.0
1.5
1.0
64%
0.5
36%
0.0
MEXO positivo
cutoff
MEXO negativo
Gráfico 4: Comparação da leitura das densidades óticas para todas as 136 amostras de soros bovinos,
comparando o antígeno MEXO. Resultado em porcentagem.
40
A figura 14 representa a distribuição das densidades óticas dos soros das 136 vacas analisados
pelo método de ELISA, utilizando o antígeno Pb27r. Os dados são representados em
porcentagem.
Dentre as 136 amostras testadas, 45% (n= 61) apresentaram uma leitura acima do cut-off e 55%
(n= 75) apresentaram uma leitura abaixo do cut-off.
Pb27r
2.5
OD (450NM)
2.0
1.5
1.0
0.5
45%
55%
pb
27
r-
cu
to
ff
pb
27
r+
0.0
Gráfico 5: Comparação da leitura das densidades óticas para todas as 136 amostras de soros bovinos,
comparando o antígeno Pb27r. Resultado em porcentagem.
41
A figura 15 representa a distribuição das amostras de soros positivos (acima do cut-off), dentre as
136 vacas analisados pelo método de ELISA, utilizando os antígenos Pb27r e MEXO. Os dados
são representados em porcentagem.
Dentre as 136 amostras testadas, 65% (n= 88) apresentaram resultados positivos (leitura acima do
cut-off ) para os testes de ELISA utilizando os antigenos Pb27r ou Mexo. 35% (n= 48)
apresentaram uma leitura negativa (abaixo do cut-off).
Gráfico 6: Porcentagem de amostras positivas para Mexo e Pb27r. n=136.
42
A figura 16 representa a distribuição das amostras de soros positivos (acima do cut-off), utilizando o
antígeno Pb27r e Mexo e positivas para a PCR. Dentre as 14 amostras testadas 64% (n= 9)
apresentaram resultados positivos para os três métodos. Os dados são representados em
porcentagem.
Gráfico 7: Porcentagem de amostras positivas para os tres métodos Mexo, Pb27r e PCR. n=14.
43
5.4.
PPM
Comparação dos resultados da PCR nas diferentes amostras.
1
2
3
4
5
6
7
8
PCR-Out
9
1- Controle Positivo – amostra de P.brasiliensis
padrão (código 31 AMS)
2- Controle Negativo
217pB
3456789-
vaca A1 – Total
vaca A2 – Total
vaca A3 – Total
vaca A4 – Total
vaca A5 – Total
vaca A6 – Total
vaca A7 – Total
Figura 17: gel corado pela prata, apresentando os fragmentos amplificados pela técnica de PCR–out.
A PCR-out, que amplifica o fragmento de 217 pares de base apresentou amplificação na
amostra padrão de P. brasiliensis – controle positivo da reação, confirmando a
amplificação do fragmento desejado.
O controle Negativo não amplificou, confirmando que não houve contaminação na reação.
44
1 PPM
2
3
4
5
6
7
8
9
Nested
1- vaca A2 - Total
2- vaca A2 – 1:10
3- vaca A4 - Total
4- vaca A9 - Total
5- vaca A13 - Total
6- vaca A14 – Total
7- Aspergillus flavus
8- Controle Negativo
156p
B
9- Controle Positivo – amostra de
P.brasiliensis padrão (código 31 AMS)
Figura 18: gel corado pela prata, apresentando os fragmentos amplificados pela técnica de PCR–nested.
A PCR-nested, que amplifica o fragmento de 156 pares de base, apresentou amplificação
na amostra padrão de P. brasiliensis – controle positivo da reação, confirmando a
amplificação do fragmento desejado.
O controle Negativo não amplificou, confirmando que não houve contaminação na reação.
A amostra de DNA do fungo A. flavus não amplificou.
45
6. DISCUSSÃO
De acordo com os resultados obtidos, podemos observar que o teste de ELISA,
para detecção de anticorpos anti- P. brasiliensis em bovinos forneceu dados relevantes
sobre o comportamento imunológico dos mesmos. Neste estudo, observaram-se os altos
níveis de anticorpos para os antígenos Pb27r e MEXO de P. brasiliensis, corroborando
com os estudos de SILVEIRA e colaboradores (2005), no qual concluíram que bovinos
imunizados com P. brasiliensis induzem resposta imune humoral com altos índices de
anticorpos, porém contra o antígeno gp43.
Os ensaios do teste ELISA foram realizados diluindo-se os soros dos bovinos em
50, 100, e 200 vezes. Nesta titulação dos soros, observamos que a diluição de 1:50 foi a
que apresentou melhor resolução (Figuras 10 e 11). Verificou-se nas diluições 100 e 200
vezes uma diminuição acentuada dos valores de absorbância, com tendência de
aproximação dos valores. Assim, optou-se pela diluição de 50 vezes, pelo fato de
apresentar melhor visualização e diferença significativa entre os grupos. O mesmo ocorreu
no trabalho de MINOZZO e colaboradores (2004), que utilizaram a técnica para diagnóstico
da cisticercose bovina.
A partir da definição dos valores de “cut off” (UPTON 2005), 36% dos animais foram
considerados negativos para a paracoccidioidomicose e 64% animais foram considerados
positivos para a paracoccidioidomicose. Estes dados demonstraram a presença de
anticorpos contra os antígenos de P. brasiliensis o que poderia significar que animais com
PCM poderiam estar escapando às metodologias de rotina. Essa conclusão corrobora com
os estudos de MINOZZO et al. ( 2004) em que, no mesmo método de diagnóstico, os
bovinos negativos para a cisticercose demonstraram a presença de anticorpos. Estes
autores concluíram que os dados da inspeção de rotina poderiam não estimar a real
incidência da cisticercose bovina, após observarem presença de cisticercos através de
cortes paralelos em animais considerados negativos nessa inspeção. Dessa forma, a
técnica utilizada para diagnóstico individual, poderia não detectar alguns animais em fase
crônica.
Segundo a Organização Mundial da Saúde (1994), o ensaio de ELISA para
diagnóstico da tuberculose bovina deve ser utilizado como um exame complementar aos
ensaios baseados na imunidade celular e se mostra útil para identificar a infecção em
animais anérgicos. Porém, mesmo sendo um método simples, rápido e de fácil execução,
46
tanto a sua especificidade quanto a sua sensibilidade precisariam ainda ser aperfeiçoadas
RUGGIERO et al. (2007), o que podemos extrapolar para a paracoccidioidomicose.
A partir dos resultados, observa-se a necessidade de obtenção de um maior número
de amostras confirmadamente negativas e positivas, dando-nos maior confiabilidade aos
testes e resultados. Assim, talvez, a absorbância seria mais bem discriminada entre os
diferentes grupos possibilitando a criação de um “cut off” que diferenciaria melhor os
controles negativos dos positivos.
Será necessária também a inclusão de antígenos específicos para outras doenças,
como a esquistossomose, por exemplo, nos testes de ELISA e Western-Blotting. Com a
inclusão destes antígenos será possível observar se os soros controles negativos não
reagem para uma doença pouco comum entre bovinos, descartando assim, as reações
cruzadas. Infelizmente, devido ao curto espaço de tempo, não foi possível adquirir estes
antígenos antes da finalização do prazo de entrega desta dissertação.
Tendo em vista que a técnica de ELISA, embora relativamente simples, não
identifica os antígenos reconhecidos na resposta imune do animal examinado, em um
estudo anterior, desenvolvido no laboratório de imunologia do Departamento de Bioquimica
e imunologia, ICB-UFMG, utilizou-se a técnica de Western-blotting, como ferramenta
confirmativa e comprobatória de diagnóstico (ANEXO 1).
Conforme os dados apresentados neste estudo, para a confirmação da presença de
anticorpos anti-P. brasiliensis utilizou-se como antígenos a proteína recombinante Pb27r e
MEXO nos soros dos bovinos.
A reação mais intensa foi contra a Pb27r pura. O mesmo ocorreu nos estudos de
GONZÁLEZ et al. (1999) e CORREA et al., (2007), no qual os autores utilizaram Westernblotting para detecção de anticorpos contra o vírus da leucose em soros de 233 bovinos
naturalmente e experimentalmente infectados. Neste estudo, observaram diferentes níveis
de reatividade para as proteínas específicas da doença.
Ainda neste estudo, foram testados, com a mesma técnica, dois soros fetais bovinos
(BSF) distintos – o primeiro proveniente de fazendas do Brasil e o segundo proveniente de
fazendas dos Estados Unidos (Gibko, USA), para verificar se esses soros também
apresentariam reatividade, uma vez que por se tratar de soros de fetos, esperava-se que
fossem bons controles negativos, observando que os soros fetais não foram positivos.
A partir dos resultados de ELISA, pode-se considerar que a maioria (64%) dos
bovinos testados possuem anticorpos que reajam com o antígeno MEXO e com as
47
proteínas específicas e puras do fungo P. brasiliensis (Pb27r). Isto pode estar ocorrendo
devido a uma reação cruzada com outras doenças, pelo contato direto desses animais com
o solo e a vegetação, ou pelo fato de que possa ocorrer a passagem dos anticorpos da
mãe para bezerro logo após o nascimento.
A proteína recombinante de 27kDa também tem sido detectada pelas técnicas de
biologia molecular. RESTREPO et al. (2001), utilizaram sondas capazes de detectar gene
específico de 27kDa na tentativa de isolamento do fungo diretamente de amostras de solo
experimentalmente contaminados pelo P. brasiliensis.
De acordo com os resultados gerados pela técnica de nested-PCR, podemos
observar que dentre as 14 vacas, 10 vacas apresentaram amplificação para a região do
gene da Pb27r. Para todas estas vacas que apresentaram resultados positivos para a
nested-PCR também apresentaram uma alta leitura de absorbância nos testes de ELISA.
A técnica de nested-PCR é muito importante quando se deseja amplificar um
fragmento de poucas cópias no genoma, em material biológico, sendo uma das
alternativas para aumentar a sensibilidade da reação de PCR no diagnóstico molecular
ZANDEN (2002). Esta técnica consiste na re-amplificação, com iniciadores internos, de um
fragmento amplificado em uma primeira reação. Esta técnica tem sido utilizada por outros
autores, com sucesso para a amplificação de outras regiões no genoma de P. brasiliensis
(BIALEK et al., (2000); RUGGIERO et al. (2007). Entretanto, utilizando os pares de
iniciadores desenhados neste estudo, observamos que a nested-PCR pode ser uma
ferramenta muito importante nos estudos de diagnóstico e epidemiológico da PCM em
bovinos.
De acordo com as figuras 17 e 18 foram amplificados fragmentos de 217 pb, pela
PCR-out e de 156 pb pela PCR-in, confirmando o tamanho esperado pelo desenho de
iniciadores. Embora a reação de PCR tenha se apresentado muito bem padronizada no
laboratório, ainda será necessário confirmar se o produto da amplificação, de 156 pb é
realmente a região do gene da proteína Pb27r. Esta confirmação seria realizada pelo
sequenciamento nucleotídico deste amplicon. Infelizmente, devido ao curto espaço de
tempo, não foi possível de realizar este sequenciamento nucleotíco para confirmação da
amplificação do fragmento do gene da Pb27r.
Levando-se em conta a extrema importância da agropecuária na economia
brasileira, já descrita por alguns autores (VERCESI FILHO, 2000; GEHLEN, 2001;
FREITAS et al., 2007), este estudo vem demonstrar que os programas de controle da PCM
48
em animais domésticos carecem de ensaios rápidos e sensíveis para diagnóstico da
doença, principalmente em regiões onde a doença é endêmica.
49
7. CONCLUSÕES
De acordo com os dados apresentados pode-se concluir que:
Que a técnica de ELISA, utilizando o antígeno MEXO e Pb27r de P. brasiliensis,
apresentou bons resultados e pode ser aplicada em estudos de diagnóstico sorológico e
epidemiologia da paracoccidioidomicose;
Que a técnica de PCR, utilizando os iniciadores desenhados para detecção do gene
da proteína Pb27r pode ser aplicada em estudos de diagnóstico sorológico e epidemiologia
da paracoccidioidomicose.
50
8. ESTUDOS PROSPECTIVOS
A partir dos resultados preliminares, o presente trabalho demonstra a possível
aplicação do teste ELISA como ferramenta para estudos epidemiológicos da PCM e na
identificação dos animais infectados. Maiores ajustes da técnica poderão auxiliar no
esclarecimento da resposta imunológica em bovinos para a PCM e ainda, esclarecer sobre
os aspectos epidemiológicos da distribuição da doença em animais domésticos.
Há de se considerar a necessidade de maiores estudos quanto ao assunto, pela sua
importância para a economia brasileira e mundial e, principalmente para a saúde pública.
Vários problemas ainda precisam ser solucionados, tais como a identificação do
micro habitat exato do Paracoccidioides brasilienses, o modo de viver saprofítico na
natureza e a relação do fungo com o seu ambiente e se há possibilidades de infecção
humana a partir do uso de produtos de origem animal. Estas questões são importantes e,
até que elas se esclareçam, a prevenção da paracoccidioidomicose continuará sendo uma
tarefa difícil.
51
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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Paracoccidioides brasiliensis in dogs with leishmaniasis. Mycopathologia, 162: 325–329
SILVEIRA, L.H.; PAES, R.C.S.; MEDEIROS, E.V.; ITANO, E.N.; CAMARGO, Z.P.; ONO, M.A.
2005. Paracoccidioidomycosis - Infection in Bovine from Microregions of Mato Grosso do Sul –
Brazil. IX International Meeting on Paracoccidioidomycosis . Rev. Inst. Med. trop. S. Paulo, 47(14).
TOBÓN, A.; RESTREPO,A.;GÓMEZ,B.L. 2012. Paracoccidioidomycosis: Latin America’s Own
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polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proc. Natl. Acad.
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56
UPTON A, A.GUGEL,W.LEISENRING,A.LIMAYE,B. ALEXANDER, R. HAYDEN AND K.
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Econômicos para Seleção de Gado de Leite. Rev. bras. zootec., 29(1):145-152.
VIDAL, M.S.M.; MELO, N.T.; GARCIA, N.M.; DEL NEGRO, G.M.B.; ASSIS, C.M.; HEINSVACCARI, E.M.; NAIFF, R.D.; MENDES, R.P. e LACAZ, C.S.1995. Paracoccidioides brasiliesis. A
mycologic and immunochemical study of a sample isolated from na armadillho (Dasipus
novencinctus). Rev. Inst. Med. Trop. 37(1):43-49.
57
10. APÊNDICE 1
10.1 Banco de dados de ELISA (cut-off)
Os cutt-offs foram estabelecidos da seguinte forma:
Das 14 amostras em que foram realizados os testes de ELISA ( Pb27r e Mexo) e PCR,
foram selecionadas as amostras V3 e V14 como controle positivo (pois deram positivo para
todos os testes ) e V1 e V7 como controle negativo ( pois deram negativo para todos os
testes ).
Uma vez verificados os resultados para todos os testes, o procedimento foi o seguinte:
Foram obtidas as medias positivas e negativas para MEXO
Resultados positivos do MEXO
V3 Leituras Média
0,586
0,5495
0,513
V14 0,613
0,489
0,551
Média dos resultados
(0,5495 + 0,551)/2 = 0,55025
Resultados negativos do MEXO
V1 Leituras Média
0,341
0,3475
0,354
V7 0,353
0,471
0,412
Média dos resultados
(0,3475 + 0,412)/2 = 0,37975
Uma vez estabelecidas as medias de controle do MEXO, foi tirada a media desses valores
e assim obtido o Cutt-off positivo para o MEXO.
Média dos resultados
(0,55025 + 0,37975)/2 = 0,465
58
O mesmo procedimento foi realizado com o Pb27r
Foram obtidas as medias positivas e negativas para Pb27r
Resultados positivos do Pb27r
V3 Leituras Média
0,588
0,518
0,448
V14 0,411
0,451
0,531
Média dos resultados
(0,518 + 0,531)/2 = 0,5155
Resultados negativos do Pb27r
V1 Leituras Média
0,349
0,279
0,209
V7
0,178
0,163
0,1705
Média dos resultados
(0,279 + 0,1705)/2 = 0,22475
Uma vez estabelecidas as medias de controle do Pb27r, foi tirada a media desses valores
e assim obtido o Cutt-off para o Pb27r.
Média dos resultados
(0,5155 + 0,22475)/2 = 0,3701
59
10.2 Banco de dados de ELISA
14:50:01 ID-P20120920-9
MEXO
0,547
1,194
0,57
0,513
0,414
0,336
0,594
0,933
0,599
0,182
0,047
0,512
0,756
0,538
0,469
0,44
0,302
0,381
0,659
0,485
0,309
0,051
0,322
0,475
0,25
0,367
0,427
0,453
0,514
0,553
0,358
0,186
0,061
0,845
1,146
0,418
0,636
0,514
0,451
0,743
0,979
0,553
0,215
0,052
0,502
0,978
0,326
0,717
0,475
0,645
0,418
0,535
0,241
0,38
0,062
0,615
0,974
0,463
1,047
0,566
0,696
0,261
0,58
0,22
0,694
0,064
0,349
0,91
0,282
0,46
0,427
0,326
0,399
0,473
0,378
0,606
0,064
0,302
0,763
0,418
0,185
0,359
0,447
0,431
0,243
0,393
0,293
0,07
0,28
0,314
0,299
0,42
0,239
0,623
0,176
0,05
14:59:58
PB27
0,41
0,496
0,344
0,419
0,475
0,378
0,27
0,316
0,408
0,385
0,357
0,724
0,206
0,055
0,321
0,202
0,247
0,412
0,39
0,288
0,238
0,243
0,618
0,153
0,066
0,276
0,426
0,384
0,167
0,481
0,29
0,386
0,413
0,522
0,179
0,053
0,271
0,179
0,204
0,607
0,262
0,248
0,334
0,212
0,193
0,277
0,068
0,272
0,212
0,235
0,491
0,222
0,294
0,329
0,209
0,211
0,183
0,077
0,395
0,279
0,303
0,306
0,242
0,18
0,277
0,253
0,208
0,266
0,075
0,245
0,333
0,331
0,193
0,227
0,171
0,335
0,362
0,183
0,313
0,067
60
MEXO 18/10/2012
18/10/2012
coluna 1
16:31:57
coluna 2
coluna 3
coluna 4
coluna 5
coluna 6
coluna 7
coluna 8
coluna 9
coluna 10
coluna 11
coluna 12
0,076
0,304
0,442
0,688
0,327
0,252
0,512
0,586
0,353
0,689
0,073
0,077
0,072
0,31
0,305
0,371
0,45
0,503
0,619
0,513
0,471
0,634
0,083
0,072
0,086
1,246
0,464
0,694
0,165
0,625
0,464
0,599
0,442
0,879
0,076
0,818
0,081
1,239
0,467
0,526
0,252
0,913
0,424
0,728
0,973
0,943
0,063
0,587
0,196
0,569
0,997
0,595
0,915
0,609
0,341
0,972
0,745
0,974
0,073
0,072
0,088
0,478
1,108
0,435
0,898
0,774
0,354
0,942
0,424
1,406
0,068
0,062
0,136
0,512
0,523
0,77
1,311
1,538
0,902
0,886
1,168
0,613
0,097
0,072
0,107
0,606
0,543
0,881
0,778
1,132
0,697
0,643
0,899
0,489
0,072
0,067
0,133
0,164
PB 18/10/2012
18/10/2012
16:39:48
0,062
0,306
0,244
0,725
0,278
0,211
0,237
0,588
0,178
0,238
0,099
0,186
0,146
0,946
0,294
0,251
0,196
0,448
0,163
0,267
0,07
0,236
0,117
0,302
0,183
0,19
0,137
0,179
0,259
0,404
0,285
0,33
0,108
0,521
0,082
0,197
0,156
0,223
0,12
0,187
0,257
0,381
0,236
0,321
0,059
0,568
0,109
0,183
0,274
0,167
0,62
0,507
0,349
0,766
0,264
0,381
0,115
0,296
0,445
0,152
0,456
0,232
0,646
0,821
0,209
0,754
0,484
0,57
0,07
0,178
0,255
0,208
0,216
0,177
0,343
0,263
0,155
0,418
0,177
0,411
0,081
0,102
0,361
0,206
0,277
0,176
0,59
0,24
0,237
0,506
0,277
0,651
0,093
0,116
61
MEXO1
23/11/2012
23/11/2012
19:02:04
0,064
1,683
1,61
1,606
0,816
0,747
1,084
0,043
0,99
1,066
0,061
0,051
0,09
1,765
2,117
2,305
1,839
2,065
2,016
0,053
1,432
1,664
0,067
0,052
0,088
2,232
2,073
2,149
0,067
2,053
1,44
0,056
1,76
1,651
0,065
0,058
0,066
2,386
2,273
2,352
0,062
2,314
1,549
0,048
1,449
1,489
0,053
0,049
0,099
2,555
2,737
1,797
1,913
1,742
1,824
0,074
2,158
2,493
0,084
1,359
0,152
1,904
1,837
1,154
1,175
1,759
1,307
0,049
1,253
1,746
0,083
0,907
0,114
2,174
1,418
1,035
1,195
1,455
1,396
0,084
0,918
1,443
0,11
1,255
0,081
1,025
0,843
0,843
0,652
1,231
0,864
0,07
0,674
0,966
0,068
0,818
PB27 1
23/11/2012
23/11/2012
19:36:27
0,081
0,41
1,399
1,831
0,789
0,731
0,557
0,053
0,787
0,992
0,063
0,087
0,068
0,823
1,643
2,088
1,065
1,054
0,645
0,067
0,93
0,949
0,069
0,056
0,068
1,944
1,118
1,178
1,318
1,026
1,031
0,058
0,893
0,995
0,075
0,071
0,061
2,086
1,067
1,247
1,176
0,962
0,951
0,054
0,78
0,841
0,082
0,077
0,055
1,172
1,16
0,721
0,746
1,177
0,761
0,103
0,661
1,135
0,061
0,515
0,072
1,022
1,016
0,649
0,716
1,072
0,767
0,062
0,599
1,088
0,064
0,455
0,067
1,5
1,365
0,75
0,47
0,909
0,631
0,064
0,597
0,944
0,061
1,13
0,055
1,216
1,292
0,791
0,705
0,908
0,782
0,083
0,573
0,882
0,055
1,257
62
pb27 02
23/11/2012
23/11/2012
19:33:50
0,046
0,363
0,442
0,244
0,236
0,256
0,442
1,424
0,075
0,049
0,054
0,052
0,053
0,591
0,558
0,364
0,355
0,244
0,513
1,321
0,063
0,078
0,053
0,049
0,081
0,351
0,285
0,382
0,353
0,202
0,362
1,585
0,155
0,082
0,062
0,117
0,054
0,344
0,939
0,345
0,438
0,366
0,531
1,947
0,065
0,087
0,059
0,119
0,055
1,825
0,876
0,985
0,629
0,291
1,529
1,915
0,213
0,137
0,073
1,087
0,052
0,864
1,272
0,654
0,51
0,326
1,518
1,61
0,09
0,126
0,07
0,99
0,18
0,742
1,261
0,543
0,704
0,672
0,119
0,924
0,062
0,125
0,074
0,708
0,056
0,573
0,649
0,579
0,534
0,411
0,105
0,43
0,113
0,051
0,073
0,486
MEXO 02
23/11/2012
23/11/2012
19:40:01
0,046
0,379
0,327
0,578
0,39
0,418
0,272
0,939
0,046
0,043
0,048
0,069
0,055
1,824
1,154
0,433
0,752
0,413
0,499
1,194
0,051
0,05
0,051
0,048
0,061
0,675
2,397
1,97
0,719
1,262
0,958
1,79
0,13
0,145
0,062
0,057
0,097
0,824
1,161
1,171
1,408
1,058
0,971
1,803
0,144
0,088
0,055
0,052
0,066
1,423
2,06
1,961
0,449
1,142
0,717
1,538
0,175
0,162
0,07
1,011
0,053
1,727
1,635
1,793
1,61
0,57
0,409
1,162
0,176
0,057
0,06
0,824
0,077
2,225
1,455
1,042
0,342
0,947
0,199
1,026
0,112
0,086
0,076
0,972
0,122
0,763
0,753
2,406
0,612
2,112
0,13
0,972
0,083
0,129
0,097
1,095
63
11. ANEXO 1
Resultados apresentados pela técnica de Western-blot, desenvolvida em um projeto de
Iniciação científica.
64
Francine Carla de Souza Silveira
PADRONIZAÇÃO DAS TÉCNICAS DE ELISA, PCR E WESTERN-BLOTTING NO
DIAGNÓSTICO DA PARACOCCIDIOIDOMICOSE EM BOVINOS
Monografia apresentada ao Departamento de
Ciências Biológicas Licenciatura e Bacharelado com
ênfase em Gestão Ambiental da Pontifícia
Universidade Católica de Minas Gerais.
Orientadora:
Dra. Rachel Basques Caligiorne
Núcleo da Pós-Graduação da Santa Casa de Belo
Horizonte
Colaboradores:
Dr. Alfredo Miranda de Góes
M. Viviane Cristina Fernandes
Depto de Bioquímica e Imunologia - UFMG
65
Resultados e discussão apresentados na monografia:
4.2 Western-Blotting
Tendo em vista que a técnica de ELISA, embora relativamente simples, não
identifica os antígenos reconhecidos na resposta imune do animal examinado, utilizou-se a
técnica de Western-blotting, como ferramenta confirmativa e comprobatória de diagnóstico.
Para a confirmação da presença de anticorpos anti-P. brasiliensis utilizou-se como
antígenos a proteína recombinante Pb27r e o antígeno bruto PbAg. As membranas de
nitrocelulose, após a transferência dos marcadores e dos antígenos, foram expostas a um
pool de soros, diluídos 1/50 e divididos em três grupos, sendo eles, controle positivo,
controle negativo e teste. O conjugado foi diluído 1:30.000, como também utilizado no
ELISA.
As figuras 5, 6 e 7 identificam as reações dos soros considerados, controles
positivos, controles negativos e testes, respectivamente, com os antígenos bruto e
específico de P. brasiliensis.
A reação mais intensa foi contra a Pb27r pura. Já a reação contra o PbAg
apresentou diferentes padrões de reconhecimento de antígenos, que variou de acordo com
os diferentes grupos de soros utilizados, como pode ser observado na figura 7 em
comparação as figuras 5 e 6.
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Para se entender os níveis elevados de anticorpos presentes em todos os três
grupos de amostras, inclusive no grupo composto por soros de animais aparentemente
saudáveis, foram testados, com a mesma técnica, dois soros fetais bovinos (BSF) distintos
– o primeiro proveniente de fazendas do Brasil (figura 8) e o segundo proveniente de
fazendas dos Estados Unidos (Gibko, USA) (figura 9), para verificar se esses soros
também apresentariam reatividade, uma vez que por se tratar de soros de fetos, esperavase que fossem bons controles negativos. Para esse teste levou-se em consideração a falta
de um controle conhecidamente negativo e o endemismo da doença no território brasileiro.
Nas figuras 8 e 9, observa-se que os soros fetais brasileiro e estrangeiro, não
reagiram com os antígenos utilizados na reação.
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Pelo exposto pode-se concluir que o Western-blotting é uma técnica que tem
potencial emprego no diagnóstico da PCM, precisando ser mais amplamente avaliada.
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12. ANEXO 2
Artigo revisão sobre a paracoccidioidomicose, publicado em 2011.