Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
Departamento de Botânica
Sebenta de Fisiologia
Celular
Alda Almeida 2007/2008
Fisiologia Celular  Parte da Biologia que estuda os fenómenos vitais, ou seja, as
funções pelas quais a vida se manifesta.
 A Fisiologia, como Ciência independente, com os seus métodos e os seus fins, ganhou
o seu verdadeiro impulso no séc. XIX.
 Por volta de 1800, todos os fenómenos do organismo eram atribuíveis a um princípio
geral que presidia ao conjunto das funções vitais (Força Vital) e não a factores fisicoquímicos.
Doutrina do Vitalismo (Professada por Bordeu e Barthez  Escola Francesa).
 Esta noção de força vital vai ser seriamente criticada pelos
fisiologistas do séc. XIX, particularmente François Magendie (17831855), que utilizou o método experimental apoiando-se, antes de mais,
nos resultados obtidos em laboratório.
Este investigador foi o mestre de Claude Bernard.
 Claude Bernard (1813-1878) foi um dos mais importantes
fisiologistas de todos os tempos. Formulou pela primeira vez o
importantíssimo conceito de homeostase (estabilidade controlada
de meio interno). Ele propôs que ―a fixidez do ambiente interno é
a condição para a vida livre‖.
 Claude Bernard fez da Fisiologia uma ciência independente com os seus métodos e
os seus fins. É considerado o principal iniciador do Método Experimental nas Ciências
Biológicas. Os processos do método experimental foram condensados pelo fisiologista
desta forma: ―O facto sugere a ideia; a ideia dirige a experiência; a experiência julga a
ideia‖.
Observação de factos  Observação sugere a hipótese (explicação provisória dos
factos)  Experimentação para verificar ou contradizer a hipótese  Formulação da lei
(generalização da relação causal descoberta).
 Nas Ciências Biológicas o Vitalismo criava uma separação nítida entre a química dos
seres vivos e a do mundo não-vivo.
 Friedrich Whoelher (1828) realizou a experiência que
determinou o fim das teorias vitalistas. A partir de uma
substância inorgânica (cianato de amónia) sintetizou um
composto orgânico (ureia).
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 O objecto da fisiologia é a física e a química dos seres vivos.
 A vida é difícil de definir porque não resulta de uma simples
propriedade da matéria. Podemos, no entanto, afirmar que os seres
vivos se diferenciam dos sistemas inorgânicos (não-vivos) por
estarem dotados de um conjunto de funções mais ou menos
complexas que são idênticas em todos eles: nutrição, crescimento,
reprodução, adaptação, auto regulação… É mais útil caracterizar os
seres vivos do que tentar definir a vida!
 Podemos caracterizar os organismos vivos por possuírem funções muito especiais e
também estruturas que lhe são características. As funções capacitam o ser vivo com a
propriedade da vida, já as estruturas permitem ao ser vivo executar as funções vitais.
Quais são essas funções e estruturas?
a) As reacções bioquímicas, chamadas vias metabólicas
são praticamente as mesmas em todos os organismos vivos;
b) A informação hereditária é codificada quimicamente
de modo idêntico em todos os organismos vivos.
As funções características da vida podem agrupar-se em duas grandes propriedades
vitais:
vida:
 Metabolismo, que inclui 4 actividades responsáveis pela manutenção da
1. Nutrição: Processo através do qual os seres vivos obtêm os materiais
necessários ao seu crescimento e à sua manutenção;
2. Respiração: Processo dos seres vivos obterem a maior parte da energia
necessária para a manutenção da sua actividade;
3. Síntese: Processo que permite aos seres vivos edificar a sua própria
estrutura;
4. Crescimento e Auto-Conservação: Processos que levam ao aumento
irreversível do tamanho e complexidade dos seres vivos.
 Auto-Prepetuação, que inclui 4 processos relacionados com a sobrevivência
dos seres vivos:
1. Reprodução: Capacidade que os seres vivos
tem de se auto-duplicarem;
2. Adaptação: Capacidade que os seres vivos
têm de se ajustarem às condições particulares de um
dado meio de modo a poderem sobreviver e a
reproduzir-se;
3. Fluxo de informação: Fluxo de informação codificado pelo DNA;
4. Auto-Regulação: Capacidade de os seres vivos em manterem as condições
internas constantes num meio variável.
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Membranas Biológicas:
Pensa-se que, inicialmente, no caldo primitivo as reacções ocorriam desordenada e
anarquicamente. Quando surgiu a primeira membrana, as diferentes reacções passaram
a decorrer simultaneamente, em compartimentos diferentes, tornando-se mais rápidas,
ordenadas e sincronizadas. Assim podemos dizer que a vida resulta de um conjunto de
reacções coordenadas e sincronizadas que se sucedem rigorosamente ordenadas no
espaço e no tempo.
 A compreensão da estrutura e função das
biomembranas é fundamental para a compreensão dos
fenómenos vitais  Objecto de estudo da Fisiologia
Celular
 As membranas biológicas são estruturas
diferenciadas que determinam a realização de funções
diferentes (Ex. Mitocôndrias e lisossomas). Apesar das
diferenças, todas as membranas têm atributos comuns.
As biomembranas são estruturas em folha, de pequena espessura (60 a 100 A°), que
formam fronteiras fechadas que separam compartimentos de composição distinta.
 A bicamada fosfolipídica é a unidade básica das biomembranas.
 Os lípidos membranares são moléculas anfifílicas ou anfipáticas (camada
hidrofóbica e hidrofílica), que, quando em solução aquosa formam espontaneamente
folhas bimoleculares fechadas.
A organização em bicamada nas biomembranas resulta predominantemente das
interacções dos fosfolípidos membranares (moléculas anfifílicas) com a água. Essas
interacções são uma consequência directa do Efeito Hidrofóbico. Este determina a
estrutura das membranas biológicas.
O que é o Efeito Hidrofóbico?
É o efeito pelo qual as cadeias hidrocarnonadas (apolares) dos fosfolípidos tendem a
―fugir‖ da fase aquosa.
A água exclui moléculas apolares da sua estrutura (esta apresenta pontes de
hidrogénio, que constituem uma ―rede‖ de difícil destruição).
Os fosfolípidos membranares assumem estruturas diferentes em solução aquosa.
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 Este efeito é também responsável pela inserção das proteínas membranares no
interior da membrana.
 As cadeias laterais dos aminoácidos apolares tendem a ―fugir‖ da água.
Exemplos de aminoácidos apolares:
 O efeito hidrofóbico depende directamente das propriedades da água.
 Não constitui uma força atractiva. Representa a incapacidade relativa da água em
―acomodar‖ espécies não-polares. Esta incapacidade resulta das características
moleculares e físicas da água que tem a propriedade especial de estabelecer ligações de
H que se estendem ordenadamente por toda a estrutura da água em forma de uma rede
de ligações de H.
Água:
 Estrutura da água no estado sólido. Cada molécula
encontra-se no centro de um tetraedro, ligando-se a 4 outras
moléculas por ligações de H, dando origem a uma estrutura
hexagonal (malha hexagonal).
No estado líquido a água apresenta uma estrutura de malha quadrangular.
 Devido a esta malha de ligações de hidrogénio existe uma enorme força de
coesão entre as moléculas de água. Assim, as interacções água-água possuem uma força
de atracção maior do que as interacções hexano-hexano ou hexano-água.
Por exemplo a energia livre de interacção entre a água e o hexano é de
aproximadamente – 40 ergs/cm2 de área de contacto.
1cal/mole = 6,9x10-17 ergs/molécula
 As forças atractivas entre as moléculas de água são muito maiores devido à
regularidade geométrica da rede de ligações de H.
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 Quando se dissolve uma substância em água a estrutura organizada é
desfeita e o contacto H2O – H2O diminui. Se a substância é polar não se destrói
seriamente a rede organizada de ligações de H. Se a substância é apolar as ligações de H
desfeitas não são compensadas por outras interacções que evitem a destruição da
estrutura da H2O.
2ª Lei da Termodinâmica:
∆G = < ∆H – T∆S
A energia livre para a transferência é positiva, logo a transferência não é favorecida
(processo energeticamente desfavorável).
As moléculas de H2O tendem a reorientar-se para
compensar a destruição das ligações de H. Isso
promove a restrição à mobilidade das moléculas de H2O
que rodeiam a molécula hidrofóbica em forma de um
―envoltório‖ — ∆S diminui.
A formação de interacções hidrofóbicas entre duas moléculas não polares em água é
favorecida porque o número de moléculas de H2O imobilizadas em redor da superfície
molecular decresce. Assim dá-se um aumento da entropia e uma diminuição da energia
livre (reacção energeticamente favorável).
 Assim, o efeito hidrofóbico depende de considerações entrópicas e contribui com a
maior parte da energia de interacção que estabiliza a organização em bicamada.
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Interacção da água com moléculas anfipáticas:
A água tende a hidratar a porção polar e ao mesmo tempo
tende a excluir a porção apolar (hidrofóbica).
A porção apolar força as moléculas de água circundantes a
assumir um estado altamente ordenado. De um modo geral, no
entanto, as estruturas lipídicas tendem a agrupar-se, reduzindo a
superfície em contacto com a água.
As porções apolares são estabilizadas por interacções
hidrofóbicas que resultam da tendência da água excluir porções
apolares.
As micelas são um bom exemplo de estruturas que expõem à
água apenas os grupos hidrofílicos (polares) e escondem
completamente os grupos apolares.
 A água exclui do seu seio estruturas apolares, um factor indispensável para a
estrutura das membranas tal como elas se apresentam na célula viva.
 As micelas não são as associações de moléculas anfipáticas mais importantes na
célula viva, os agregados planares em bicamada molecular são os que constituem
a base da estrutura das membranas biológicas.
CMC – Detergentes:
Se fragmentarmos uma membrana, os seus fragmentos
voltam a unir-se (recelam) devido ao efeito hidrofóbico.
Podemos então extrair proteínas da membrana com a
adição de detergentes* não iónicos. Estes vão fragmentar
a membrana e a dado momento as proteínas são
libertadas, inserindo-se na estrutura micelar (detergente)
 Concentração micelar crítica (CMC).
* Composto por moléculas orgânicas de alto peso
molecular. Cada extremidade apresenta carácter polar
diferente. Um lado é apolar (afinidade pela água),
enquanto o outro é polar (afinidade pelas gorduras e por
substâncias não solúveis). Devido às interacções com a
água, formam uma estrutura micelar.

Lisofosfolípidos:
Podem
funcionar
como
detergentes, uma vez que o fosfolípido pode passar de um
forma cilíndrica para uma cónica invertida, e assim,
quando em solução aquosa, formar estruturas micelares.
 SDS: É um detergente iónico, não é bom para
formar micelas. É usado para separar proteínas
electroforeticamente.
Correlação entre as diferentes estruturas lipídicas e as
formas moleculares dos lípidos que as originam.
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Transporte membranar:
 A vida na terra apenas se tornou possível graças ao aparecimento de uma
estrutura impermeável que fazia a distinção entre o meio interno e externo. Essa
estrutura é aquilo que hoje conhecemos como membrana celular. A membrana celular
é uma barreira selectivamente permeável entre os dois meios. Esta permeabilidade
assegura que moléculas como a glucose, aminoácidos e lípidos entrem na célula,
intermediários metabólicos permaneçam na célula e que os lixos metabólicos sejam
excretados. Basicamente a membrana celular permite à célula manter um ambiente
interno constante.
 As membranas são:
-
Sistemas dinâmicos;
Assimétricas;
Formadas por uma bicamada fosfolípidica;
Barreiras selectivamente permeáveis.
 Os lípidos e as proteínas (transporte) possuem um papel complementar no controlo
da permeabilidade membranar.
 O facto de o interior da membrana ser
hidrofóbico condiciona a selectividade desta. A
membrana é permeável a gases (CO2, NO e O2) e a
pequenas moléculas polares não carregadas
(etanol), sendo impermeável a moléculas grandes
não carregadas (glucose, frutose). Para estas
substâncias existem sistemas de transporte
específicos.
A membrana é ainda impermeável à passagem de iões devido à sua carga (elevado
gasto de energia) e de moléculas polares carregadas (aminoácidos, ATP, proteínas).
Difusão simples de pequenas moléculas pela bicamada:
Uma membrana artificial composta unicamente por fosfolípidos ou por
fosfolípidos e colesterol é permeável a gases e pequenas moléculas polares não
carregadas. Tais moléculas podem atravessar a membrana através de difusão simples,
sem a ajuda de proteínas transportadoras e sem gasto energético, explicando-se o seu
movimento unicamente devido ao gradiente de concentração (da zona mais
concentrada para a menos concentrada). Este tipo de transporte é muito pouco
específico e tem um ΔS positivo (aumento da entropia) e um ΔG negativo (decréscimo da
energia livre). A taxa de difusão de uma substância pela bicamada é proporcional ao seu
gradiente de concentração e à sua hidrofobicidade.
 O primeiro passo no transporte por difusão simples é o movimento da molécula da
solução aquosa para o interior hidrofóbico da bicamada lipídica. A hidrofobicidade da
substância é medida pelo seu coeficiente de partilha (K) que é o valor da constante
de equilíbrio para a sua partição (divisão) entre água e óleo. Dado que o interior da
bicamada se assemelha a um óleo, o coeficiente de partilha de uma substância que se
move através da icamada é igual à razão entre o valor da concentração dessa substância
no interior (Cm) e o valor da concentração dessa substância em solução aquosa (Caq):
K= Cm/Caq
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 O coeficiente de partilha é a medida da afinidade relativa de uma substância
para o lípido (apolar) em relação à água (polar). Quanto maior o coeficiente de
partilha de uma substância mais solúvel é em lípidos (lipossolúvel). A ureia por exemplo
tem um K = 0,0002, enquanto que a dietilureia (com dois grupos etil) tem um K = 0,01.
Deste modo, a dietilureia é 50 vezes mais hidrofóbica do que a ureia, o que significa que
irá difundir 50 vezes mais rápido que a esta.
 Uma vez no interior hidrofóbico da bicamada, a molécula difunde-se, atravessandoa até atingir a solução aquosa do meio interno. Devido ao facto da zona hidrofóbica típica
de uma célula ser 100 a 1000 vezes mais viscosa que a água, a velocidade de difusão de
qualquer molécula é muito mais lenta no meio hidrofóbico do que na água. Deste modo o
movimento através da porção hidrofóbica da membrana é um passo limitante
da taxa de difusão das moléculas pela membrana plasmática.
 Vamos supor uma membrana de superfície A e espessura x que separa duas
soluções de concentração C1aq e C2aq, onde C1aq > C2aq. Neste caso a taxa de difusão
(dn/dt – em mol/s) é dada por uma modificação da Lei de Fick*  A velocidade de
difusão é directamente proporcional ao gradiente (C1aq - C2aq), área (A) e à constante de
pemeabilidade (P):
*
Para qualquer molécula, o valor de P, e assim a sua taxa de difusão simples, é
proporcional ao seu coeficiente de partilha (K):
Onde D é o coeficiente de difusão da substância no interior da membrana e X é a
espessura a membrana. Substituindo esta equação na anterior obtém-se:
Deste modo podemos verificar a proporcionalidade directa entre a taxa de difusão e o
coeficiente de partilha.
 No entanto a espessura do interior hidrofóbico das membranas é aproximadamente
a mesma (2,5 a 3 nm) e o coeficiente de difusão (D) é igual para a maioria das
substâncias, deste modo as diferenças verificadas na taxa de difusão das moléculas pela
membrana dependem principalmente dos seus coeficientes de partilha (K).
Quanto maior a hidrofobicidade maior a taxa de difusão através da
bicamada lipídica.
 Se o coeficiente de partilha da substância for grande, esta acumula-se nas
membranas. Assim, a determinação do K (Coeficiente de Partição) das substâncias é
muito importante. Por exemplo, os pesticidas, devido ao facto de ficarem armazenados
no tecido adiposo, devem apresentar um coeficiente de partilha baixo, pois caso contrário
tornam-se muito prejudiciais (acumulam-se em grandes quantidades).
Para determinarmos o coeficiente de partilha de uma substância, esta deve estar
marcada. Se adicionarmos DDT (insecticida muito hidrofóbico, extremamente
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lipossolúvel) a um meio contendo mitocôndrias (encubar por um período máximo de 30
minutos), e pelo processo de filtração separarmos a fase aquosa da lipídica, podemos
determinar o coeficiente de partilha (por radioctividade). Verificamos que a concentração
na fase lipídica é muito elevada (800 000 vezes mais, K DDT). Este aumento de DDT nas
membranas mitocondriais provoca uma diminuição acentuada da actividade respiratória.
Modelos para a Difusão Membranar:
Existem dois modelos que tentam explicar o mecanismo pelo qual as moléculas
podem difundir através das biomembranas.
 No primeiro modelo, Teoria Lacunar (―Lattice Theory‖), a principal barreira
energética à difusão é a energia de activação necessária para mover o substrato da fase
aquosa para o meio apolar da bicamada fosfolipídica. Formam-se lacunas
(descontinuidades temporárias) resultantes do movimento lateral dos fosfolípidos, que
permitem a passagem dos substratos.
Esta teoria descreve adequadamente o movimento de moléculas pequenas, não
carregadas e apolares. A permeabilidade correlaciona-se com a hidrofobicidade.
 Se o colesterol fosse retirado da biomembrana, o que aconteceria à
permeabilidade membranar relativamente a uma molécula apolar?
O colesterol regula a fluidez das membranas. Se não existisse estas tornar-seiam muito fluidas, uma vez que o colesterol diminui a fluidez. Este aumento de fluidez
(devido à ausência de colesterol) leva a um aumento da permeabilidade relativamente a
moléculas apolares.
 A ―Lattice Theory‖ não explica a difusão de todas as moléculas. Moléculas
pequenas como a água e o metanol têm uma permeabilidade superior à esperada em
função do K, e os gases dissolvidos como o O2 e o CO2 difundem-se a uma velocidade
idêntica apesar de apresentarem dimensões muito diferentes. Estas e outras observações
sugeriram a existência de poros aquosos (hidrofílicos) na membrana.
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 O segundo modelo é o dos Poros Membranares Proteícos, que fala de um
rearranjo micelar ou presença de proteínas membranares integrais. Trata-se também de
um processo inespecífico onde os solutos passam sem entrarem no centro hidrofóbico da
bicamada.
 Na ―Lattice Theory‖, a velocidade de difusão é inversamente proporcional à
raíz quadrada do peso molecular. Assim, PM 1/2 é uma constante.
Dados tirados da C. ceratophylla mostram que o valor desta constante muda
com a hidrofobicidade da molécula tirada do K em óleo / água. Ou seja, a solubilidade
determina a velocidade difusão.
Lipofilicidade:
Canais aquosos:
Apesar do carácter polar da água, esta difunde-se através da bicamada lipídidica.
Assim, e independentemente da presença de proteínas, todas as membranas são
permeáveis à água. Contudo o grau de permeabilidade das diversas membranas difere
consideravelmente. Os eritrócitos, mas sobretudo os túbulos próximais do rim,
apresentam uma maior permeabilidade à água.
O papel fisiológico da elevada permeabilidade à água dos eritrócitos não é evidente,
sendo no rim fundamental para o equilíbrio hídrico do organismo.
 A grande permeabilidade à água de certas membranas deve-se à presença de
proteínas integrais (canais aquosos), que constituem uma família – as Aquaporinas.
Observações que levaram à descoberta das aquaporinas:
- Alta permeabilidade dos eritrócitos e das células
renais;
- A difusão simples não explica a elevada taxa de
difusão nestas células;
- Inibição da difusão da água por mercúrio (e DTNB)
em certas células (inactivação das proteínas);
- Regulação da permeabilidade à água por hormonas
(Ex. ADH).
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 A existência de canais para a água nas membranas foi predita em 1957 por V.W.
Sidel e A. K. Solomon, no entanto a proteína responsável por esse transporte não tinha
ainda sido isolada. Em 1987, Peter Agre escreveu o primeiro artigo sobre aquaporinas,
tendo em 1988 conseguido isolar proteínas da membrana plasmática com essas
características. Este químico acabou por receber um prémio Nobel da Química, em 2003,
por esta descoberta.
A água pode atravessar as biomembranas mediante dois mecanismos:
- Difusão simples através da bicamada lipídica;
- Através de canais especializados: Aquaporinas.
Demonstração experimental da existência de aquaporinas:
Uma simples experiência foi capaz de provar a existência de poros na superfície
membranar das células. Verificou-se que os oócitos de rã, apesar de possuírem uma
salinidade interna semelhante à da maioria das células animais, não sofriam qualquer
alteração quando mergulhados em meios hipo ou hipertónicos. Este facto levou os
investigadores a pensar que os oócitos de rã não possuem poros que permitem a
passagem da água, estando assim protegidos da lise (vantagem considerável visto serem
animais com reprodução dependente da água – meio dulciaquícola).
Na experiência microinjectararam-se oócitos de rã com mRNA, de eritrócitos,
codificante de aquaporina. De seguida os oócitos foram transferidos de uma solução
salina isotónica para uma solução salina hipotónica. Com o decorrer do tempo
verificaram-se alterações nos oócitos injectados, estes sofreram lise, sendo que os
oócitos usados como controlo (sem mRNA para as aquaporinas) permaneceram intactos.
Podemos então concluir que a entrada de água é facilitada pela presença de aquaporinas.
Permeabilidade à água de ovócitos expressando aquaporina 1 (AQP1):
1. Injectou-se mRNA codificando AQP1 em oócitos
de Xenopus;
2. Após a expressão da proteína diminuiu-se a
osmolaridade do meio;
3. Registou-se a velocidade de entumescimento em
função do tempo;
4. A cruz representa o momento da ruptura da
célula;
5. O entumescimento é menos nítido se os oócitos forem incubados com HgCl2 (inibe
as proteínas, logo a água não entra nas células);
6. A experiência controlo é realizada com oócitos que não expressam AQP1.
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Permeabilidade à água de lipossomas e de proteolipossomas reconstituídos
com aquaporina 1 (AQP1):
Foi feita uma experiência onde se colocaram
lipossomas (esféricos e com interior e exterior hidrofílicos)
e proteolipossomas em solução hipertónica. Verificou-se
que a água sai dos proteolipossomas mais rapidamente do
que dos lipossomas.
Este facto explica-se devido à existência de aquaporinas na estrutura dos
proteolipossomas.
Além de perderem água pela bicamada, também perdem pelas aquaporinas.
 O transporte de água é induzido por um choque hiperosmótico.
 Em A a permeabilidade foi determinada a partir da velocidade de contracção dos
lipossomas e dos proteolipossomas.
 Em B está representada a energia de activação (E), que é a energia necessária
para ocorrer a penetração de uma molécula na membrana. Pode ser calculada através da
velocidade inicial do transporte de água em função do inverso da temperatura absoluta
(T). O declive representa a energia de activação.
 A existência de aquaporinas nos proteolipossomas reduz a quantidade de energia
necessária para a ocorrência de tal fenómeno (penetração de uma molécula na
membrana).
Slope (Inclinação) = - Energia de activação / Constante dos gases
 A proteína CHIP 28 existente nos eritócitos e nas células renais foi alvo de estudo
pelos cientistas. Injectou-se mRNA de CHIP 28 em oócitos de rã e verificou-se um
aumento na capacidade de permeabilidade dos oócitos (100x). Observou-se também que
a proteína CHIP 28 sofria inibição quando se encontrava na presença de Hg (mercúrio).
Os cientistas renomearam esta proteína, passando a chamar-se Aquaporina 1 (AQP1).
 A cristalografia de raio-x permite inferir acerca da estrutura tridimesional das
proteínas.
Modelo Estrutural da Aquaporina 
Proteína tetramérica composta por 4 subunidades
idênticas. Cada subunidade forma um canal aquoso.
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Esquema da topologia de uma
subunidade
relativamente
à
membrana  Três pares de α-hélices
transmembranares homólogas (A e A’; B e
B’; C e C’) orientados em direcções
opostas relativamente à membrana e
ligados por 2 ―loops‖ hidrofílicos contendo
pequenas hélices não-membranares e
resíduos de asparagina (N) que são
conservados.
Os ―loops‖ inclinam-se para o interior da cavidade formada por seis
encontrando-se no centro para fazer parte do canal selectivo a água.
α-hélices
Vista lateral do poro numa única subunidade da
aquaporina  Vêm-se várias moléculas de água. O canal
contém resíduos de histidina e arginina altamente conservados,
bem como dois resíduos de asparagina (a azul) cujas cadeias
laterais formam ligações de H com as águas transportadas. As
águas transportadas também formam ligações de H com o grupo
carbonilo de um resíduo de cisteína da cadeia principal.
 A baixa energia de activação para a passagem da água através da AQP1 (∆G++ <
15 KJ/mol) sugere que a água se move através dos canais sob a forma de um fluxo
contínuo.
Canal de água numa subunidade de AQP1 (selectividade para a água):
a) Restrição de tamanho. 8 Å acima do
ponto médio do canal, o poro estreita-se para um
diâmetro de 2,8 Å (aproximadamente o diâmetro
de uma molécula de água).
b) Repulsão eletrostática. Um resíduo
conservado (R, Arg-195) na constrição mais
estreita do poro impõe uma barreira a catiões,
incluindo água protonada (H3O+).
c) Reorientação do dípolo da água.
Duas hélices parciais encontram-se no ponto
médio do canal, fornecendo dipolos carregados
positivamente que reorientam uma molécula de
água quando ela passa por este ponto. Ocorre
uma quebra das pontes de hidrogénio na fila
unitária de moléculas de água, o que impede a
formação de uma condutância de protões.
 Devido à especificidade da sua estrutura (adaptação à pasagem de moléculas de
água), nas aquaporinas passam apenas moléculas de água.
Ocorrência das aquaporinas:
 Bactérias, Plantas e Animais.
 11 isoformas de aquaporinas em mamiferos
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Localização das diversas aquaporinas:
 AQP 0 – Cristalino;
 AQP 1 – Vasos sanguíneos, túbulos renais
proximais, ança de Henle, orelha, olhos, etc.
 AQP 2 – Túbulos colectores. A concentração
da urina é regulada pela hormona ADH, esta estimula a
inserção das AQP2 na membrana plasmática das células
dos túbulos colectores.
A Diabetis insipidus nefrogénica pode ser causada por mutação no gene que
codifica AQP 2;
 AQP 3 – Túbulos colectores, epiderme, tratos respiratório e digestivo;
 AQP 4 – Membrana perivascular de astrócitos, olhos, orelhas, músculos
esqueléticos, estômago e túbulos coletores;
 AQP 5 – Córnea, glândulas salivares, sudoríparas e células epiteliais
pulmonares;
 AQP 6 – Túbulos colectores;
 AQP 7 – Adipócitos, testículos e rins;
 AQP 8 – Rins, testículos e fígado;
 AQP 9 – Fígado e leucócitos;
 AQP 10 – Intestino, ductos eferentes e epidídimo.
Família Aquaporinas:
 Aquaporinas – Seleccionam apenas água;
 Aquagliceroporinas – Seleccionam água e glicerol:
- AQP 3, transporte de glicerol para o eritrócito;
- AQP 7 (tecido adiposo), transporte de glicerol originado dos TAG;
- AQP 9, captação de glicerol pelo fígado para formação de glicose.
Energia de activação:
 As energias de activação (energias necessárias para
ocorrer a penetração de uma molécula na membrana)
calculadas para o glicol, glicerol e eritritol correspondem às
energias que se conhecem serem necessárias para a
desidratação das moléculas. Ou seja, para estes solutos a
remoção da água de hidratação é um pré-requisito para a entrada na bicamada lipídica.
Dai se conclui que para uma molécula (não-electrólito) se mover passivamente em
resposta a um gradiente químico, a barreira energética mais importante reflecte
provavelmente a necessidade da molécula perder toda a sua água de hidratação antes de
passar através da barreira polar da cabeça dos fosfolípidos.
Alterações de energia associadas à passagem de um soluto hidrofílico através
da bicamada lipídica de uma membrana biológica:
a) Na difusão simples a remoção da camada de hidratação (solvatação) é altamente
endergónica e a energia de activação (ΔG‡) para a difusão através da bicamada é muito
elevada;
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b) A proteína transportadora reduz a ∆G++ para a
difusão transmembranar do soluto visto este ter acesso
a um meio hidrofílico propício à sua passagem.
A proteina transportadora forma interacções nãocovalentes com o soluto desidratado para substituir as
ligações de hidrogénio com a água e fornece uma
passagem transmembranar hidrofílica.
 A energia usada para desfazer a camada de hidratação e para mover o composto
polar da água para e pela bicamada lipídica é reposta assim que a molécula deixa a
bicamada no lado oposto ao de entrada, ocorre re-hidratação.
 Tanto em a como em b uma barreira de activação tem de ser ultrapassada para se
atingir o estado de transição. A energia de activação ΔG‡ para a translocação de um
soluto polar através da bicamada é tão alta que uma bicamada lipídica pura é
virtualmente impermeável a espécies polares e carregadas. Quando não há intervenção
de proteínas a difusão simples requer uma energia superior para acontecer. Na presença
de proteínas transportadoras, diz-se estarmos na presença de difusão facilitada.
Porque razão as moléculas se difundem de zonas de maior concentração para
zonas de menor concentração?
A
B
Existe alguma força física responsável por esse movimento?
 A difusão é um processo espontâneo, tende para um estado de equilíbrio, um
estado de maior desordem. O estado de equilíbrio de um sistema é o estado de
entropia máxima.
 A Lei da Difusão baseia-se no puro acaso e a sua validade é uma mera
aproximação. Esta aproximação é, no entanto, excelente porque, regra geral, uma
enorme quantidade de moléculas participa no processo.
Se a difusão se baseia no acaso, a probabilidade de ir de A  B é exactamente igual à
de ir de B  A. No entanto existe uma força física envolvida, a Energia Livre. Apesar da
difusão ser baseada nas probabilidades, o mundo da física tende sempre para um estado
de equilíbrio e de entropia máxima.
A variação de energia livre associada a este movimento é geralmente negativa, dado
que há um aumento da entropia.
16
Por exemplo: O movimento de 1 mole de substância de uma solução 1M para outra
0,1M liberta (a 25ºC):
Numa reacção simples em que:
O caso de difusão simples pode ser encarado como um caso particular da situação
anterior, sendo que:
Em equilíbrio:
A substância S passa espontaneamente por difusão simples de fora para dentro da
célula se [S1] > [S2]. Neste caso, o processo decorre com uma ΔG < 0 até [S1]=[S2],
pois quando isto acontece o sistema encontra-se em equilíbrio.
 Este tipo de variação pode ocorrer por difusão simples ou facilitada, mas apenas é
verdade quando se fala em moléculas não carregadas!
Difusão de moléculas carregadas:
No ponto de equilíbrio, a concentração de
uma substância com carga eléctrica pode ser
diferente nos dois lados da membrana que
mantém uma diferença de potencial – Δψ.
Isto pode acontecer mesmo quando a
transferência da substância se processa só por
difusão simples e/ou facilitada. Neste caso a
membrana possui um potencial de membrana
negativo do lado do citoplasma e a substância S+
está mais concentrada no interior do que no
exterior, no ponto de equilíbrio.
17
 Se S for uma molécula com carga eléctrica a difusão simples ou a difusão facilitada
produzem uma situação de equilíbrio em que a membrana possui um potencial de
membrana (Δψ) e nesse caso em equilíbrio [Sf]≠[Sd].
Nesta situação existem duas forças que contribuem para o movimento das
moléculas, o gradiente iónico e o gradiente eléctrico. Por sua vez a existência de um
gradiente eléctrico vai influenciar a equação para calcular a energia livre da seguinte
maneira:
Por exemplo: Qual será a energia associada ao movimento de fora para dentro se
Δψ = - 70 mV? (relação S2/S1)
Substitui-se na equação:
Z = +1
F = 23062 cal/mol. Volt
ψ = 0,07 V
(Passar a constante de Faraday sempre para volts, assim como o Δψ)
Em equilíbrio:
ΔG = 0
(Z x F x Δψ ) = – 1610
Logo:
0 = 1362 X log (S2/S1) – 1610
log (S2/S1) = 1610 / 1362  (S2/S1) = 101,2  (S2/S1) = 15,2  S2 > S1
Resposta: Em equilíbrio o ião é 15,2 vezes mais concentrado dentro do que fora.
 Nota: Se o ião fosse negativo a concentração dentro seria muito inferior pois
haveria um impedimento eléctrico.
Porque existe um gradiente iónico?
Qual a origem do Δψ através da membrana?
A composição iónica específica do citosol geralmente difere bastante da composição
extracelular. De uma forma geral todas as células mantêm um pH interior perto dos 7,2 e
uma concentração substancialmente grande de K+ em comparação com Na+. Do mesmo
modo a concentração de Ca2+ livre no citosol é também muito reduzida (menos de 0,2
micromolar - 2x10-7).
Estes aniões devem-se
principalmente a proteínas
carregadas negativamente
18
A membrana celular é constituída por fosfolípidos que são hidrofóbicos, formando
uma barreira à passagem dos iões. Contudo, a permeabilidade da membrana a iões devese à existência de transportadores capazes de anular o efeito de carga
(semelhante ao que se passava com as aquaporinas e o transporte de H2O).
A taxa de iões, transportados através da membrana plasmática e de organelos, é
altamente influenciada não só pela diferença de concentrações (gradiente químico) entre
os dois lados da membrana, mas também pela diferença de voltagens (gradiente
eléctrico). Por exemplo, a diferença de concentração entre o interior e o exterior induz a
saída do potássio da célula, que é acompanhada pela entrada de cargas positivas (uma
vez que no interior existem muitas cargas negativas), mantendo-se a electronegatividade
(gradiente eléctrico). A uma dada altura a força de potencial osmótico iguala a força do
potencial eléctrico e a saída de K+ iguala a sua entrada. Quando se atinge este ponto
dizemos que temos um Potencial de equilíbrio.
 No inicio o ∆ψ = 0. Depois os iões K+ vão-se movimentar, o potássio desloca-se
até que a concentração deste ião seja igual nos dois compartimentos.
 Devido ao movimento de cargas o ∆ψ ≠ 0.
 A Equação de Nernst mede o potencial de equilíbrio para um ião específico
num dado momento:
Z = Valência do ião
T = Temperatura em K
F = Constante de Faraday
R = Constante dos gases perfeitos
19
 Esta equação considera os efeitos do gradiente eléctrico e do gradiente de
concentração na distribuição dos iões.
 Descreve a situação em que a força do gradiente de concentração é igual e oposta
à força do gradiente eléctrico, isto é, em que o fluxo de K+ para fora é igual ao fluxo de
K+ para dentro.
Porque é que o Δψ medido experimentalmente é igual a – 70 mV?
O potencial de membrana é permeável a outros iões, não apenas ao potássio. O facto
de EK+= -78 mV deve-se à distribuição desigual de cargas e ao facto do interior estar
mais carregado negativamente do que o exterior.
Se variarmos a permeabilidade ao sódio ou ao potássio, a temperatura ou a
concentração de iões, vamos causar uma alteração no potencial de membrana.
 Axónio da lula:
Através da colocação de microelectrodos
observa-se uma diferença de potencial
(diferença de cargas entre o interior e o
exterior) de aproximadamente – 70 mV, o sinal
negativo indica que no interior há mais cargas
negativas.
No interior há mais cargas negativas devido às membranas apresentarem diferentes
permeabilidades, às proteínas serem carregadas negativamente e às diferentes
concentrações de iões (gradientes de concentrações). Por exemplo, o axónio gigante da
lula (grande e espesso) permite medir facilmente os potenciais de membrana. Na lula é
fácil colocar microelectrodos que podem ser implantados dentro do axónio.
 Se a membrana apenas fosse permeável ao sódio era de esperar um valor de
potencial de membrana positivo (58 mV).
20
 Para determinar o potencial da membrana, ∆ m (diferença de cargas entre os
dois lados) é preciso ter em conta a permeabilidade e a concentração de vários iões,
sendo os mais importantes K+, Na+ e Cl-. Este potencial pode ser calculado através da
Equação de Goldman:
Vm = +60 log (PK [K+]ext + PNa [Na+]ext + PCl [Cl-]int) / (PK [K+]int + PNa [Na+]int + PCl [Cl-]ext)
 No caso do axónio da lula, os iões que contribuem apreciavelmente para o ∆ m
são o K+, o Na+ e o Cl-. Inserindo na equação acima os valores de P (constantes de
permeabilidade) e as concentrações dos iões, encontra-se um valor idêntico ao valor de
∆ m medido experimentalmente.
 As concentrações de Na+ e K+, no interior e no exterior, são mantidas por uma
bomba de iões Na+/K+ ATPase (bomba), que transporta 3 sódios e 2 potássios, movendo
mais cargas num sentido do que no outro. A ubaína inibe a Na+/K+ ATPase, sem este
inibidor as células morreriam.
Origem do Potencial de acção:
Concentrações de iões e permeabilidades membranares de Mamíferos
 As células podem alterar o seu potencial de membrana por modificação da
permeabilidade, em resposta a um estímulo, através da abertura de canais iónicos. O
estímulo é detectado por receptores que desencadeiam uma alteração no potencial de
membrana. Este por sua vez vai desencadear um potencial de acção (abertura de
canais de Na+).
Alteração no potencial de membrana:
O estímulo provoca uma alteração
do potencial de membrana, tornando-o
menos negativo (-70 mV → -40 mV),
devido à entrada de sódio (dá-se uma
alteração da permeabilidade ao sódio) –
Despolarização
(o
potencial
da
membrana aproxima-se de zero). Quando
o potencial volta ao repouso –
Repolarização. Pode haver ainda uma
situação onde o potencial de membrana é
ainda mais negativo que no estado de
repouso (saída de K+ ou entrada de Cl-) –
Hiperpolarização.
21
 Os estímulos causam sempre alteração no potencial de membrana das células. A
despolarização é que depende da intensidade do estímulo.
 Os canais iónicos sensíveis à voltagem apresentam selectividade. Só deixam
passar determinados iões. Além disso, os canais podem estar abertos ou fechados,
dependendo da cancela – ―Gate de activação‖. Esta liga-se a um sensor de voltagem que
detecta alterações no potencial de membrana, permitindo a formação de um potencial de
acção.
Potencial de acção:
 Os potenciais de acção têm sempre a mesma intensidade e não dependem
intensidade do estímulo. Só se formam nos axónios (zona de engatilhamento, inserção do
axónio), uma vez que ai existem canais sensíveis á voltagem. Se a despolarização da
membrana gerar um potencial superior ao potencial limiar, já se forma um potencial de
acção.
 É a existência de canais iónicos sensíveis à voltagem (de sódio e potássio) que
permite uma alteração do potencial de membrana. São estes canais que justificam a
existência de potencial de acção.
 No esquema seguinte podemos analisar o papel das cancelas (―gate‖) dos canais
iónicos no potencial de acção. Verificamos que ocorre uma despolarização, uma
repolarização e uma hiperpolarização, até se atingir de novo o estado de repouso.
O canal de potássio tem uma cancela enquanto que o canal de sódio tem duas, uma
de activação e outra de inactivação (basta uma estar fechada para que o canal não
funcione, este fica impermeável).
Em (1) – ―Resting state‖ (estado de repouso) os dois canais estão fechados. Na fase
de despolarização (2), dá-se a abertura do canal de sódio, entrando este para o interior
da célula, ocorrendo a despolarização. Quando esta despolarização atinge o pico, a
cancela de inactivação do sódio fecha e a cancela do potássio abre, permitindo a saída de
potássio, Isto leva à repolarização da membrana (3). Porque é que a cancela de
inactivação do sódio fecha? Esta é controlada pela cancela de activação, que por sua
22
vez é controlada pela voltagem (dependência indirecta da voltagem). Em (4) ambas as
cancelas do canal de sódio se encontram fechadas, estando apenas o canal de potássio
aberto, ou seja só à libertação de potássio, não há entrada de sódio, o que torna o
potencial de acção muito negativo. Ocorre hiperpolarização.
Os canais de potássio são mais lentos (apesar de serem controlados por um sensor
de voltagem) que os de sódio, abrindo mais tarde e consequentemente fechando mais
tarde também. A membrana volta então ao normal, ou seja ao estado de repouso.
 Na fase de hiperpolarização, não há entrada de sódio mas há uma saída
excessiva de potássio, este processo denomina-se potencial de acção.
Período refractário:
 Os canais de sódio são responsáveis pelo
período refractário – breve momento (1-2
milisegundos) em que não se pode gerar potencial
de acção.
 Quando falamos de potencial de acção é
necessário falar dos períodos refractários absolutos
e relativos.
O período refractário absoluto corresponde a um certo período de tempo em que
num local da membrana é impossível gerar um segundo potencial de acção, mesmo que
haja uma nova despolarização, ou seja, um novo estímulo com uma intensidade superior
à do primeiro. Continua a haver uma repolarização (fase de repolarização), uma vez que
as cancelas de inactivação do sódio se encontram fechadas, abrindo apenas quando as
cancelas de activação se fecharem. Devido a este facto, não se forma um segundo
potencial de acção.
Segue-se o período refractário relativo (mais alargado) em que é possível formar um
segundo potencial de acção, desde que o estímulo seja superior ao anterior. Isto passase na fase de hiperpolarização, em que o valor do potencial de membrana está abaixo
dos -70 mV (necessita de um estímulo maior). Este período termina quando se atinge um
novo estado de repouso.
Propagação do potencial de acção ao longo do axónio:
 Em axónios não mielinizados, os canais de sódio e potássio estão bem
distribuídos pela membrana. Quando ocorre uma despolarização, vai haver abertura dos
canais de sódio que promovem correntes de despolarização (por entrada de sódio), estas
levam à abertura de outros canais, noutras regiões, sempre no mesmo sentido.
 Esta unilateralidade está mais uma vez associada ao facto de não ser possível,
nos locais onde um primeiro potencial de acção se gerou, gerar outros potenciais de
acção (canais inactivos).
23
Velocidade de propagação do potencial de acção:
 Tendo em conta o diâmetro dos axónios, quanto maiores, maior a velocidade de
propagação do potencial de acção.
Diâmetro (μm)
Velocidade (m/s)
Exemplo
12-22
70-120
Neurónios sensoriais – posição dos músculos
3-8
15-40
Neurónios sensoriais – tacto, pressão
0,3-1,3
0,7-2,2
Sistema nervoso autonómico
 Em axónios mielinizados, as membranas das regiões mielinizadas ficam isoladas
electricamente, não havendo perda de voltagem.
Condução saltatória do potencial de acção em axónios mielinizados:
 Os canais de sódio e potássio só
existem nos nódulos de Ranvier, zonas
não isoladas, ou seja não mielinizadas. A
corrente gerada é sempre muito forte,
atingindo facilmente o nódulo seguinte e
assim sucessivamente. Entre estes nódulos
encontramos as regiões mielinizadas por
onde o potencial de acção não passa
(condução saltatória do potencial de
acção). Este tipo de condução é muito
mais rápida, ou seja, nos neurónios
mielinizados a transmissão dos sinais dáse muito mais depressa do que em
neurónios não mielinizados. Os factores
que determinam a velocidade de
propagação do potencial de acção são a
mielinização e o diâmetro.
Desmielinização  Esclerose múltipla:
 Tudo isto funciona bem até as bainhas de mielina serem destruídas. A esclerose
múltipla é uma doença que estimula o sistema nervoso a atacar as células que permitem
a mielinização. Quando há um enfraquecimento ou destruição da bainha de mielina há
perda do potencial de acção nos locais desmielinizados.
24
 Numa desmielinização parcial (B), verificamos que o tempo de excitação é maior
do que na presença normal de mielina (A), a condução do potencial é muito mais lenta.
No caso da desmielinização total (C), a excitação por parte dos estímulos não atinge o
limiar para que possa ser gerado um potencial de acção. Os estímulos não são
detectados e a informação para os órgãos aferentes não é transmitida.
Comunicação entre as células:
 A transmissão de informação pode ser feita entre vários neurónios, formando-se
a rede neuronal. Haverá uma comunicação eléctrica entre neurónios e outras
células? Sim e não. Durante muito tempo pensou-se que este era o único mecanismo de
comunicação mas, apesar de existir, não é o único nem o mais comum. Uma experiência
realizada por Loewi em 1921, veio introduzir uma nova hipótese, a comunicação química.
 Foram utilizados dois corações, estes
encontravam-se banhados na mesma solução. A um
dos corações foi estimulado o nervo vago, que levou a
uma diminuição das contracções, ou seja, do ritmo
cardíaco. O outro coração, embora não tendo sido
estimulado, também diminuiu o número de
contracções, devido a substâncias libertadas pelo
coração estimulado para a solução. Desta forma, para
além da sinapse eléctrica, encontramos também a
sinapse química, em que intervêm moléculas
denominadas neurotransmissores.
 Sinapses eléctricas: São mais raras. Não há demora sináptica uma vez que as
células estão muito próximas umas das outras, havendo continuidade membranar
(junções de hiato), podendo a comunicação ser bidireccional.
 Sinapses químicas: São as mais comuns. O processo é mais lento. Há demora
sináptica, as células não estão em contacto. Não é envolvida corrente eléctrica mas sim
mensageiros químicos, sendo a transmissão unidireccional.
25
Mecanismo da sinapse química:
 Os neurotransmissores estão armazenados em vesículas sinápticas membranares.
Quando há recepção de um estímulo, estas vesículas fundem-se com a membrana, sendo
os neurotransmissores libertados para a fenda sináptica. Estes vão difundir-se na fenda e
ligar-se a determinados receptores (proteínas) na membrana pós-sináptica.
Se o receptor, por exemplo, formar um canal de sódio, abrindo ao ligar-se aos
neurotransmissores, vai haver entrada de sódio, o que provocará uma despolarização.
 A ocorrência do transporte activo de um ião pode deduzir-se a partir do
conhecimento das concentrações intra e extracelulares do ião e do valor de ∆ m.
 O Na+ não se distribui de acordo com o potencial eléctrico medido (∆Ψm = -70
mV), logo, este ião é transportado activamente.
 Se o Na+ se distribui-se de acordo com o ∆Ψm medido qual seria a Ci esperada?
Conclusão: O Na+ é transportado activamente para o interior da célula.
26
 O K+ apesar de apresentar um ∆ K muito próximo do valor do potencial eléctrico
medido (∆Ψm = -70 mV), também é transportado activamente.
Difusão facilitada:
 A membrana plasmática da maioria das células contém vários transportadores,
que possibilitam o transporte de aminoácidos, nucleósidos, açúcares e outras pequenas
moléculas para dentro e para fora da célula de acordo com o seu gradiente de
concentração.
 A difusão da glicose é facilitada, uma vez que
existem mecanismos (proteínas transportadores) que
facilitam o seu transporte – Permeases.
 Se estas proteínas não existissem, o transporte era
inespecífico (difusão simples) e as substâncias eram
imediatamente metabolizadas, não dando resposta às
necessidades da célula.
 Estes transportadores (semelhantes a enzimas):
- Aceleram uma reacção que é termodinamicamente favorável, sem ocorrer
alteração do valor de ΔG (negativo) associado à passagem das substâncias.
- Não provocam alterações conformacionais no substrato, no entanto, quando
este é elevado podem saturar.
 Podemos dizer que a cinética enzimática também se aplica à difusão facilitada,
uma vez que quando se dá a saturação dos transportadores, a velocidade é máxima.
Logo existe um Km, e quanto maior o seu valor menor a afinidade do transportador pelo
substrato.
Características do transporte facilitado:
1. A velocidade da difusão facilitada é muito mais elevada relativamente à da
difusão passiva;
2. Existe um número limitado de transportadores. Consequentemente estes saturam
e ocorre velocidade máxima de transporte;
3. O transporte é específico. O Km representa a medida da afinidade do
transportador;
4. O K (Coeficiente de partição) é irrelevante.
 O gráfico mostra a diferença entre a velocidade de difusão passiva e facilitada, no
―uptake‖ de glicose em eritrócitos. Dado que a concentração de glicose é elevada no
espaço extracelular, os transportadores membranares geralmente fazem um transporte
27
unidireccional (de fora para dentro). Sob estas condições, a Vmax atinge-se a
concentrações muito elevadas de glicose.
 No entanto, se o gradiente de
concentração for invertido os transportadores de
glicose são também capazes de a exportar
(movimento uniporte, efectua transporte nos dois
sentidos). Isto acontece no fígado, em caso de
fome extrema, onde a glicose é sintetizada a partir
de outros compostos e posteriormente exportada
para o sangue. Este facto também se verifica nas
células do epitélio intestinal, onde ocorre a
absorção de glucose que é depois exportada para
o sangue.
 Quando metade dos transportadores (permeases) estão a ligar glicose, obtém-se
metade do valor da velocidade máxima, sendo o Km = 1,5 (neste caso).
Transporte de Glicose:
 O transporte de glicose é fundamental para o metabolismo energético celular. A
rota glicolítica é empregada por todos os tecidos para degradação de glicose e
fornecimento de energia (na forma de ATP) e intermediários para outras rotas
metabólicas.
 A glicose não pode difundir-se através dos poros da membrana, visto que o seu
peso molecular é de 180 M, e o máximo das partículas permeáveis é cerca de 100 M.
 Existem dois mecanismos de transporte de glicose através da membrana celular:
- Transporte facilitado  Mediado por transportadores de membrana
específicos (GLUT), que permitem a difusão facilitada de glicose, por gradiente de
concentração, através da membrana plasmática das células;
- Co-transporte com o ião sódio (SGLT).
 Os transportadores de glicose mostram homologia significativa na sua sequência
primitiva, mas apresentam um padrão de expressão com especificidade tecidual. O peso
molecular das moléculas carregadoras é de aproximadamente 45000 M, podem
transportar outros monosacarídeos, com estruturas semelhantes à da glicose, incluindo,
especialmente a galactose.
 A permease da glicose é a enzima que transporta glicose. Existem vários
membros da família dos transportadores da glicose (doze isoformas), que constituem um
conjunto de transportadores, os GLUT, numerados de 1 a 12 (GLUT1, GLUT2…). Os
GLUT 1, 2, 3, 4 e 5 são os mais conhecidos, sobre as restantes sete formas não sabe
bem qual a sua função.
28
Diferentes tipos de transportadores:
 SGLUT – Transportador de Sódio – glicose (B - Simporta);
 GLUT1 – Transportador de Glicose (A – Uniporta);
 Na+/K+ ATPase (C – Antiporta)
GLUT1:
 Virtualmente todas as células de mamíferos utilizam a glicose existente no sangue
como principal fonte de energia, sendo que a maioria expressa GLUT1.
 É um poro transitório (uniporta) da membrana plasmática que cataliza a entrada
de glicose de acordo com o seu gradiente de concentração. As propriedades de GLUT1
têm sido extensamente estudadas em eritrócitos dado que estas células são anucleadas e
sem membranas internas.
 Os transportadores de glicose tipo 1 estão amplamente difundidos por todo o
corpo, sendo responsáveis pelo nível basal de glicose celular (de 5 mM). Largamente
difusos nos tecidos fetais, tendo diminuído a sua expressão nos tecidos adultos.
 Possuem uma elevada capacidade de transporte e uma grande afinidade pela
molécula de glicose, mantendo rapidamente o nível de glicose dentro das células.
 A sua actividade não é alterada na presença de insulina.
Estruturas propostas:
(a) As hélices transmembranares são representadas por linhas oblíquas de três ou
quatro aminoácidos, cada uma delas descrevendo uma volta da α-hélice. Nove das 12
hélices contêm três ou mais resíduos de aminoácidos polares ou carregados, separados
frequentemente por diversos resíduos hidrofóbicos.
(b) Um diagrama helicoidal em roda, mostra a distribuição de resíduos polares e
não-polares na superfície de um segmento helicoidal. A hélice é desenhada como se
observada ao longo da sua linha central no terminal amínico. Os resíduos adjacentes na
sequência linear são ligados com setas, e cada resíduo é colocado em torno da roda na
posição que ocupa na hélice. Neste exemplo, os resíduos polares (azuis) estão num lado
29
da hélice e os resíduos hidrofóbicos (amarelo) no outro. Isto é, pela definição, uma hélice
anfipática.
(c) Lado-a-lado a associação de cinco ou seis hélices anfipáticas, cada uma com a
sua face polar orientada para a cavidade central, esta associação produz um canal
transmembranar alinhado com resíduos polares e carregados. Este canal fornece muitas
oportunidades para a ligações de hidrogénio com a glucose enquanto esta se move
através do transportador. A estrutura tridimensional de GLUT1 não foi determinada ainda
por cristalografia de raio X, mas os investigadores crêem que os canais hidrofóbicos deste
e de muitos outros transportadores, assim como canais iónicos se assemelharão a este
modelo.
 O GLUT1 é uma proteína com 12 α-hélices, cada uma com 3 aminoácidos polares
e quatro não polares. Algumas hélices possuem aminoácidos (serina, treonina,
asparagina, glutamina) cujas cadeias laterais podem formar ligações por pontes de H
com grupos OH da glicose, tanto no interior como no exterior celular.
Modelo hipotético para o funcionamento do transportador de glicose (Modelo
Conformacional):
 O GLUT1 forma um poro hidrofílico transitório (uniporta) que transporta glicose
do exterior para o interior. Um poro transitório não está permanentemente aberto,
sofrendo alteração conformacional. Primeiro ocorre activação externa, a glicose liga-se ao
GLUT1 e conforme vai atravessando o poro, ligações por pontes de H vão-se
estabelecendo e destabelecendo, finalmente a glicose atravessa o poro e fica no interior
celular.
 Experiências com glicose marcada com 14C mostraram que a velocidade de
importação de glicose aumenta quando esta já existe previamente dentro da célula. Esta
observação inesperada indica-nos que o passo limitante para o transporte da glicose é a
alteração conformacional do transportador GLUT1.
 O GLUT1 pode ainda catalizar o movimento da glicose para fora do citosol,
fazendo a reacção inversa.
 Neste procedimento experimental, o GLUT 1 foi removido,
solvatado por um detergente e depois colocado num lipossoma,
formando-se um proteolipossoma. Os lipossomas obtêm-se
quando se colocam moléculas de fosfolípidos em água. Segundo
o efeito hidrofóbico, apenas as partes hidrofílicas ficam em
contacto com a água, as hidrofóbicas ficam em contacto umas
com as outras. Nos lipossomas é possível modelar a composição
em termos de fosfolípidos. Foi mais simples introduzir o GLUT 1
num lipossoma com apenas um fosfolípido, pois diferentes
fosfolípidos têm diferentes cargas. Consoante a concentração de
glicose, o transportador transporta-a para dentro ou para fora do
lipossoma e aumenta a velocidade de transferência da glicose
através da bicamada.
30
 A taxa de entrada de glicose nos eritrócitos versus a concentração externa não é
linear, é uma curva com valor de Vmax a elevadas concentrações de glicose. Assim, a
cinética do transporte unidireccional da glicose para o interior da célula via GLUT1 pode
ser descrita pelo mesmo tipo de equação usada para descrever uma reacção catalizada
enzimaticamente.
 Vamos assumir que o substrato (glicose) inicialmente apenas está presente fora
da membrana:
Onde, Km é a constante de ligação do substrato ao transportador e V max é a
velocidade máxima de entrada de substrato na célula.
 Por uma derivação semelhante à usada na equação de Michaelis-Menten,
podemos derivar a seguinte expressão para V, a taxa de transporte de substrato para o
interior da célula:
Onde C é a concentração de substrato fora (dado que inicialmente o substrato
dentro é 0), Vmax é a velocidade máxima a que o transporte pode ocorrer (a elevados
níveis de substrato) e Km é a constante de ligação do substrato ao transportador. Quanto
menor o valor de Km maior é a afinidade do ligando para o transportador e maior a
velocidade.
 A concentração de glicose no sangue é,
geralmente, de 5 mM – cerca de 3x o Km (1,5 mM) – A
esta concentração o transporte de glucose funciona a 77%
da sua velocidade máxima.
31
 A partir de:
Obtemos:
 Num sistema de difusão simples a recta passa pela origem, o que significa que a
Vmax é infinita quando a concentração fora também o é. Assim o Km é irrelevante.
 Num sistema mediado por transportadores verificam-se intercepções com os
eixos dos X e Y
 A vantagem dos registos lineares é que permitem a quantificação precisa do K m e
da Vmax através da extrapolação em linhas rectas em vez de assímptotas.
 O gráfico de Lineweaver-Burk foi o primeiro a ser utilizado historicamente e é o
mais utilizado dos três. Contudo tem desvantagens:
- A valores baixos de [S] (ou seja, 1/[S] elevados) os dados tendem a ser menos
fiáveis porque [S] e, consequentemente V, variam dramaticamente à medida que a
reacção prossegue. Por conseguinte, o desvio dos resultados a baixo [S] influencia o
―slope‖ e, por isso, a precisão da recta.
 Pelo contrário, o gráfico de Hanes-Woolf, onde [S]/V é registado contra [S],
melhora o problema (o gráfico de Eadie-Hofstee também o melhora, embora em menor
extensão.
 A vantagem do gráfico de Eadie-Hosftee é que o termo V([S] permite o registo
de uma gama muito ampla de concentrações no gráfico.
32
Especificidade de GLUT1:
 Como referido antes, o Km para o
transporte de D-glicose pelo GLUT1 é 1,5 mM. O
Km para um isómero não biológico de glicose, a Lglicose é superior a 3000 mM. Deste modo, a
concentrações em que a D-glicose entra
rapidamente na célula, a taxa de importação de Lglicose é muito reduzida.
 Também D-manose e D-galactose são transportadas pelo GLUT1 com Km
relativamente elevado. Desta forma GLUT1 é específico para a glicose biológica, sendo
esta especificidade indicada pelo reduzido valor de Km.
 No transporte de glicose para o interior dos eritrócitos, esta é fosforilada em
Glicose-6-fosfato, que não pode sair da célula. Dado que esta molécula é a primeira do
metabolismo da glicose, ela é rapidamente degradada, mantendo-se constante a
concentração intracelular de glicose, o gradiente de concentração através da membrana e
consequentemente a taxa de importação.
GLUT1 e 3:
 Tanto o GLUT1 como o GLUT3 aparecem em todos os tecidos de Mamíferos. Têm
um Km mais baixo e, portanto, uma maior afinidade para a glicose.
 São responsáveis pelo transporte de glicose ao cérebro. Como o transporte
mínimo de glicose a este órgão deve ser mantido, os seus transportadores são
independentes de insulina.
 O GLUT1 é expresso nas células endoteliais, sendo responsável pelo transporte
de glicose através da barreira hemato-encefálica. A expressão de GLUT1 relaciona-se
com o crescimento do cérebro, sendo este o transportador mais abundante na infância e
fase de desenvolvimento
 O GLUT3 proporciona o transporte da glicose do astrócito ao neurónio e está
associado à maturação funcional, quanto mais maduro e evoluído maior a expressão
deste transportador.
 Em situações frequentes de hipoglicémia há um aumento na expressão de GLUT1
para maior captação de glicose.
 A hipoxia e/ou hisquémia com morte celular e consequente baixa de GLUT3 gera
um incremento na expressão de GLUT1 na proximidade da área afectada.
 Na doença de Alzheimer ocorre uma redução dos transportadores tipo 1 e 3,
principalmente nos lobos parietais e temporais.
GLUT2:
 Possui a maior cinética entre os GLUT e está presente nos hepatócitos, células βpancreáticas, mucosa intestinal e rins. A alta afinidade deste transportador pela glicose
promove um transporte proporcional à glicemia nas referidas células.
 Devido às suas funções, este transportador não tem actividade modelada pela
insulina.
 Na célula intestinal, após absorção e reabsorção de glicose no rim, é pela via
GLUT2 que a molécula de glicose entra na circulação.
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 Toda a variação de glicemia é detectada pelas células β-pancreáticas, iniciando
automaticamente o controle da secreção de insulina e captação ou libertação de glicose
hepática.
 Alterações na expressão de GLUT2 estão associadas a defeitos na estimulação de
insulina em diabéticos, o que não permite uma baixa na glicemia. Variações na expressão
destes transportadores, em células β-pancreaticas, explicam em parte a baixa ou mesmo
nenhuma libertação de insulina nos diabéticos com a doença tipo 1.
 A expressão do GLUT2 é estimulada pela hiperglicémia e dietas ricas em carbohidratos, sendo suprimida pela hiperinsulinemia.
 Defeitos no GLUT2 resultam na síndrome Fanconi-Bickel, descrita em humanos.
Esta doença é caracterizada por: raquitismo, acumulação de glicogénio hepático,
glicosúria, perda de aminoácidos e acidose renal.
 Os transportadores GLUT2 expressos no fígado e nas células β-pancreaticas
(secretoras de insulina) têm um Km de aproximadamente 20 mM (cerca de 13 vezes
superior ao Km de GLUT1).
 Em resultado, quando a glicose do sangue sobe de 5 mM (nível basal) para 10
mM, ou após uma refeição, a velocidade do ―uptake‖ de glicose quase duplica nas células
que expressam GLUT 2, enquanto apenas aumenta ligeiramente nas células que
expressam GLUT1. Isto deve-se ao facto de os transportadores GLUT1 estarem quase
todos saturados e da velocidade de armazenamento de glicose estar muito próxima da
velocidade máxima, ao contrário dos GLUt2.
 Para além do Km temos de ter em conta a Vmax e os niveis de glicose.
GLUT4:
 Os GLUT4 são os transportadores insulino-dependentes, cujo principal papel é
proporcionar a captação de glicose (insulino-mediada) do sangue para os tecidos
adiposos e musculares.
 São mais abundantes nas membranas celulares dos músculos esqueléticos,
cardíacos e no tecido adiposo.
 No fígado, a insulina inibe a degradação e a síntese de glicose e estimula a
síntese de glicogénio. Na musculatura esquelética estimula a captação de glicose e a
síntese de glicogénio. No tecido adiposo estimula a captação de glicose, a redução da
libertação de ácidos gordos e a síntese de triglicerídeos. A insulina também estimula a
entrada de aminoácidos nas células, para promover a síntese proteica.
 Os transportadores GLUT4 possuem a menor cinética entre os GLUT, no entanto
apresentam grande afinidade pelo substrato.
 Sem estimulação, a densidade dos GLUT4 na membrana das células é
extremamente baixa, estando estes transportadores presentes em vesículas
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citoplasmáticas. A quantidade destas é variável, dependendo da actividade do tecido.
Após a estimulação pela insulina, as vesículas são translocadas para a membrana (das
células alvo) e o transporte de glicose é aumentado.
 O aumento destes transportadores na superfície celular aumenta o ―uptake‖ de
glicose em cerca de 15 vezes. Quando os níveis de glicose voltam ao normal, a libertação
de insulina diminui e a maior parte das moléculas GLUT4 são removidas da membrana
plasmática e novamente armazenadas em vesículas.
 A glicose entra na célula e é imediatamente fosforilada. Quando há glicose em
excesso, ela tem de ser captada e armazenada sob forma de glicogénio. A insulina, para
além de levar ao aumento de receptores de glicose que a transportam para o interior da
célula, activa a sintase (sintetase) do glicogénio.
 A contracção muscular aumenta a taxa de transcrição e translocação de GLUT4,
este processo é mediado pelo AMP, que se forma em grande quantidade durante o
esforço muscular.
 Para além da presença ou ausência de transportadores, existem outros factores,
o que não nos permite correlacionar a resistência à insulina com os GLUT4. No entanto,
qualquer defeito na rota de translocação das vesículas (que contêm GLUT4) determina a
resistência ao estímulo da insulina (Diabetes tipo II  grande quantidade de glicose no
sangue, devido à não translocação dos GLUT4 para a membrana  Não ocorre
transporte de glicose para dentro das células). O mecanismo de fusão vesicular está
envolvido na resistência a insulina.
 O exercício intenso pode provocar lesão celular, levando a uma inflamação
tecidual e consequentemente a uma resistência à insulina. Este processo é mediado pelo
factor de necrose tumoral (TNF-α) e por outras substâncias do processo inflamatório, que
diminuem a densidade dos GLUT4 (resistência à insulina  menos vesículas  menos
GLUT4) na membrana e tornam o músculo mais resistente à captação de glicose.
 Em animais diabéticos, o nível de GLUT4, tanto nos adipócitos como nas células
musculares cardíacas e esqueléticas, está diminuído. Indivíduos diabéticos devem então
iniciar um programa de exercícios leves, sem contudo promover uma agressão dos
tecidos musculares.
 Aquando da ingestão de refeições ricas em hidratos de carbono, ocorre uma
subida dos níveis de glicose no sangue, esta é captada pelos músculos cardíacos e
esqueléticos (que a armazenam sob a forma de glicogénio) e pelos adipócitos que a
convertem em triglicerídeos.
 Dietas ricas em gorduras fazem com que a secreção de insulina por parte das
células β-pancreáticas não seja suficiente para responder às elevadas concentrações de
glicose. Dá-se uma diminuição da estimulação (por parte da insulina), as vesículas
intracelulares contendo GLUT4 não se fundem com a membrana plasmática das células e
consequentemente os níveis de GLUT4 nos adipócitos e músculos baixam, havendo um
aumento da glicose sanguínea. Assim, a dieta é um factor determinante para o
tratamento de doentes diabéticos.
 Experiências realizadas com ratos ―knock-out‖ GLUT4, onde o gene para esta
proteína foi suprimido, revelaram resultados onde os animais são consideravelmente mais
pequenos e não possuem tecido adiposo. Porém não desenvolvem diabetes, mas
evidenciam resistência à insulina, que a longo prazo leva a um diabetes tipo II.
 Experiências feitas com ratos ―overexpressing GLUT4‖ mostraram que estes
apresentavam um baixo nível de glicose sanguínea e um grande aumento da
sensibilidade à insulina, com grande mobilização de ácidos gordos para o tecido adiposo.
Isto demonstra uma potencial terapia para a diabetes, que deve ser objecto de maiores
estudos, pois mais de 80% dos pacientes com diabetes tipo II são obesos, sendo
resistentes à insulina.
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Transportadores de Glicose e Diabetes:
 A insulina ao ligar-se ao seu receptor vai promover a fusão das vesículas
(contendo GLUT4) com a membrana plasmática. Os transportadores ficam assim alojados
na membrana, mas quando os níveis de insulina baixam, os GLUT4 são removidos da
membrana por endocitose, formando pequenas vesículas que posteriormente se vão
fundir com endossomas. Estes voltam a formar pequenas vesículas com transportadores
de glicose.
 Na diabetes tipo I, produz-se pouca ou nenhuma insulina, assim a fusão das
vesículas com a membrana não ocorre, logo os GLUT4 não se alojam na membrana e o
transporte de glicose não se dá, sendo que os níveis desta aumentam muito no sangue.
 Na diabetes tipo II, os receptores de insulina perdem afinidade ou são
defeituosos, assim a quantidade de insulina libertada para o interior celular é reduzida,
levando a uma diminuição da fusão das vesículas com a membrana plasmática. Ocorre
acumulação de glicose no sangue.
Outros transportadores de glicose GLUT:
 Com os avanços na biologia molecular, actualmente são propostos outros
componentes da família dos transportadores de glicose.
 GLUT5 é uma proteína transportadora de frutose, com pequena ou nenhuma
afinidade por glicose. Existe no intestino delgado.
 Dois genes codificantes, denominados como pseudogenes não funcionais, são
responsáveis pela expressão de GLUT6, possivelmente encontrados nos leucócitos.
 Sugerido como transportador no retículo endotelial dos hepatócitos, o GLUT7 não
é caracterizado nem reconhecido por parte da literatura.
 As novas proteínas descritas são o GLUT9 presente no fígado e rins, GLUT11
presente no coração e músculos esqueléticos, GLUT8 expresso nos blastocistos e o
GLUT10 no fígado e pâncreas.
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