RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR: Gradus Primus*
Cláudia Jorge do Nascimento
Professora do Instituto de Química - UnB
Carlos Bloch Jr.
PESQUISA
Professor do Instituto de Química - UnB
Pesquisador da EMBRAPA Recursos
Genéticos e Bioctenologia
[email protected]
* Primeiros passos
INTRODUÇÃO
Por quase meio século, a determinação de estrutura tridimensional (3D)
de proteínas vem sendo feita por
métodos de cristalografia e difração
de raio-X; é inquestionável a importância e a contribuição que aplicações dessa técnica têm proporcionado à Bioquímica. Entretanto, há mais
ou menos vinte anos, a Ressonância
Magnética Nuclear (RMN), que já
ocupava um local de destaque nos
estudos estruturais de pequenas moléculas, começou a ser utilizada na
determinação da estrutura tridimensional de peptídeos e proteínas em
solução, independentemente de dados cristalográficos. Para que isso
fosse possível, sensíveis avanços na
instrumentação e na metodologia
dessa técnica tiveram que ocorrer,
incluindo-se, entre os mais importantes, o uso de campos magnéticos
homogêneos de alta intensidade,
novas técnicas de pulso e a introdução de métodos computacionais mais
avançados para a produção e a interpretação dos dados de RMN de macromoléculas.
Atualmente, mais de duas mil estruturas 3D de proteínas determinadas por RMN têm suas coordenadas
atômicas depositadas no Brookhaven
Protein Data Bank (http://
www.rcsb.org/pdb/) e esse número
vem crescendo rapidamente. Verificaram-se também significativos progressos na determinação estrutural
de outros biopolímeros por RMN,
como é o caso dos ácidos nucléicos e
dos oligossacarídeos, antes obtidos
52
Figura 1: A Radiação Eletromagnética
apenas por difração de raio-X.
Com a chegada da era pós-genômica, nunca se exigiu tanto dos métodos para obtenção de estruturas 3D
de biomoléculas. Tradicionalmente,
esse trabalho tem sido efetuado com
características quase “artesanais” devido à alta complexidade da tarefa,
ao tempo necessário para a obtenção
de apenas uma estrutura (vários meses) e aos elevados custos com infraestrutura e manutenção. Por essas e
por outras razões é que o uso da RMN
em Bioquímica ainda se encontra
restrito a poucos grupos de excelência espalhados pelo mundo e que
seus fundamentos teóricos permanecem obscuros para a maioria daqueles que têm algum interesse nos mais
recentes avanços dessa nova era de
descobertas científicas.
O presente artigo tem como objetivo primordial oferecer a leitores
que não sejam da área de RMN, mas
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21 - julho/agosto 2001
que possuam noções básicas em física
e em química, uma visão global dos
fenômenos que fundamentam essa
técnica, e da maneira como tais fenômenos são utilizados no processo de
determinação estrutural de substâncias relativamente simples, permitindolhes dar os primeiros passos para uma
melhor compreensão das metodologias desenvolvidas na obtenção de
estruturas 3D de moleculas bem mais
complexas (peptídeos, proteínas e ácidos nucléicos) disponíveis na literatura.
É importante ressaltar que a abordagem escolhida será bastante simplificada, uma vez que para uma verdadeira compreensão do fenômeno que
representa a Ressonância Magnética
Nuclear seria necessária uma descrição em termos de Mecânica Quântica,
com a utilização de operadores quânticos e matrizes de densidade, 1-4 o que
está fora dos objetivos deste artigo.
PRINCÍPIOS BÁSICOS DA
ESPECTROSCOPIA DE
RESSONÂNCIA
MAGNÉTICA NUCLEAR
A Espectroscopia é o estudo da
interação da radiação eletromagnética
(REM) com a matéria. Essa radiação
pode ser vista como uma onda com
duas componentes, uma elétrica e outra magnética, que oscilam perpendicularmente entre si, sendo ambas também perpendiculares à direção de propagação da luz (Figura 1). A interação
entre a radiação eletromagnética e a
matéria pode ocorrer de duas formas:
pela sua componente elétrica ou pela
sua componente magnética.
Uma das diferenças fundamentais
entre a RMN e as outras formas de
espectroscopia reside no fato de que,
na RMN, essa interação se dá com o
campo magnético da REM e não com o
campo elétrico, como é o caso, por
exemplo, do infravermelho ou do ultravioleta.
A REM de interesse em análises
químicas vai desde os raios gama (alta
energia) até as ondas de rádio (baixa
energia). Para cada tipo de espectroscopia é exigido um tipo de excitação e,
para cada uma delas, existe uma quantidade definida de energia, ou seja,
esses fenômenos são quantizados. Isso
quer dizer que uma radiação de freqüência determinada e característica é
absorvida para uma determinada transição.
A RMN encontra-se na região das
ondas de rádio (radiofreqüências). Em
princípio, pode-se dizer que a RMN é
uma outra forma de espectroscopia de
absorção. Em um campo magnético,
sob determinadas condições, uma
amostra pode absorver REM na região
da radiofreqüência (rf), absorção essa
governada por características da amostra. Essa absorção é função de determinados núcleos presentes na molécula,
que são sensíveis à radiação aplicada e,
por isso, esses núcleos são alvo de
estudo para a compreensão da RMN.
1- A DEFINIÇÃO DE
SPIN NUCLEAR
Tabela 1: Mostra a correlação existente entre o número atômico (Z) e o
número de massa (A) com o número de spin (I)
A
Z
Exemplos *
I
1
Ímpar Par ou ímpar
H(1/2), 17O (5/2), 15N (1/2)
Meio inteiro
2
Par
Ímpar
H (1), 14N (1), 10B (3)
Inteiro
12
Par
Par
C (0), 16O (0), 32S (0)
Zero
* O número entre parênteses indica o número de spin I do núcleo
exemplificado
A grandeza física envolvida em
RMN é o spin nuclear. O conceito de
spin nuclear provém da Mecânica Quântica, não possuindo conceito equivalente na Mecânica Clássica. Esse conceito é fundamental para a compreensão do fenômeno e pode ser compreendido como uma propriedade que
determinados núcleos apresentam. Tais
núcleos, devido à sua configuração
nuclear, assumem um comportamento
característico de momento angular,
capaz de gerar um momento magnético (Figura 2), pois uma carga em
movimento gera um campo magnético. O momento magnético µ gerado
pode ser descrito em termos do número de spin I, cujos valores, calculados
pela mecânica quântica5,6, podem ser
0, 1/2, 1, 3/2 etc. Como se sabe,
núcleos que apresentam tanto massas
atômicas quanto números atômicos
Figura 2: Momento magnético
µ gerado a partir do momento
angular
pares não possuem spin, sendo, conseqüentemente, o número de spin igual
a zero. É o caso do 12C, 16O, 32S etc.
(Tabela 1). Esses núcleos não têm
momento angular associado e, portanto, não exibem propriedades magnéticas, o que implica a ausência de sinais
detectáveis por RMN. Núcleos com
spin I ≠ 0 são, em princípio, detectáveis
por RMN. A detecção desses núcleos
está relacionada a condições experimentais especiais, que não serão aqui
abordadas.
Dentre os diferentes núcleos detectáveis por RMN, núcleos com I = ½ são
bastante apropriados para uma compreensão mais simplificada da técnica.
2- APLICAÇÃO DE UM CAMPO
MAGNÉTICO: A ENERGIA E A
FREQÜÊNCIA EM RMN
Na ausência de um campo magnético, os spins nucleares estão orientados randomicamente, não apresentando nenhuma orientação definida (Figura 3). Entretanto, quando uma amostra é submetida a um campo magnético
externo B0, de alta intensidade e homogêneo, os spins nucleares tendem a
assumir determinadas orientações. Segundo a mecânica quântica, o número
de spin I determina o número de
orientações que um núcleo pode assumir diante de um campo magnético
externo pela relação7:
número de orientações possíveis = 2I + 1
No caso de um núcleo com número
de spin I = ½, apenas duas orientações
são possíveis, quando há aplicação de
um campo magnético: uma “parcialmente alinhada” com o campo magnético aplicado e outra “parcialmente
contra” o campo magnético (Figura
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21- julho/agosto 2001
53
Figura 3: Spins randomicamente orientados
4). O ângulo θ que define a orientação
do vetor com relação a B0 também é
determinado pela mecânica quântica
(seus valores aproximados são 55º e
125º). As duas orientações representam diferentes estados energéticos. Isso
acontece porque um núcleo com spin
cria seu próprio campo magnético,
como já mencionado. Quanto “mais
paralelo” forem esses dois campos (o
do núcleo e o campo magnético externo), menor será a energia desse estado. Assim, o estado de menor energia
é aquele que se encontra “parcialmente alinhado” com o campo e é denominado estado α (ou +½), e o estado de
maior energia, o “parcialmente contra”, é denominado estado β (ou -½)
(Figura 5). As energias desses níveis
podem ser descritas como Eα = - µB0 e
Eβ = µB0, o que equivale a dizer que a
diferença de energia entre os dois
níveis pode ser expressa por8: ∆E = (Eβ
- Eα) = 2µB0, desde que I = ½.
A diferença de energia ∆E que
surge entre os dois níveis está relacionada com vários fatores, dentre eles,
segundo a equação anterior, a intensidade do campo magnético B0 aplicado:
quanto maior for o campo magnético
aplicado, maior será a diferença de
energia entre os dois níveis (Figura 6)
e maior a diferença de população associada a esses níveis. Isso significa que,
para uma melhor resolução de spins
nucleares em ambientes químicos semelhantes, são desejáveis espectrômetros com campos cada vez mais intensos.
É interessante observar que a diferença entre níveis de energia – inicialmente inexistente – surge devido ao
54
efeito do campo magnético externo B0
aplicado sobre o sistema de spins em
estudo. Essa é mais uma das diferenças
básicas entre a RMN e outros tipos de
Espectroscopia: em infra-vermelho e
ultra-violeta, por exemplo, já existem
diferentes níveis energéticos (vibracionais e eletrônicos, respectivamente),
bastando a aplicação de uma radiação
de freqüência apropriada para que
uma transição (vibracional ou eletrônica) ocorra. No caso da RMN, os diferentes níveis energéticos devem ser
primeiramente criados pela aplicação
de um campo magnético de alta intensidade (B0); só assim é que se pode
proceder à Espectroscopia, aplicandose, então, a radiação de freqüência
apropriada para cada núcleo.
O fenômeno da RMN ocorre na
região das radiofreqüências (MHz) e a
Figura 4: Direções quantizadas
assumidas pelos spins sob ação
de um campo magnético B0
interação da radiação eletromagnética
com a matéria dá-se com a sua componente magnética. Portanto, para se
proceder a RMN, deve ser aplicado um
segundo campo magnético (chamado
de B1), proveniente de uma fonte de
radiofreqüência aplicada perpendicularmente ao campo B0. É esse segundo
campo magnético que permite a observação de absorções em RMN.
entretanto, um estado é mais estável
que o outro, devido a uma interação
entre o campo e o momento magnético
associado ao spin nuclear. A absorção
em RMN é, portanto, uma conseqüência das transições entre o nível de
menor energia e o de maior energia,
possíveis pela aplicação de um segundo campo magnético na região da
radiofreqüência.
O momento angular L e o momento
magnético µ podem ser representados
por vetores e a proporcionalidade entre eles é chamada de constante (ou
razão) giromagnética. Essa constante,
que determina a freqüência de ressonância do núcleo, constitui um parâmetro muito importante em RMN e é
representada por γ, apresentando um
valor próprio para cada núcleo, podendo ser expressa pela relação:
γ = 2πµ / hI
onde h é a constante de Plank (∆E =
hν).
Se a constante giromagnética γ for
positiva, como é o caso dos núcleos de
1
H e 13C, o estado +½ representa um
nível de menor energia. Caso a constante giromagnética seja negativa, como,
por exemplo, para o 15N, ocorre o
oposto.9
Além de ser responsável pela freqüência de ressonância de cada núcleo, a constante giromagnética influencia outros fenômenos importantes
da Ressonância Magnética Nuclear,10
como é o caso do acoplamento de
spins (que será abordado mais adiante), da sensibilidade dos núcleos, em
processos de polarização cruzada, entre outros.
3- O CONCEITO DE CONSTANTE
GIROMAGNÉTICA - A EQUAÇÃO
FUNDAMENTAL DA RMN
Na ausência do campo magnético
externo B0, os estados α e β são degenerados, uma vez que não há distinção
de energia. Aplicando-se o campo B0,
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Figura 5: Níveis energéticos
criados pela ação do campo
magnético B0
Figura 6: Efeito do campo B0
na diferença de energia entre
os estados α e β
nα/nβ = e∆E/kT
onde k é a constante de Boltzmann e T,
a temperatura expressa em escala Kelvin.
Pode-se deduzir que, à temperatura ambiente, como a diferença de energia ∆E é muito menor que kT (∆E <<
kT), haverá um pequeno excesso de
população de spins no estado menos
energético. Assim, para um valor positivo de γ, haverá um ligeiro excesso de
população para o estado α, ou seja,
para os núcleos que estão alinhados
com o campo magnético. Esse excesso
Substituindo-se as equações anteriores (∆E = hν e γ = 2πµ / hI) , podese chegar a:
ν = γB0 /2π
que é a equação fundamental utilizada
em RMN e que define a condição de
ressonância para um núcleo com spin
I = ½.
4- A MAGNETIZAÇÃO LÍQUIDA
Em um campo magnético externo,
o momento magnético µ apresenta um
ângulo θ com a direção do campo
magnético B0 aplicado (Figura 4). Segundo a Mecânica Clássica, bastante
útil para a visualização de muitos conceitos de RMN, a interação entre um
núcleo com um momento magnético µ
e o campo B0 faz com que o momento
magnético precesse em torno daquele
eixo (Figura 7). A freqüência desse
movimento é chamada freqüência de
Larmor, e seu valor é dado pela expressão anterior ν = γB0 /2π em Hertz.
Os dois estados energéticos correspondem, então, à precessão de µ em
torno do eixo, alinhado (menor energia, se γ for positiva) ou oposto ao
campo magnético aplicado B0. Considerando que o campo B0 esteja aplicado na direção z, no equilíbrio, os
vetores dos momentos magnéticos estarão distribuídos em dois cones, em
torno dos eixos +z e –z (Figura 8).11
A população dos dois diferentes
estados energéticos α e β (respectivamente nα e nβ) pode ser obtida a partir
da equação de Boltzmann:7
Figura 7: Precessão nuclear
de população resulta em uma magnetização líquida na direção +z, uma vez
que no plano xy, a resultante é nula
(Figuras 9, 10).
5- O EFEITO DA APLICAÇÃO DE B1
SOBRE A MAGNETIZAÇÃO
Em RMN, a aplicação do campo B1
é feita perpendicular ao campo B0
aplicado (portanto, na direção x ou y).
Assumindo que B1 seja aplicado na
direção x, o campo oscilante nessa
direção é equivalente à soma vetorial
de dois vetores de igual amplitude,
movendo-se em direções opostas no
plano xy (Figura 11). A magnitude de
cada uma dessas componentes corresponde à metade do vetor B1 e somente
uma delas tem efeito no vetor magnetização. A outra pode, portanto, ser
negligenciada.12,13
O campo B1 é aplicado na forma de
um pulso, ou seja, a fonte de r.f.
permanece ligada por períodos con-
trolados da ordem de microssegundos
(µs) a milissegundos (ms). O pulso
eletromagnético é criado por manipulação da fonte de radiação eletromagnética, ligando-a ou desligando-a, e a
duração do pulso (µs a ms) é o tempo
para o qual a fonte de radiação se
encontra ligada.
No método pulsado, os núcleos são
excitados em uma região de freqüências por um ou mais pulsos. Na ressonância, o campo B1, aplicado na forma
de um pulso, faz com que alguns
núcleos – que se encontravam em
situação de equilíbrio (magnetização
líquida em z), apenas sob influência de
B0 – absorvam energia e seus momentos magnéticos nucleares passem a
precessar no plano xy (Figura 12).14
Ou seja, o campo B1 altera a direção de
precessão da magnetização, acarretando, portanto, uma perturbação do sistema, retirando-o do equilíbrio.
A nova componente gerada no plano xy pode ser observada com auxílio
de um detector no mesmo plano de
precessão. Para isso, a fonte de r.f.
deve ser desligada. Quando isto ocorre, o sistema tende a retornar à situação
original de equilíbrio. Este retorno é
conhecido por processo de relaxação,
que faz com que os núcleos percam o
excesso de energia e retornem às suas
posições originais de equilíbrio.
O decaimento da magnetização xy
– que dá origem ao sinal de RMN – para
retornar à sua posição de equilíbrio é
exponencial e dá origem ao chamado
sinal FID (Free Induction Decay). Os
Figura 8: Cone de precessão
nuclear
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55
Figura 9: Resultante no plano xy
seja, para que a interpretação do espectro seja facilitada, os sinais da FID
são convertidos para um domínio de
freqüências de ressonância, características de cada núcleo, através de uma
operação matemática chamada transformada de Fourier. A transformada de
Fourier dos diferentes sinais de FID dá
origem ao espectro de RMN comumente analisado15 (Figura 15). Em outras
palavras, um espectro de RMN consiste
em uma série de ressonâncias em diferentes freqüências, denominadas deslocamentos químicos.
6- O DESLOCAMENTO QUÍMICO
sinais da FID (Figura 13) são detectados como uma função do tempo, encontrando-se aí todas as informações
sobre acoplamento e deslocamento
químico (fenômenos que serão vistos a
seguir) contidos em um espectro de
RMN. Como existem vários núcleos em
uma amostra, também são originados
vários sinais de FID que se superpõem,
de forma que se torna muito difícil a
extração das informações desejadas
(Figura 14). Para que as informações
se tornem acessíveis ao usuário, ou
Segundo a equação fundamental
da RMN já apresentada (ν = γB0 /2π),
em um espectro de RMN, todas as
absorções devidas a um mesmo tipo de
núcleo deveriam ocorrer a uma mesma
freqüência, uma vez que, segundo
essa equação, a freqüência ν depende
apenas do campo B0 aplicado e da
constante giromagnética de cada núcleo. O espectro obtido experimentalmente, no entanto, mostra que a situação não é exatamente assim, poden-
Figura 10: Magnetização líquida
Figura 11: Em vermelho estão mostradas as componentes de B1
56
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21 - julho/agosto 2001
do ser observadas diferentes absorções a diferentes freqüências (Figura
15).
O fator que rege essa diferença de
freqüências de absorção é denominado blindagem. Esse fenômeno pode
ser compreendido levando-se em conta a vizinhança (núcleos e elétrons) na
qual se encontra o núcleo que está
sendo objeto de análise.
Cada uma dessas partículas carregadas está sujeita à influência de campos magnéticos. Tomando como exemplo um átomo de hidrogênio em uma
molécula, observa-se que, quando ela
é submetida a um campo magnético, o
campo induz uma circulação dos elétrons em torno do hidrogênio, em um
plano perpendicular ao campo externo. Essa carga circulante gerada é tal
que o campo magnético gerado (chamado induzido) pode se opor ou não
ao campo externo. No primeiro caso,
diz-se que os elétrons produzem um
efeito de blindagem sobre o hidrogênio, no segundo, o efeito é de desblindagem desse núcleo (Figura 16). Dessa forma, o núcleo fica sujeito a um
campo magnético efetivo (Befet = B0 Binduzido), e o grau de blindagem ou
desblindagem dependerá da densidade eletrônica próxima dele, ou seja, do
ambiente químico em que ele se encontra. Isso justifica diferentes absorções para núcleos próximos a átomos
eletronegativos, onde a desblindagem
é maior, uma vez que átomos eletronegativos diminuem a densidade eletrônica dos átomos de hidrogênio que
estejam em suas vizinhanças. Para o
etanol (Figura 15), por exemplo, os
átomos de hidrogênio do grupo -CH2
encontram-se mais próximos do átomo de oxigênio do que os do grupo –
CH3. Por isso, a densidade eletrônica
na região próxima ao grupo –CH2 será
menor que na região próxima ao grupo
–CH3, o que torna os primeiros mais
desblindados com relação a esses últimos.
Conclui-se, então, que núcleos em
diferentes ambientes químicos apresentarão diferentes freqüências de absorção devido a diferentes graus de
blindagem ou desblindagem. A diferença entre essa freqüência de absor-
Figura 12: Influência de B1 na magnetização líquida
ção com relação a um determinado
núcleo-referência (chamado padrão) é
denominada deslocamento químico.
Assim, núcleos quimicamente equivalentes (em semelhantes ambientes eletrônicos) apresentam o mesmo deslocamento químico. No etanol, todos os
três núcleos de hidrogênio do grupo –
CH3 apresentam o mesmo deslocamento químico, ocorrendo a mesma
coisa com os dois núcleos de hidrogênio do grupo –CH2.
Os valores de deslocamento químico em unidades de freqüência são
valores muito próximos. Por isso, é
δ),
muito usual a chamada escala delta (δ
dada pela relação:
δ = νamostra x 106 / νespectrômetro
onde νamostra é dada em Hertz e νespectrôem MHz. A escala δ é, portanto,
metro
adimensional com valores expressos
em ppm. Os núcleos mais blindados
apresentam valores de δ menores, enquanto os mais desblindados apresentam valores de δ maiores. No espectro
de RMN de hidrogênio (RMN-1H) do
etanol (Figura 15), podem ser observados dois valores de deslocamento
químico: um primeiro, próximo a 1
ppm, mais blindado em relação ao
segundo, próximo a 3,5 ppm. Como os
Figura 13: Decaimento exponencial do sinal de RMN
núcleos de hidrogênio da –CH3 são
mais blindados que os do -CH2, os
primeiros absorvem a 1 ppm e esses
últimos a 3,5 ppm.
7- ACOPLAMENTO SPIN-SPIN
Observando-se um espectro de
RMN, pode-se ver que os sinais originados das absorções nem sempre aparecem como picos únicos ou singletos,
mas podem aparecer também como
dupletos, tripletos, quartetos etc. (Figura 15), o que está relacionado com
o que se chama acoplamento spinspin. Esse fenômeno é originado quando núcleos em diferentes ambientes
eletrônicos estão próximos entre si
(normalmente o efeito é observado em
até três ligações, exceto quando existirem duplas ou triplas ligações).
Basicamente, existem dois tipos de
acoplamento spin-spin: o acoplamento homonuclear, quando o acoplamento ocorre entre o mesmo tipo de
núcleos, como, por exemplo, quando
hidrogênios em diferentes ambientes
químicos acoplam entre si, e o acoplamento heteronuclear, que ocorre entre
núcleos diferentes, como, por exem-
Figura 14: FID do etanol
plo, entre hidrogênio e carbono.
Por meio da Mecânica Quântica,7
sabe-se que o desdobramento de um
sinal de singleto para dupleto, tripleto,
etc. (chamado de multiplicidade) pode
ser dado pela relação 2nI+1, onde n é
o número de núcleos vizinhos em
diferentes ambientes químicos e I é o
número de spin do núcleo que está
sendo analisado. Para núcleos com
spin I = ½ , a multiplicidade será dada
simplesmente por (n+1).
Assim, no espectro de hidrogênio
do etanol (Figura 15), desprezandose o hidrogênio do grupo –OH, devido
ao processo de troca química, (não
abordado aqui), serão observados dois
sinais devidos a acoplamento homonuclear: um relativo aos hidrogênios
da metila e outro aos hidrogênios do
grupo –CH2, uma vez que se encontram em diferentes ambientes eletrônicos e que, portanto, apresentarão diferentes deslocamentos químicos. Esses
sinais, entretanto, não aparecem como
singletos (Figura 15). A multiplicidade é dada por (n+1): os três hidrogênios da metila têm dois vizinhos (os
dois hidrogênios do grupo –CH2); logo,
o seu sinal aparecerá no espectro como
um tripleto (2 + 1 = 3), observado em
torno de 1 ppm. Analogamente, os dois
hidrogênios do grupo –CH2 têm como
vizinhos os três hidrogênios da metila
e seu sinal será um quarteto (3 + 1 = 4),
cuja absorção é obervada em torno de
3,5 ppm.
A intensidade dos picos de um
multipleto não é a mesma. Ela está
associada ao número de transições
naquela determinada freqüência de
cada um dos picos observados. Para
núcleos com I = ½, a intensidade dos
picos do multipleto pode ser obtida a
partir do triângulo de Pascal (Figura
17), dispensando o cálculo dos números de transições associadas a cada um
dos picos. Assim, para um dupleto, por
exemplo, a intensidade dos sinais será
de 1:1; para um tripleto, de 1:2:1; para
um quarteto, de 1:3:3:1; e assim por
diante, segundo os valores expressos
no triângulo de Pascal.
A distância entre cada um dos picos
de um multipleto é chamada de constante de acoplamento J (Figura 18), e
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21- julho/agosto 2001
57
Figura 15: Espectro de hidrogênio do etanol
indica o quanto um acoplamento entre
núcleos é efetivo: uma maior constante
de acoplamento significa um acoplamento mais efetivo.
Além disso, a constante de acoplamento também pode servir para identificar diferentes acoplamentos no espectro. Essa identificação é facilitada
tendo-se em conta que, se um núcleo
A acopla-se a um núcleo B com uma
constante de acoplamento JAB, a constante de acoplamento de B com A (JBA)
deve ser igual a JAB (JAB = JBA). Tabelas
contendo diferentes valores de constantes de acoplamento para diferentes
grupos funcionais e moléculas podem
ser encontradas na Literatura,7-10 o que
facilita a interpretação dos sinais em
um espectro de RMN de uma maneira
inequívoca. Os valores das constantes
de acoplamento J são dados em unidades de freqüência (Hz) e são chamadas
1 2 3
J, J, J,…, nJ, dependendo do número
de ligações existentes entre os núcleos
que acoplam (1, 2, 3, …, n ligações,
respectivamente).
poderosa técnica para a elucidação
estrutural de moléculas orgânicas, inorgânicas e principalmente de biomoléculas. Essas moléculas apresentavam
espectros de difícil interpretação devido, principalmente, à superposição de
sinais ao longo de toda a faixa espectral
e/ou em uma dada região de freqüência17 (Figura 19). A RMN-2D possibilitou a interpretação dos espectros dessas moléculas, antes dificilmente identificadas pelos métodos em uma dimensão.
Para entender as razões disso e o
que é um espectro de RMN em duas
dimensões, assim como o seu processamento, é necessário compreender
conceitos como tempo de preparação,
tempo de evolução e tempo de detecção.
Tempo de preparação é o período
durante o qual um sistema de spins é
preparado para atingir o equilíbrio térmico. Esse tempo pode incluir a aplicação de um ou mais pulsos ou, simplesmente, ser um período t ≠ 0; pode até
mesmo nem existir, dependendo do
experimento que está sendo realizado.
O importante é que o sistema de spins
se encontre em equilíbrio antes que o
experimento seja iniciado.
O tempo de evolução (chamado t1)
constitui o experimento de RMN propriamente dito, durante o qual o sistema de spins evolui fora da situação de
equilíbrio pela aplicação de um ou
mais pulsos, dependendo da informação que se deseja obter. O tempo de
detecção (ou tempo de aquisição, chamado t2) é o período durante o qual se
adquire o sinal do FID.
Um experimento unidimensional
pode apresentar esses três tempos (Figura 20). O tempo de evolução (t1) é
fixo e o sinal recebido é apenas função
do tempo de detecção (t2), que é
variável. Em um experimento convencional em uma dimensão, o tempo de
evolução t1 é zero e a detecção é
realizada imediatamente após o pulso
de radiofreqüência (Figura 21). Os
spins sofrem ação do campo B1 e o
resultado é, então, detectado. O sinal
A RESSONÂNCIA MAGNÉTICA
NUCLEAR EM DUAS
DIMENSÕES
Nas últimas quatro décadas, a realização de experimentos de RMN em
várias dimensões elevou sobremaneira
a capacidade de resolução dessa técnica, ampliando, conseqüentemente, os
seus horizontes de aplicação. A RMN
em duas dimensões (RMN-2D) foi proposta em 1971,16 e hoje representa uma
58
Figura 16: Blindagem e desblindagem de um núcleo
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21 - julho/agosto 2001
Figura 17: Triângulo
de Pascal mostrando a
intensidade relativa dos
picos para diferentes
valores de multiplicidade (n+1): para um
tripleto, n=2; para um
quarteto, n=3; e assim
por diante.
Figura 18: Constante de Acoplamento (J)
detectado no domínio temporal (FID)
é transformado para o domínio das
freqüências mediante a transformada
de Fourier e o espectro resultante é um
“gráfico” de amplitude x freqüência,
chamado unidimensional porque apenas um dos eixos corresponde a freqüências de absorção (Figura 15).
Em um experimento bidimensional, é válido o mesmo diagrama temporal (Figura 20). A principal diferença é que existem obrigatoriamente dois
períodos variáveis: o tempo de evolução (t1, que em um experimento 1D
pode ser zero) e o tempo de aquisição
(t2). Fazendo-se uma série de experimentos nos quais variem progressivamente os valores do tempo de evolução, desde zero até t1, tem-se duas
variações no domínio temporal: uma
devida a t1 e outra devida a t2. Se uma
série de FIDs for detectada a partir
desses experimentos nos quais se variam os valores de t1, a transformada de
Fourier ao longo de t2 dessas diferentes
FIDs fornecerá uma série de espectros
1D. Se uma outra transformada de
Fourier for realizada ao longo de t1,
então poderemos obter um espectro
bidimensional, com sinais observados
ao longo de duas dimensões, F1 e F2.18
Dessa forma, informações complexas, que antes apareciam em apenas
uma dimensão (por exemplo, hidrogênios em ambientes químicos semelhantes que apresentam deslocamentos químicos muito próximos, o que
pode levar à superposição de sinais),
aparecem agora em duas dimensões,
facilitando a interpretação do espectro
para determinação da estrutura molecular.
O espectro bidimensional resultante pode ser representado de duas formas: o gráfico superposto (stacked),
que mostra o espectro em três dimensões (F1, F2 e intensidade); e o gráfico
de contorno, que representa um corte
horizontal do gráfico stacked. Esse
corte é selecionado pelo próprio usuário de acordo com a intensidade que
se deseja obter. O corte leva a um
gráfico bidimensional F1 x F2 (Figuras
22, 23).
Embora o gráfico stacked seja mais
fácil de ser visualizado, é, entretanto,
mais difícil de ser analisado, uma vez
que interpretação em três dimensões
se torna mais complexa. Por isso, um
corte transversal que gera um gráfico
de contornos (Figuras 22, 23) é
muito mais utilizado, já que com ele
se obtém um diagrama bastante claro, constituído por linhas de contorno que são bem mais convenientes
de ser analisadas.
Existem hoje diferentes tipos de
experimentos em RMN multidimensional (2D e 3D) que utilizam diferentes recursos tanto em termos de
software como de hardware.13
Experimentos menos recentes
também continuam sendo muito utilizados para elucidação estrutural.
Os experimentos COSY (Correlated
SpectroscopY) e HETCOR (HETeronuclear CORrelation) são exemplos
disso. O espectro COSY fornece correlações para o mesmo núcleo (por
exemplo, 1H com 1H, Figura 22). O
espectro de 1H aparece ao longo da
diagonal. Os pontos fora dessa diagonal representam correlações entre
hidrogênios não-equivalentes e são
denominados “cross-peaks”.
Os cross-peaks, como mostra a
Figura 22, devem, obrigatoriamente, formar um triângulo retângulo
com relação aos picos correspondentes na diagonal, em razão da
simetria do espectro, dado de grande
importância na interpretação do espectro, pois é uma garantia de que os
picos realmente estão acoplando.
Caso não seja formado um triângulo
retângulo, pode-se garantir que os
picos em análise não estão acoplando. Além disso, o experimento COSY
apresenta também a vantagem de
obter os valores das contantes de
acoplamento J em unidades de freqüência Hz, o que representa mais
uma garantia do acoplamento entre
os picos que estão sendo analisados.
No caso do espectro obtido pelo
experimento HETCOR (Figura 23),
o espectro não aparece na diagonal.
Em uma dimensão, aparece o espectro do hidrogênio, por exemplo, enquanto em outra dimensão aparece
o espectro do outro núcleo (no caso
do espectro da Figura 23, o outro
núcleo é o de carbono-13). O espectro bidimensional mostra as correlações existentes entre os dois núcleos
como em um gráfico do tipo xy.
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21- julho/agosto 2001
59
Figura 19: Espectro de RMN-2D de uma proteína (Bloch Jr. C., et al. 1998)
CONCLUSÃO
Apesar de relativamente recente, a
Ressonância Magnética Nuclear já é
referência mundial para a análise de
estruturas moleculares em diversas áreas
do conhecimento. Na Bioquímica moderna, essa técnica permitiu, de forma
inédita, a investigação de estruturas
tridimensionais de biomoléculas em
condições próximas do estado fisiológico (soluções aquosas). Tal fato pos-
Figura 20: Tempos
possíveis em um experimento de RMN
60
sibilitou um considerável avanço nos
estudos de dinâmica molecular que,
antes da RMN, limitavam-se quase que
exclusivamente a dados cristalográficos. Mesmo com todo o avanço tecnológico registrado ultimamente nesse
campo, a determinação da estrutura
tridimensional de uma biomolécula
ainda não pode ser considerada uma
tarefa trivial. As limitações e peculiaridades dessa técnica, bem como a gigantesca demanda imposta pelos vári-
os projetos genomas concluídos neste
começo de século, além daqueles que
ainda estão por vir, indicam as dimensões do trabalho que se tem pela
frente.
De fato, vários grupos de pesquisa
têm-se unido em consórcios (The Research Collaboratory for Structural Bioinformatics, http://www.rcsb.org/
index.html), assim como empresas de
biotecnologia (Celera Genomics; http:/
/www.celera.com/), para atacar de for-
Figura 21: Experimento de RMN em uma dimensão
Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento - nº 21 - julho/agosto 2001
Morales, pelos elaboração e arte de
várias figuras apresentadas neste artigo.
REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
Figura 22: Espectro COSY do etanol
Figura 23: Espectro HETCOR do etanol
ma mais eficiente a etapa considerada
mais fascinante e desafiadora desses
vários projetos, que é a determinação
das estruturas tridimensionais de todas
as proteínas sintetizadas por um dado
ser vivo, ao longo de todas as etapas
metabólicas de seu desenvolvimento.
É possível que os próximos anos
testemunhem iniciativas ousadas, a
exemplo do projeto genoma humano,
na área de determinação estrutural de
proteínas, nos quais, tanto a cristolografia de raio-X quanto a RMN multidimensional deverão ocupar papéis de-
cisivos na obtenção de estruturas 3D
em larga escala. Espera-se que o presente artigo possa dar uma contribuição, por menor que seja, nessa direção
a partir da difusão dos fundamentos
aqui apresentados e como introdução
a uma próxima publicação dedicada
exclusimente à RMN de proteínas.
AGRADECIMENTOS
Ao Professor José Daniel Figueroa
Villar pelos espectros do etanol gentilmente fornecidos e a Rodrigo A.V.
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2- Farrar, T.C. (1990), Concepts
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