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PERÍCIAS EM DNA: A COISA CERTA PODE SER FEITA DE FORMA ERRADA?
UM ESTUDO DE CASO HIPOTÉTICO.
Mary Christina Pitta Pinheiro de Souza Melgaço 1 , André Luís dos Santos
Figueiredo 2, 3 , Eduardo Ribeiro Paradela 2, 3
1
Coordenação Geral de Investigação por Análise do DNA in vivo e post mortem
da Defensoria Pública Geral do Estado do Rio de Janeiro.
2 DNA Forense – Peritos Associados e Análises Laboratoriais LTDA.
3 Universidade Federal do Estado do Rio de Janeiro (UNIRIO) – Laboratório de
Vínculo Genético (VINGENE).
Resumo
A introdução das técnicas para identificação humana por análise de DNA nos
tribunais de países como os Estados Unidos da América foi cercada de
desconfiança por uma significativa parcela da comunidade científica e dos
operadores do direito. Esta objeção se deveu, em parte, a inexistência de regras
definidas e padronizada s para os laboratórios envolvidos nestes exames. Embora
tal período de crítica tenha contribuído para o estabelecimento de rígidos
critérios para os serviços prestados, falhas ainda podem ocorrer. Neste artigo, é
apresenta do um caso criminal hipotético em que se aplicou a genética forense
como ferramenta investigativa. O objetivo é demonstr ar algumas possibilidades
de erro já descritas na literatur a especializada.
1. Introdução
Na área criminal, um dos propósitos da identificação humana por DNA
(genotipagem) é testar uma hipótese de que determina da pessoa é a fonte
doadora de uma evidência biológica. Dentre os possíveis resultados desta
investigação constam a exclusão - as amostras biológicas possue m origens
diferentes; o laudo com resultados inconclusos - não é possível deter minar, com
base nos resultados dos testes, se as amostras provêm ou não do mesmo doador;
a inclusão (ou não exclusão) - as genotipagens são similares e originara m - se da
mesma fonte. Esta última conclusão de similaridade genética meramen te
descreve o fato de que não foram detectadas diferenças entre duas amostras
através dos testes realizados (INMAN e RUDIM, 1997).
As genotipagens de regiões STR através da técnica da PCR (reação em
cadeia da polimerase) podem apresentar similaridades em três circunstâ ncias:
1-
2-
As amostras possue m a mesma fonte: a evidência biológica (mancha de
sangue, saliva, esper ma etc) se origina da mesma pessoa que cedeu a
amostra utilizada como referência;
A similaridade é coincidência: o doador da amostra referência e o
verdadeiro doador do material biológico possue m alelos coincidentes
em relação aos marcadores examinados;
1
2
3-
A similaridade é acidental: isto decorre de erros durante os processos
de coleta e/ou análise das amostras.
Em casos de abuso sexual e em cenas de múltiplos assassinatos, por
exemplo, é comum a análise de amostras contendo mistura de DNA de duas ou
mais pessoas. Há situações em que os profissionais responsáveis não levam em
consideração tais aspectos, fazendo pairar dúvidas a cerca de seus resultad os
(PARADELA et al., 2006). Em relação às investigações criminais, cada rastro
biológico encontrado na cena de um crime ou no corpo da vítima pode
represen tar um vestígio ou uma prova funda men tal para elucidar questões.
Portanto, deve haver um cuidado absoluto no levanta ment o dos vestígios de
material orgânico, quando todo e qualquer material passa a ter relevância. Sabese que a exposição do DNA a fatores como luz solar, microorganis mo s e
compo nentes químicos pode provocar a degradação da molécula. Logo, quanto
melhor for a coleta e a preservação do material coletado, melhor será a análise
do material genético extraído (PARADELA e FIGUEIREDO, 2007).
Os erros mais comuns nas genotipagens envolvem troca ou contaminação
de amostras e análise incorreta dos dados. Tal fato pode ser constatado a partir
de algumas manchetes publicadas nos últimos cinco anos, tais como: “DNA
errors lead to murder case review” (The Times on line , fevereiro de 2007);
“Forensic lab errors in hundreds of crime cases” (The Guardian,fevereiro de
2007); “POLICE FORENSICS: DNA mix- up prompt s audit at lab” (Las Vegas
Review- Journal, abril de 2002); “Audit calls for changes in police DNA lab” (Las
Vegas Review- Journal , maio de 2002); “Laboratório do PR é condenado por erro
em exame de DNA” (Folha de Londrina, julho de 2006); “More than 200 cases
reopened after DNA error” (The Independent, maio de 2007).
Entretanto, se os exames forem corretamen te executados, as amostras
estiverem em condições para análise (a degradação do DNA pode interferir nos
resultados) e os cálculos forem apropriada me n te executados, a confiabilidade
dos testes de DNA é absoluta. A seguir é apresenta do um caso hipotético de
investigação de abuso sexual que exemplifica algumas das falhas descritas na
literatura em análises desta nature z a.
2. O caso hipotético
2.1 - O caso: violência sexual contra mulher com vestígios de sêmen detectados
no raspado vaginal coletado da vítima.
2.2 - O laudo: o documento em que a análise do material genético é apresenta d a
informa a comparação de marcadores genéticos STR (regiões curtas repetidas in
tanden) presentes nas seguintes amostras: EVIDÊNCIA BIOLOGICA - esfregaço
vaginal coletado da vítima (V); AMOSTRAS REFERÊNCIA - amostras biológicas
(sangue) cedidas pela vítima e pelo principal suspeito (S1).
De acordo com o laudo, os alelos encontra dos foram visualizados com auxílio de
2
3
fluorescência e a razão de verossimilhança foi deter minada, não excluindo (S1)
como doador das células esper máticas encontrada s na evidência biológica. Os
resultados são parcialmente apresenta dos na Tabela 1.
Tabela 1 – Tipagens e avaliação dos resultados.
locus
V
Evidência
biológica
S1
Freqüência
alélica
F13B
9
10
8
9
10
8
10
25,9 (8)
40,2 (10)
TPOX
8
11
8
11
8
11
46 (8)
29(11)
AVALIAÇÃO DOS
DADOS DO LAUDO
O estu d o dos picos de intensi da de das
bandas se faz necessário para deter mi n a r
os comp o n e n t e s principal e secun dá rio na
mistu ra e eliminar a hipótese de o alelo 8
encon t ra d o no esfregaço vaginal ser um
“STUTTER BAND” (stutter band: tamb é m
conhecido como banda fantas ma) relativo
ao alelo 9 provenien te da vítima. Tais
bandas são artefato s da reação em cadeia
da
polime ras e
e
pode m
provocar
equívocos de interpr e ta ção se certos
cuidad o s não forem toma do s.
A análise dos picos de intensid a d e das
bandas se faz necessária para deter mi n a r
se o siste ma de amplificação usou como
molde o material das células do acusa do e
da vítima ou some n t e as desta última,
visto que há coincidência alélica nas
amos tra s de V e S1. Em casos de
esfregaços vaginais conte n d o mistu ra de
material biológico e send o o compo n e n t e
masculino
predo mi n a n t e m e n t e
constit uíd o de células esper m á ticas é
comu m a amplificação preferencial da
principal contribuin te, ou seja, a vítima.
3
4
6
13
6
6
6
6
32,2 (6)
17
17
16
17
16
17
25,4 (16)
23,4 (17)
D13S31 8
7
13
8
12
13
12
12
27,1 (12)
F13A0
1
vWA
O alelo 13 prese n te na amos t ra de V não é
verificado no prepa ra d o advind o do
esfregaço vaginal. Isto pode decorrer do
fenô me n o
conhecido
como
“AMPLIFICAÇÃO DIFERENCIAL”, que é um
artefato caracteriza d o pela diferença na
eficácia de amplificação entre dois alelos
(GILL et al, 1997; LYGO et al, 1994).
Problema s no curso dos processo s de
amplificação
e
detecção
de
alelos
invalida m o uso deste locus , pois não se
pode deter min a r com absoluta precisão se
o material das células esper m á tica s foi
amplificad o. Desta forma, a razão de
verossi milha nça apresen ta d a no laudo
deve ser recalculada.
A deter min ação dos picos de intensida d e
das bandas se faz necessária para
deter mi n a r os compo ne n t e s principal e
secun dá rio na mist u ra e eliminar a
hipóte se de o alelo 16 encon tra d o no
esfregaço vaginal ser um “STUTTER
BAND” relativo ao alelo 17 provenien te
do DNA de V.
A deter min ação dos picos de intensida d e
das bandas se faz necessária para
deter mi n a r os compo ne n t e s principal e
secun dá rio na mist u ra e eliminar a
hipóte se de o alelo 12 encont ra d o no
esfregaço vaginal ser um “STUTTER
BAND” relativo ao alelo 13 provenie nte do
DNA de V.
2.3 - Análise do laudo técnico hipotético
O uso de reações MULTIPLEX empregando corantes fluorescentes associado
à detecção automatiza d a para determinação de alelos STR pela técnica da PCR
fornece não só informação qualitativa dos alelos presentes na amostra (tipagem),
mas também informação quantitativa referente às intensidades relativas das
bandas. Como conseqüência, isto possibilita aferir a quantidade de DNA
amplificado (CLAYTON et al, 1998). Com freqüência, é possível separar as
contribuições principal e secundária em misturas simples (BAN, 2000; CLAYTON
et al, 1998; EVETT et al, 1998) e determinar a presença de “STUTTER BANDS”,
bandas extras geradas pelo desliza mento da enzima TAQ POLIMERASE e que
apresenta m uma unidade de repetição a menos que a verdadeira (GILL et al,
1997). Vale ressaltar que tal artefato de técnica é comum nas reações MULTIPLEX
utilizadas neste caso.
4
5
No laudo técnico em questão não é mencionada a avaliação dos picos de
intensidade (“PEAK AREAS”) das bandas referentes aos alelos identificados. Tal
análise é importante para eliminar eventuais interpretações equivocadas dos
resultados (BAN, 2000; CHANNELL, 2000; GUTIN et al, 1999; EVETT et al, 1998;
GILL et al, 1998) e deter minar as freqüências estatísticas consideran d o - se
somente os loci para os quais não há múltiplas possibilidades interpreta tivas.
Todo o processo envolvido na análise de DNA é importante e a
interpretação adequada dos resultados é essencial (MELENDEZ, 2001). As análises
estatísticas são utilizadas para interpretar os resultados das genotipagens
(SALDANHA, 2001). Quando o teste falha em excluir um acusado como possível
contribuinte para uma evidência, deve- se calcular a representatividade estatística
do emparelhame nt o (MELGAÇO, 1998). Este cálculo depende da freqüência dos
alelos encontra dos em determinado grupo populacional (MONSON e BUDOWLE,
1998; ROEDER, 1994; WEIR, 1996).
A análise de misturas pode ser complexa uma vez que várias combinações
de genótipos podem ser consideradas, de acordo com cada situação (CURRAN et
al, 1999). Existem diferentes estratégias para tratament o estatístico de misturas
(MAIA et al, 2001; SZAKACS, 2001). Embora o tipo de cálculo para deter minação
da razão de verossimilhança utilizada neste caso seja reconhecida por alguns
autores como uma maneira apropriada para interpretar evidências (AIKEN, 1995;
EVETT e WEIR, 1998), outros tratament os estatísticos poderiam ser utilizado s
para validar os resultados em situações que envolvem misturas de materiais
biológicos (SZAKACS, 2001; CURRAN et al, 1999; WEIR et al, 1996). Tais
metodologias levam em consideração diferentes hipóteses para constr ução do
perfil alélico em misturas como a encontra da no esfregaço vaginal da vítima.
Considerações finais
Em análises forenses de DNA, os resultados podem incluir ou excluir
suspeitos como doadores de amostras encontradas em cenas de crime ou no
corpo da vítima. O mesmo acontece quando o propósito do estudo é investigar a
existência de vínculo genético, pode - se incluir ou excluir a possibilidade de
ocorrência do parentesco analisado. As exclusões não requerem análise
estatística desde que sejam absolutas, ou seja, haja diferenças entre as amostras
que não justificadas por outra razão. As inclusões, por sua vez, devem ser
analisadas estatisticamente, pois é preciso saber a freqüência em que o
emparelha men t o pode ocorrer.
3. Consideraçõe s gerais
Para a aceitação de um trabalho pericial, dois componentes devem ser
considerados: a acurácia (validade) e a consistência (reprodutibilidade) das
análises. Em análises de DNA, o perito deve informar honesta m en te as limitações
dos testes, quando estas existirem. Qualquer falha entre a coleta de amostras e a
5
6
divulgação dos resulta dos pode levar a conclusões equivocadas em exames de
DNA.
São recomendações básicas de quesitos para a elaboração do laudo pericial
de análise de DNA: identificação do número do inquérito policial ou processo
judicial; identificação das partes envolvidas e amostras; informação da etnia
(raça) dos envolvidos, quand o possível e relevante; citação da metodologia
empregada na coleta e armazena m en t o de materiais e, se necessário,
esclarecimento dos cuidados empreendidos para manutenção da cadeia de
custó dia destes materiais. Em adição, o laudo deve conter informações
bibliográficas a cerca das metodologias utilizadas para a extração, quantificação
e amplificação do DNA; forma de identificação dos alelos obtidos nos testes e
funda me nt os empregados para os cálculos estatísticos (CHANNELL, 2000). As
freqüências estatísticas utilizadas como base para os cálculos também devem ser
mencionadas (US CONGRESS, 1990).
4. Conclusõe s
O fato de duas amostras terem o mesmo perfil para um grupo de
marcadores genéticos em especial não significa, obrigatoriamente, que elas
possu a m a mesma origem. Quando a tipagem genética de duas amostras é igual,
torna - se necessário expressar numericamente a significância deste evento. O
número de marcadores empregados, a presença de subestr ut u r a s na população e
a mistura de amostras podem interferir nos resultados. A expressão estatística
dos resultados deve basear - se na presença ou não de misturas de material
biológico, como é freqüenteme n te observado em casos de abuso sexual.
Uma questão funda me nt al no uso do DNA como evidência é a validação
científica dos métodos de análise. Em outras palavras, é preciso ter garantias
científicas de que os testes podem inequivocamente identificar inclusões e
exclusões para cada marcador genético utilizado. Inicialmente, a credibilidade
dos testes deve partir da nature za das amostras biológicas utilizadas. Com
freqüência, as amostras são encontra das em superfícies não - estéreis, podend o
sofrer danos após contato com a luz solar, microorganis mos e solventes. Existem
procedimentos que podem minimizar a ação destes fatores de degradação do
DNA. Entretanto, muitos cuidados devem ser tomados para evitar equívocos na
interpretação. A amplificação pela PCR (reação em cadeia da polimerase) que é
largamente empregada nas tipagens genéticas, pode produzir falhas e artefatos
quand o a qualidade do material biológico está compro me tida. Amostras
parcialmente degrada das podem proporcionar, por exemplo, a amplificação
preferencial de alelos e o surgimento das bandas fantasm as (“stutter bands”). No
primeiro caso, tem - se a amplificação de um alelo em detrimento do outro. Isto
pode gerar a falsa impressão de se tratar de um indivíduo homozigoto ao invés
de heterozigoto para o locus em estudo. Já as bandas fantasm as decorrem de
falhas no processo que geram bandas com uma unidade de repetição a menos
que a do alelo original. Deste modo, pode - se interpretar equivocada men te o
resultado como um falso heterozigoto ou identificar um alelo erronea men te.
6
7
Na atualidade, existem tecnologias, como os leitores por fluorescência
capazes de dirimir dúvidas e evitar erros desta nature za. Contudo, estes
equipamen tos são caros e poucos técnicos no Brasil estão capacitados a operá los. Outro fator importante é a reprodu tibilidade dos testes. Em Ciência, é
preciso que os resultados sejam passíveis de reprodução para que sejam aceitos
como verdade científica. No campo forense, não é incomu m a necessidade de
repetição das tipagens. Isto pode encarecer o processo, mas não deve ser
descartado, principalmente quando o que está sob suspeita é o teste em si.
Para as análises de DNA, diversos quesitos podem ser postulados para a
interpretação dos dados, incluindo - se neste ponto a escolha e o uso apropriad o
das técnicas; as supracita das freqüências populacionais empregadas para os
cálculos e o tipo de análise estatística empregada; os controles de qualidade
adotado s; a documentação dos procedimentos; a qualidade dos equipamen to s e
reagentes utilizados e a capacitação técnica dos profissionais envolvidos.
Todas as etapas empreendidas para a tipagem do DNA, desde a coleta até a
interpretação
do
significado
estatístico
dos
dados
obtidos,
serão
consubstanciadas em uma peça pericial escrita que servirá aos interesses de seus
leitores. Em instância final, o laudo poderá ainda servir como elemen to de
convicção para juizes, promotores e advogados nas ações penais.
Cabe a advogados, juizes e a comunidade científica estar atentos ao fato de
que os testes absoluta me n te não são infalíveis, como ocorre com qualquer outra
atividade humana. Deve- se implementar no Brasil, confor me já ocorre em outros
países, rigorosos padrões de qualidade para garantir a credibilidade de tão
importante ferrame nta.
4. Referências bibliográficas
Ban JD. Interpreta tion of STR profiles - commu nity guidelines. Presentation in the
3 rd annual fluorescent STR megaplex technology workshop. SC, USA, 2000.
Channell K. Writing a complicated STR report. Presentation in the 3 rd annual
fluorescent STR megaplex technology workshop. SC, USA, 2000.
Clayton TM, Whitaker JP, Sparkes R, Gill P. Analysis and interpretation of mixed
forensic stains using DNA STR profile. Forensic Sci. Int. 91: 55- 70. 1998.
Curran JM, Triggs CM, Buckleton J, Weir BS. Interpreting DNA mixtures in
structure d populations. J. Forensic Sci. . 44 (5): 987- 995. 1999.
Evett IW, Weir BS. Interpreting DNA Evidence: Statistical Genetics for Forensic
Scientists. Sinauer Associates Ed, Sunderland, MA, US, 1998.
Gill P, Sparkes R, Kimpton C. Development of guidelines to desiguinate alleles
using STR Multiplex systems. Forensic Sci. Int. 89: 185- 197. 1997.
7
8
Gutin S, Scholl T, Thomas A. Advancement in allele- calling accuracy and
through p u t. Proceedings of the 10 th International Symposium on Human
Identification. FL, USA. 1999.
Inman K, Rudin N. An introduction to forensic DNA samples. CRC Press. 1997.
Lygo JE, Johnson P, Holdaway J, Woodroffe S, Whitaker JP, Clayton TM, Kimpton
CP, Gill P: The validation of short tandem repeat (STR) loci for use in forensic
casework. Int. J. Leg. Med. 107: 77- 89. 1994.
Maia FAS, Paula KAA, Dalton GC. Análise de mistura de material genético em
crimes sexuais envolvendo dois suspeitos. Anais do III simpósio latino americano de identificação humana. Curitiba, PR. 2001.
Melendez E. Razão de verossimilhança em casos complexos. Anais do III simpósio
latino - americano de identificação humana. Curitiba, PR. 2001.
Melgaço, MCP. DNA e Paternidade: “Falsa Exclusão”. Revista de Direito da
Defensoria. 12, 1998.
Monson KL, Budowle B. Effect of reference database on frequency estimates of
polymerase chain reaction (PCR) – Based DNA profiles. J. Forensic Sci. 43 (3):
483 - 488. 1998.
Paradela ER, Figueiredo ALS. Genética Forense - Coleta, Documentação e
Transferência de Evidências Biológicas Destinadas a Testes Forenses de DNA.
Trinolex,
São
Paulo,
11/01 / 2 0 07.
[Internet].
Disponível
http: / / w ww.trinolex.com / a r tigos_view.asp?icaso = a r tigos&id= 3177 . Acesso em
02 /0 5 / 2 0 0 7.
Paradela ER, Figueiredo ALS, Smarra ALS. A identificação humana por DNA:
aplicações e limites. In: Âmbito Jurídico, Rio Grande, 30, 30/06 / 2 0 0 6 [Internet].
ISSN
1518
–
0360.
Disponível
em
http: / / w w w.ambito juridico.com.br / site /i n d ex.ph p n_link = revista_artigos_leitura&artigo_id =1 1 75 .
Acesso em 02/05 / 2 0 0 7 .
Roeder K. DNA fingerprint: a review of the controversy. Statstical Sci. 9(2): 222 278. 1994.
Saldanha G. Software para cálculos estatísticos de casos de investigação de
vínculo genético. Anais do III simpósio latino - americano de identificação
humana. Curitiba, PR. 2001.
Szakacs N. Perspective on DNA casework: unusual exhibits mixture interpretatio n
and profiles from inhibited PCR mixtures. Anais do III simpósio latino - americano
8
9
de identificação humana. Curitiba, PR. 2001.
US Congress, Office of Technology Assessment: Genetic witness: forensic uses of
DNA tests. OTA- BA- 438. US Government Printing Office. Washington, DC. 1990.
Weir BS. Genetic Data Analysis II. Sinauer Associates Ed. Sunderland, MA, US,
1996.
Notas esclarecedoras:
Marcadores STR (“short tande m repeats”) - seqüências que apresenta m
repetições com unidade básica de 2- 7 pares de base e o polimorfismo, assim
como nos loci VNTR, também está baseado no número de repetições. Devido ao
pequeno tamanho, geralmente menor que 350 pares de base, alelos STR podem
ser analisados após amplificação pela técnica PCR.
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) - A PCR é um método in vitro que
sintetiza seqüências específicas de DNA. Esta reação utiliza um DNA que é usado
como "molde" (template em inglês) e primers , que são oligonucleotídeos
(pequenas seqüências que complementa m o DNA), que hibridam com o molde de
DNA para que a molécula seja copiada. A copia do molde é catalisada pela
enzima Taq polimerase . Uma série de ciclos repetitivos faz com que o molde seja
separado em suas hemi - hélices, os primers hibridem com o molde, a polimerase
catalise a ligação de nucleotídeos para formar uma nova cópia da região de
interesse do DNA. Como cada cópia produ zida em um ciclo pode servir de molde
no próximo ciclo, a cópia do DNA ocorre de forma exponencial. Em
aproxima da me n te 20 ciclos, a concentração de DNA aumenta aproximada me n te
um milhão de vezes.
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