Biologia Molecular
O termo Biologia Molecular
é usualmente aplicado à
Química de Ácidos Nucleicos
Ácido Deoxirribonucleico - DNA
Ácido Ribonucleico – RNA
Ciência Genômica
A informação genética de todos os animais é escrita na
linguagem universal das seqüências de DNA.
A seqüência de DNA pode ser obtida por técnicas bioquímicas
simples que hoje praticamente todos os laboratórios de
pesquisa podem dominar.
Histórico:
Primeiras evidências de que o DNA é o material genético:
• F. Miescher, 1868- extraiu DNA do núcleo celular pela primeira vez
(nuclein)
• O. Hertwing, 1884 - demonstrou que a fertilização de ovos dependia
da união de dois núcleos - um do óvulo e outro do esperma
Hertwing suspeitou que “nuclein” fosse o material da
hereditariedade. Hipótese que caiu em esquecimento durante os
próximos 60 anos.
• O. Avery, C. MacLeod e M. MacCarty, em 1944 - demonstraram em
experimentos com Pneumococcus que o DNA é o material genético
A pedra fundamental da Biologia Contemporânea
Nature - 25 de abril de 1953
“A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid”
J. Watson and W. Crick
•
“We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose
nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which
are of considerable biological interest….”
Hoje, o fato de que o DNA é o material genético é um
fato biológico tão óbvio e fundamental que torna-se
difícil apreender a enormidade do vazio de
conhecimento que esta descoberta preencheu.
1950: - Não se conhecia a seqüência de amino ácidos
de nenhuma proteína.
- Não se sabia que os amino ácidos numa proteína
permanecem arranjados numa seqüência exata.
1960: - Foi definida a primeira estrutura tridimensional
de uma proteína, definida por cristalografia.
Hoje conhecemos a seqüência primária de amino ácidos
de centenas de milhares de proteínas a partir dos genes
que as codifica.
A identificação de
moléculas de ácidos
nucleicos tornou-se a
maneira mais fácil de se
chegar a uma dada
proteína
Estrutura do DNA
Os ácidos nucleicos são moléculas muito mais
simples que as proteínas
Os ácidos nucleicos são formados de apenas
4 tipos de monômeros
(alfabeto de 4 letras)
Proteínas - alfabeto de 20 letras
ESTRUTURA DO DNA
O DNA é uma molécula quase “unidimensional”
Largura: 20 Angstrons
Comprimento: 1,7 a 8,5 cm
•Uma Estrutura linear que dá origem a outra
estrutura linear (o RNA)
•O RNA, por sua vez, dá origem a outra estrutura
linear (sem ramificações):
A Cadeia Polipeptídica
AS UNIDADES DO POLÍMERO - DNA
• Bases Purínicas (A ou G) e Pirimidínicas (C ou T)
• Um açúcar: desoxiribose
• Fosfato
• Nucleosídeo: purina ou pirimidina ligada ao açúcar
• Nucleotídeo: éster de fosfato de um nucleosídeo
• Exemplo: deoxiadenosina 5’ - trifosfato (dATP)
RNA
O DNA é uma molécula com polaridade:
uma extremidade 5’- P
uma extremidade 3’-OH
• A SEQÜÊNCIA DE BASES É SEMPRE LIDA NA DIREÇÃO
5’  3’
O DNA sempre tem duas fitas de ácidos nucléicos
enroladas em hélice
• As duas fitas de ácidos nucleicos se mantêm juntas por
PONTES DE HIDROGÊNIO
• Para que o pareamento ocorra, a DUAS FITAS têm que
ser ANTIPARALELAS
• O pareamento G-C tem 3 pontes de hidrogênio
• O pareamento A-T tem 2 pontes de hidrogênio
Figure 4-5 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Quanto maior o número de pontes de H mais
estável é a interação.
As fitas das moléculas de DNA no cromossomo
não se separam na célula íntegra sem ajuda de
enzimas especiais.
Desnaturação e Renaturação do DNA
(1961 - Marmur e Doty descobriram a RENATURAÇÃO do DNA)
• As duas fitas da dupla hélice podem ser reversivelmente
separadas quando as PONTES DE HIDROGÊNIO são rompidas:
Aumento de
temperatura ou
Extremos de pH
(usamos pH
alcalino para
separar as fitas)
Força de interação entre moléculas e entre átomos numa
mesma molécula
Tm
Quanto maior a
porcentagem de
pares GC, mais
difícil é a
desnaturação
e
% de GC
Separação das fitas é denominada “FUSÃO”
da molécula de DNA - “MELTING”
MELTING POINT:
TEMPERATURA NA QUAL É DESFEITA METADE DA
ESTRUTURA EM HÉLICE DO DNA
Ácidos Nucleicos absorvem
máximamente a 260 nm.
A quantificação de ácidos
nucleicos em laboratório é,
usualmente, feita por
espectrofotometria - na
faixa UV
A absorbância a 260 nm aumenta quando as fitas se separam.
Temperatura de desnaturação, ou “melting point” (Tm), é a
temperatura na qual ocorre 50% de desnaturação.
O DNA no núcleo:
• Um cromossoma : uma molécula de DNA
• Genoma: o conjunto de cromossomas de uma dada espécie
• Genoma Humano: 46 cromossomas
• 22 CROMOSSOMAS AUTOSSÔMICOS (x2)
• 2 CROMOSSOMAS SEXUAIS
• Total: 6 x 109 pares de nucleotídeos
Cada célula tem aproximadamente 2 metros de DNA, se esse
fosse desenrolado. O núcleo tem apenas 6 mm.
Compactação do DNA
Primeiro nível de compactação:
. nucleossomos
Segundo nível de compactação:
Histona H1
As histonas são proteínas altamente conservadas.
Histona H4 – 102 amino ácidos:
apenas duas diferenças entre H4 de uma pêra e de uma vaca!
Cromossomos na interfase
H1, H2A, H2B, H3 e H4 em interação com o DNA
142 pontes de H são formadas entre DNA e
o cerne das histonas, em cada nucleossomo.
A maioria entre o “backbone” de amino
ácidos das histonas e o “backbone”
fosfodiéster do DNA
Modificações na cauda N terminal das histonas
DNA de procariotas tem cerca de 1mm.
Têm que ser compactados para se acomodarem na célula.
A associação com poliaminas carregadas positivamente reduz a
repulsão entre moléculas de DNA, facilitando a compactação:
Proteínas interagem com o DNA, exercendo papel
semelhante aos das histonas. A mais abundante destas
proteínas é a H-NS.
Duplicação do DNA “in vivo”
DNA POLIMERASES
POLIMERIZAÇÃO: 5’---> 3’
• Todas as DNA-POLIMERASES requerem para
seu funcionamento:
– Molécula de DNA - molde
– “Primer” de oligonucleotídeo
– Magnésio
– dNTPs
Incorporação de um nucleotídeo na cadeia
Extremidade 3’
DNA-polimerase
DNA polimerases precisam de primer
DNA polimerases têm
dois sítios catalíticos:
. Sítio de polimerização:
Polimerase 5’3
. Sítio de remoção:
Exonuclease 3’5'
A necessidade de que a
duplicação se faça com alta
fidelidade requer uma
atividade “proofreading
Mecanismo
hipotético:
incompatível com
o processo de
correção
Mecanismo
real
O SENTIDO DA VIDA É ....
NA DIREÇÃO 5’  3’
DUPLICAÇÃO DO DNA “in vivo"
DNA bacteriano: circular
Origem de replicação em
bactérias:
Uma seqüência específica de
DNA, com algumas centenas
de pares de bases, rica em AT.
Na origem forma-se o
complexo de replicação (RC)
na fase G1.
Figure 5-25 (part 1 of 2) Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Duplicação de um DNA circular
Bactérias
Plasmídeos
DNA mitocondrial
Duplicação do DNA
Em eucariotos
As origens de replicação são elementos do DNA
aos quais se ligam ORCs (origin replication
complex)
Janela de oportunidade: fim em G1
proteínas específicas se ligam aos ORCs (pre-RC)
[Leveduras: Cdc6p e RLFs (MCM)]
Proteínas cinases dependente de ciclinas
(ciclinas B-CDK) agem no pré-RC
Ciclinas B acumulam-se na célula
imediatamente antes da fase S e fosforilam
proteínas do pré-RC
pré-RC fosforilado  pós-RC
Inicia-se a fase S
Pós-RCs não são capazes de reiniciar a
replicação do DNA
O Processo de replicação só será possível
quando as células filhas passarem novamente
pelo mesmo processo.
Cada cromossomo tem aproximadamente 150 milhões de pares de nucleotídeos.
Numa velocidade de 50 nts/s, levaria cerca de 800 horas para replicar um
cromossomo.
Em cada cromossomo, 20 a 80 origens são ativadas para que o DNA seja replicado
em tempo hábil.
O intervalo entre as origens de replicação varia entre 30.000 a 300.000 pares de
nucleotídeos.
Replicação semiconservativa
No local de replicação forma-se uma bolha, que vai se abrindo
em ambas as direções.
Das duas fitas originais, simultaneamente surgem quatro.
A fita nova é iniciada pelo
complexo PRIMASE+DNA-pol a
que sintetiza um primer de RNA
A polimerização se faz obrigatoriamente na direção 5’3'
Fragmentos de Okazaki
na fita de síntese
descontínua
Fazem parte do complexo de replicação além das polimerases:
Girase e Helicase (abrem as fitas)
Helicase é um hexâmero de proteínas MCM
 Proteínas que se ligam no DNA quando em fita única
RPA (replication protein A)
Figure 5-15 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 5-16 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
 RFC (replication factor C) – (Clamp Loader)
Atua na substituição do complexo primase/DNA-pol a
•
pela polimerase que irá estender a fita por distâncias maiores (Pol e ou Pol d)
•
Carrega a PCNA para o local
 PCNA (proliferating cell nuclear antigen)
(Sliding clamp)
•
PCNA funciona como um anel que circunda o DNA
e prende a DNA-polimerase no local, aumentando
sua processividade
Figure 5-18a Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
RFC
Estas proteínas são
importantes para
manutenção da estabilidade
cromossômica porque
participam também do
reparo do DNA e soluções
dos problemas de quebra na
fita durante a replicação
(stalled replication forks)
PCNA
Figure 5-18b Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Figure 5-18c Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Um “fork” de replicação de mamífero.
Primers: 7-9 RIBOnucleotídeos estendidos depois até ~30 nts pela DNA polimerase a
Na “lagging-strand”, os “primers” são sintetizados a cada 100 a 200 nucleotídeos.
DNA helicase:
à medida que se
move ao longo do
DNA, hidrolisa ATP
e separa as fitas,
numa velocidade
de ~ 1000 nt/s
Velocidade de polimerização:
Procariota: 500 a 1000 nucleotídeos/segundo
Eucariota: 50 nucleotídeos/segundo
Topoisomerase I
Topoisomarease II
Figure 5-23 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)
Maturação dos fragmentos de Okazaki
Cerca de 50 milhões de Fragmentos de Okazaki são gerados a cada
duplicação do DNA em células de mamíferos
Sempre auxiliadas por PCNA as seguintes enzimas participam da maturação dos
fragmentos de Okazaki:
• Rnase H/FEN1: degrada os segmento RNA do segmento alfa
• FEN1: cliva o segmento que é deslocado pela DNA polimerase d (se pequeno)
• DNA2/RPA: cliva o segmento deslocado, se este é longo
• FEN1 + exo1 : podem também fazer a edição da porção DNA do segmento a
FEN1 – metilada: cliva o segmento
FEN1 – fosforilada: desprende-se do complexo
Ligase I : fecha a interrupção na fita (nick)
Término de replicação de DNA linear: telômeros
Sequências repetidas dos
telômeros (TTAGGG)
velha
3’
Fitas
parentais
5’
****
nova
Telomerase
nova
3’
velha
5’
+
velha
3’
nova
5’
Primers de RNA
Digestão dos primers
por RNases
3’
****
Digestão do primer
por RNases
5’
+
3’
5’
Preenchido pela DNA-polimerase
Primase
DNA-polimerase
Falha na extremidade
(primer gap)
Falha na extremidade
(primer gap)
Estrutura da
telomerase
Telomerase é uma transcriptase reversa: uma classe de DNA
polimerases que sintetiza DNA a partir de uma “template” de RNA.
Em humanos, a
seqüência
GGGTTA é
adicionada pela
telomerase, se
estendendo por
cerca de 10.000
nucleotídeos.
A extremidade do telômero adquire
uma estrutura especial (alça T)
Ausência de Rtel1 leva a
instabilidade genômica com fusões
de cromossomos.
Os telômeros têm a cromatina
altamente condensada.
A maquinaria de replicação desloca o DNA das histonas. Ambas as fitas de DNA herdam histonas velhas.
H2A e H2B velhas se juntam com H3 e H4 novas.
H3 e H4 velhas se juntam com H2A e H2B novas.
mRNAs de histonas aumentam cerca de 50 vezes durante a replicação, e em seguida são rapidamente
degradados.
Chaperonas auxiliam na montagem dos nucleossomos nas fitas filhas