NATUREZA E ESTRUTURA DO MATERIAL GENÉTICO ÁCIDOS NUCLEICOS INTERVENÇÃO EM MUITAS REACÇÕES IMPORTANTES TRANSPORTE DA INFORMAÇÃO GENÉTICA DUPLICAÇÃO FIEL TRANSCRIÇÃO SELECTIVA VARIABILIDADE REPLICAÇÃO DNA TRANSCRIÇÃO RNA TRADUÇÃO PROTEÍNA NOMENCLATURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS BASES RARAS DNA RNA As células também contêm nucleótidos com o grupo fosfato noutras posições: • 2’ monofosfatos • 3’ monofosfatos • 2’,3’ monofosfatos cíclicos Exemplos: • Adenosina 3’,5’ monofosfato cíclico (cAMP) • Guanosina 3’,5’ monofosfato cíclico (cGMP) Funções? Os ácidos nucleicos formam-se através de ligações fosfodiéster entre nucleótidos sucessivos O esqueleto covalente é hidrofílico Os grupos OH dos açúcares estabelecem ligações de hidrogénio com a água Os grupos fosfato encontramse completamente ionizados e carregados negativamente a pH=7 OLIGONUCLEÓTIDOS < 50 nucleótidos POLINUCLEÓTIDOS > 50 nucleótidos As cargas negativas são neutralizadas por interacções iónicas com cargas positivas das proteínas, iões metálicos e poliaminas AS PROPRIEDADES DAS BASES AFECTAM A ESTRUTURA TRIDIMENSIONAL DOS ÁCIDOS NUCLEICOS ¾ Compostos com características básicas fracas ¾ Moléculas conjugadas; a ressonância entre os átomos do anel confere às ligações propriedades de duplas ligações parciais ¾ Moléculas planares ou quase planares que apresentam tautomerismo consoante o pH ¾ Moléculas hidrofóbicas e relativamente insolúveis a pH próximo da neutralidade da célula ¾ Interacções hidrofóbicas entre as bases minimizam o contacto com a água e estabilizam a estrutura tridimensional dos ácidos nucleicos ¾ Grupos funcionais (azoto do anel, grupos carbonilo e amino exocíclicos) estabelecem ligações de hidrogénio entre as bases EXPERIÊNCIA DE GRIFFITH EXPERIÊNCIA DE HERSHEY – CHASE 1953 ESTUDOS DE CHARGAFF ¾ A composição em bases do DNA varia de espécie para espécie ¾ Os DNA isolados de diferentes tecidos da mesma espécie apresentam todos igual composição em bases ¾ A composição em bases do DNA de determinada espécie não varia em função da idade, do estado nutricional ou de mudanças do meio ambiente ¾ Em todos os DNA celulares, independentemente da espécie, o nº de adenosinas é igual ao nº de timidinas (A = T) e o nº de guanosinas é igual ao nº de citidinas (G = C) AS CADEIAS POLINUCLEOTÍDICAS ADOPTAM ESTRUTURAS EM HÉLICE A ESTRUTURA EM HÉLICE É DETERMINADA PELAS PROPRIEDADES DAS BASES Moléculas conjugadas, planares, hidrofóbicas e praticamente insolúveis em água EMPILHAMENTO DAS BASES (stacking) mantido por interacções hidrofóbicas, van der Waals e dipolo-dipolo A DUPLA HÉLICE DO DNA MODELO DE WATSON-CRICK 1953 ¾ 2 CADEIAS POLINUCLEOTÍDICAS ¾ COMPLEMENTARES ¾ ANTIPARALELAS (estabilidade) ¾ SULCO MAIOR (ideal para ligação de proteínas) E SULCO MENOR ¾ ESTRUTURA ESTABILIZADA POR: ligações de hidrogénio forças de van der waals interacções dipolo-dipolo ¾ A CONFORMAÇÃO DA DUPLA HÉLICE ESTÁ RELACIONADA COM A EXPRESSÃO DOS GENES, DADO QUE INFLUENCIA A LIGAÇÃO DE PROTEÍNAS REGULADORAS FORMAS TRIDIMENSIONAIS DIFERENTES DO DNA A VARIAÇÃO ESTRUTURAL DO DNA REFLECTE 3 PARÂMETROS: ¾ diferentes conformações possíveis da desoxirribose ¾ rotação nas ligações que constituem o esqueleto fosfo-desoxirribose ¾ rotação livre na ligação C - 1’- N - glicosídica Desoxirribose: • Endo • Exo Possibilidade de rotação livre em 7 ligações diferentes do esqueleto de fosfo-desoxirribose Rotação livre na ligação C - 1’- N - glicosídica Devido a condicionamentos de ordem estérica apenas 2 conformações estáveis se observam: • Syn • Anti DIFERENTES FORMAS TRIDIMENSIONAIS DA MOLÉCULA DE DNA SOLUÇÕES QUE PROVOCAM CERTAS SEQUÊNCIAS DESIDRATAÇÃO DO DNA INDUZEM FORMA Z EXISTÊNCIA INCERTA ZONAS DE REGULAÇÃO ESTRUTURAS POUCO HABITUAIS DAS SEQUÊNCIAS DE DNA ESTRUTURA EM GANCHO APENAS UMA CADEIA DE DNA OU RNA ESTÁ ENVOLVIDA ESTRUTURA CRUCIFORME AS DUAS CADEIA DE DNA ESTÃO ENVOLVIDAS EMPARELHAMENTO DE HOOGSTEEN Posições de Hoogsteen → N-7, O6 e N6 das purinas H - DNA TAT CGC GGC AAT TETRAPLEXES DE GUANOSINA a) anti-paralelos b) paralelos Formam-se nos telómeros que são regiões ricas em guanosinas SEQUÊNCIA ESPECÍFICA DE AMINOÁCIDOS NUMA PROTEÍNA FUNCIONAL INFORMAÇÃO GENÉTICA CODIFICADA NO DNA RNA ESTRUTURA ¾ Cadeia simples ¾ Conformação helicoidal com rotação para a direita ¾ Interacção por empilhamento de bases (mais forte entre purinas) ESTRUTURAS MAIS COMPLEXAS DAS MOLÉCULAS DE RNA PRESENÇA DE SEQUÊNCIAS COMPLEMENTARES ¾ dupla hélice na forma A ¾ nunca se observou a forma B ¾ a forma Z apenas foi observada em laboratório EMPARELHAMENTO INCORRECTO, OU BASES NÃO EMPARELHADAS, LEVAM À FORMAÇÃO DE: ¾ Saliências (bulges) ¾ Círculos (loops) ESTRUTURAS MAIS COMPLEXAS DAS MOLÉCULAS DE RNA O RNA PODE EMPARELHAR COM REGIÕES COMPLEMENTARES DE RNA OU DNA: ¾ Emparelhamento G – C ou A – U (T) ¾ Ligações de hidrogénio que não seguem a regra de Watson-Crick ¾ Emparelhamento G – U muito comum ¾ Emparelhamento antiparalelo ESTRUTURAS TRIDIMENSIONAIS ÚNICAS E COMPLEXAS tRNA da fenilalanina de levedura Ribozima em cabeça de martelo Intrão de Tetrahymena thermophila SUPERCOILING DO DNA TOPOLOGIA (DO DNA) ¾ ESTUDO DAS PROPRIEDADES DE UM OBJECTO QUE NÃO SE ALTERAM SOB DEFORMAÇÕES CONTÍNUAS ¾ AS DEFORMAÇÕES CONTÍNUAS INCLUEM MUDANÇAS CONFORMACIONAIS DEVIDAS A MOVIMENTO TÉRMICO OU A INTERACÇÕES COM PROTEÍNAS OU OUTRAS MOLÉCULAS ¾ AS DEFORMAÇÕES DESCONTÍNUAS ENVOLVEM A QUEBRA DA CADEIA DE DNA SUPERCOILING DO DNA ¾ O supercoiling corresponde ao sobre-enrolamento da dupla hélice de DNA como resultado de uma tensão estrutural A replicação e a transcrição do DNA requerem a separação das cadeias de modo que afectam e são afectadas pelo supercoiling ¾ Propriedade intrínseca da estrutura terciária do DNA ¾ Ocorre em todos os DNA celulares e encontra-se altamente regulado em cada tipo de célula SUPERCOILING DO DNA 10,5 pares de bases por cada volta da dupla hélice ¾ Menos voltas da dupla hélice ¾ Maior número de pares de bases por volta Tensão termodinâmica ¾ Nos DNA circulares isolados a tensão estrutural é aliviada preferencialmente pelo supercoiling, em vez da separação das cadeias, porque requer menos energia que a necessária para a quebra de pontes de hidrogénio ¾ In vivo, contudo, é favorecida a separação de cadeias dado que permite o acesso à informação nelas contida Cada célula desenrola activamente o seu DNA com ajuda de processos enzimáticos de onde resulta um estado de tensão que representa uma forma de energia armazenada Estado de desenrolamento: ¾ Facilita a compactação do DNA ¾ Permite o acesso de enzimas necessárias à separação de cadeias que ocorre em diversas fases do metabolismo do DNA ¾ A MAIORIA DO DNA CELULAR ENCONTRA-SE DESENROLADO ¾ O DESENROLAMENTO PROVOCA TENSÃO TORCIONAL QUE INDUZ O DNA A DOBRAR-SE SOBRE SI PRÓPRIO REMOÇÃO DE UMA VOLTA PROVOCA TENSÃO ESTRUTURAL SUPERCOILING DO DNA ¾ Enrolamento da dupla hélice sobre si própria ¾ DNAs circulares fechados ¾ DNAs lineares complexados com proteínas que bloqueiam as extremidades da dupla hélice Supercoil negativo favorecido pelo desenrolamento da hélice Supercoil positivo favorecido pelo sobre-enrolamento da hélice NÚMERO DE LIGAÇÃO Linking number Nº de voltas completas de uma cadeia sobre a outra NÚMERO DE LIGAÇÃO Linking number Nº de voltas completas de uma cadeia sobre a outra O DESENROLAMENTO DO DNA PROVOCA MUDANÇA NO LINKING NUMBER CÍRCULO RELAXADO Lk = 20 = Lk0 ∆Lk Lk0 ∆Lk== Lk Lk -- Lk 0 QUEBRA DA CADEIA ∆Lk = - 2 nick Lk = NÃO DEFINIDO Lk = 18 A DIFERENÇA ESPECÍFICA DE LINKING -2 __ = - 0,1 σ= 20 σ= ∆Lk Lk0 Nº VOLTAS ELIMINADO Nº VOLTAS NO DNA RELAXADO SUPERCOIL NEGATIVO O GRAU DE DESENROLAMENTO (σ x 100) DA MAIORIA DOS DNA CELULARES É 5 - 7% PROMOÇÃO DE ESTRUTURAS CRUCIFORMES PELO DESENROLAMENTO DO DNA SUPERCOILS NEGATIVOS E POSITIVOS TOPO-ISOMERASES Enzimas que afectam o supercoiling do DNA FUNÇÕES ¾ Manter o DNA no estado de supercoiled, importante para a função de muitas enzimas tal como a RNA polimerase ¾ Aliviar a tensão induzida pelo desenrolamento da dupla hélice durante os processos de replicação e de transcrição ¾ Necessárias para a condensação e empacotamento do DNA no mínimo espaço possível TOPO-ISOMERASE ¾ Conhecidas como enzimas nicking - closing Linking number = n ¾ Monoméricas (≈ 100 kD) ¾ Presentes em TIPO I procariotas e eucariotas ¾ Formam um intermediário covalente transitório com o DNA ¾ Não necessitam de cofactor energético para a sua actividade ¾ Removem supercoils negativos → > Lk Linking number = n + 1 TOPO-ISOMERASE TIPO II ∆ LK = 0 ∆ LK = - 2 ¾ Introduz supercoils negativos - < LK ¾ Requer a presença de ATP - ATPases ¾ Relaxa supercoils positivos ou negativos ¾ Mecanismo de “inversão de sinal” ¾ Durante todos os processos biológicos em que o DNA está envolvido (replicação, transcrição, etc), a dupla hélice separa-se. ¾ As forças que a mantêm unida devem ser adequadas para manter a sua estabilidade, mas suficientemente fracas para facilitar a separação das cadeias quando necessário. ¾ O estado dinâmico da dupla hélice é caracterizado por um movimento constante das partes abertas ao longo da cadeia. TIPOS DE SUPERCOILING DO DNA PLECTONÉMICO IN VITRO SOLENOIDAL COMPACTAÇÃO DO DNA IN VIVO PROPRIEDADES QUÍMICAS DOS ÁCIDOS NUCLEICOS DESNATURAÇÃO Processo correspondente à separação das duas cadeias da dupla hélice A desnaturação pode ser provocada por: ¾ ¾ ¾ ¾ aumento de temperatura compostos alcalinos forças iónicas baixas reagentes desnaturantes (compostos que enfraquecem ou quebram as pontes de hidrogénio) EFEITO HIPOCRÓMICO A absorvência de uma solução de DNA é cerca de 40% inferior à soma das absorvências das bases individuais No entanto, quando o DNA se desnatura completamente o valor da sua absorvência atinge praticamente o valor esperado através da soma das absorvências das bases individuais RENATURAÇÃO Processo correspondente ao reemparelhamento das bases após uma desnaturação 1 PASSO 2 PASSOS Observa-se novamente um EFEITO HIPOCRÓMICO tm - TEMPERATURA DE FUSÃO DEPENDE: • pH • FORÇA IÓNICA • TAMANHO DO DNA • SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA A DETERMINAÇÃO DO tm A pH E FORÇA IÓNICA FIXOS DEPENDE DA COMPOSIÇÃO EM BASES A SEPARAÇÃO DE CADEIAS ANTES DA REPLICAÇÃO E DA TRANSCRIÇÃO DÁ-SE EM ZONAS RICAS EM PARES A=T HIBRIDAÇÃO Processo correspondente à reassociação de duas cadeias, com igual ou diferente origem DNA - DNA RNA - RNA DNA - RNA TRANSFORMAÇÕES NÃO-ENZIMÁTICAS ¾ ALTERAÇÕES EXPONTÂNEAS NA ESTRUTURA COVALENTE DOS NUCLEÓTIDOS CONSTITUINTES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS ¾ OCORREM MUITO LENTAMENTE, MAS REVESTEM-SE DE IMPORTÂNCIA FISIOLÓGICA PORQUE A CÉLULA TOLERA MAL ALTERAÇÕES NA SUA INFORMAÇÃO GENÉTICA ¾ MUTAÇÕES ALTERAÇÕES QUE PROVOCAM MUDANÇAS PERMANENTES NA INFORMAÇÃO GENÉTICA. ENCONTRAM-SE RELACIONADAS COM OS PROCESSOS DE ENVELHECIMENTO E CARCINOGÉNESE POR QUE É QUE O DNA TEM TIMINA E NÃO URACILO? DESAMINAÇÃO DESPURINAÇÃO RADIAÇÃO ULTRA-VIOLETA RADIAÇÕES IONIZANTES Xeγ ABERTURA DO ANEL FRAGMENTAÇÃO DAS BASES QUEBRA DO ESQUELETO COVALENTE DOS ÁCIDOS NUCLEICOS PRECURSORES AGENTES DO ÁCIDO NITROSO ALQUILANTES Provocam desaminação Provocam a metilação das bases Usados na alimentação como conservantes DMS metila guanina em O6metilguanina que não pode emparelhar com citosina DANOS OXIDATIVOS A fonte mais importante de alterações mutagénicas no DNA Durante os processos de irradiação, ou como produto intermediário do metabolismo aeróbico, formam-se espécies de oxigénio super-reactivas (peróxido de hidrogénio, radicais hidroxilo, radicais superóxido) A célula dispõe de sistemas de defesa (catalase, superóxido dismutase) para destruir estas espécies reactivas, convertendo-as em produtos inofensivos A alteração do DNA ocorre devido a um grande e complexo grupo de reacções que vão desde a oxidação da desoxirribose e das bases até a ruptura na cadeia nucleotídica METILAÇÃO DAS BASES DO DNA ¾ Certas bases são enzimaticamente metiladas ¾ Adenina e citosina são metiladas mais frequentemente que guanina e timina ¾ A metilação ocorre geralmente em determinadas sequências e regiões do DNA ¾ A função da metilação é conhecida em certos casos, enquanto que em outros permanece por esclarecer ¾ Todas as DNA metilases utilizam a S-adenosilmetionina (SAM) como dador de grupos metilo FUNÇÕES DA METILAÇÃO EM E.coli ¾ Dois sistemas de metilação: 1. Mecanismo de defesa que auxilia a célula a distinguir o seu próprio DNA do DNA estranho (metila o seu DNA e destrói o DNA estranho que não apresenta grupos metilo) 2. Mecanismo de reparação de erros ocorridos durante a replicação (metila as adenosinas da sequência GATC em N6metiladenosina)
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