WEBLAB: FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA
Gabriel C. Fonseca; Giann B. Reis; Roberto C. Giordano; Alberto C. Badino;Antonio J.
G. Cruz
1
Universidade Federal de São Carlos, Departamento de Engenharia Química
Rodovia Washington Luis (SP 310), km 235, Bairro Monjolinho
CEP 13565-905 – São Carlos – São Paulo
[email protected]
Resumo: Este trabalho descreve o desenvolvimento, implementação e operação de
experimento de acesso remoto (WebLab) baseado em experimento de fermentação alcoólica
(produção de etanol). A produção de etanol é realizada em um reator (dois litros de volume
útil) empregando o microrganismo Saccharomyces cerevisiae na presença de glicose como
principal fonte de carbono. Durante o processo, o dióxido de carbono produzido é enviado
para um tubo hermético, onde este se acumula. O aumento da pressão no interior deste tubo é
monitorado com auxílio de um manômetro digital. Vários experimentos foram realizados de
modo a calibrar o sistema. Dessa forma foi possível estabelecer uma relação direta da
concentração de etanol no meio reacional com a pressão no interior do tubo. Desenvolveu-se
no programa LabVIEW interface gráfica para o experimento (WebLab) onde se visualiza
graficamente o valor da pressão e da concentração de etanol. Foi também programado
modelo matemático para simular os perfis da concentração de células, de glicose e de etanol
ao longo do cultivo. Implementou-se também um simulador para o WebLab, sendo este
disponibilizado na internet. Assim, é possível simular a realização do experimento em
diferentes condições antes da realização da prática experimental a distância.
Palavras-chave: Experimento remoto, i-Lab, Etanol, Simulador, Bioprocesso.
1.
INTRODUÇÃO
Na última década a instalação de acessórios para aquisição de dados em experimentos
tornou-se prática comum, devido à redução dos custos da instrumentação e da popularização
dos computadores. Com os experimentos automatizados e controlados via computador, o
próximo passo foi associar a tecnologia Web. Surgiu, desta forma, os WebLabs ou i-Labs no
final da década passada (i-CAMPUS, 2007). Um WebLab (laboratório de acesso remoto via
Internet) pode ser definido como um laboratório de qualquer ciência experimental que pode
ser remotamente acessado e controlado através da Internet. Com isto, ampliou-se o nível de
interatividade dos ambientes virtuais de ensino-aprendizagem (NEDIC et al., 2003). Em um
WebLab o experimento é realizado através do acesso a um link (endereço eletrônico) onde o
experimento encontra-se disponível. É preciso de um Web browser (programa para “navegar”
pela Internet) e um computador conectado à Internet para ter acesso ao aparato experimental
que se encontra fisicamente instalado em algum laboratório de ensino ou pesquisa. O
experimento é controlado a distância e em tempo real.
No estado de São Paulo a FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa no Estado de São
Paulo), através do projeto KyaTera (programa TIDIA), financiou o desenvolvimento e a
implantação de uma rede de fibras ópticas interligando várias instituições de ensino e
pesquisa. Esta rede opera em velocidade gigabit e conecta os laboratórios que integram o
projeto original (fibras apagadas, ou seja, conectam-se laboratório a laboratório). Os WebLabs
foram desenvolvidos para serem ferramentas colaborativas entre as instituições.
Neste trabalho descreve-se o desenvolvimento, implementação e operação de WebLab
utilizado para realização de experimentos de fermentação alcoólica em biorreator de bancada
(volume útil de dois litros). O experimento foi montado para que se possa remotamente
acompanhar o aumento da concentração de etanol na fase líquida através do aumento da
pressão no interior de tubo de PVC causada pela produção simultânea de dióxido de carbono
na reação. Neste experimento é possível também visualizar a variação da concentração de
células e de glicose ao longo do cultivo através de modelo matemático do processo. Foi
desenvolvido também um simulador do experimento (disponibilizado na Internet). Dessa
forma, é possível a simulação do experimento em diferentes condições experimentais antes do
acesso remoto ao experimento real.
2.
FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
O etanol tem muitas aplicações como matéria-prima e solvente sendo utilizado em
grandes quantidades nas indústrias química, farmacêutica e de alimentos (SHULER E
KARGI, 2002). No Brasil, também é empregado como combustível alternativo aos
combustíveis fósseis. Na safra 2006/07 foram produzidos 17,5 bilhões de litros de etanol
(JORNAL CANA, 2008). O etanol pode ser produzido pela rota química e bioquímica.
Contudo, a rota bioquímica é a dominante. As leveduras são os organismos preferencialmente
empregados para a produção de etanol em escala industrial. A levedura Saccharomyces
cerevisiae é o principal organismo usado para produção de álcool etílico. No Brasil a sacarose
proveniente da cana-de-açúcar é a matéria-prima do processo produtivo. A levedura sintetiza
em nível de parede celular a enzima invertase responsável pela conversão da sacarose em
glicose e frutose (hexoses).
2.1 Teoria
No interior das células as leveduras convertem as hexoses (via glicólise) em etanol e
dióxido de carbono, de acordo com a estequiometria (1):
C 6 H12 O 6
→
2 CO 2
+
2C 2 H 5OH
(1)
A partir da equação (1) observa-se que quantidades equimolares de dióxido de carbono e
etanol são formadas para cada mol de hexose consumida.
O rendimento teórico do processo (massa de etanol formado / massa de glicose
consumida) é 0,51. Normalmente subprodutos como glicerol, acido succínico e ácido acético
são produzidos, o que faz com que o rendimento obtido seja da ordem de 90 a 95% do teórico.
A produção de etanol ocorre em ambiente anaeróbio (ausência de oxigênio) e o rendimento
célula/substrato obtido (massa de células formada / massa de glicose consumida) é de 0,12. A
fermentação ocorre a temperatura (30 - 35 oC) e pH (4 - 6) (SHULER E KARGI, 2002).
2.2 Cinética do Crescimento Microbiano
Em processos fermentativos que produzem metabólitos primários, como é o caso do
etanol, o crescimento celular e a formação de produto ocorrem simultaneamente. Desta forma,
o crescimento celular e a síntese de produto estão diretamente relacionados. Assim, a
produção de etanol pode ser estimada diretamente da cinética de crescimento celular. Partindo
da hipótese que a concentração celular é uma boa medida do sistema enzimático responsável
pela conversão do substrato a produto, define-se de forma conveniente a velocidade específica
de crescimento celular (μ) como:
μ=
onde:
dC X
dt
1 dC X
⋅
C X dt
(2)
é a variação da concentração celular com o tempo (t).
Vários modelos cinéticos são propostos na literatura para relacionar a velocidade
específica de crescimento celular (μ) com o substrato limitante e, quando conveniente, com
concentrações de inibidores. Modelo clássico foi proposto por Monod (BAILEY e OLLIS,
1986), sendo apresentado na equação (3).
μ = μ max ⋅
onde: μmax
CS
KS
CS
K S + CS
(3)
é a velocidade específica máxima de crescimento celular (CS >> KS)
é a concentração do substrato limitante
é a constante de saturação do modelo de Monod
No processo de produção de etanol, altas concentrações iniciais de glicose levam a
obtenção de elevadas concentrações de produto, o que inibe o crescimento celular e,
conseqüentemente, a produção de etanol. Várias equações relacionando o efeito da
concentração do produto (CP) à velocidade específica de crescimento celular (μ) existem na
literatura. Um dos modelos propostos é apresentado na equação (4).
μ = μ max ⋅
onde: CP
KP
CS
KP
⋅
K S + CS K P + C P
(4)
é a concentração de etanol
é a constante de inibição pelo produto
Um modelo para o processo de produção de etanol pode ser obtido a partir do balanço de
massa para células, glicose e etanol em um biorreator operado em batelada. As equações (5),
(6) e (7) apresentam este modelo, composto por três equações diferenciais ordinárias.
dC X
= μ ⋅ CX
dt
(5)
dCS
μ ⋅ CX
=−
dt
YX / S
onde: YX/S
é o coeficiente global de conversão de substrato a células
dC P μ ⋅ C X
=
dt
YX / P
onde: YX/P
(6)
(7)
é o coeficiente global de rendimento de células a produto (YX/P = YX/S/YP/S)
2.3 Descrição do WebLab
O WebLab foi implementado utilizando equipamento da National Instruments para
aquisição dos dados e programa LabVIEW (versão 8.0) para elaboração do programa de
supervisão e controle do processo. Um diagrama esquemático dos equipamentos que compõe
o WebLab é apresentada na Figura 1 (Curraleiro e Badino, 2006).
Figura 1. Diagrama esquemático do WebLab de fermentação alcoólica.
A Figura 2 apresenta a tela do programa desenvolvido em LabVIEW (versão 8.0) para
simulação do processo de produção de etanol. Nesta tela o usuário visualiza o aparato
experimental (composto pela dorna de fermentação, reator, conectada ao tubo de PVC). A
temperatura do processo é monitorada em um mostrador. O valor da pressão no interior do
tubo é visualizado graficamente. Os valores das concentrações de células, de glicose e etanol
são apresentados também graficamente. O usuário deve fornecer os valores dos parâmetros
cinéticos (μmáx, ks, YX/S, YX/P) além das condições iniciais utilizadas (concentração celular, de
glicose e de etanol). O tempo desejado para realizar o experimento deve também ser
fornecido.
O próximo passo consiste em clicar sobre o botão <INICIAR>. A qualquer momento o
usuário pode parar o experimento, reiniciando a partir do mesmo ponto. Ao término do
experimento, basta clicar sobre o botão <LIMPAR GRÁFICOS> e uma nova simulação pode
ser realizada em diferente condição. Caso o usuário queira sobrepor gráficos (experimentos
em diferentes condições), não é necessário clicar no botão <LIMPAR GRÁFICOS>.
Figura 2. Tela do simulador do experimento de produção de etanol implementada no
programa LabVIEW (versão 8.0).
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Microrganismo
Foi empregado o microrganismo Saccharomyces cerevisiae – fermento comercial marca
“Fleischmann”, com teor de umidade de 70% em todos os experimentos.
3.2 Meios de Cultura
Os meios de cultura empregados nos experimentos têm as composições (em g/L)
apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição do meio de cultivo empregado nos experimentos.
Componente
Glicose
KH2PO4
MgSO4.7H2O
Extrato de levedura
(NH4)2SO4
Anti-espumante
H2O destilada
Concentração (g/L)
20,0 – 40,0
5,0
0,4
3,0
1,8
1 mL / L
q.s.p.
O pH do meio de cultivo foi ajustado em 4,6 utilizando-se ácido sulfúrico ou hidróxido
de sódio diluídos. Os meios foram preparados imediatamente antes dos cultivos e, devido à
alta concentração de inóculo utilizada (levedura), ao baixo valor de pH e ao curto período de
fermentação (aproximadamente 240 minutos), não houve necessidade de esterilização dos
mesmos.
3.3 Métodos Analíticos
Determinação da Concentração Celular (CX)
A concentração celular foi avaliada pelo método da massa seca.
Determinação da Concentração de Glicose (CS)
A concentração de glicose foi analisada pelo método do DNS (ácido dinitrosalicílico)
(MILLER, 1959).
Determinação da Concentração de Etanol (CP)
A concentração de etanol foi analisada pelo método de oxidação pelo dicromato de
potássio (JOSLYN, 1970).
4.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Realização de Cultivos para Determinação de Parâmetros Cinéticos
3.0
20
2.8
18
2.6
16
Concentração de glicose (g/L)
Concentração celular (g/L)
Foram realizados cultivos para determinação de parâmetros cinéticos do processo. Em
todos os ensaios foram retiradas amostras em intervalos regulares para a análise da
concentração de células, de substrato e de etanol. A Figura 3 ilustra os dados experimentais e
simulados de um dos experimentos realizados. Os valores dos parâmetros empregados na
simulação estão na Tabela 2.
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
14
12
10
8
6
1.4
4
1.2
2
0
1.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
0.0
4.5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Tempo (horas)
Tempo (horas)
7
Concentração de etanol (g/L)
6
5
4
3
2
1
0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Tempo (horas)
Figura 3. (A) Concentração de células, (B) concentração de glicose e (C) Concentração de
etanol, ao longo do experimento 6.
A partir dos valores experimentais, procedeu-se a determinação do coeficiente de
conversão célula/substrato (YX/S) e da velocidade específica máxima de crescimento celular
(μmax). As Figuras 4 e 5 apresentam os gráficos elaborados para determinação destes
parâmetros.
Figura 4. Gráfico para determinação de YX/S.
Figura 5. Gráfico para determinação de μmax.
A Tabela 2 apresenta os valores dos parâmetros YX/S e μmax obtidos nos experimentos
realizados.
Tabela 2 – Valores experimentais dos parâmetros YX/S e μmax.
Experimento 1
YX/S (g/g)
μmax (h-1)
Experimento 2
YX/S (g/g)
μmax (h-1)
Experimento 3
YX/S (g/g)
μmax (h-1)
Experimento 4
YX/S (g/g)
μmax (h-1)
Cs0 = 20,0 g/L e Cx0 = 1,3 g/L
0,12
0,26
Cs0 = 40,0 g/L e Cx0 = 6,0 g/L
0,08
0,16
Cs0 = 30,0 g/L e Cx0 = 4,0 g/L
0,14
0,23
Cs0 = 30,0 g/L e Cx0 = 4,0 g/L
0,11
0,21
Experimento 5
YX/S (g/g)
μmax (h-1)
Experimento 6
YX/S (g/g)
μmax (h-1)
YP/S (g/g)
Cs0 = 30,0 g/L e Cx0 = 4,0 g/L
0,13
0,29
Cs0 = 20,0 g/L e Cx0 = 1,0 g/L
0,098
0,31
0,34
Os valores obtidos para o coeficiente de conversão célula/substrato (YX/S) e para a
velocidade específica máxima de crescimento celular (μmax) estão próximos daqueles
encontrados na literatura (BADINO E HOKKA, 1999).
4.2 Influência do Aumento da Pressão na Produção de Etanol
A influência da pressão na formação de etanol foi investigada. Os resultados da
concentração de etanol obtida em cultivos realizados sem pressurização foram comparados
com resultados de cultivos realizados com pressurização do reator. O gráfico da Figura 6
apresenta esta comparação. Foram comparados os experimentos realizados em condições
experimentais semelhantes (experimento 2 com experimentos 4 e 5; e experimento 1 com
experimento 6).
Figura 6. Comparação da concentração celular em cultivos sem pressurização (experimentos 1
e 2) com a concentração em cultivos com pressurização (experimentos 4, 5 e 6).
A partir da Figura 6 é possível concluir que a pressurização não teve influência na
produção de etanol nas condições experimentais avaliadas.
4.3 Estimativa da Concentração de Etanol a partir da Pressão
Para obter uma relação entre a concentração de etanol produzida (presente na fase
líquida) e a pressão gerada no interior do tubo de PVC elaborou-se o gráfico da Figura 7. Foi
ajustada uma equação (curva de calibração para o sistema) relacionando a pressão com a
concentração de etanol em cada instante (equação 8).
Figura 7. Gráfico da concentração de etanol versus a pressão no interior do tubo de PVC ao
longo do experimento.
C P,estimado (g/L ) = 0,0082 ⋅ P
onde: CP,estimado
P
(8)
é a concentração estimada de etanol (g/L)
é a pressão (mmH2O)
A concentração de etanol referente ao dióxido de carbono (CO2) gerado e acumulado na
fase gasosa (interior do tubo de PVC) foi determinada utilizando a equação dos gases ideais,
para calcular o número de mols de CO2 no interior do tubo de PVC, e supondo quantidades
equimolares de etanol e CO2 gerados na fermentação.
C P,estimado (g/L) =
onde: P
VPVC
R
T
MMEtanol
Vmeio-cultivo
P ⋅ VPVC MM Etanol
⋅
R ⋅ T Vmeio_cultivo
(9)
é a pressão no interior do tubo de PVC (m.c.a)
é o volume do tubo de PVC (cm3)
é a constante dos gases ideais (847,37 m.c.a · cm3 · mol-1 · K-1)
é a temperatura (K)
é a massa molar do etanol (g · gmol-1)
é o volume do meio de cultivo (cm3)
A Tabela 3 apresenta os resultados de concentração de etanol calculada (CP,estimado)
utilizando-se a equação (9) e os valores de concentração de etanol experimental (CP) obtidos
em análise química empregando o método da oxidação pelo dicromato de potássio
(experimento 6).
Tabela 3 – Concentrações de etanol experimental e calculada pela equação (9).
Tempo (horas) P (mmH2O)
0,0
0
0,5
37
1,0
97
1,5
180
2,0
257
2,5
514
3,0
743
3,5
949
4,0
1008
CP (g/L)
0,137
0,275
0,275
1,923
3,023
4,671
5,221
6,045
6,595
CP,estimado (g/L)
0,010
0,163
0,415
0,771
1,109
2,235
3,265
4,219
4,537
4.4 WebLab do Experimento
A Figura 8 ilustra a primeira tela do WebLab desenvolvido. Nesta tela o usuário fornece
os valores das concentrações iniciais de célula, glicose e etanol (estes valores são a condição
inicial para integração das equações diferenciais ordinárias referentes aos balanços de massa,
equações 5, 6 e 7; a integração é realizada no próprio LabVIEW).
Figura 8. Primeira tela do WebLab de fermentação alcoólica.
Assim que a dorna é inoculada é possível acompanhar a variação da pressão no interior
do tubo de PVC (experimental e simulada), conforme ilustra a Figura 9. O valor simulado é
obtido a partir da equação (9). Nesta equação obtém o valor da pressão a partir do valor
simulado da concentração de etanol no meio de cultivo (integração do sistema composto pelas
equações 5, 6 e 7).
A Figura 10 apresenta a simulação da concentração celular, de glicose e etanol durante o
experimento.
Figura 9. Simulação e monitoramento em tempo real do valor da pressão no interior do tubo de PVC.
Figura 10. Simulação dos valores da concentração celular, de glicose e etanol a partir das
condições iniciais assumidas.
5.
CONCLUSÕES
Neste trabalho apresentou-se o desenvolvimento, implementação e operação remota de
WebLab onde se realizam experimentos de fermentação alcoólica.
A implantação de WebLabs torna possível o compartilhamento de experimentos por
diferentes instituições de ensino, permitindo que os estudantes possam ter uma formação mais
homogênea (nem todos laboratórios dispõem do mesmo conjunto de práticas experimentais).
O uso de WebLabs permite explorar o grande potencial de novas ferramentas de ensino
voltadas para a Internet. O simulador desenvolvido mostra-se adequado para ser utilizado
como uma ferramenta de treinamento antes da realização da atividade experimental.
O experimento mostrou-se adequado para ser operado remotamente. É adequado como
atividade de prática laboratorial devido ao tempo de duração (aproximadamente quatro horas;
este tempo pode ser reduzido aumentando-se a concentração celular do inóculo). Encontra-se
disponível para acesso dos demais laboratórios participantes do projeto KyaTera.
Agradecimentos
Os autores agradecem à FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo) pelo auxílio financeiro para realização deste projeto (Processos 03/08155-1 e
05/01377-4).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAILEY, J. E.; OLLIS, D. F. Biochemical Engineering. New York, USA: Academic Press,
2006.
BADINO, A.C.; HOKKA, C.O. Laboratory Experiment in Biochemical Engineering: Ethanol
Fermentation. Chemical Engineering Education, v. 33(1), p. 54, 1999.
CURRALEIRO, R. G.; BADINO, A. C. Sistema para Execução Remota e Monitoramento de
Experimento de Fermentação Alcoólica. In: CONGRESSO DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA,
2, 2006, São Carlos. Anais. São Carlos: UFSCar, 2006. P. 348.
i-CAMPUS. Citação de referências e documentos eletrônicos.
<http://icampus.mit.edu/spotlights/iLab.shtml> Acesso em 06 junho 2008.
Disponível
em:
JORNAL CANA. Citação de referência e documentos eletrônicos. Disponível em:
<http://www.jornalcana.com.br/Conteudo/Conheca%20o%20Setor.asp>. Acesso em 06 de
junho de 2008.
JOSLYN, M.A. Methods in Food Analysis. New York, USA: Academic Press, 1970.
NEDIC, Z.; MACHOTKA, J.; NAFALSKI, A. Remote Laboratories Versus Virtual and
Real
Laboratories.
Mawson
Lakes,
USA,
2003.
Disponível
em
<http://fie.engrng.pitt.edu/fie2003/papers/1077.pdf>. Acesso em 06 de junho 2008.
SHULER, M. L.; KARGI, F. Bioprocess Engineering – Basic Concepts. Upper Saddle
River, New Jersey, USA: Prentice Hall PTR, 2002.
MILLER, G. L. Use of the Acid Dinitrosalicilic for Determination of Reducing Sugar.
Analytical Chemistry, v. 31, p. 426-431, 1959.
WEBLAB: ALCOHOLIC FERMENTATION
Abstract: This work describes the design, implementation and internet remote operation of
WebLab based on alcoholic fermentation (ethanol production). The ethanol production is
carried out in a vessel (two liter working volume) employing Saccharomyces cerevisiae
microorganism. Glucose is used as main carbon and energy source. During the process, the
carbon dioxide produced is sent to a hermetically sealed PVC tube. The pressure increase is
monitored by means of a digital manometer. Various experiments were conducted in order to
calibrate the system. It was possible to establish a direct relation between ethanol
concentration in the liquid phase and the pressure inside the tube. A program was
implemented in LabVIEW (graphical interface) for the WebLab. In this program it was
possible to monitor the pressure inside the PVC tube and the ethanol concentration in the
medium during the process. A mathematical model was implemented to infer the cell, glucose
and ethanol concentration during the production process. A simulator was developed for
training purpose. Therefore it can be possible to simulate the experiment in different
conditions before to access and to carry out the WebLab experiment.
Key-words: Remote experiment, i-Lab, Ethanol, Simulator, Bioprocess.