UNISEB COC
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
BACHARELADO EM ENGENHARIA AMBIENTAL
PROSPECÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE XILANASES
E/OU CELULASES PARA REALIZAÇÃO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE
BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
André Luiz Gianeti Cardoso
Orientador: Dr(a). Simone de Carvalho Peixoto-Nogueira
RIBEIRÃO PRETO
2011
ANDRÉ LUIZ GIANETI CARDOSO
PROSPECÇÃO DE FUNGOS FILAMENTOSOS PRODUTORES DE XILANASES
E/OU CELULASES PARA REALIZAÇÃO DE HIDRÓLISE ENZIMÁTICA DE
BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR
Trabalho de conclusão de curso apresentado às
Faculdades COC de Ribeirão Preto, como
parte dos requisitos para obtenção do grau de
Bacharel em Engenharia Ambiental.
Orientador: Dr(a). Simone de Carvalho Peixoto-Nogueira
RIBEIRÃO PRETO
2011
C266p
Cardoso, André Luiz Gianeti.
Prospecção de fungos filamentosos produtores de xilanases
e/ou celulases para hidrólise enzimática do bagaço de cana-deaçúcar. André Luiz Gianeti Cardoso. - Ribeirão Preto, 2011.
49 f.
Orientadora: Profª. Drª. Simone de Carvalho PeixotoNogueira.
Trabalho de conclusão de curso apresentado ao Centro
Universitário UNISEB de Ribeirão Preto, como
parte dos requisitos para obtenção do Grau de
Bacharel em Engenharia Ambiental sob a
orientação da Profª. Drª. Simone de Carvalho
Peixoto-Nogueira..
1. Engenharia ambiental. 2. Microbiologia. 3. fungos
filamentosos. 4. Etanol. I. Título. II. PeixotoNogueira, Simone de Carvalho.
CDD 628.15
ii
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
Aluno: André Luiz Gianeti Cardoso
Código: 5455
Curso: Engenharia Ambiental
Semestre/Ano: 10º/2011
Tema: Prospecção de fungos filamentosos produtores de xilanases e/ou celulases para
realização de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar.
Objetivos pretendidos: Obter, a partir dos fungos selecionados, enzimas capazes de fazer a
hidrólise enzimática do bagaço de cana-de-açúcar e aperfeiçoar as condições de cultivo desses
mesmos fungos.
_____/_____/________
______________________________
Prof.ª Simone de C. Peixoto-Nogueira
Professor(a) Orientador(a)
_____/_____/________
_____________________________
André L. Gianeti Cardoso
Aluno
_____/_____/________
_____________________________
Prof. Osmar Sinelli
Coordenador do Curso
_____/_____/________
_____________________________
Prof. Reginaldo Arthus
Vice-Reitor
iii
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO
FORMULÁRIO DE AVALIAÇÃO – FATCC
Tema do trabalho: Prospecção de fungos filamentosos produtores de xilanases e/ou
celulases para realização de hidrólise enzimática de bagaço de cana-de-açúcar.
Data da apresentação: _____/_____/________
Horário: ____________
Local: _________________________________
Comissão Julgadora:
1) Professor Orientador: ________________________________________________
2) Professor da Área: __________________________________________________
3) Professor Convidado: ________________________________________________
iv
FOLHA DE PONTUAÇÃO
Fatores de Avaliação
Pontuação (0.0 a 2.0)
1. Atualidade e relevância do tema proposto.
2. Linguagem técnica utilizada em relação ao tema e aos
objetivos, e competência lingüística.
3. Aspectos metodológicos e formais da editoração do trabalho
escrito - seqüência lógica e coerência interna.
4. Revisão Bibliográfica realizada em relação ao tema
pesquisado.
5. Apresentação oral – segurança e coerência em relação ao
trabalho escrito.
Média: ____________ (__________________________________________________)
Assinaturas dos membros da Comissão Julgadora:
1) _____/_____/________
_______________________________________________
2) _____/_____/________
_______________________________________________
3) _____/_____/________
_______________________________________________
v
À minha querida mãe Divalda Gianeti,
dedico este trabalho, todo o meu amor e reconhecimento por
seu esforço em procurar, desde cedo, proporcionar-me
um futuro e uma vida digna. Por sua influência direta cheguei até aqui, sendo ela uma
fiel amiga.
vi
AGRADECIMENTOS
A minha orientadora, Dr(a). Simone de Carvalho Peixoto-Nogueira pela dedicação e
contribuição, para a concretização deste trabalho.
A minha namorada Fernanda, pelo apoio e incentivo.
À Uniseb - COC e aos professores que proporcionaram todo conhecimento e aprendizado
necessário para minha formação acadêmica, profissional e pessoal.
A todos meus amigos de classe que lutaram ao meu lado para conquistar este objetivo, em
especial Murilo de Paula Peterson Luque, Otávio Loss, Irineu Côrrea Neto e Renan Carneiro
de Castro.
Ao meu querido Pai Evandro Luiz Cardoso, agradeço e também dedico este trabalho. Muito
obrigado Pai pelo amor e carinho.
A minha irmã que muitas coisas me ensinou e muito amor me dedicou.
Aos meus Tios Ademir e Denizete, que não medem esforços em me ajudar todas as vezes que
preciso.
vii
“É melhor que fale por nós a nossa vida, que as nossas palavras”.
Mahatma Gandhi
viii
RESUMO
O trabalho iniciou-se com a coleta e prospecção de fungos filamentosos produtores de
xilanases e/ou celulases. As áreas para coleta e prospecção foram escolhidas de acordo com a
possibilidade de se encontrar fungos produtores de xilanases e/ou celulases, uma vez que
nessas áreas encontra-se material rico em xilana e celulose, assim, foi estabelecida como
prioridade a escolha de áreas com grande quantidade de matéria vegetal em decomposição. As
áreas de coleta foram: mata estadual de Batatais - SP, Bosque municipal de Ribeirão Preto –
SP e usina São Martinho S/A. Foram isoladas dezesseis espécies as quais foram submetidos a
um screening. As cepas denominadas AG7, AG11 e AG12 produziram mais xilanases e/ou
celulases em comparação às demais linhagens testadas. Com o intuito de obter melhores
condições de cultivo, o fungo AG7 foi cultivado com diferentes fontes de carbono, as quais
foram encubadas por 72 horas. Após esse experimento, escolheu-se o melhor tempo de cultivo
(72 horas) e fonte de carbono (farelo de trigo), para a realização dos experimentos posteriores.
ix
ABSTRACT
The work began with the collection and bioprospection of filamentous fungi producing
xylanases and / or cellulases. Areas for collecting and prospecting were chosen according to
the possibility of finding fungi that produce xylanases and / or cellulases, since these areas is a
material rich in cellulose and xylan was thus established as the choice of priority areas with
lots of mulch. The collection areas were state forest of Batatais - SP, municipal woodland of
Ribeirão Preto - SP and Factory São Martinho S/A. Sixteen species were isolated which were
subjected to a screening. Strains called AG7, AG11 and AG12 produced more xylanase and /
or cellulase in comparison to other strains tested. In order to better growing conditions, AG7
the fungus was grown with different carbon sources, which were incubated for 72 hours. After
this experiment, we chose the best cultivation time (72 hours) and a carbon source (wheat
bran), for the experiments later.
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................. 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................................................... 2
2.1 FUNGOS ......................................................................................................................................................... 2
2.2 FUNGOS FILAMENTOSOS ................................................................................................................................ 2
2.3 O REINO FUNGI .............................................................................................................................................. 3
2.4 COMPOSIÇÃO DA PAREDE CELULAR VEGETAL ................................................................................................ 4
2.5 OS SISTEMAS ENZIMÁTICOS EM ESTUDO ........................................................................................................ 8
2.5.1 A xilana e o sistema xilanolítico ........................................................................................................... 8
2.5.2 A celulose e o sistema celulolítico ...................................................................................................... 10
3. OBJETIVOS .................................................................................................................................................... 12
4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................................ 13
4.1 COLETA E ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS.................................................................................... 13
4.1.2 Isolamento dos microrganismos coletados......................................................................................... 13
4.2 MANUTENÇÃO DAS CEPAS ........................................................................................................................... 13
4.3 CONDIÇÕES DE CULTIVO EM FERMENTAÇÃO SUBMERSA .............................................................................. 14
4.4 DOSAGENS ENZIMÁTICAS ............................................................................................................................ 15
4.4.1 Xilanase .............................................................................................................................................. 15
4.4.2 Celulase .............................................................................................................................................. 15
4.5 DOSAGEM PROTÉICA .................................................................................................................................... 15
5. RESULTADOS ................................................................................................................................................ 16
5.1 COLETA E ISOLAMENTO DE FUNGOS FILAMENTOSOS.................................................................................... 16
5.2 SCREENING ................................................................................................................................................... 22
5.2.1 Screening - Xilanases ......................................................................................................................... 22
5.2.2 Screening – Celulases ........................................................................................................................ 23
5.3 EFEITO DE FONTE DE CARBONO NA PRODUÇÃO ENZIMÁTICA ....................................................................... 24
6. DISCUSSÃO .................................................................................................................................................... 26
7. CONCLUSÃO ................................................................................................................................................. 28
8. POSSIBILIDADE PARA EXPERIMENTOS FUTUROS........................................................................... 29
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................................................... 30
xi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
AG: André Gianeti
M: Lamela Média
P: Parede Primária
S1: Parede Secundária 1
S2: Parede Secundária 2
S3: Parede Secundária 3
L: Lúmen
Nº: Numeração
CMC: CM-celulose
U: Unidades
mg: Miligramas
Prot: Proteínas
µg = microgramas
mL = mililitros
C-2 = Carbono 2
C-3 = Carbono 3
O = Oxigênio
xii
LISTA DE SÍMBOLOS
OH = É um radical e íon negativo, OH (hidroxila ou hidróxido)
CH2O = Formaldeído
COOH = ácidos carboxílicos
H2O = Água
DNS = Ácido 3,5 dinitrosalicílico
pH = Ponte de Hidrogênio
BSA = Albumina de soro bovino
nm = Nanômetro
MgSO4.7H2O = Sulfato de magnésio heptaidratado
KH2PO4 = Fosfato de Potássico Monobásico
NH4H2PO4 = Fosfato de Amônio Monobásico
p/v = Peso/volume
xiii
LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Divisão do Reino Fungi...........................................................................................4
xiv
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Tabela 1 – Composição química (%) da parede celular de uma fibra de madeira......................7
Tabela 2 – Composição química de quatro espécies de madeira mole e madeira dura..............8
Tabela 3 – Coordenadas dos pontos de coleta referentes as imagens da figura 7............... .....19
Tabela 4 – Fungos Isolados.......................................................................................................22
Tabela 5 – Dados obtidos para o screening das xilanases.........................................................23
Tabela 6 – Dados obtidos para o screening das celulases.........................................................24
Tabela 7 – Efeito de diferentes fontes de carbono na produção celulolítica do fungo AG7.....25
1
1. Introdução
O interesse nos estudos de enzimas está na sua possibilidade de aplicação em diversos
setores industriais melhorando procedimentos e produtos já existentes, bem como no
estabelecimento de novos processos. As principais aplicações de xilanases são para o
biobranqueamento da polpa de celulose na indústria de papel e celulose (BHAT, 2000;
WHITMIRE & MAITI, 2002; TECHAPUN et al., 2003; SANDRIM et al., 2005; BETINI et
al., 2008; PEIXOTO-NOGUEIRA et al., 2009), assim como na indústria de rações
(TRICARICO et al., 2005; JURKOVICH et al., 2006; PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009). Os
produtos da hidrólise de xilana, como a xilose, podem ser convertidos em combustíveis
líquidos como etanol (SHAPACK et al., 1987; CHEN et al., 2007; PEIXOTO-NOGUEIRA,
2009), solventes, e adoçantes artificiais de baixa caloria (xilitol) (PARAJÓ et al., 1998;
ARISTIDOU & PENTILLÄ, 2000; LIAVOGA et al., 2007; PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009).
Outra categoria envolve o uso do complexo xilanolítico no processamento de fibras vegetais
como o cânhamo ou o linho na indústria têxtil (CSISZÁR et al., 2006; PEIXOTONOGUEIRA, 2009). As celulases que são enzimas que constituem um complexo capaz de
atuar sobre materiais celulósicos, promovendo sua hidrólise, por serem enzimas que são
biocatalisadores altamente específicas que atuam em sinergia para a liberação de açúcares,
dos quais glicose é o que desperta maior interesse industrial, devido à possibilidade de sua
conversão em etanol.
2
2. Revisão Bibliográfica
2.1 Fungos
Os organismos conhecidos como fungos possuem peculiaridades, e isto lhes confere a
exclusividade de um reino aparte, conhecido como reino Fungi. Com uma extensa variedade
de organismos, estes são cosmopolitas, de formas microscópicas, apresentando-se também em
formas macroscópicas. Esses microscópicos seres coexistem conosco vivendo em diferentes
hábitats: água, ar, plantas, solo, animais e até mesmo no próprio homem. Estes organismos
vivem em relações onde podem proporcionar tanto benefícios quanto malefícios ao meio onde
existe, bem como a outros organismos na natureza.
Os fungos desempenham papel de grande importância no equilíbrio do ambiente. São
os fungos importantes aliados do processo de decomposição, em especial a decomposição de
vegetais (GHIZELINI et al., 2006). Tal atividade é exercida, principalmente, por suas enzimas
extracelulares, como as celulases e pectinases que fazem a degradação das estruturas rígidas
de plantas, que não são digeridas por outros animais (STAMFORD et al., 1998). Os fungos se
associam a outros seres, e auxiliam no desenvolvimento de espécies. Um exemplo são as
micorrizas, simbiose entre plantas e fungos, que ajuda a planta a absorver minerais e água do
solo (PEREIRA et al., 1996).
Os fungos são explorados de diversas formas, principalmente nas indústrias
farmacêuticas, de alimentos, cosmética e têxtil, que utilizam o seu potencial de produção de
ácidos cítricos, fumárico e gálico para fabricação de seus produtos.
2.2 Fungos Filamentosos
Os fungos filamentosos são formados e constituídos a partir de estruturas de
frutificação que germinam dando origem a tubos germinativos que crescem, formando as
hifas ou filamentos. (TORTORA et al., 2002).
As hifas podem ser septadas ou não, sendo essa última denominada hifa cenocítica. O
septo serve para promover a individualização das células que compõem as hifas. Desse modo,
no segmento intermediário de dois septos têm-se uma célula e, consequentemente, um núcleo.
Apesar de o septo estar presente a individualização não ocorre completamente, pois os septos
apresentam poros interligando o citoplasma de uma célula com outra. Em se tratando de hifas
3
cenocíticas, essas são visualizadas como uma estrutura contínua composta de vários núcleos.
O crescimento da hifa ocorre por alongamento de suas extremidades. Em condições ideais as
hifas proliferam formando uma massa fibrosa denominada micélio (TORTORA et al., 2002).
A organização em hifas apresenta funções importantes para o crescimento da colônia.
A hifa denominada vegetativa desempenha o papel de obtenção de nutrientes, enquanto que
os esporos têm função reprodutiva. O estudo dos esporos assexuais e sexuais produzidos pelos
fungos filamentosos é necessário para a sua correta identificação. Devido à complexidade da
organização estrutural dos fungos filamentosos eles se desenvolvem mais lentamente em
relação às leveduras (TORTORA et al., 2002).
2.3 O Reino Fungi
A identidade dos seres vivos é determinada pela composição e sequência do material
genético. A utilização de técnicas moleculares, através da análise de DNA, possui a vantagem
de ser um processo rápido e altamente sensível. Essas técnicas não estão sujeitas a variações
fenotípicas, à ação do ambiente, ao estágio de desenvolvimento do fungo e a outros fatores
que possam alterar a morfologia do organismo (MANSO & TENENTE, 1984).
As diferenças genéticas entre populações de uma espécie constituem o primeiro
estágio da divergência evolutiva. Essa diferenciação resulta, na maioria dos casos, da ação de
diferentes ambientes a que cada população está sujeita sobre a variabilidade preexistente na
espécie (MARQUES, 2003). As técnicas conhecidas de diagnóstico molecular baseiam-se na
análise direta ou indireta da composição ou na sequência dos ácidos nucléicos para
identificação e caracterização de organismos (MARQUES et al., 2002).
Os fungos são classificados em quatro filos: fungos imperfeitos, Zigomicota,
Ascomicota e Basiodiomicota. Esta classificação é dada pela presença de reprodução sexual e
o tipo de estrutura que gera os esporos sexuais (TORTORA et al., 2002). Sendo importância
médica: Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota.
4
Quadro 1: Divisão do Reino Fungi
CLASSES
ZYGOMYCETES
ASCOMYCETES
BASIDIOMYCETES
TIPOS COMUNS
BOLOR PRETO DO PÃO.
REPR.
ASSEXUADA
ESPOROS NÃOMÓVEIS
LEVEDURAS, FUNGOS EM
CONÍDIOS
FORMA DE TAÇA,
DESPRENDEMSE DOS
TRUFAS.
CONIDIÓFOROS
COGUMELOS, FUNGOS
DA FERRUGEM E DO
CARVÃO.
DEUTEROMYCETES CANDIDA ALBICANS,
REPR. SEXUADA
ZIGÓSPOROS
ASCÓSPOROS
INCOMUM
BASIDIÓSPOROS
CONÍDIOS
ESTÁGIO SEXUAL
DESCONHECIDO
ALGUMAS ESPÉCIES DE
PENICILLIUM.
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho.
2.4 Composição da parede celular vegetal
Em uma planta existem vários tipos de células, sendo que cada uma possui paredes
celulares distintas em sua estrutura e composição. As paredes celulares são compostas de
microfibrilas de celulose embebidas em lignina, hemicelulose e pectina (BEGUIN &
AUBERT, 1994).
Na Figura 1 observar-se a estrutura de uma parede celular de planta que consiste de
paredes primárias e secundárias. A primária (P) é formada por uma rede composta
principalmente por lignina e pectina, e ocupa de 7 a 14% da parede celular.
A parede secundária se divide em três camadas distintas S1, S2 e S3, classificadas
segundo a orientação das fibras de celulose, sendo que a camada S1 representa 5 –11% da
parede celular; a S2, 74 – 84%; e a S3, 3 – 4%. Na lamela média, cuja função e aderir uma
célula a outra formando um tecido, a substância predominante e a lignina (MITCHELL et al.,
1992), polímero de estrutura não uniforme e massa molecular elevada, composto basicamente
de unidades de fenil propano.
5
A composição química de cada camada da parede celular de madeiras esta apresentada
na Tabela 1, nota-se que a P e composta em sua maioria de lignina, já em S, com exceção de
S1, os compostos que predominam são celulose e hemicelulose (ALMEIDA, 1981).
As hemiceluloses podem ser definidas como um grupo de heteropolissacarídeos da
parede celular, com exceção da celulose e pectina. Elas possuem baixa massa molecular (70 a
200 monossacarídeos) e podem ser facilmente extraídos por deslignificação do material
(TIMELL, 1967; REVISTO POR FERREIRA-FILHO, 1994). Alem disso, esses
polissacarídeos tem propriedades que permitem sua adesão, mediada por interações
covalentes com lignina e não-covalentes com celulose que são fundamentalmente essenciais
para manter a integridade da parede celular (ESAÚ, 1993). Somando-se a isto, as
hemiceluloses são subcomponentes da biomassa, sendo responsável por 1/3 de todo o carbono
orgânico renovável na Terra. Biomassa é o único recurso natural alternativo às substâncias
químicas, com um ciclo pequeno de reposição, capaz de sustentar a demanda no mercado
mundial de produtos químicos, bioquímicos e combustíveis (PRADE, 1995).
Nas plantas terrestres, as hemiceluloses podem ser compostas por uma variedade de
monossacarídeos como: D-xilose, D-manose, D-galactose, D-glicose, L-arabinofuranose, ácido
4-O-metil-D-glucurônico
resíduos de abocares
e ácido galacturônico, sendo classificadas geralmente com base nos
que as
compõem,
como:
glucuronoxilanas,
glucomananas,
galactoglucomananas, entre outras (VIIKARI et al., 1994). Entre as hemiceluloses, a xilana é
o componente mais abundante. A estrutura básica da xilana é composta de uma cadeia
principal linear de resíduos ƒÀ-D-xilopiranosil unidos por ligações glicosídicas ƒÀ-1,4
(HALTRICH et al., 1996). Normalmente, esses resíduos tem ramificações contendo
principalmente grupos acetil, acido 4-O-metil-D-glucuronico e L-arabinose (PULS &
POUTANEN, 1989).
As hemiceluloses que estão presentes em gimnospermas (madeira mole) e
angiospermas (madeira dura) possuem composições distintas (SAKA, 2001). Em madeiras
moles (Figura 2), a hemicelulose predominante é a o-acetilgalactoglucomananas (±18%),
seguida pela arabino-4-O-metilglucoronoxilana (±10%), constituída de resíduos de xilose
unidos por ligação β-1,4 e grupos arabinofuranosídeos e ácidos metilglucurônicos ligados no
C-3 e C-2 da xilose respectivamente (SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997). Em madeiras
duras, a hemicelulose predominante é a O-acetil-4-Ometilglucuronoxilana (Figura 3)
responsável por 20 – 35% das hemiceluloses nesse tipo de madeira. Além dos resíduos de
xilose, esse tipo de hemicelulose contém o ácido metilglucurônico no C-2 e grupos acetil
6
principalmente no C-3 da xilose. Devido à presença desses grupos permite a maior
solubilidade das hemiceluloses (SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997).
Na Tabela 2 está apresentada à composição química de quatro espécies de madeira
mole e madeira dura, onde pode-se observar algumas variáveis entre as espécies e o tipo de
madeira.
Figura 1: Estrutura esquemática da parede celular de uma fibra de madeira com suas
respectivas camadas (Legenda: M - Lamela média; P - Parede primária; S1, S2 e S3 - Parede
Secundária 1, 2 e 3, respectivamente; L - Lúmen).
Fonte: ALMEIDA, 1981.
Figura 2: Estrutura da arabino-4-O-metilglucuronoxilana de madeira mole
Fonte: Adaptado de SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997.
7
Figura 3 – O-acetil-4-O-metilglucuronoxilana de madeira dura
Fonte: Adaptado de SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997.
Tabela 1: Composição química (%) da parede celular de uma fibra de madeira
Fonte: Adaptada de ALMEIDA, 1981.
8
Tabela 2: Composição química de quatro espécies de madeira mole e madeira dura
Fonte: Adaptado de SAKA, 2001.
2.5 Os sistemas enzimáticos em estudo
2.5.1 A xilana e o sistema xilanolítico
A xilana é a principal hemicelulose de madeiras provenientes de angiospermas (1530% do peso seco total), sendo menos abundante em madeiras de gimnospermas (7-12%). Em
madeiras duras (angiospermas), a xilana é composta por pelo menos 70 resíduos de βxilopiranosil (figura 4). Cada décimo resíduo de xilose carrega um ácido α-4-Ometilglucurônico. Além disso, estas xilanas são altamente acetiladas (70%). A acetilação pode
ocorrer tanto no C2, quanto no C3, conferindo à xilana sua parcial solubilidade em água
(PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009).
Por estas razões são denominadas O-acetil-4-O-metilglucuronoxilana. Já em madeira
mole (gimnospermas) a xilana é formada por arabino-4-O-metilglucuronoxilana, apresentando
um conteúdo maior em ácido 4-O-metilglucurônico do que as madeiras duras (figura 4).
Porém, as xilanas de madeira mole não são acetiladas, e no lugar do grupo acetil apresentam
um grupo α-L-arabinofuranosil unidos ao C3 da xilose por ligações glicosídicas α-1,3.
9
(FERREIRA-FILHO, 1994; SUNNA & ANTRANIKIAN, 1997; POLIZELI et al., 2005;
PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009).
Devido a sua heterogeneidade estrutural, a degradação da xilana requer a ação de
várias enzimas, ou seja, de um sistema enzimático que pode ser encontrado presente em
fungos e bactérias. As enzimas pertencentes ao sistema xilanolítico são: β-1,4-endoxilanase
(1,4-β-D-xilana xilohidrolase; EC 3.2.1.8): cliva ligações glicosídicas internas da cadeia
principal da xilana, acarretando diminuição do grau de polimerização do substrato. Essa
clivagem não ocorre ao acaso, uma vez que as ligações a serem hidrolisadas dependem da
natureza do substrato, isto é, do comprimento, do grau de ramificação e da presença de
substituintes (LI et al., 2000; POLIZELI et al., 2005; PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009).
No começo, os principais produtos formados são os xilooligossacarídeos (CHÁVEZ et
al., 2006). Muitas classificações são atribuídas para as endoxilanases sendo que (WONG et
al., 1988) dividem as endoxilanases em não desramificadoras, as quais não catalisam a
hidrólise nos pontos de ramificação 1,3-α-1-arabinofuranosil de arabinoxilanas, em adição à
hidrólise das ligações da cadeia principal e, portanto, não liberam arabinose; e
desramificadoras, as quais hidrolisam os pontos de ramificação, liberando arabinose. A
presença de cada forma individual foi constatada em diversos fungos. No entanto, há aqueles
que são capazes de produzir ambas as formas de xilanases, o que resulta em maior eficácia na
hidrólise de xilana (PEIXOTO-NOGUEIRA, 2009).
10
Figura 4: Representação esquemática de uma molécula de xilana e das enzimas do
sistema xilanolítico. Fonte: POLIZELI, 2008.
2.5.2 A celulose e o sistema celulolítico
A estrutura da celulose é representada por um homopolímero de até 15000 unidades de
β-D–glicose unidas por ligações β-1,4. Essas estruturas são denominadas fibrilas e, quando
dispostas paralelamente, formam uma estrutura cristalina (Figura 5).
Na natureza, a celulose apresenta-se em duas formas estruturais: a amorfa, que
constitui uma forma menos organizada, e a forma cristalina, que se caracteriza por apresentarse altamente organizada e complexa e, portanto, menos susceptível à atuação das enzimas,
como é o caso da celulose do algodão, do bagaço da cana-de-açúcar e das palhadas.
11
Figura 5. Estrutura da celulose.
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S010040422006000400031&script=sci_arttext&tlng=e
Fonte: Internet.
12
3. Objetivos
O objetivo foi coletar material em decomposição em diferentes regiões para isolar
fungos filamentosos. A partir dos fungos isolados, seguiu-se com a prospecção de xilanases e
celulases. Objetivou-se também aperfeiçoar a condição de cultivo do fungo selecionado
(AG7) para produção de celulases.
13
4. Material e métodos
4.1 Coleta e isolamento de fungos filamentosos
A coleta foi realizada em 05/05/2010 na área da usina São Martinho S/A Pradópolis –
SP, Mata Estadual de Batatais - SP e no Bosque Municipal de Ribeirão Preto - SP. Os
microrganismos foram coletados a partir de substratos em decomposição incubados em meio
de farinha de aveia Quaker® (EMERSON, 1941) a 30ºC. Para um rigoroso controle e
identificação do local de coleta utilizou-se georeferenciamento por GPS - “Global Positioning
Systems” para determinação da latitude, longitude e altitude.
4.1.2 Isolamento dos microrganismos coletados
Para isolar os fungos filamentosos, inicialmente, o material em decomposição foi
espalhado sobre placa de Petri contendo meio sólido de aveia. A este inóculo foram
adicionados 5mL de pentabiótico veterinário (50 mg/mL) para impedir crescimento
bacteriano. Decorridos sete dias de incubação, diferentes fungos se desenvolveram nas placas.
Seguiu-se, então, o isolamento dos espécimes através de inóculo em estrias, utilizando-se alça
de platina. Este procedimento foi realizado até se obterem culturas homogêneas.
4.2 Manutenções das cepas
As cepas foram mantidas, em laboratório, utilizando-se meio complexo de aveia,
composto por 4% de farinha de aveia Quaker® e 2% de ágar bacteriológico (EMERSON,
1941). Os meios foram autoclavados (1,5 atm, 120°C, por 15 minutos) em tubos de ensaio e
posteriormente inclinados. Os repiques foram realizados periodicamente, com auxílio de uma
alça de platina, e mantidos a 30ºC durante 5 a 7 dias. Posteriormente, estes foram vedados e
guardados em geladeira, à temperatura de 4ºC.
14
4.3 Condições de cultivo em fermentação submersa (FSbm)
Em fermentação submersa determinou-se o meio de cultivo mais adequado para a
produção de xilanase por Aspergillus niveus e Aspergillus fumigatus. Os esporos, obtidos a
partir de culturas estoques (neste caso o estoque citado refere-se aos fungos isolados das
áreas), foram raspados com alça de platina e suspensos em 10 mL de água destilada estéril.
Um volume de 1 mL da suspensão de esporos foi inoculado em frascos Erlenmeyer de 125
mL, contendo 25 mL de meio líquido e incubados a 40ºC, por 72 horas, em estufa
bacteriológica. Os meios testados e suas composições estão descritos a seguir:
Meio SR (RIZZATTI et al., 2001)
Solução de sais SR [20x].-------------------------------------------------------------------------------------------------- 5,0 mL
Peptona------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 0,02 g
Extrato de levedura---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 0,45 g
Xilana Birchwood---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1,0 g
Água destilada q.s.p------------------------------------------------------------------------------------------------------------100 mL
Solução de sais SR [20X]
MgSO4.7H2O-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------0,24 g
KH2PO4-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------0,3 g
NH4H2PO4--------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------1,0 g
Água destilada q.s.p ------------------------------------------------------------------------------------------------------------100 mL
15
4.4 Dosagens enzimáticas
4.4.1 Xilanase
A atividade xilanolítica foi detectada pela formação de açúcares redutores
(xilooligossacarídeos) a partir da xilana Birchwood (Sigma) utilizando-se ácido 3´,5´dinitrosalicílico, DNS (MILLER, 1959). A mistura da reação foi composta de 0,2 mL de
solução de substrato 1% (p/v) em tampão McIlvaine, pH 5,5 e 0,2 mL do extrato enzimático.
A reação foi realizada a 50°C e alíquotas de 0,1 mL foram retiradas em diferentes tempos e
adicionadas a 0,1 mL de DNS. Para cada reação enzimática foi determinado um branco que
correspondeu ao tempo 0 de reação. Posteriormente, os tubos foram fervidos por 5 minutos e
depois de resfriados, 1 mL de água destilada foi adicionado. As leituras espectrofotométricas
foram realizadas a 540nm, utilizando-se uma curva padrão de xilose (0 – 1 mg/mL). A
unidade de atividade xilanásica foi definida como sendo a quantidade de enzima capaz de
liberar 1µmol de xilooligossacarídeo por minuto. A atividade específica foi expressa em
unidade de atividade total por mg de proteínas totais (U/mg prot.).
4.4.2 Celulase
Para a determinação da atividade enzimática da celulase, a metodologia empregada foi
a mesma da xilanase. No entanto, ao invés de se usar a xilana birchwood como substrato,
utilizou-se CM-celulose ou avicel 1% (p/v) em tampão acetato de amônio, pH 5, e curva
padrão de glicose (0 - 1 mg/mL).
4.5 Dosagem protéica
A quantificação de proteínas foi estimada pelo método de LOWRY et al., (1951) que
utiliza albumina de soro bovino (BSA) como padrão na concentração de 200 µg/mL. A
unidade foi definida como mg de proteína por mL.
16
5. Resultados
5.1 Coleta e isolamento de fungos filamentosos
Determinou-se três áreas para coleta de matérias em decomposição e posteriormente,
seguiu-se com o isolamento de fungos filamentosos. As regiões foram: usina São Martinho
S/A (Figura 6 A), Mata Estadual de Batatais – SP (Figura 6 B) e o Bosque Municipal de
Ribeirão Preto – SP (Figura 6 C). Foram realizadas coletas de material em decomposição,
outras matérias vegetais e solo (Figura 7); e prospecção de xilanases e celulases. Do material
coletado foram obtidos 16 fungos.
O padrão para nomeação dos fungos foi feito da seguinte forma: AG + nº como
representado na Figura 8.
A
B
C
Figura 6: Imagens das áreas de coleta. (A) Usina São Martinho S/A,
http://www.revistafator.com.br/ver_noticia.php?not=8306; (B) Mata Estadual de Batatais-SP,
http://www.panoramio.com/photo/39012867; (C)Bosque Municipal Ribeirão Preto-SP,
http://www.skyscrapercity.com/showthread.php?t=816128;
Fonte: Internet.
17
A
B
C
D
E
F
G
H
I
J
K
L
M
N
O
Figura 7: Imagens dos pontos de coleta; (A - G) Mata Estadual de Batatais; (H - L) Bosque
Municipal de Ribeirão Preto; (M - O) Usina São Martinho.
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
18
Tabela 3: Coordenadas dos pontos de coleta referentes às imagens da figura 7
Coordenadas
Imagens
Local
20° 56’ 13.17" de latitude sul e 47° 37’ 53.19" de longitude oeste
A
Batatais
20° 56’ 12.20" de latitude sul e 47° 37’ 53.73" de longitude oeste
B
Batatais
20° 56’ 13.06" de latitude sul e 47° 37’ 54.16" de longitude oeste
C
Batatais
20° 56’ 12.01" de latitude sul e 47° 37’ 55.09" de longitude oeste
D
Batatais
20° 56’ 12.66" de latitude sul e 47° 37’ 54.86" de longitude oeste
E
Batatais
20° 56’ 12.35" de latitude sul e 47° 37’ 55.98" de longitude oeste
F
Batatais
20° 56’ 11.55" de latitude sul e 47° 37’ 56.15" de longitude oeste
G
Batatais
21° 10’ 16.2" de latitude sul e 47° 48’ 5.6" de longitude oeste
H
Bosque RP
21° 10’ 13.9" de latitude sul e 47° 48’ 6.9" de longitude oeste
I
Bosque RP
21° 10’ 16.9" de latitude sul e 47° 48’ 2.9" de longitude oeste
J
Bosque RP
21° 10’ 16.4" de latitude sul e 47° 48’ 3.0" de longitude oeste
K
Bosque RP
21° 10’ 13.5" de latitude sul e 47° 48’ 3.3" de longitude oeste
L
Bosque RP
25° 55’ 0.73" de latitude sul e 47° 37’ 20.12" de longitude oeste
M
Usina
25° 55’ 0.73" de latitude sul e 47° 37’ 20.12" de longitude oeste
N
Usina
25° 55’ 0.73" de latitude sul e 47° 37’ 20.12" de longitude oeste
O
Usina
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
19
AG1
AG2
AG3
AG4
AG5
AG6
AG7
AG8
20
AG9
AG10
AG11
AG12
AG13
AG14
AG15
AG16
Figura 8: Imagens dos fungos isolados com a respectiva nomeação.
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
21
Depois de obtidos os isolamentos e padronizados sua nomeação identificou-se cada
fungo com sua região de origem como exemplificado na tabela 2, também foi relacionado à
temperatura de crescimento durante o processo de isolamento dos fungos.
Tabela 4: Fungos Isolados
Fungos
Temperatura de isolamento
AG1
AG2
AG3
AG4
AG5
AG6
AG7
AG8
AG9
AG10
AG11
AG12
AG13
AG14
AG15
AG16
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
30ºC
Local
Usina
Bosque RP
Usina
Usina
Usina
Usina
Usina
Usina
Batatais
Usina
Usina
Usina
Bosque RP
Batatais
Bosque RP
Usina
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
5.2 Screening
Com o objetivo de selecionar fungos com potencial enzimático para produção
de xilanases e celulases foi realizado um screening em fermentação submersa utilizando-se
meio SR suplementado com farelo de trigo como fonte de carbono. Para dosar xilanases
utilizou-se a Xilana Birchwood como substrato, já para dosar celulases foi usado CMC como
substrato.
5.2.1 Screening - Xilanases
Analisando os resultados para produção de xilanases apresentados na tabela 3 pode-se
concluir que entre todos os fungos utilizados no experimento, o AG11 e AG12 foram os que
22
apresentaram as maiores atividades, sendo que, para a atividade especifica o AG11 foi melhor
que AG12, porém para a atividade total, o fungo AG11 foi menor que o AG12.
Tabela 5: Dados obtidos para o screening das xilanases. Os valores destacados em vermelho
apresentaram maior atividade enzimática
Amostras
Fungos
AG1
AG2
AG3
AG4
AG5
AG6
AG7
AG8
AG9
AG10
AG11
AG12
AG13
AG14
AG15
AG16
Ativ Extra (U
Totais)
276,0417
279,1667
196,875
707,2917
483,3333
164,5833
1436,458
1848,958
1694,792
505,2083
2072,917
2407,292
1134,375
1025
282,2917
787,5
Proteína ( U
Totais)
0,959158
2,011139
1,57797
1,429455
3,02599
1,231436
2,060644
1,47896
1,373762
2,964109
0,767327
0,971535
1,064356
1,924505
1,095297
1,831683
Ativ Esp.(U/mg
Prot)
287,7957
138,8103
124,7647
494,798
159,7273
133,6516
697,0921
1250,174
1233,686
170,4419
2701,478
2477,824
1065,785
532,6045
257,7307
429,9324
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
5.2.2 Screening – Celulases
Analisando-se os valores de atividade celulásica verificou-se que os fungos AG7 e
AG11 tiveram melhor desempenho em relação ao outros fungos testados, tendo o fungo
AG11 maior atividade especifica que o AG7. Assim o fungo AG11 é potencialmente
xilanolítico e celulolítico (Tabela 6).
23
Tabela 6: Dados obtidos para o screening das celulases. Os valores destacados em vermelho
apresentaram maior atividade enzimática
Amostras
Fungos
AG1
AG2
AG3
AG4
AG5
AG6
AG7
AG8
AG9
AG10
AG11
AG12
AG13
AG14
AG15
AG16
Ativ Extra (U
Totais)
65,47619
57,14286
32,14286
15,47619
46,42857
2,38095
89,28571
10,71429
19,04762
7,142857
66,66667
32,14286
32,14286
25
27,38095
36,90476
Proteína ( U
Totais)
0,959158
2,011139
1,57797
1,429455
3,02599
1,231436
2,060644
1,47896
1,373762
2,964109
0,767327
0,971535
1,064356
1,924505
1,095297
1,831683
Ativ Esp.(U/mg
Prot)
68,26421
28,41319
20,36975
10,82663
15,34327
1,93348
43,32904
7,244471
13,86529
2,409782
86,88172
33,08462
30,19934
12,99035
24,99865
20,14801
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
5.3 Efeitos de fonte de carbono na produção enzimática
Para otimizar as condições de cultivo do visando aumentar a produção das enzimas de
interesse (xilanases e celulases) inicialmente o efeito da fonte de carbono do fungo AG7.
Foram testadas as fontes de carbono avicel, xilose, farinha de centeio, flocos de cevada,
bagaço de cana-de-açúcar sem tratamento, flocos de centeio, sabugo de milho, flocos de
aveia, bagaço de cana-de-açúcar explodido, bagaço de cana-de-açúcar lavado, soja moída,
glicose, serragem, flocos de milho e farelo de trigo. O tempo de cultivo foi de 72 horas, a
40°C em condições estáticas.
Analisando-se os dados apresentados na tabela 5 verificou-se que dentre as fontes de
carbono testadas a melhor foi o farelo de trigo uma vez que induziu os maiores níveis de
celulose (334,5 Utotais).
24
Tabela 7: Efeito de diferentes fontes de carbono na produção celulolítica do fungo AG7.
Fontes de Carbono
Avicel
Xilose
Farinha de Centeio
Flocos de Cevada
Bagaço de cana s/ tratam.
Flocos de Centeio
Sabugo Milho
Flocos Aveia
Bagaço de cana Explodido
Bagaço de cana Lavado
Soja Moída
Glucose
Serragem
Flocos de Milho
Farelo de Trigo
Ativ Extra (U
Totais)
125
91,66667
140,4762
110,7143
148,8095
59,52381
178,5714
127,381
236,9048
194,0476
129,7619
105,9524
138,0952
111,9048
334,5238
Proteína ( U Ativ Esp.(U/mg
Totais)
Prot)
0,977723
127,8481
0,19797
698,497
2,320545
60,53587
2,035891
54,38124
0,136139
1093,074
0,532178
111,8494
0,618812
288,5714
0,884901
143,9494
0,37748
627,603
0,625
310,476
1,868812
69,43551
0,148515
713,4127
0,18564
-743,873
0,253713
441,0685
1,042079
321,0157
Fonte: Elaboração própria do autor deste trabalho (pesquisa de campo).
25
6. Discussão
Os fungos apresentam filamentos conhecido como hifas, com paredes ricas em
quitina, sendo este o mesmo material que reveste insetos. Os fungos têm características
heterotróficas, isto é, não possuem clorofila e, portanto, necessitam de material orgânico para
viver, sendo sua nutrição feita por absorção de nutrientes graças à presença de enzimas que
são por eles produzidas e que degradam produtos como, por exemplo, celulose, amido, etc.
Sabendo-se que os fungos sintetizam e secretam enzimas para o meio extracelular para, assim,
realizar a digestão da matéria orgânica, pode-se utilizar esses microrganismos para degradar
resíduos agroindustriais colocando-os na vanguarda dos estudos ecologicamente responsáveis.
O bagaço de cana-de-açucar é um resíduo agroindustrial gerado em enormes
quantidades na região de Ribeirão Preto - SP. Entretanto sabe-se que grande parte não é
queimado para gerar energia, há, portanto, excedente deste resíduo que pode ser reaproveitado
para gerar etanol de segunda geração a partir de sua hidrólise enzimática. As enzimas aqui
estudadas foram as xilanases e celulases, as quais podem ser utilizadas para realizar a
degradação de material celulósico e hemicelulósico presente no bagaço da cana gerando o
etanol de segunda geração. Assim, a bioprospecção se justifica pela necessidade de descobrir
novos fungos bons produtores dessas enzimas, para que assim se possa reaprovetitar o bagaço
excedente, aumentando ainda seu valor agregado através da produção de combustível.
Submetendo os fungos isolados ao screening para determinar os melhores produtores
de xilanases e celulases verificou-se que os fungos AG11 e AG12 são bons xilanolíticos,
enquanto que AG7 e AG11 são bons celulolíticos. Valores semelhantes de atividades
xilánasica foram verificados para o fungo Aspergillus niveus (PEIXOTO-NOGUEIRA et al.,
2009), enquanto a atividade celulolítica foi semelhante ao fungo Trichoderma sp, comumente
descrito na literatura, como um conhecido gênero de fungos celulolíticos (DE SANTO et al.,
2002; GHIZELINI et al., 2006).
Na fase seguinte analisou-se o efeito de diferentes fontes de carbono para o fungo
AG7, sendo que em farelo de trigo foram obtidos os maiores valores de atividade celulolítica.
Resíduos agroindustriais também foram descritos como excelentes indutores celulolíticos para
o fungo Trichoderma reesei QM9414 (BASSO et AL., 2010).
A utilização de resíduos agroindustriais é uma alternativa barata para a produção de
enzimas, assim encontrar microorganismos capazes de produzir e secretar enzimas utilizando
farelo de trigo como fonte de carbono, trata-se de uma alternativa interessante do ponto de
26
vista biotecnológico, uma vez que barateia o custo de produção e, consequentemente, o
produto final é também menos oneroso.
27
7. Conclusão
• Os fungos AG11 e AG12 são bons produtores de xilanases;
• Os fungos AG7 e AG11 são bons produtores de celulases;
• O fungo AG11 se destacou por apresentar bom desempenho na produção das duas
enzimas;
• O fungo AG7 teve como melhor fonte de carbono farelo de trigo durante um período
de cultivo de 72 horas a 40 ºC em condições estáticas;
• A utilização de resíduos agroindustriais como o farelo de trigo, trata-se de uma
alternativa barata para a produção de enzimas e, portanto, interessante do ponto de vista
biotecnológico.
28
8. Possibilidade para experimentos futuros
Para os próximos experimentos pode-se determinar qual a melhor fonte de carbono
para os fungos AG11 e AG12, melhor meio de cultivo, melhor temperatura e tempo de
encubação e, finalmente, tratar enzimaticamente o bagaço de cana-de-açúcar para formação
de açúcares fermentescíveis.
Na etapa seguinte deve-se definir qual fungo seguirá nos experimentos de acordo com
a melhor atividade apresentada, posteriormente definir temperatura ótima e pH ótimo de
reação. Por fim verificar as condições de degradação de resíduos agroindustriais com as
enzimas.
29
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