UNIVERSIDADE FEDERAL DO ABC
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM NANOCIÊNCIAS E MATERIAIS AVANÇADOS
Erika Tiemi Sato
INVESTIGAÇÃO SOBRE O PAPEL DA ÁGUA CONFINADA
EM TECIDOS BIOLÓGICOS
Dissertação de Mestrado
Santo André
2010
Erika Tiemi Sato
INVESTIGAÇÃO SOBRE O PAPEL DA ÁGUA CONFINADA
EM TECIDOS BIOLÓGICOS
Dissertação de Mestrado
Dissertação apresentada para obtenção
do título de Mestre ao curso de PósGraduação em Nanociências e Materiais
Avançados.
Universidade Federal do ABC – Campus
Santo André
Orientador: Prof. Dr. Herculano S.
Martinho
Santo André
2010
Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da Universidade Federal do ABC
SATO, Erika Tiemi
Investigação sobre o papel da água confinada em tecido biológicos / Erika Tiemi Sato —
Santo André : Universidade Federal do ABC, 2010.
116 fls. il. 29 cm
Orientador: Herculano da Silva Martinho
Dissertação (Mestrado) — Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-graduação
em Nanociências e Materiais Avançados, 2010.
1. Aglomerado de água 2. Espectroscopia 3. Cálculo vibracional I. MARTINHO,
Herculano da Silva . II. Programa de Pós-graduação em Nanociências e Materiais Avançados,
2010, III. Título.
CDD 543.0858
A todos aqueles
que participaram efetivamente da
minha formação pessoal e profissional
AGRADECIMENTOS
A Deus, minha fortaleza;
Aos meus pais, grandes exemplos na minha vida;
A minha irmã, minha doutora da alegria;
A família Tanaka, que me acolheu em São Caetano do Sul;
Aos meus irmãos em Cristo, que torceram por mim e oraram comigo!
Ao Grupo de Estudos Bíblicos da UFABC, que em tão pouco tempo tanto me apoiou.
Ao Grupo de Pesquisa em Biossistemas e Biofotônica, pela colaboração no trabalho;
Ao prof. Dr. Herculano, meu orientador, por toda paciência que teve comigo;
Ao prof. Dr. Maurício Coutinho, pelo auxílio nas simulações computacionais;
Ao Han Pang, meu companheiro nos estudos, de quem partiu a idéia de cursar o
mestrado;
Ao Rodrigo Nagata, meu “amigo de ouro”, com quem eu sempre pude contar nesta
caminhada;
Aos professores e funcionários da UTFPR, por todo apoio e confiança;
Aos alunos da UTFPR, que saudade!
A todos da UFABC que contribuíram para a realização deste trabalho.
A UFABC e a CAPES pelo apoio financeiro.
"Quanto mais eu estudo a natureza mais fico
impressionado com a obra do Criador. Nas
menores de suas criaturas Deus colocou
propriedades extraordinárias..."
Louis Pasteur (1822-1895)
RESUMO
SATO, Erika Tiemi. Investigação sobre o papel da água confinada em tecidos biológicos.
2010. 116 f. Dissertação (Mestrado em Nanociências e Materiais Avançados) – PósGraduação em Nanociências e Materiais Avançados. Universidade Federal do ABC.
Santo André, 2010.
Neste trabalho procuramos avaliar o tipo de organização estrutural da água confinada
em tecidos biológicos. Como o nível de estruturação da água é capaz de influenciar a
grande maioria das propriedades físicas e químicas dos tecidos, objetivamos sondar se
a mesma é capaz de estruturar-se de modo diferenciado em tecidos sadios e
patológicos. Escolhemos como objeto de estudo amostras de tecidos provenientes de
mucosa bucal normal (MN – 6 pacientes) e com hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI –
6 pacientes). A técnica de espectroscopia FT-Raman foi utilizada como meio de acessar
experimentalmente estas informações. Foi analisada a região espectral entre 2800 e
3600 cm-1, a qual foi deconvoluída, com o auxilio do software FITYK, em sete bandas
(picos 1 a 7), respectivamente em 2854, 2885, 2934, 2991, 3071, 3220 e 3362 cm-1
para o tecido normal; e (picos 1 a 7), respectivamente em 2843, 2887, 2937, 2977,
3060, 3221 e 3387 cm-1 para o tecido inflamatório. Pelos resultados dos testes tstudent e ANOVA pôde-se perceber que os picos 2 e 6 não apresentam diferença
estatística ao nível de 0,05; porém todos os outros picos apresentam diferença
estatística ao nível de 0,05, sendo, portanto, picos importantes para o diagnóstico de
HFI. Tendo em vista que o colágeno é uma proteína de importância fundamental na
constituição da matriz extracelular e encontra-se amplamente presente em nosso
corpo, cada agrupamento de moléculas de água foi confinado em um recorte de uma
dupla hélice de colágeno. Os resultados foram interpretados com ajuda de simulações
para várias estruturas de água, (H2O)n, sendo n = 1–8: (H2O), (H2O)2, (H2O)3, (H2O)4,
(H2O)5-cíclico, (H2O)6-gaiola, (H2O)7-baixo, (H2O)8-S4. As simulações foram comparadas
aos dados experimentais. Desse modo, pôde-se perceber que a água é de extrema
importância na interpretação dos picos característicos de diagnóstico e desempenha
um papel fundamental na obtenção destes picos. Nesse sentido, pôde-se concluir que
existem alterações nas amostras avaliadas nestas regiões de alta freqüência,
relacionadas à organização estrutural da água. Isso consiste numa importante
informação para o entendimento do processo inflamatório do ponto de vista bio-fisicoquímico e fisiológico.
Palavras-chave: Aglomerados de Água. Inflamação. Cálculo Vibracional. Espectroscopia
Raman.
ABSTRACT
SATO, Erika Tiemi. Research on the role of water confined in biological tissues. 2010.
116 f. Dissertação (Mestrado em Nanociências e Materiais Avançados) – PósGraduação em Nanociências e Materiais Avançados. Universidade Federal do ABC.
Santo André, 2010.
In this work we evaluate the type of structural organization of water contained in
biological tissues. The structuring level of water is able to influence the vast majority of
physical and chemical properties of tissues. In this work, we aimed to probe whether
water is able to structure itselves differently in healthy and pathological tissues. We
chose as objects of study tissue samples from normal oral mucosa (NM - 6 patients)
and inflammatory fibrous hyperplasia (IFH - 6 patients). The technique of FT-Raman
spectroscopy was used as a means of accessing experimental information. We
analyzed the spectral range between 2800 and 3600 cm-1, which was deconvolve with
the help of software FITYK in seven bands (peaks 1-7), respectively in 2854, 2885,
2934, 2991, 3071, 3220 and 3362 cm-1 for normal tissue, and (peaks 1-7), respectively
in 2843, 2887, 2937, 2977, 3060, 3221 and 3387 cm-1 for inflammatory tissue. From
the results of ANOVA and t-student the tests could be seen as peaks 2 and 6, do not
show statistical difference at the 0.05 level, while all other peaks show a statistical
difference at the 0.05 level, being therefore important peaks for the diagnosis of IFH.
Given that collagen is a protein of fundamental importance in the formation of
extracellular matrix and is widely present in our body, each cluster of water molecules
was confined to a piece of a double helix of collagen. The results were interpreted with
the help of molecular dynamics simulations for different structures of water (H2O)n,
where n = 1-8: (H2O), (H2O)2, (H2O)3 (H2O)4 (H2O)5-cyclic (H2O)6-cage, (H2O)7-low,
(H2O)8-S4. The simulations were compared to experimental data. Thus, we could see
that water is of extreme importance in the interpretation of the characteristic peaks of
diagnosis and plays a key role in obtainment these peaks. In this sense, we concluded
that there are changes in the samples in these regions of high frequency, related to
structural organization of water. This is an important information for understanding
the inflammatory process in terms of bio-physico-chemical and physiological.
Keywords: Clusters of water. Inflammatory infiltrates. Vibrational Calculation. Raman
spectroscopy.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema da ligação de hidrogênio na água. ................................................. 21
Figura 2 - Ligações de hidrogênio por grupos funcionais. As ligações de hidrogênio
formadas entre a água e (a) grupos hidroxila, (b) grupos cetônicos, (c) grupos
carboxílicos e (d) grupos amino [28]. ............................................................................. 22
Figura 3 – Representação da ligação de hidrogênio bifurcada (a) no doador, (b) no
aceptor............................................................................................................................ 22
Figura 4 – Exemplos de simetria Cn para eixos C2, C3 e C6. ............................................. 23
Figura 5 – Exemplo de simetria Sn com uma molécula de trans-dicloroetileno.
Rotacionando a molécula de trans-dicloroetileno em 180° ao redor do eixo (S2),
seguido por reflexão em um plano de reflexão, a orientação original da molécula é
restabelecida. ................................................................................................................. 23
Figura 6 – Exemplo de simetria Sn e Cn em carbono tetraédrico. Uma rotação de 90°
sobre um S4, seguido ou precedido de reflexão em um plano de reflexão restabelece a
orientação original. Utilizando o mesmo plano de simetria é possível rotacionar a
molécula em 180° e obter a molécula idêntica à original (C2). ...................................... 24
Figura 7 – Estruturas dos aglomerados de água, (H2O)n, sendo n = 2–8: (a) (H2O)2, (b)
(H2O)3, (c) (H2O)4, (d) (H2O)5-cíclico, (e) (H2O)5-C2, (f) (H2O)6-cíclico, (g) (H2O)6-gaiola, (h)
(H2O)6-prisma, (i) (H2O)7-baixo, (j) (H2O)7-próximo, (k) (H2O)8-D2d, (l) (H2O)8-S4 [33]. .. 25
Figura 8 – Caminho da barreira de tunelamento do dímero da água em 157cm-1,
207cm-1 e 394cm-1 [33]................................................................................................... 26
Figura 9 – Ilustração esquemática da tripla hélice de colágeno. ................................... 37
Figura 10 – Estrutura geral da prolina, glicina e hidroxiprolina. .................................... 38
Figura 11 – Ilustração dos sulcos do B-DNA. O B-DNA é a forma mais comum de DNA,
que o DNA assume quando em solução. Se pensarmos na hélice de B-DNA como uma
estrutura cilíndrica, com cerca de 2 nm de diâmetro, notaremos que a superfície da
molécula é irregular, formando 2 sulcos ou depressões, de tamanhos diferentes, que
giram ao longo de todo o seu comprimento. O sulco menor resulta da depressão entre
as duas cadeias complementares, enquanto que o sulco maior resulta da depressão
existente entre os giros adjacentes da hélice. Os sulcos são importantes porque
deixam superfícies livres para a interação entre o B-DNA e as proteínas. .................... 42
Figura 12 – Ilustração esquemática de (a) micela e (b) micela reversa. ........................ 43
Figura 13 – Esquema Ilustrativo dos espalhamentos (a) Raileigh, (b) Raman Stokes e (c)
Raman Anti-Stokes. ........................................................................................................ 51
Figura 14 – Tipos de vibração: estiramento simétrico (ν1), estiramento assimétrico (ν3)
e dobramento (ν2) e librações nos eixos x, y e z [23]..................................................... 54
Figura 15 – Aglomerados das moléculas de água utilizadas na simulação: (a) (H2O), (b)
(H2O)2, (c) (H2O)3, (d) (H2O)4, (e) (H2O)5-cíclico, (f) (H2O)6-gaiola, (g) (H2O)7-baixo, (h)
(H2O)8-S4. Tais estruturas foram confinadas em colágeno. Adaptado de [127] ............ 66
Figura 16 – Estrutura do colágeno hidratado (perspectiva)........................................... 67
Figura 17 – Estrutura do colágeno sem hidratação (perspectiva). ................................ 68
Figura 18 – Estrutura do colágeno sem hidratação (vista longitudinal). ....................... 68
Figura 19 – Estrutura do colágeno sem hidratação (vista transversal interna). ............ 68
Figura 20 – Estrutura do colágeno sem hidratação (vista transversal). ......................... 69
Figura 21 – Área de recorte do colágeno para utilização na simulação. ....................... 69
Figura 22 – Recorte de colágeno utilizado na simulação. A figura corresponde a um
pequeno trecho de duas hélices do colágeno: uma com três estruturas cíclicas e a
outra com duas. .............................................................................................................. 70
Figura 23 – Aglomerado de moléculas de água confinado em colágeno. ..................... 71
Figura 24 – Vibração de coll_3 (em 3073cm-1) em um determinado momento. As linhas
em azul-claro representam a direção e o sentido dos vetores dos átomos vibrantes. . 89
Figura 25 – Vibração de coll_3 (em 3073cm-1) em outro determinado momento. As
linhas em azul-claro representam a direção e o sentido dos vetores dos átomos
vibrantes. ........................................................................................................................ 89
Figura 26 – Indicação da posição dos quadrantes A, B, C e D em relação aos átomos do
colágeno. ........................................................................................................................ 93
LISTA DE QUADROS
Quadro 1 - Freqüências vibracionais (em cm-1) para três modos da molécula de água
líquida. ............................................................................................................................ 54
Quadro 2 – Freqüências vibracionais (em cm-1) para três modos normais de diferentes
isótopos da molécula de água gasosa. ........................................................................... 54
Quadro 3 – Comparação entre a presença/ausência de aglomerados de água para cada
pico experimental. .......................................................................................................... 87
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Resultados dos testes estatísticos. ............................................................... 77
Tabela 2 – Resultados da sensibilidade e especificidade. .............................................. 80
Tabela 3 – Posição dos picos de MN e HFI. .................................................................... 87
Tabela 4 - Comparação entre as vibrações das moléculas de água confinadas em
colágeno para MN e HFI. Cada cor refere-se a um determinado pico........................... 94
Tabela 5 - Comparação entre as vibrações do colágeno para MN e HFI, conforme os
quadrantes. Cada cor refere-se a um determinado pico e cada letra (A, B, C, D) a um
quadrante. ...................................................................................................................... 95
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Relação entre energia total e corte para uma única molécula de água
isolada. ............................................................................................................................ 73
Gráfico 2 – Exemplo de deconvolução da região espectral de uma das amostras de MN
em 7 picos. ...................................................................................................................... 74
Gráfico 3 – Exemplo de deconvolução da região espectral de uma das amostras de HFI
em 7 picos. ...................................................................................................................... 75
Gráfico 4 – Box-plots das amostras de MN e HFI. As setas com números de 1 a 7
indicam a posição dos picos (pico 1 a pico 7)................................................................. 76
Gráfico 5 – Área dos picos 7 versus área dos picos 1, para MN e HFI. ........................... 78
Gráfico 6 – Área dos picos 7 versus área dos picos 3, para MN e HFI. ........................... 79
Gráfico 7 – Área dos picos 7 versus área dos picos 4, para MN e HFI. ........................... 79
Gráfico 8 – Área dos picos 7 versus área dos picos 5, para MN e HFI. ........................... 80
Gráfico 9 – Área dos picos 6-7 versus área dos picos 1-5, para MN e HFI. .................... 81
Gráfico 10 – Modos vibracionais de coll_0 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 82
Gráfico 11 – Modos vibracionais de coll_2 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 83
Gráfico 12 – Modos vibracionais de coll_3 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 83
Gráfico 13– Modos vibracionais de coll_4 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 84
Gráfico 14– Modos vibracionais de coll_5 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 84
Gráfico 15 – Modos vibracionais de coll_6 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 85
Gráfico 16 – Modos vibracionais de coll_7 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 85
Gráfico 17 – Modos vibracionais de coll_8 equivalentes aos resultados experimentais.
........................................................................................................................................ 86
Gráfico 18 – Energia total para cada aglomerado de água confinada. .......................... 96
Gráfico 19 – Energia total por molécula de água confinada. ......................................... 96
Gráfico 20 – Momento de dipolo para cada aglomerado de água confinada. .............. 98
SIGLAS E ABREVIATURAS
Coll_0
Colágeno SEM água confinada
Coll_1
Colágeno com uma molécula de água confinada, (H2O)
Coll_2
Colágeno com duas moléculas de água confinada, (H2O)2
Coll_3
Colágeno com três moléculas de água confinada, (H2O)3
Coll_4
Colágeno com quatro moléculas de água confinada, (H2O)4
Coll_5
Colágeno com cinco moléculas de água confinada, (H2O)5-cíclico
Coll_6
Colágeno com seis moléculas de água confinada, (H2O)6-gaiola
Coll_7
Colágeno com sete moléculas de água confinada, (H2O)7-baixo
Coll_8
Colágeno com oito moléculas de água confinada, (H2O)8-S4
DFT
Teoria do Funcional da Densidade
DM
Dinâmica Molecular
FT-Raman
Espectroscopia Raman com Transformada de Fourier
HFI
Hiperplasia Fibrosa Inflamatória
IR
Infravermelho (Infrared)
MC
Monte Carlo
MN
Mucosa Normal
RNOS
Espécies Reativas de Nitrogênio e Oxigênio
SUMÁRIO
1
2
INTRODUÇÃO .......................................................................................... 15
1.1
Objetivos ..................................................................................................... 18
1.2
Apresentação do trabalho ........................................................................... 19
REVISÃO DE LITERATURA .................................................................... 20
2.1
2.1.1
2.1.2
2.1.3
2.2
2.2.1
2.2.2
2.3
2.3.1
2.3.2
2.3.3
2.3.4
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO E AGLOMERADOS DE ÁGUA ................... 20
Ligação de hidrogênio e sua importância ........................................................................... 20
Considerações de simetria.................................................................................................. 23
Aglomerados de água ......................................................................................................... 24
ESTRUTURA DA ÁGUA CONFINADA ........................................................ 29
Confinamento Hidrofóbico ................................................................................................. 29
Confinamento Hidrofílico ................................................................................................... 31
PROCESSO INFLAMATÓRIO EM TECIDOS BIOLÓGICOS ...................... 32
Mecanismo da Inflamação.................................................................................................. 32
Espécies reativas de nitrogênio e oxigênio (RNOS) e a bioquímica da inflamação ............ 33
Hiperplasia Fibrosa Inflamatória......................................................................................... 36
Colágeno ............................................................................................................................. 37
2.4
O PAPEL DA ÁGUA EM BIOSSISTEMAS .................................................. 38
2.5
MICELAS REVERSAS ................................................................................ 43
2.6
ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL E MODOS VIBRACIONAIS DA ÁGUA ..
.................................................................................................................... 47
2.6.1
2.6.2
2.7
Teoria de espectroscopia Raman ....................................................................................... 49
Espectroscopia Raman da água .......................................................................................... 52
SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS............................................................ 56
2.7.1
Noções gerais e aplicação. .................................................................................................. 56
2.7.2
Teoria .................................................................................................................................. 59
2.7.2.1 Equação molecular de Schrödinger e aproximação de Born-Oppenheimer. ................... 59
2.6.2.2 Teoria do Funcional da Densidade ................................................................................... 63
3
4
METODOLOGIA ....................................................................................... 65
3.1
AMOSTRAS ................................................................................................ 65
3.2
ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL .......................................................... 65
3.3
SIMULAÇÕES DE CÁLCULOS VIBRACIONAIS ......................................... 66
RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 74
4.1
CARACTERIZAÇÃO DE ÁGUA CONFINADA EM TECIDOS BIOLÓGICOS
POR ESPECTROSCOPIA RAMAN ........................................................................ 74
4.2
CARACTERIZAÇÃO DE ÁGUA CONFINADA EM TECIDOS BIOLÓGICOS
UTILIZANDO SIMULAÇÕES .................................................................................. 82
4.2.1
4.2.2
Discussão energética .......................................................................................................... 96
Polarização e momento de dipolo ...................................................................................... 98
5
DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO .................................................. 100
6
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................... 103
1
INTRODUÇÃO
A investigação consiste numa indagação, numa inquirição. Indagar é
procurar saber, tentar descobrir, esforçar-se por descobrir; enquanto inquirir é
procurar informações acerca de, fazer perguntas a, perguntar, interrogar [1].
A água, substância composta de um oxigênio e dois hidrogênios é bem
conhecida de todos, no entanto suas propriedades e seu comportamento correlatam
anomalias. Apesar do extensivo trabalho teórico e experimental [2,3,4,5,6,7,8,9,10]
devotado à compreensão das propriedades da água, muitas delas ainda permanecem
envoltas em mistério. Dada a sua importância em muitos domínios da ciência,
tecnologia, meio ambiente e na vida quotidiana, as propriedades incomuns da água
são atualmente objeto de intensa investigação. Entre essas propriedades podemos
citar, além da bem conhecida existência de uma densidade máxima em 277 K,
[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]:
(i)
comportamento inesperado da compressibilidade isotérmica, capacidade
calorífica isobárica, e coeficiente de expansão térmico, em baixas
temperaturas;
(ii)
a água pode ser supercongelada abaixo do seu ponto de fusão e abaixo de
235K se cristaliza inevitavelmente (sua temperatura de nucleação
homogênea é TH = 231K);
(iii)
no estado supercongelado, as anomalias nas propriedades termodinâmicas
são mais acentuadas, mostrando uma lei de potência divergente nas
proximidades de uma temperatura singular TS = 228 K;
(iv)
A pressão ambiente, a água pode existir numa forma vítrea amorfa abaixo
de 135 K;
(v)
Dependendo da temperatura e pressão, a água apresenta um polimorfismo,
ou seja, tem duas fases amorfas com diferentes estruturas: a baixa e a alta
densidade LDA e HDA, respectivamente;
15
(vi)
LDA, quando aquecido, sofre uma transição vidro-líquido em TG, em seguida
cristaliza em cubos de gelo em TX = 150 K. O valor exato de TG ainda é uma
questão em aberto.
Na Terra, a maior parte da água está na fase bulk: a fase líquida nos
oceanos, as formas cristalinas de calotas polares e geleiras, a fase de vapor no ar. O
bulk é um sistema em fase condensada, em que o número de constituintes de um
sistema (átomos, elétrons, etc.) é extremamente grande [12]. Em muitos sistemas
vivos reais, no entanto, a água não está na forma “bulk”, mas localizada próximo a
superfícies ou contida em pequenas cavidades. A chamada água confinada é
encontrada muito facilmente na natureza em materiais porosos e granulares e
também dentro e ao redor de macromoléculas, estruturas supramoleculares e géis. O
processo de confinamento gera um conflito entre a minimização energética da rede de
ligações de hidrogênio formada, das interações com a superfície da cavidade e o ajuste
ao espaço disponível para alocar as moléculas [13].
Extensões finitas em uma ou mais direções espaciais fazem o sistema
ser preso numa geometria de poro. Na terra, a água confinada pode ser encontrada
em vários materiais geológicos, que possuem uma estrutura de poros permeável a
água. Quantidade considerável de água em organismos vivos é confinada em células e
seus compartimentos. Uma quantidade essencial de água confinada pode ser esperada
em cometas, que presumivelmente representam uma mistura de poeira e gelo [14].
Nestas situações de confinamento as propriedades da água são as
mesmas de quando super-resfriada. Assim, o confinamento é utilizado para estudar a
água em baixas temperaturas, em estados supercongelados [15]. Em certas geometrias
confinadas, as moléculas de água são incapazes de formar estruturas cristalinas e,
desse modo, a água permanece fluida [16].
Não há dúvidas sobre a importância da água, basta ver as questões
ambientais a ela associadas. E o que dizer do pensamento atual da NASA em seu
programa de astrobiologia, que busca vestígios de água em outros locais do Universo,
que não a Terra? Mas não é apenas em escala macroscópica que ela desempenha
papéis fundamentais. Em micro e nano-escalas ela apresenta papéis vitais ao
16
funcionamento de órgãos e tecidos. Nas palavras de Albert Szent-Gyorgi, o biólogo
ganhador do prêmio Nobel de 1937: “A água é a matéria e matriz da vida” [17].
Alguns cientistas duvidam se a água dentro de células vivas, o sumo da
vida, é a mesma coisa que a água num copo; para eles, em escala molecular, sua
estrutura pode ser alterada [18]. A água se comporta de um modo inesperado quando
confinada ou confinada abaixo do ponto de congelamento. A vida precisa de água, mas
ela permanece um profundo mistério por conta da água [18]. Há uma “teoria para
líquidos” perfeitamente boa. Mas, no caso da água, apresenta pouco uso [18]. Algumas
das anomalias da água são mais ocultas e reveladas apenas por medidas científicas
cuidadosas, como o fato de a água ser menos ao invés de mais viscosa, quando
comprimida [18].
Uma coisa é clara: a água que se coloca entre duas proteínas, ou duas
camadas lipidicas separadas por apenas alguns nanometros não se comporta como a
água bulk [19].
Aproximadamente 60 a 80% do corpo humano é composto por água
[20]. A água ligada constitui de 30-50% da massa seca da proteína em pó e até 80% da
massa do DNA cristalino [17]. Esta água ligada pode ser, assim, considerada como
parte integral da própria biomolécula. Uma grande variedade de processos biológicos
ocorre em ambientes confinados, com a solvatação da água desempenhando um
importante papel [21]. O fato de a água apresentar-se freqüentemente confinada
nanoscopicamente em meios não-aquosos traz à tona a necessidade de entender essas
propriedades em ambientes confinados e próximos às interfaces [21].
A explicação para todas estas propriedades específicas da água só é
possível levando-se em conta as interações entre as moléculas, denominadas ligações
de hidrogênio [22]. Em muitos sistemas biológicos a água encontra-se confinada em
regiões hidrofílicas e/ou hidrofóbicas específicas [23]. As propriedades físicas e o
estado da água confinada podem sofrer grande variação dependendo das
características moleculares da superfície da cavidade, das dimensões do confinamento,
da temperatura e da pressão [24,23]. Tais propriedades refletem-se nas alterações
conformacionais da estrutura da água [23].
17
Há alguma evidência que a natureza da água difere entre células
saudáveis e doentes [25]. Investigações recentes sobre água confinada mostram que
em proporções nanoscópicas muitas propriedades da água diferem daquelas da água
bulk [25]. Existem indicações de que a mobilidade da água celular é genericamente
diferente da água bulk [17] e que esses movimentos tornam-se mais parecidos com o
bulk em células cancerosas. Entretanto, o entendimento das propriedades físicas da
água por si só é um objetivo que ainda não foi plenamente alcançado [26].
Neste sentido, propôs-se o estudo da água confinada em tecidos
biológicos, de modo a investigar se a mesma é capaz de estruturar-se de modo
diferenciado em tecidos sadios e patológicos.
1.1
OBJETIVOS
Propomos nesta pesquisa o estudo das interações água-água e águabiomolécula para a água confinada. Cálculos vibracionais auxiliam na interpretação dos
resultados. Visa-se com isso dois principais objetivos específicos: contribuir para a
compreensão das propriedades físicas da água confinada bem como aplicar esses
resultados à elucidação de propriedades de biomoléculas hidratadas.
18
1.2
APRESENTAÇÃO DO TRABALHO
Para alcance do objetivo proposto nesta pesquisa, foram desenvolvidos
os seguintes capítulos do presente trabalho.
O primeiro capítulo apresenta o tema da pesquisa, justificando de
maneira prática e teórica a realização da mesma. Define ainda os objetivos
norteadores do estudo em pauta e os limites existentes no desenvolvimento da
investigação.
O segundo capítulo contém a revisão de literatura, na qual se apóia esta
pesquisa. São apresentados os aglomerados da água; a importância das ligações de
hidrogênio e da água em biossistemas; os tipos de confinamento; uma breve
explicação sobre espectroscopia vibracional, com ênfase em espectroscopia Raman;
alguns modos vibracionais dos aglomerados de água; e uma sucinta explicação a
respeito de simulações computacionais.
No terceiro capítulo são apresentados os estudos utilizados na
realização da pesquisa. Com base nestes resultados, o quarto capítulo trata da
descrição e comparação entre os resultados experimentais das amostras de mucosa
normal (MN) e de hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI), bem como sua relação com os
resultados das simulações.
O quinto capítulo faz uma síntese desses fatos e discorre sobre algumas
características da água em biossistemas. Alem disso, apresenta algumas sugestões
para possíveis futuros trabalhos e relata a continuidade do presente estudo.
Por fim, o último capítulo traz as referencias bibliográficas consultadas
na elaboração desta monografia.
19
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO E AGLOMERADOS DE ÁGUA
2.1.1 Ligação de hidrogênio e sua importância
De todos os tipos de forças moleculares a ligação de hidrogênio ocupa
uma posição de destaque, uma vez que é suficientemente forte para produzir
profundos efeitos na reatividade e na estrutura das moléculas [22]. Assim, as ligações
de hidrogênio [22]:
Modificam as propriedades físicas das moléculas, como a solubilidade, a
volatilidade, o ponto de fusão e ebulição, a constante dielétrica, a velocidade
de passagem de um composto por uma coluna cromatográfica, etc.;
Determinam as propriedades da água;
Influenciam fortemente a atividade enzimática;
São importantes para a dinâmica dos sistemas biológicos;
Em posições favoráveis, durante a reduplicação do DNA, são responsáveis por
mutações genéticas; e
Mecanismos de formação e destruição de ligações de hidrogênio podem
explicar a ação enzimática do corpo humano, a contra-relaxação dos músculos,
a atividade cerebral e a memorização.
Em geral, a ligação de hidrogênio é definida pelas propriedades físicas e
geométricas dos elementos que a formam. Conforme a definição de L. Pauling (1960),
adaptada por M. Etter [27], a ligação de hidrogênio é a interação de um átomo de H ,
já covalentemente ligado, com um ou mais átomos, grupos de átomos ou moléculas,
formando uma estrutura suficientemente estável para ser considerada uma espécie
química independente (Figura 1).
20
Figura 1 – Esquema da ligação de hidrogênio na água.
Fonte: http://dererummundi.blogspot.com
Quimicamente, as atrações eletrostáticas entre os dipolos de duas
moléculas de água tendem a orientá-las entre si de tal maneira que a ligação O–H de
uma molécula de água volta-se para a nuvem do par de elétrons não-compartilhado do
átomo de oxigênio da outra molécula de água [28]. Isto resulta em uma associação
intermolecular direcionada conhecida como ligação de hidrogênio, uma interação
decisiva tanto para as propriedades da própria água, como para o seu papel como
solvente bioquímico [28]. De uma maneira geral, uma ligação de hidrogênio pode ser
representada como D–HLA, onde D–H é um "grupo doador" fracamente ácido, como
N–H ou O–H, e “A” está carregando um par não-compartilhado, ou seja, um "átomo
aceptor" fracamente básico, como um N ou O [28]. Alguns exemplos de ligações de
hidrogênio podem ser vistos na Figura 2.
21
Figura 2 - Ligações de hidrogênio por grupos funcionais. As ligações de hidrogênio formadas
entre a água e (a) grupos hidroxila, (b) grupos cetônicos, (c) grupos carboxílicos e (d) grupos
amino [28].
A via bifurcada, na qual cada doador é ligado por ligações de H a dois
aceptores, é especialmente adequada para o estudo da dinâmica da ligação de
hidrogênio em pequenos aglomerados de água, como tem sido observado para o
dímero, trímero, pentâmero e hexâmero [29,30] e corresponde à via de menor energia
para quebrar e fazer uma ligação de hidrogênio. Por essa via, um grupo D–H pode ser
ligado a mais de um aceptor A ao mesmo tempo, A1 e A2, denominado doador
bifurcado (Figura 3a); ou dois grupos doadores podem conectar-se a um único aceptor,
designado aceptor bifurcado (Figura 3b)
Figura 3 – Representação da ligação de hidrogênio
bifurcada (a) no doador, (b) no aceptor
22
2.1.2 Considerações de simetria [31]
Eixos de rotação (Cn) apresentam operações de simetria de rotação. O
eixo-espelho,
espelho, eixo de rotação-reflexão
rotação
ou eixo impróprio (Sn) possui a operação de
simetria de rotação-reflexão.
reflexão.
Uma molécula apresenta um eixo de simetria (Cn) de ordem n (n eixos
de simetria) se uma rotação de 360°/n
360 /n ao redor deste eixo levar a um arranjo que não
pode ser distinguido do original. Se a molécula possuir um arranjo linear,
linear então seu
eixo será C∞. A Figura 4 mostra alguns exemplos de eixos Cn.
Figura 4 – Exemplos de simetria Cn para eixos C2, C3 e C6.
Já o eixo de simetria de rotação-reflexão (Sn) envolve duas
manipulações:
1) rotação de 360°/n
/n sobre um eixo designado Sn;
2) seguida de reflexão por um plano perpendicular ao eixo Sn, que pode estar fora
da molécula.
As Figuras 5 e 6 ilustram operações de simetria de rotação-reflexão.
rotação
Figura 5 – Exemplo de simetria Sn com uma molécula de trans-dicloroetileno. Rotacionando a molécula
de trans-dicloroetileno em 180°° ao redor do eixo (S2), seguido por reflexão em um plano de reflexão, a
orientação original da molécula é restabelecida.
23
Figura 6 – Exemplo de simetria Sn e Cn em carbono tetraédrico. Uma
rotação de 90°° sobre um S4, seguido ou precedido de reflexão em um
plano de reflexão restabelece a orientação original. Utilizando o
mesmo plano de simetria é possível rotacionar a molécula em 180°
180° e
obter a molécula idêntica à original (C2).
As operações Cn e Sn não têm prioridade uma sobre a outra. Assim uma
molécula pode ter simetria Cn e também Sn, conforme o exemplo da Figura 6.
Moléculas que têm
tê um eixo principal Cn e n eixos C2 em um plano
perpendicular a Cn possuem simetria diédrica, cujo grupo pontual é denominado Dn. O
grupo Dnd tem um eixo principal e n eixos C2 perpendiculares a ele.
2.1.3 Aglomerados de água
A estrutura da água líquida é dinâmica e as moléculas de água no estado
líquido podem alterar suas posições e orientações rapidamente [32]. Alguns
aglomerados de água, citados nesta seção, podem
po
ser observados na Figura 7 como o
dímero, trímero, tetrâmero, pentâmero e hexâmero.
hexâmero
24
Figura 7 – Estruturas dos aglomerados de água, (H2O)n, sendo n = 2–8: (a) (H2O)2, (b) (H2O)3, (c) (H2O)4,
(d) (H2O)5-cíclico, (e) (H2O)5-C2, (f) (H2O)6-cíclico, (g) (H2O)6-gaiola, (h) (H2O)6-prisma, (i) (H2O)7-baixo, (j)
(H2O)7-próximo, (k) (H2O)8-D2d, (l) (H2O)8-S4 [33].
O arquétipo das ligações de hidrogênio na água é o dímero da água
(Figura 7a). A distância O–O frequentemente está associada ao comprimento da
ligação de hidrogênio, cujo valor é 2,952Å e a dissociação de energia dessas ligações de
(H2O)2 é de 3,09kcal/mol, correspondendo ao ponto zero corrigido da energia de
ligação (De) de 4,85kcal/mol [34]. Um dímero com apenas uma única ligação de
hidrogênio, por exemplo, é facilmente acomodado em cavidades com diâmetro menor
que 0,9nm, mas não é termodinamicamente estável [35].
O dímero da água apresenta três distintas vias de barreira de
tunelamento fracas que reorganizam o padrão das ligações de hidrogênio (Figura 8). O
aceitador de comutação (aceptor switching), tendo a menor barreira de todos os
movimentos de tunelamento, estimada em 157 cm-1, é o movimento mais fácil de
tunelamento [34]. Esta via de tunelamento troca os dois prótons na ligação de
hidrogênio do monômero aceitador e começa com uma espécie de inversão do
25
monômero aceitador seguida por uma rotação do monômero doador em torno de sua
ligação O–H doadora, finalizada por uma rotação de 180° do complexo sobre a ligação
O–O [34].
-1
Figura 8 – Caminho da barreira de tunelamento do dímero da água em 157cm ,
-1
-1
207cm e 394cm [34].
O movimento de tunelamento divide cada nível de energia rotacionalvibracional em dois. O intercâmbio de tunelamento troca os papéis dos monômeros
aceitador e doador das ligações de hidrogênio da água [34]. Existem vários caminhos
possíveis para este intercâmbio, sendo o caminho de menor barreira o movimento de
troca orientado. Este percurso começa com uma rotação do doador num ângulo θD e
rotação do aceitador em torno do seu eixo C2 para formar uma estrutura do estado de
transição “trans” (Figura 8) [34]. Isto é seguido por uma rotação do doador inicial
sobre o seu eixo C2 e uma rotação inicial do aceitador no ângulo θA tal que ele se torna
o doador. O trajeto se completa por uma rotação de 180° em torno do fim do
complexo [34].
Cálculos com o potencial de tunelamento, rotação e vibração
determinaram a barreira em 207cm-1 (Figura 8) [34]. O caminho de troca antiorientada também tem se mostrado importante e é semelhante ao caminho
orientado, exceto por ter um estado de transição “cis”. O movimento de tunelamento
divide cada nível de energia por uma quantidade muito menor que a comutação do
aceitador resultando em dois conjuntos de três níveis de energia. O movimento de
tunelamento bifurcado, no qual o doador da ligação de hidrogênio troca o seu próton,
consiste de modo simultâneo no plano de movimentos libracionais do doador com
26
inversões do monômero aceitador. Isto é a via de tunelamento com a barreira mais
alta (394cm-1), resultando numa pequena alteração do nível de energia [34].
O trímero de água (Figura 7b) é uma estrutura muito mais rígida que o
dímero, sendo estabilizado por três ligações de hidrogênio [34]. A distância O–O no
trímero, 2,85Å, é significantemente menor que sua correspondente no dímero. O
trímero de água tem uma estrutura de equilíbrio cíclico quiral com cada monômero de
água agindo como uma única ligação de hidrogênio doadora e aceitadora [36]. Todos
os doadores das ligações OH são direcionados no mesmo sentido, padrão horário ou
anti-horário, com os hidrogênios livres existindo alternadamente acima e abaixo dos
planos dos átomos de oxigênio. Assim, os dois hidrogênios livres adjacentes no mesmo
lado do anel facilitam movimentos de torção [34].
No caso do tetrâmero (Figura 7c), as ligações de hidrogênio são
similares ao trímero, com cada monômero atuando como doador e aceitador e tendo
um hidrogênio ligado e um livre. A média da distância O–O é mais curta: 2,79Å.
Curiosamente, o tetrâmero de água acaba por ser mais difícil de caracterizar do que o
trímero, como resultado de sua maior simetria (S4). [37,38,39,40] A alta simetria
também impõe muito mais movimentos de tunelamento cooperativos e o rearranjo
bifurcado não tem sido observado [34].
Essa evolução estrutural continua com o pentâmero (Figuras 7d e 7e),
sendo muito similar ao trímero tanto na estrutura quanto na dinâmica [29,41,42]. Em
contraste ao trímero, lamelas devido ao tunelamento da bifurcação foram observadas
apenas para (H2O)5 e não para (D2O)5, devido à forte ligação de hidrogênio, ao forte
acoplamento de torção e ao movimento de contração do anel no último caso [30]. Este
acoplamento também exige o movimento de átomos pesados para os movimentos de
torção e resulta em uma multiplicidade de torção muito mais densa e um grande
número de transições de dipolo permitidas em baixas freqüências [43]. A ligação de H
do pentâmero é quase linear e a distância O–O, de 2,76Å, está próxima ao valor
encontrado para a água líquida e especialmente o gelo.
O hexâmero representa a transição das ligações de hidrogênio da rede
bidimensional para a rede tridimensional no seu arranjo mais estável (Figura 7g). Aqui
27
quatro monômeros formam três ligações de hidrogênio enquanto os dois monômeros
dos picos (apical) permanecem duplamente ligados em uma estrutura de cadeia quase
octaédrica [34]. Estes últimos monômeros engajam em um tipo de rearranjo bifurcado
cooperativo, novamente imposto pela simetria da rede de ligação de hidrogênio. É
notável que a estrutura mais estável do hexâmero de água, determinada na fase
gasosa, assemelha-se a unidade básica de gelo VI. Nauta e Miller [44] determinaram
uma estrutura cíclica do hexâmero em gotículas de hélio líquido, análogas às dos
aglomerados menores e, curiosamente, essa estrutura se assemelha a forma de um
anel de seis membros existentes em formas cristalinas do gelo, uma geometria
topologicamente favorável.
Embora experimentos de alta resolução ainda não tenham sido bem
sucedidos para aglomerados maiores que o hexâmero (Figuras 7i, 7j, 7k e 7l),
aglomerados (H2O)n, com n= 7, 8, 9, 10, têm sido observados em experimentos de
baixa resolução IR [45,46,47] e as estruturas destes grupos foram determinadas
através da comparação das freqüências vibracionais experimentais com os resultados
de cálculos ab initio para várias estruturas. Esta análise sugeriu a existência das
estruturas D2d e S4, ambas no octâmero, que correspondem aos anéis de tetrâmero
empilhados. Também foi determinado que a estrutura do heptâmero deriva da
estrutura do octâmero S4 pela remoção de um dos monômeros; uma estrutura
nonâmero vem da expansão da estrutura cúbica D2d do octâmero, que por sua vez é
composta de unidades do pentâmero e do tetrâmero; e que a estrutura dos
decâmeros é semelhante à estrutura do octâmero D2d com as duas moléculas de água
adicionais inseridas em cantos opostos.
A principal distinção entre os aglomerados e o bulk está no fato de que
os hidrogênios livres em aglomerados não são previstos para influenciar
significativamente os movimentos intermoleculares de translação e libração, um tipo
de oscilação que pode ocorrer nos eixos x, y e z [48]. Estudos da dinâmica da água
líquida por simulações computacionais [49,50] em conjunto com experimentos de
Keutsch e colaboradores [51] sugerem que os movimentos libracionais desempenham
um papel central na dinâmica do estado líquido, porque constituem o movimento
28
dominante para o início da quebra das ligações de hidrogênio em redes extensas. Já os
movimentos translacionais, por si próprios, não permitem uma quebra de ligação
significativa, mas podem facilitar indiretamente a quebra pelo enfraquecimento das
ligações de hidrogênio [52,49,50,53,54]. A interpretação das recentes medidas de
relaxação dielétrica tem até mesmo sugerido que as moléculas de água que fazem
apenas duas ligações de hidrogênio podem ser de especial importância para a
dinâmica do bulk [55].
2.2
ESTRUTURA DA ÁGUA CONFINADA
Água confinada é encontrada muito facilmente na natureza em
materiais porosos e granulares e também dentro e ao redor de macromoléculas,
estruturas supramoleculares e géis [23]. O processo de confinamento gera uma
competição entre a minimização energética da rede de ligações de hidrogênio
formada, das interações com a superfície da cavidade e o ajuste ao espaço disponível
para alocar as moléculas [13]. As propriedades físicas e o estado da água confinada
podem sofrer grandes variações dependendo das características moleculares da
superfície da cavidade, das dimensões do confinamento, da temperatura e da pressão
[24,23]. Quando as dimensões de confinamento estão em escalas nanoscópicas estas
mudanças são especialmente drásticas [23].
2.2.1 Confinamento Hidrofóbico
Quando confinada em cavidades compostas de superfícies hidrofóbicas
como, por exemplo, nanotubos de carbono, o comportamento da água é similar
àquele observado em interfaces líquido-gás, com exceção de que o confinamento
impede o livre movimento da água na direção da superfície e interações de van der
29
Waals direcionam as moléculas mais externas em direções preferenciais relativas aos
átomos da superfície [56]. Muitos trabalhos teóricos e experimentais têm se
preocupado com o problema da água confinada em nanotubos [57,58,59,60]. A
principal interação neste caso são as forças de van der Waals, que irão variar
dependendo do tipo de nanotubo e de seu diâmetro. Os orbitais π dos carbonos da
superfície podem ainda ser polarizados pelas moléculas de água e causar efeitos
significativamente diferentes daqueles esperados em cilindros hidrofóbicos uniformes
[56,61,62]. O sistema nanotubo+água tem mostrado-se um bom condutor de prótons
devido ao efeito Grotthuss, pelo qual, um "próton em excesso" ou defeito protônico se
difunde através da rede de ligações de hidrogênio de moléculas de água ou de outros
líquidos ligados, através da formação de ligações covalentes [63]. Após a adição de um
próton para um final de uma cadeia de hidrogênios ligados, a ligação de hidrogênio
lançada abaixo da cadeia libera um próton diferente, porém idêntico ao da outra
extremidade dessa cadeia, também denominada de “fio d’água”. Assim, os prótons
movem-se mais rápido quando uma cadeia unidimensional de ligações de hidrogênio
ordenadas facilita o seu movimento [64]. Fios de água são tão eficientes na
transferência de prótons que são deliberadamente interrompidos em canais
transmembrana, denominados aquaporina, responsáveis, em parte, pela alta
permeabilidade de muitas células à água. No meio destes canais, as moléculas de água
são reestruturadas, de modo a evitar ligações de hidrogênio seqüenciais e a
transferência facilitada do próton resultante [65].
Em simulações, tem-se mostrado que a penetração da água em
nanotubos é modulada por pequenas mudanças na polaridade da parede e nas
dimensões da cavidade [56,66,35]. Trabalho recente de Takaiwa et al. [67] propôs um
diagrama de fase para a água confinada em nanotubos com diâmetros menores do
que 1,7 nm, onde há pelo menos nove fases possíveis dentro do espaço cilíndrico. Um
comportamento similar ao da água em camadas superficiais deve ser esperado em
quaisquer confinamentos hidrofóbicos. Estudos de simulação da água em minúsculos
poros hidrofóbicos indicam o desaparecimento da transição líquido-líquido [68] ou a
sua mudança para temperaturas mais baixas [69]. Em um confinamento fortemente
30
hidrofóbico o ponto triplo da água desloca-se aproximadamente 7oC para
temperaturas mais baixas [70].
2.2.2 Confinamento Hidrofílico
Quando em cavidades hidrofílicas, tipicamente constituídas por sílica, a
água irá condensar da fase gasosa à fase vítrea gerando ao menos quatro camadas de
água absorvida [71]. Há forte competição entre as interações polares, as ligações de
hidrogênio superficiais e as ligações de hidrogênio água-água. A água mais próxima à
parede de sílica é altamente estruturada, fortemente dependente da natureza da
superfície e de caráter bem distinto da água mais interna, como demonstrado por
estudo de infravermelho [71] e Raios-X [72]. Fouzri et al. [73] mostraram que mesmo
os segundos vizinhos à superfície são afetados consideravelmente pela competição
entre a água superficial e efeitos de confinamento. Outro efeito interessante
observado em regimes de confinamento hidrofílico menores do que 2 nm é o aumento
abrupto de cerca de 1x106 vezes na viscosidade da água [74], o que não se observa em
ambiente hidrofóbico. O confinamento também pode causar aumento ou diminuição
dos pontos de fusão, dependendo da superfície e do espaço disponível. Espera-se uma
correlação inversa entre o aumento no ponto de ebulição e diminuição do ponto de
congelamento com o diâmetro capilar, devido ao efeito Gibbs-Thomson. Por este
efeito, a temperatura de solidificação de um líquido é reduzida em virtude da tensão
superficial. Todavia, efeitos opostos podem ocorrer, como o gelo que forma-se a 400 K
nos poros de 0.6-1.0 nm de vidros [75]. Simulações computacionais [24] mostram
ainda que a água pode experimentar significativas variações em sua densidade e
viscosidade se a separação da superfície é variada, com a água indo de líquido a sólido
e a líquido novamente, quando a separação varia de 0,58 nm a 0,53 para 0,47 nm. Em
condições onde não é possível estabelecer uma estrutura ordenada estável, a água
confinada sofre grandes flutuações de densidade na tentativa de otimizar a sua
estrutura dentro das restrições de confinamento [24].
31
2.3
PROCESSO INFLAMATÓRIO EM TECIDOS BIOLÓGICOS
2.3.1 Mecanismo da Inflamação
Entende-se como inflamação a reação local dos tecidos vascularizados à
agressão. O processo inflamatório é uma resposta tissular, que ocorre basicamente no
tecido conjuntivo, logo, é um fenômeno essencialmente mesenquimático [76].
A inflamação é uma das respostas primárias para a infecção [77]. Se
uma parte do corpo está para ser contaminada por bactérias, como pode ocorrer após
um ferimento por corte na pele, o local da ferida se tornará um “imã” para uma
variedade de células brancas do sangue [77]. As células brancas do sangue (leucócitos),
que normalmente permanecem na corrente sanguínea, são, em vez disso, estimuladas
a atravessar a camada endotelial que reveste as menores veias (vênulas) na região e a
entrar no tecido. Uma vez no tecido, os leucócitos se movem em resposta aos sinais
químicos em direção aos microorganismos invasores, os quais eles fagocitam [77].
Desde muito tempo a inflamação vem sendo relacionada com o calor,
do latim: inflamatio, onis = incêndio ou do grego flogose, phleg ou phlogos = queimar
[76]. O médico romano Aulus Cornellius Celsus (50 a.C) já descrevia a inflamação
como: rubor, tumor, calor e dor (como sendo os quatro sinais clássicos da inflamação)
[76].
O rubor é resultado da vasodilatação, o tumor é causado principalmente
pelo acúmulo de líquido no local [76]. A sensação de calor é resultado do rápido
acúmulo de sangue arterial com temperatura mais elevada na região [76]. A dor
apresenta mecanismo complexo: a distensão dos tecidos, a estimulação de
terminações nervosas livres e a lesão direta tecidual pelo agente agressor [76].
Outro sinal clínico, o aumento da permeabilidade vascular, é observado
sob a forma de edema [78]. A passagem de proteínas plasmáticas (albumina,
globulinas e fibrinogênio) para o meio extravascular altera a diferença entre as
pressões osmóticas intra e extravascular, favorecendo a saída de água e eletrólitos do
vaso, que leva ao aparecimento de edema [78].
32
Várias células e fragmentos de células estão envolvidos no processo
inflamatório, dentro das veias e fora delas, no tecido conjuntivo. Além de leucócitos,
macrófagos e plaquetas, as fibras também participam deste processo, como é o caso
do colágeno.
Num processo inflamatório, as decisões de “ir” ou “não ir” são baseadas
em uma série de sinais moleculares em resposta a traumas, lesões, infecções,
toxicidade, etc. [79]. Se em qualquer passo for emitido um sinal para avançar, mas este
for bloqueado na próxima etapa, o processo inflamatório pode executar uma ação
padrão, como a infiltração de um tecido com agregados de linfócitos e leucócitos que
às vezes são incorporados na proliferação de fibroblastos sinoviais (pannus), ou
distorção de um tecido com feixes de colágeno (fibrose) [79].
2.3.2 Espécies reativas de nitrogênio e oxigênio (RNOS) e a bioquímica da inflamação
[80,81]
Diversas reações do nosso organismo dependem da presença do
oxigênio, que é essencial a vida, mas também é tóxico. As reações de oxidação são
usadas na cadeia respiratória para a síntese de adenosina trifosfato (ATP). Os elétrons
liberados durante a glicólise e ciclo de Krebs são oxidados na mitocôndria e, a partir da
adenosina difosfato (ADP) e fosfato inorgânico (Pi) produzem ATP. Entretanto, quando
o O2 aceita elétrons singletos é transformado em radicais de oxigênio altamente
reativos, que causam danos às células lipídicas, protéicas e ao DNA. Esses danos
contribuem a morte/envelhecimento celular e a presença de patologias.
Os radicais são compostos que contêm um elétron singleto, geralmente
em um orbital externo. O oxigênio é um biradical, ou seja, possui dois elétrons
desemparelhados em orbitais separados. Através de processos enzimáticos e nãoenzimáticos que ocorrem repetidamente nas células, o O2 aceita elétrons singletos
para formar espécies reativas de oxigênio (ROS). ROS são radicais de oxigênio
altamente reativos ou compostos que são facilmente convertidos nas células para
33
radicais reativos. Podem ser geradas por processos enzimáticos ou não-enzimáticos
como subprodutos acidentais de ubiquinona (coenzima usualmente abreviada como
CoQ) ou de enzimas contendo metais (como por exemplo, citocromo P450, xantina
oxidase e NADPH oxidase).
As ROS estão sendo formados constantemente; aproximadamente 3 a
5% do oxigênio que consumimos é convertido em radicais livres de oxigênio. Alguns
são subprodutos acidentais de reações enzimáticas normais que escapam do sítio ativo
das enzimas que contêm metais durante reações de oxidação. Outros, como o
peróxido de hidrogênio, são produtos fisiológicos de oxidases nos peroxissomas. A
produção proposital de radicais livres ocorre em respostas inflamatórias. O uso de
medicamentos, a radiação natural, a poluição do ar e outros fatores químicos também
podem aumentar a formação de radicais livres nas células.
As ROS formadas pela redução de O2 são radicais superóxido (O2-), o
não-radical peróxido de hidrogênio (H2O2) e o radical hidroxil (OH·). O radical hidroxil,
por exemplo, causa danos oxidativos às proteínas e ao DNA. Também forma peróxidos
de lipídio e malondialdeído nas membranas lipídicas contendo ácidos graxos
poliinsaturados. Em alguns casos, os danos por radicais livres são a causa direta de
doenças (como é o caso dos danos aos tecidos devido à exposição à radiação
ionizante). Em doenças neurodegenerativas, como o mal de Parkinson, ROS podem
perpetuar os danos celulares causados por outros processos.
Em proteínas, os aminoácidos prolina, histidina, arginina, cisteína e
metionina são particularmente suscetíveis ao ataque de radicais hidroxil e danos
oxidativos. Como conseqüência dos danos oxidativos, as proteínas podem fragmentar
ou cruzar as ligações dos resíduos com outros resíduos. O ataque dos radicais livres
nos resíduos de cisteína das proteínas pode resultar em cross-linking e formação de
agregados que previnem sua degradação. Entretanto, os danos oxidativos aumentam a
suscetibilidade de outras proteínas à digestão proteolítica.
Os radicais de oxigênio estão combinados em seus danos destrutivos
aos radicais livres de oxido nítrico (NO) e as espécies reativas de oxigênio de ácido
34
hipoloroso (HOCl). NO combina com O2 ou superóxido para formar espécies reativas
de oxigênio, como o não-radical peroxinitrito ou o radical dióxido de nitrogênio.
O oxido nítrico é um radical livre que contém oxigênio e que também é
essencial para a vida e tóxico. NO possui um elétron singleto e, além disso, se liga a
outros compostos que possuem elétrons singletos, como Fe3+. Como um gás, se
difunde através do citosol, membranas lipídicas e dentro das células. Fisiologicamente,
em baixas concentrações, funciona como um neurotransmissor e um hormônio que
ocasiona a vasodilatação. Entretanto, em altas concentrações, ele se combina com O2
ou com superóxido para formar reativos adicionais e espécies tóxicas que contém
nitrogênio e oxigênio (RNOS). RNOS estão envolvidos em doenças neurodegenerativas,
como o mal de Parkinson e processos inflamatórios crônicos, como a artrite
reumatóide.
Em resposta aos agentes infecciosos e outros estímulos, células
fagocíticas do sistema imune (neutrófilos, eosinófilos e monócitos/macrócitos) exibem
um rápido consumo de O2, denominado explosão respiratória. A explosão respiratória
é a maior origem de superóxido, peróxido e hidrogênio, o radical hidroxil, ácido
hipocloroso (HOCl) e RNOS. Essa geração de radicais livres é parte da defesa
antimicrobiana humana, cujo objetivo é destruir microorganismos invasores, células
tumorais e outras células que devem ser removidas.
A explosão respiratória resulta da atividade da NADPH oxidase, que
catalisa a transferência de um elétron do NADPH para o O2 para formar o superóxido.
O superóxido é liberado no espaço intramembranoso do fagolisosssomo, onde é
geralmente convertido em peróxido de hidrogênio e outras ROS efetivas contra
bactérias e fungos patógenos. Quando os neutrófilos do sistema imune são ativados
para produzir NO, a NADPH oxidase também é ativada. NO reage rapidamente com o
superóxido para gerar peróxinitrito, que forma RNOS adicionais. Em alguns quadros
patológicos, os radicais livres liberados pelos neutrófilos e macrófagos durante a
inflamação contribuem para a injúria dos tecidos.
RNOS estão presentes no ambiente (como na fumaça do cigarro) e
também são gerados nas células. Durante a fagocitose pela invasão de
35
microorganismos, as células do sistema imune produzem O2-, HOCl e NO através das
ações de NADPH oxidase, mieloperoxidase e óxido nítrico sintetase, respectivamente.
Além de matar microorganismos invasores fagocitados, estes metabolismos tóxicos
podem danificar componentes do tecido. As células se protegem contra os danos por
ROS e outros radicais através de processos de reparo, compartimentalização da
produção de radicais livres, enzimas de defesa e antioxidantes endógenos e exógenos.
A enzima de defesa superóxido dismutase (SOD) remove o radical superóxido livre.
Catalase e glutationa peroxidase removem peróxidos de hidrogênio e peróxidos de
lipídio. Vitamina E, vitamina C e flavonóides das plantas agem como antioxidantes.
Perturbações nesse equilíbrio redox geram o estresse oxidativo, que ocorre quando a
taxa de geração de ROS excede a capacidade das células em removê-las.
2.3.3 Hiperplasia Fibrosa Inflamatória [82]
A hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI) é um processo proliferativo nãoneoplásico freqüentemente diagnosticado nos tecidos bucais. Ocorre principalmente
por traumas crônicos de baixa intensidade, devido a próteses mal adaptadas ou
hábitos parafuncionais. As alterações histopatológicas das hiperplasias fibrosas
inflamatórias são observadas em epitélio e tecido conjuntivo. No tecido conjuntivo, há
aumento na quantidade das fibras colágenas e alteração no padrão de maturação
dessas fibras, as quais se apresentam mais espessas e com disposição aleatória.
Observa-se que em processos hiperplásicos inflamatórios, o colágeno é a proteína mais
alterada.
36
2.3.4 Colágeno
O colágeno é a proteína mais abundante em vertebrados [81] e está
presente somente em matrizes extracelulares [77]. Uma fibra de colágeno consiste
numa tripla hélice com três cadeias polipeptídicas
polipeptídicas torcidas sobre si mesmas como em
uma corda trançada [81],, de alta resistência a tração [77] (Figura 9).
). Estima-se que
uma fibra de colágeno de 1 mm de diâmetro seja capaz de suspender um peso de 10kg
sem quebrar [77]. O tropocolágeno,
tropocolágeno como é denominado a tripla hélice do colágeno,
colágeno
possui 300 nm de comprimento e 1,5 nm de diâmetro. As três fitas
itas são mantidas
unidas por ligações de hidrogênio, envolvendo resíduos de hidroxiprolina e
hidroxilisina. Cada uma dessas fitas contém cerca de 800 resíduos de aminoácidos [81].
Figura 9 – Ilustração esquemática da tripla
hélic de colágeno.
hélice
Fonte: Adaptado de Campbell [81].
Cada
ada cadeia de colágeno possui uma seqüência de aminoácidos que
pode ser considerada uma repetição do mesmo tripeptídeo, glicina-hidroxiprolinaglicina
prolina [81] (Figura 10).. Algumas variações são possíveis, mas a glicina deve estar
presente em cada terceira posição ao longo da cadeia, e a maioria dos outros resíduos
é formada de prolinas ou hidroxiprolinas [81].. Esses aminoácidos possuem cadeias
laterais com propriedades únicas [77].. A glicina usualmente está presente nos locais
37
onde dois polipeptídeos estão próximos, sua cadeia lateral consiste em apenas um
átomo de hidrogênio e pode adequar-se a um ambiente hidrofílico ou hidrofóbico [77].
Já a prolina, embora tenha a cadeia lateral com caráter hidrofóbico, apresenta a
propriedade única de criar dobras na cadeia polipeptídica [77]. O grupo hidroxil da
hidroxiprolina auxilia a manter seu anel em uma conformação que estabiliza a tripla
hélice [77].
Figura 10 – Estrutura geral da prolina, glicina e hidroxiprolina.
No colágeno também ocorrem ligações covalentes, tanto intra como
intermoleculares, formadas por reações entre resíduos de lisina e histidina [81]. A
quantidade de ligações cruzadas em um tecido aumenta com a idade. É por isso que a
carne de animais mais velhos é mais dura do que a de animais mais jovens [81].
2.4
O PAPEL DA ÁGUA EM BIOSSISTEMAS
Conforme Chaplin [13], um dos principais pesquisadores em estrutura e
ciência da água, ainda hoje, muito do material publicado a respeito de moléculas
biológicas ignora o papel central da água na máquina da vida. Recentemente,
entretanto, tornou-se mais claro o seu lugar como “principal jogadora” e também “a
mais versátil”, em biologia celular e molecular [13]. Em muitos sistemas biológicos a
água encontra-se confinada em regiões hidrofílicas e/ou hidrofóbicas específicas. Por
esta razão, vários estudos recentes têm se preocupado em estudar o comportamento
da água confinada [2,3,4,5,6,7,8,9,10].
38
A interação da água com sua vizinhança hidrofílica e não-hidrofílica é de
fundamental importância. De fato, resultados de espectroscopia no infravermelho e
simulações de dinâmica molecular [3] tem dado evidências de que o mecanismo pelo
qual a água se acopla aos seus vizinhos via ligações de hidrogênio é bastante
complexo, e as configurações ligadas por interações não-ligações de hidrogênio
desempenham um papel fundamental neste mecanismo.
Em sistemas biológicos, a água caracteriza-se pelo hidrogênio ligado
quer a biomoléculas (proteínas) ou intermolecular a outras moléculas da água [83].
Moléculas de água sem ligações de hidrogênio com as biomoléculas são normalmente
denominadas água livre, embora possuam hidrogênios ligados a outras moléculas de
água em uma estrutura tetraédrica [83]. Gniadecka e colaboradores [83] observaram
por espectroscopia Raman que em estrato córneo, unhas, e toda a pele, a água
apresenta-se principalmente na forma ligada. Embora a proporção de água livre e
ligada na pele ainda não tenha sido definida conclusivamente, devido à ausência da
banda de água livre nas amostras estudadas, eles especulam que mais de 90% do total
de moléculas de água em toda a pele, estrato córneo e unhas estão em formas ligadas
[83].
A água é uma parte integrante de muitas biomoléculas. Em particular, a
água não está presente apenas para preencher o espaço disponível dentro e em torno
das proteínas biológicas [84]. As interações proteína-água estabelecem e moldam o
panorama de energia livre que governa a atividade, estrutura, estabilidade e
dobramento das proteínas [85]. As proteínas se dobram rapidamente para formas
tridimensionais bem definidas que dependem da seqüência primária de seus
aminoácidos. Para que isso seja possível, é necessário um mecanismo que envolva
ligações flexíveis, permutáveis e extensíveis. A ligação de hidrogênio mediada pela
água é ideal para esta finalidade, de forma que tem sido proposto que o enovelamento
de proteínas é mediado e orientado pela solvatação aquosa [86].
Um papel essencial da água está relacionado ao seu efeito hidrofóbico.
A interação hidrofóbica é responsável por vários processos biológicos importantes:
para a agregação dos lipídios anfifílicos em bicamadas, com suas caudas hidrofóbicas
39
“ocultas” a água e suas cabeças hidrofílicas na superfície, para a fixação de resíduos
hidrofóbicos em cadeias polipeptídicas que ajudam as proteínas a dobrar e manter
suas formas compactas e para a agregação das subunidades protéicas em várias
subunidades das estruturas quaternárias [87]. A explicação convencional é que, a fim
de acomodar uma espécie hidrofóbica, a rede de hidrogênio-ligado deve ser
interrompida para criar um vazio [87]. Mas isto pode ser feito de tal maneira a evitar
alterações entálpicas pela perda das ligações de hidrogênio, se as moléculas de água
auto-organizarem ao redor do hidrófobo de forma relativamente ordenada [87].
As moléculas de água ocupam sítios específicos e formam aglomerados
localizados, com estruturas que são determinadas pelas suas capacidades de
formarem ligação de hidrogênio e pela estrutura da proteína [13]. Esses aglomerados
de água conferem à água líquida um caráter heterogêneo, que pode mudar com as
diferentes condições físicas e ambientais [13]. Os átomos de biomoléculas podem
substituir uma ou todas as ligações ao redor de cada molécula de água, afetando a
estrutura das moléculas de água adjacentes e os grupos biomoleculares, bem como
partes distantes desses grupos e moléculas ligadas de modo secundário [13]. A rápida
troca de parceiros (1-100 picossegundos) permite que a forma da superfície de uma
biomolécula mude, mas não altere significativamente outros efeitos de hidratação,
como a direção da rede e a intensidade das ligações de hidrogênio [13].
Na maioria das proteínas globulares, as moléculas de água estão
presentes em quantidades similares à quantia de cada um dos aminoácidos presentes,
ocupam cavidades e muitas delas são tão essenciais para a função quanto os
aminoácidos [85]. Como as moléculas de água e seus aglomerados são extremamente
alojáveis em termos de sua orientação e distribuição espacial, eles podem diminuir a
barreira de potencial entre os mínimos de energia dos sistemas vizinhos. A água pode,
portanto, funcionar como um lubrificante uma vez em que facilita os rearranjos
necessários das ligações de hidrogênio com grupos carbonil-amida peptídeo durante
as alterações conformacionais, que dão às proteínas a flexibilidade que precisam para
suas funções [88]. As ligações de hidrogênio das moléculas de água e seus
aglomerados podem também funcionar como "garras mecânicas" que transmitem o
40
movimento relativo entre as subunidades e domínios, dependendo das circunstâncias
[13].
Uma quantidade específica de água é necessária para a atividade
biológica de todas as proteínas. Mesmo as enzimas aparentemente “secas” na
presença de substratos de fase gasosa não mostram atividade sem a presença de um
pouco de água [89]. Evidências recentes indicam a necessidade de uma rede de
ligações de hidrogênio, cobrindo a maior parte da superfície de uma enzima, para que
haja atividade enzimática [90]. Além disso, a rede de moléculas de água une elementos
estruturais secundários na proteína e, deste modo, determina não apenas os
pormenores de uma estrutura protéica, mas também quais são as vibrações
moleculares preferidas [90].
Normalmente há uma estreita relação entre a perda entálpica e o ganho
entrópico das moléculas de água que estão sendo deslocadas. Por outro lado o ganho
entálpico e a perda entrópica da interação da proteína ligante que está se formando
também estão relacionados. Este balanço energético facilita tanto a formação de
ligação quanto sua quebra [91]. No entanto, as moléculas de água podem permanecer
no local quando uma nova interação é formada e, juntamente com ligações periféricas
causadas pela hidratação, podem afetar a estereoquímica, especificidade e dinâmica
do processo de ligação [92].
As moléculas de água ordenadas podem facilitar tanto a transferência
de elétrons, como a transferência de prótons. Na transferência de elétrons entre sítios
biomoleculares redox, aglomerados de água estruturados próximo a cofatores redox
aceleram a transferência de elétrons pela produção de vias de tunelamento acopladas
fortemente entre o elétron doador e o elétron aceitador [93]. Na transferência de
prótons ocorre um processo denominado mecanismo Grotthuss, em que os prótons
podem mover-se rapidamente em meio aquoso [64].
Em biomoléculas, tanto a estrutura do DNA quanto o reconhecimento
crucial da sua seqüência são dependentes de interações aquosas, com a expansão e
contração da hélice do DNA em função de seu status de hidratação [94]. A hidratação
no sulco menor (como por exemplo, do B-DNA, Figura 11) tem um padrão complexo
41
que inclui águas hexagonais na coluna inicial de hidratação, hidratação secundária, e
hidratação externa até a quarta superfície aquosa [95]. Esta seqüência de hidrataçãodependente pode funcionar como uma “impressão digital de hidratação” para uma
determinada seqüência de DNA, o que permite o entendimento da seqüência de bases
do lado de fora dos sulcos pelas proteínas, e a detecção rápida e lubrificada da
seqüência do DNA [96].
Figura 11 – Ilustração dos sulcos do B-DNA. O B-DNA é a forma mais comum de DNA, que o DNA
assume quando em solução. Se pensarmos na hélice de B-DNA como uma estrutura cilíndrica, com cerca
de 2 nm de diâmetro, notaremos que a superfície da molécula é irregular, formando 2 sulcos ou
depressões, de tamanhos diferentes, que giram ao longo de todo o seu comprimento. O sulco menor
resulta da depressão entre as duas cadeias complementares, enquanto que o sulco maior resulta da
depressão existente entre os giros adjacentes da hélice. Os sulcos são importantes porque deixam
superfícies livres para a interação entre o B-DNA e as proteínas.
Fonte: Adaptado de http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bookres.fcgi/mga/ch2f3.gif
Ao contrário de alguns estudos de Ressonância Magnética Nuclear
(RMN) [97] e a maior parte dos estudos de dinâmica molecular [98], o estudo de Ruffle
et al. [99] indica que a água dentro das células se comporta de modo diferente da água
do lado de fora. A viscosidade da água intracelular, por exemplo, é mais elevada e sua
capacidade de difusão é menor, como foi observado por RMN [100]. De fato,
argumentos convincentes propõem que o meio intracelular é um gel [101], um cristal
42
líquido [102] ou é formado por estruturas aquosas extensivamente polarizadas [103].
Muitas moléculas estão presentes nas células e uma alta proporção de água,
osmoticamente inativa, está associada a interações biomoleculares [104].
Além disso, a hidratação intracelular pode ser um fator primordial na
carcinogenesis, uma vez que as células cancerosas contêm água mais livre do que as
células normais, e o grau de malignidade aumenta com o grau de hidratação celular
[105]. Uma possível explicação para o fato é que o aumento da hidratação facilita a
aceleração dos processos intracelulares, incluindo a respiração, o que reforça a
vantagem competitiva de uma célula cancerosa para a utilização de nutrientes [13].
2.5
MICELAS REVERSAS
Os tensoativos ou surfactantes são os agentes de superfície que, por
serem constituídos por moléculas anfipáticas (ou anfifílicas: possuem uma ou mais
cadeias não polares e uma parte polar), são capazes de mudar a estrutura da água
[28]. Espontaneamente em meio aquoso formam estruturas auto-organizadas, como
agregados esféricos (chamados micelas - Figura 12), cilíndricos, planares (lamelas), etc.
As propriedades estruturais e dinâmicas de filmes destas moléculas adsorvidas são
importantes para a pesquisa básica e aplicada [106]. Um grande número de processos
químicos, físicos e biológicos ocorre em interfaces sólido-líquido ou líquido-líquido, em
escala molecular [107].
Figura 12 – Ilustração esquemática de (a) micela e (b) micela reversa.
43
Todas as moléculas ou íons dissolvidos na água interferem com as
ligações de hidrogênio de algumas moléculas de água que estão na sua vizinhança
imediata [108]. Solutos polares ou carregados compensam a perda de ligações de
hidrogênio água-água, formando novas interações água-soluto, cuja variação de
entalpia (∆H), em uma dissolução, é pequena [108]. Entretanto, solutos hidrofóbicos,
não oferecem essa compensação e sua adição à água pode resultar num pequeno
ganho de entalpia, pois a quebra de ligações de hidrogênio entre as moléculas de água
retira energia do sistema [108]. Além disso, a dissolução de compostos hidrofóbicos a
água resulta em uma diminuição mensurável na entropia [108].
As moléculas de água nas vizinhanças imediatas de um soluto não-polar
apresentam uma restrição em relação as suas possíveis orientações, à medida que
formam um arcabouço semelhante a uma gaiola, altamente organizado, ao redor de
cada molécula de soluto [108]. Essa organização das moléculas da água diminui a
entropia e, por conseguinte, o número de moléculas de água organizadas é
proporcional à área da superfície do soluto hidrofóbico, preso dentro da gaiola de
moléculas de água. Assim, a variação da energia livre para dissolver um soluto nãopolar na água é desfavorável ∆G = ∆H – T∆S, onde ∆H tem um valor positivo, ∆S um
valor negativo, e ∆G é positivo [108].
Compostos anfipáticos possuem regiões polares (ou carregadas) e
regiões não-polares. Quando um composto anfipático é misturado com água, a região
hidrofílica polar interage favoravelmente com o solvente, que tende a se dissolver;
mas a região hidrofóbica não-polar tende a evitar o contato com a água. As regiões
não-polares das moléculas se agregam, apresentando, assim, a menor área hidrofóbica
ao solvente, e as regiões polares são arranjadas para maximizar a sua interação com o
solvente [108]. Essas estruturas estáveis de compostos anfipáticos na água, chamadas
micelas, podem conter centenas ou milhares das moléculas. As forças que mantém
juntas as regiões não-polares das moléculas são chamadas interações [108]. A força
dessas interações não é devido a nenhuma atração intrínseca entre as moléculas nãopolares [108]. Ao contrário, ela resulta do fato do sistema atingir a maior estabilidade
44
termodinâmica, minimizando o número de moléculas de água ordenadas, requeridas
para envolver as regiões hidrofóbicas das moléculas do soluto [108].
Muitas biomoléculas são anfipáticas: proteínas, pigmentos, algumas
vitaminas, esteróides e fosfolipídeos de membranas têm regiões superficiais polares e
não-polares. As estruturas que compõem essas moléculas são estabilizadas por
interações hidrofóbicas ao longo das regiões não-polares [108]. As interações
hidrofóbicas entre lipídios e entre lipídios e proteínas são os determinantes mais
importantes da estrutura das membranas biológicas [108].
As interações hidrofóbicas entre aminoácidos não-polares também
estabilizam o enovelamento tridimensional das proteínas [108]. As pontes de
hidrogênio entre as moléculas de água e os solutos polares também provocam alguma
organização das moléculas da água, mas o efeito e significativamente menor que
aquele observado com solutos não-polares [108]. Parte da força de ligação de um
substrato polar (reagente) à superfície complementar polar de uma enzima provém do
aumento da entropia, à medida que a enzima desloca a água organizada ao redor do
substrato [108].
Neste sentido, micelas reversas têm se mostrado como um modelo de
pesquisa convincente de água confinada em sistemas biológicos [109]. As micelas
reversas se formam quando misturas de água, surfactantes e solventes não-polares
são combinados em concentrações apropriadas. Uma vez que elas mantêm uma forma
quase esférica sobre uma ampla gama de hidratação, a simples relação da
concentração de água pela concentração do surfactante fornece informações sobre os
tamanhos das estruturas [25]. Tal relação é dada pelo parâmetro wo (“water in oil”),
wo=[água]/[surfactante].
As dimensões do interior das micelas reversas são similares aos espaços
da água confinada encontrada nas cavidades de sistemas biológicos [110]. Esses
pacotes de água são pensados para serem envolvidos com dobras e relaxação em
proteínas. Além disso, micelas reversas existem em bicamadas lipídicas das
membranas durante a formação do endossomo. Micelas reversas também têm sido
usadas como modelo (gabarito) para a síntese de nanopartículas [110].
45
Investigações diretas da água intramicelar, pelo uso do estado
estacionário e espectroscopia IR, têm definido que a ligação de hidrogênio das
moléculas de água próximas à interface do surfactante diferem daquelas da água no
núcleo (core) das micelas [111]. Numa micela reversa pequena, toda água
essencialmente está localizada na superfície (shell) e quanto maior a micela, o efeito
de confinamento se torna menos pronunciado [111].
Baruah et al. [111], utilizando NMR, observaram que conforme w0
aumenta, a quantidade de água no núcleo (core) das micelas reversas aumenta,
enquanto a água na camada da casca (shell) permanece aproximadamente a mesma.
Em seus experimentos eles observaram que as posições dos picos para as mesmas
características apareciam em diferentes deslocamentos químicos em micelas reversas
e soluções aquosas bulk. Além disso, a largura dos picos aumenta com o decaimento
do tamanho das micelas.
Com a redução do tamanho das micelas reversas há um significante
decaimento dos tempos de relaxação da rede (T1) de spin, o qual poderia refletir em
alterações na viscosidade, uma vez que a relaxação depende da habilidade da
molécula se mover [112]. A literatura relata que com a diminuição da temperatura, a
largura dos picos aumenta e T1 diminui, compatível com a mobilidade cada vez mais
limitada de locomoção, como em amostras frias [113]. Observações similares a essas
também foram feitas por Baruah et al. [111].
O advento das novas ferramentas experimentais e computadores mais
rápidos prometem divulgar mais detalhes sobre a água em volumes nanoscópicos [25].
Começando com sistemas micelares reversos simplificados, podemos começar a
entender como a água se comporta de modo diferente quando confinada em
cavidades biológicas e como essas “piscinas” afetam as funções biológicas [25].
46
2.6
ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL E MODOS VIBRACIONAIS DA ÁGUA
A energia total de uma molécula é dada pela soma das energias
eletrônicas, vibracionais e rotacionais; além das energias cinética, nuclear, entre
outras.
Uma molécula pode absorver ou emitir energia como resultado da
transição entre diferentes níveis eletrônicos, vibracionais e/ou rotacionais. O estudo
destas
emissões
ou
absorções
da
radiação
eletromagnética
denomina-se
espectroscopia molecular [22]. Assim, quando um quantum de energia, h.ν, incide
sobre uma molécula, por exemplo, ela pode passar de um estado energético E1 para
um estado E2 de maior energia, tal que:
∆E = E2 − E1 = h.ν = h.c.ν
(2.6.1)
Sendo υ, a freqüência incidente, (dada em s-1), h a constante de Planck, ν o número de
onda (expresso em cm-1) e c a velocidade da luz [22].
Quando a radiação eletromagnética atinge a molécula A – B, ela pode
acoplar-se com o momento dipolar de A – B, induzindo uma vibração a A – B e ser
absorvida. A freqüência de vibração de estiramento da ligação
ν=
1
=
2πc
f
(m A + m B )
m A .mB
A – B é dada por
(2.6.2)
Onde ν o número de onda em cm-1, f a força, expressa em dinas.Å, c a velocidade da
luz em cm.s-1 e mA e mB as massas dos átomos A e B dadas em gramas [22]. Essa
equação mostra que o principal fator que determina a freqüência de vibração de um
grupo A – B é a sua elasticidade, dada pela constante de força e a massa relativa dos
grupos A e B. Desse modo, a freqüência de absorção de grupos de átomos com massa
e/ou constante de força diferentes devem absorver em freqüências que lhes são
características [22].
Conforme Siebert e Hildebrandt [114], a espectroscopia vibracional é
uma ferramenta de analítica que investiga o período de oscilação dos átomos em uma
molécula. Essas oscilações não ocorrem aleatoriamente, mas de um modo
precisamente definido. Isso pode ser facilmente entendido levando-se em
47
consideração que uma molécula com N átomos tem 3N graus de liberdade, dos quais
três se referem a translações e três (dois) correspondem a rotações em casos de
estruturas não-lineares (lineares) das moléculas. Os graus de liberdade representam
3N-6 (3N-5) vibrações de moléculas não-lineares (lineares) denominadas de modos
normais [114].
Em cada modo normal, cada átomo oscila em fase com a mesma
freqüência, embora com amplitudes diferentes. No entanto, a freqüência, primeira
propriedade observável em espectroscopia vibracional, tem uma dependência sensível
nas forças que atuam em átomos individuais e as respectivas massas [114]. Estas
forças não resultam apenas das ligações químicas que conectam os átomos individuais,
mas também incluem contribuições provenientes de interações de ligação dentro das
moléculas e com o ambiente molecular [114]. Portanto, as freqüências dos modos
normais constituem uma assinatura característica da constituição química, da
estrutura e da distribuição de densidade eletrônica da molécula em um dado ambiente
químico. [114]
Uma das técnicas para a obtenção de espectros vibracionais é a
espectroscopia Raman, que tem por base o espalhamento inelástico da luz [115]. Esse
fenômeno foi previsto por Smekal em 1923 [116] e observado experimentalmente em
1928, por Raman [117].
A espectroscopia Raman é uma técnica fotônica de alta resolução que
proporciona em poucos segundos informação química e estrutural de um composto,
orgânico e/ou inorgânico, permitindo assim sua identificação [114]. Tal análise
fundamenta-se no exame da luz dispersa por um material incidido por um feixe de luz
monocromático. Uma pequena porção da luz é dispersa inelasticamente
experimentando ligeiras mudanças de freqüência que são características do material
analisado e independentes da freqüência da luz incidente [114]. Trata-se de um
método analítico não destrutivo para determinar a estrutura e a conformação dos
componentes moleculares; não exige preparação da amostra ou tratamento prévio;
pode ser usado por amostras muito complexas não-purificadas; exige apenas
quantidades muito pequenas do composto e é aplicável a biomoléculas em qualquer
48
estado de agregação [114,83]. Os tecidos podem ser examinados in vitro ou in vivo em
segundos e se há uma biblioteca dos perfis espectrais dos vários tecidos, a comparação
e interpretação podem ser feitas em tempo real [45]. Por estas razões, a técnica é
especialmente adequada para as investigações de materiais biológicos [114,83]. Pode
ainda oferecer um método menos subjetivo, com rapidez nas análises e como
complemento aos métodos histológicos correntes [118].
A espectroscopia Raman do infravermelho próximo com transformada
de Fourier (FT-NIR), que foi recentemente introduzida na pesquisa biomédica, permite
o estudo da conformação molecular dos compostos em seu microambiente natural
[83]. Ela explora um efeito em que uma pequena porção de luz monocromática,
espalhada por uma substância que tenha uma freqüência diferente do feixe de luz
incidente, chega numa quantia igual à freqüência de vibração da ligação química [83].
Mudanças estruturais detectadas pela espectroscopia Raman, causadas por alterações
nas ligações de hidrogênio, são de provável importância biológica [119,120].
Alterações da estrutura molecular das proteínas e lipídios em tumores cutâneos
benignos e malignos, por exemplo, foram descritos por espectroscopia Raman [121].
2.6.1 Teoria de espectroscopia Raman [122]
O Efeito Raman pode ser explicado por um modelo clássico que parte do
princípio de que um sólido é considerado como um conjunto de átomos sofrendo
vibrações harmônicas simples devido à ação do campo elétrico da radiação incidente
sobre o material.
r
Quando o material é colocado nesse campo elétrico E ocorre o
deslocamento da nuvem eletrônica em sentido oposto ao deslocamento nuclear e isso
r
pressupõe a criação de um momento de dipolo P no material.
O momento de dipolo é dado por
r
r
P=χE
(2.6.3),
49
onde χ é a polarizabilidade (susceptibilidade) eletrônica do material que indica a
facilidade com que a nuvem eletrônica pode deformar-se; essa característica é
r
intrínseca de cada material. O campo elétrico E que pode ser representado por uma
função de ondas planas e é dado por
rr
rr
E(r , t ) = E0ei (k .r −ω t )eˆ
(2.6.4)
onde ê define a direção de polarização da luz incidente, E 0 é a amplitude da onda,
r
ω é a freqüência e k é o vetor de onda.
Uma vez que o campo elétrico é oscilante no tempo, e isso pressupõe
que a nuvem é distorcida de um lado para outro em cada intervalo de tempo t,
r r
podemos também definir um deslocamento atômico u (r , t ) igualmente oscilante com
r
o tempo t, porém com freqüência diferente daquela associada ao campo elétrico E já
que agora se trata da freqüência de vibração da rede cristalina, ou seja,
rr
rr
u (r , t ) = uo e ±i (q.r +Ωt )
(2.6.5)
r
onde u o é a amplitude do deslocamento, Ω a freqüência de vibração da rede e q o
seu vetor de onda.
Sabendo que as vibrações atômicas alteram a susceptibilidade, esta
pode ser expandida em potências de u da seguinte forma
 dχ 
u +
 du 
χ (u, ω ) = χ 0 (ω ) + 
1  d 2χ 

 +K
2  du 
(2.6.6)
Das equações 2.5.3, 2.5.4 e 2.5.6 podemos reescrever a expressão para
r
o momento de dipolo P na forma abaixo:
r r
r r r
r
 dχ 
i [ (k ± q ). r − (ω ± Ω ) t ]
P = χ 0 (ω )E 0 e i (k .r −ω t ) + 
eˆ + K (2.6.7)
 u0 E0e
 du 
Um espalhamento pode ser dividido em dois tipos: Rayleigh ou Raman
(Figura 13). Quando os quanta de energia colidem com a molécula e são espalhados
em todas as direções, com a mesma freqüência do feixe incidente, ocorre o
espalhamento Rayleigh. Já no espalhamento Raman, a indução de uma transição de
energia, devido a um quantum de freqüência ν0, modifica os níveis de energia
rotacional e vibracional, tal que a freqüência da radiação emergente será ν0 - ν1 (linha
de Stokes) [115]. Outra possibilidade é a do quantum de luz colidir com uma molécula
50
já excitada, fazendo-a retornar ao estado fundamental, de modo que a freqüência da
luz espalhada seja ν0 + ν1 (linha anti-Stokes) [115].
Figura 13 – Esquema Ilustrativo dos espalhamentos (a) Raileigh, (b) Raman Stokes e (c) Raman AntiStokes.
Assim, o primeiro termo da equação 2.6.7 corresponde ao
espalhamento Rayleigh, o segundo termo descreve o espalhamento Raman no qual as
freqüências (ω ± Ω ) correspondem aos espalhamentos Stokes (-) e anti-Stokes (+). Essa
equação também mostra que se não houver variação na polarizabilidade não há
espalhamento Raman.
Na análise via teoria quântica o espalhamento de luz pelo material dá-se
pela aniquilação de um quantum de luz incidente e posterior criação de um quantum
de luz espalhada. Para que este processo ocorra, no material, uma excitação cristalina
(fônon) deve ser criada (processo Stokes) ou aniquilada (processo anti-Stokes). Como
dito anteriormente, o efeito Raman caracteriza-se como um espalhamento inelástico
que tem como resultado a mudança da energia vibracional do material, de forma que
para que a conservação da energia do sistema ocorra, deve haver a emissão de um
fóton com energia diferente daquela do fóton inicial, assim,
∆E m = hν 0 − hν v = hν m
(2.6.8)
51
com ν 0 sendo a freqüência do fóton incidente, ν v a freqüência do fóton espalhado e
ν m a freqüência de vibração do material.
Os níveis 0 e 1 representam respectivamente os níveis de energia
fundamental e primeiro nível vibracional excitado.
Quando o fóton da radiação
incidente interage com o material no estado fundamental ν = 0, a molécula absorve a
energia desse fóton e vai para um nível de energia mais alto, mas pouco estável de
forma que esta imediatamente perde energia voltando ao estado fundamental, porém,
emitindo um fóton com energia e freqüência idênticas ao do fóton incidente,
caracteriza-se então o espalhamento Rayleigh (elástico).
Se ao perder energia, a molécula, ao invés de voltar ao estado
fundamental, permanecer no primeiro estado vibracional excitado ν = 1, o fóton
espalhado terá energia menor que aquela do fóton incidente e um fônon (vibração da
rede) será gerado, assim ∆E m > 0 e ν v < ν 0 o que caracteriza o espalhamento Raman
Stokes. No espalhamento Raman anti-Stokes, a transição se dá entre o primeiro
estado excitado da molécula e um nível de energia mais alto, porém, ao emitir um
fóton para conservar a energia do sistema, a molécula volta ao estado fundamental e
um fônon é aniquilado, assim teremos ∆E m < 0 , ν v > ν 0 e teremos o espalhamento
Raman anti-Stokes.
2.6.2 Espectroscopia Raman da água
Para estudos de estrutura da água, a espectroscopia Raman é uma
técnica preferencialmente utilizada porque as proporções das intensidades dos
principais modos de estiramento OH são pensadas de modo a refletir uma rede de
ligações de hidrogênio "intermonômeros", bem como a sua perturbação pela presença
de alguns solutos [32,123]. Enquanto que na região do infravermelho, a absorção de
radiação ocorre quando há variação no momento dipolar; em Raman esta absorção
acontece quando há uma variação na polarizabilidade das moléculas, ou seja, se
houver indução de momento dipolar nestas moléculas [115].
52
A resolução da espectroscopia Raman é de ≈10-2s, por isso é uma
técnica capaz de detectar diretamente as vibrações das ligações de hidrogênio,
principais responsáveis pela estrutura intermolecular e propriedades de muitos
compostos. Quando há formação de uma ligação de hidrogênio podem ocorrer
pequenas variações na polarizabilidade das moléculas e estas variações podem ser
detectadas com auxilio de um laser e convertidas em um espectro vibracional [22]. Isso
possibilita a avaliação direta da estrutura da água, proteínas e lipídios
[124,125,126,119,120]; e é ideal para estudos da água supercrítica devido à sua
seletividade química e ao sinal Raman, intrinsecamente fraco para água [127].
Geralmente os perfis espectrais observados são amplos e sensíveis à
temperatura e pressão [128]. Como as ligações de hidrogênio podem, em princípio,
fazer da água um líquido único, com perfis espectrais particulares, o estudo do
espectro Raman da água prossegue independentemente dos estudos de espalhamento
da luz para líquidos moleculares mais simples [128]. Decomposições dos perfis
espectrais em gaussianas e lorentzianas têm sido utilizadas a fim de estimar o tempo
de vida das ligações de hidrogênio, bem como caracterizar o ambiente molecular local
na água líquida [128].
Conforme a intensidade de absorção das ligações covalentes, as
moléculas podem ter vibrações que envolvem combinações de estiramento simétrico
(ν1), estiramento assimétrico (ν3) e dobramento (ν2) (Figura 14). Por estes fatores a
água líquida a 25oC, por exemplo, possui os modos vibracionais: ν2 (em 1643,5cm-1);
uma combinação de ν2 e libração (em 2127,5cm-1); e ν1, ν3, harmônico e ν2 (em
3404,0cm-1) (Quadro 1) [23]. Os Quadros 1 e 2 a seguir mostram as principais vibrações
para a água líquida e gasosa [23].
53
Figura 14 – Tipos de vibração: estiramento simétrico (ν
ν1),
estiramento assimétrico (ν
ν3) e dobramento (ν
ν2) e librações nos
eixos x, y e z [23].
-1
Quadro 1 - Freqüências vibracionais (em cm ) para três modos da
molécula de água líquida.
Líquido H2O (25 °C)
Vibração(es)
v, cm
-1
ν2
1643,5
Combinação de ν2 + libração
2127,5
ν 1, ν 3, harmônico de ν 2
3404,0
Fonte: Adaptado de Chaplin [23].
-1
Quadro 2 – Freqüências vibracionais (em cm ) para três modos normais de diferentes isótopos da
molécula de água gasosa.
Gás
-1
ν 1, cm
-1
ν 2, cm
-1
ν 3, cm
H2O
16
3657,05
1594,75
3755,93
H2O
17
3653,15
1591,32
3748,32
H2O
18
3649,69
1588,26
3741,57
HD O
2723,68
1403,48
3707,47
16
D2 O
2669,40
1178,38
2787,92
16
Fonte: Adaptado de Chaplin [23].
54
Em suma, o espalhamento Raman da água líquida consiste na banda de
vibração de estiramento (2800 a 3400cm-1), a banda de dobramento ν2, próximo a
1645cm-1, a combinação das bandas de libração e dobramento (νL+ν2) próximo a
2100cm-1 e as bandas de flutuação intermolecular nas regiões de baixa freqüência, que
ocorrem devido a interações entre moléculas de água através de ligações de
hidrogênio [32]. Em regiões de baixa freqüência do espectro Raman da água, existem
bandas de flutuação intermolecular devido às interações entre as moléculas de água
através das ligações de hidrogênio. As bandas de libração ou rotacional restrita da
água ocorrem na região de 200-1100cm-1. Os movimentos translacionais limitados da
água envolvidos nas interações com as ligações de hidrogênio são equivalentes ao
dobramento e movimentos de estiramento do O-H... H [32].
A interpretação do espectro Raman e IR da água líquida têm sido objeto
de considerável discussão; seu espectro vibracional tem sido atribuído a efeitos
combinados das ligações de hidrogênio e acoplamentos intermoleculares dos modos
vibracionais em moléculas vizinhas, conhecido como troca de energia de ressonância
[129].
A molécula de água tem um momento de inércia muito pequeno. Isso
dá origem a uma rica combinação de espectros vibracionais-rotacionais gerando
milhares de linhas de absorção [23]. No líquido, as rotações tendem a ser limitadas por
ligações de hidrogênio, gerando librações [23]. Além disso, linhas espectrais causam a
sobreposição de muitos dos picos de absorção [23].
Diferenças nos tipos de aglomerados refletem em picos característicos,
cujas decomposições dos espectros em gaussianas e componentes de Lorentz,
permitem conclusões a respeito das ligações de hidrogênio e o ambiente molecular
local na água líquida [128]. Mudanças de freqüência da luz espalhada podem ser
analisadas e apresentadas como espectros. Por sua vez, as bandas espectrais
representam vibrações características das ligações químicas das moléculas da amostra
analisada [83].
As propriedades da água líquida pura são determinadas pela natureza
de sua rede de ligações de hidrogênio [130]. O tempo de relaxação da água pura (2,6
55
ps) também é atribuído ao rearranjo da ligação de hidrogênio associada através de sua
reorientação [130]. Em soluções aquosas de sal a estrutura da água é modificada nas
proximidades dos íons: oxigênio-água preferencialmente solubiliza os cátions e
hidroxila-água solubiliza os ânions [130]. Conseqüentemente, as interações íon-dipolo
influenciam a estrutura e a dinâmica da água nas proximidades de íons [130].
Assim, de um modo geral, a espectroscopia Raman fornece um método
eficiente de investigação da água, já que os modos locais OH e OD estendem
praticamente dissociados de outros modos [33]. A forma da banda Raman de
estiramento OH no intervalo 2900-3700 cm-1 reflete bem a dinâmica da microestrutura
da água, bem como suas interações com solutos, polímeros ou moléculas biológicas
[123]. Geralmente, o modo em 3200 cm-1 é visto como relacionado às ligações fortes
de hidrogênio nas moléculas da água e o modo em 3400 cm-1 como ligações mais livres
[123].
2.7
SIMULAÇÕES COMPUTACIONAIS
2.7.1 Noções gerais e aplicação.
Quando resultados analíticos são difíceis de interpretar e em situações
em que os experimentos não são viáveis, podem ser utilizadas simulações
computacionais. Estas consistem em aproximações e modelos envolvendo dois
aspectos, o da mecânica quântica e o da mecânica clássica [131]. Para se determinar a
energia de potencial, uma aproximação bastante utilizada é a aproximação de BornOpenheimer, pois permite o tratamento eletrônico do problema independentemente
do nuclear [12,131]. Os graus de liberdade eletrônicos são resolvidos pela mecânica
quântica, porém, os movimentos nucleares, em geral, podem ser descritos pela
mecânica clássica. Os métodos Monte Carlo (MC) e a dinâmica molecular (DM)
descrevem as simulações classicamente e, tradicionalmente, utilizam potenciais
56
empíricos para a descrição da interação entre as partículas. Geralmente, esses
potenciais são funções das coordenadas intermoleculares que podem incluir termos de
interação entre pares, três corpos e de ordens superiores, considerando a natureza das
interações e ligações nos sistemas, sendo analisados por determinados parâmetros.
[12]. Tais potenciais, entretanto, são construídos para descrever com precisão
sistemas próximos a determinadas configurações e essa descrição pode não ser tão
boa em sistemas com outras configurações [12,131]. Assim, há um grande interesse
em associar técnicas de MC ou DM com métodos que descrevam a estrutura eletrônica
com precisão, os chamados métodos de primeiros princípios (ab initio) [12].
Nos métodos ab initio, os orbitais moleculares são aproximados por
uma combinação de orbitais atômicos. Estes são definidos para certos ajustes de base,
normalmente funções gaussianas [131]. Os coeficientes que descrevem essa
combinação linear são calculados pelo princípio variacional, isto é, através da
minimização da energia eletrônica de um sistema para um dado ajuste de orbitais
escolhidos [131].
Em casos nos quais se deseja acompanhar a dinâmica do sistema, a
técnica de DM é claramente justificável [12]. Se por outro lado, o objetivo é obter
valores médios ou configurações finais, o método de MC passa a ser uma alternativa
viável [12]. O método de MC não exige o cálculo de forças, ao contrário do método de
DM e é facilmente formulado para descrever situações nas quais o sistema de
interesse encontra-se a temperatura ou pressão constante [12].
Outro método é a Teoria do Funcional da Densidade (DFT) [132,133],
que permite que sistemas complexos, com centenas de átomos sejam estudados com
uma precisão significativa e, atualmente, é um dos mais utilizados para a descrição da
estrutura eletrônica da matéria. A DFT pode ser formada como uma variante de
métodos ab initio, onde os funcionais de troca/correlação são usados para representar
a energia de correlação eletrônica [131]. Os métodos DFT são baseados no uso do
funcional de densidade eletrônica como um descritor básico do sistema eletrônico
[131]. Em geral esse método oferece uma boa combinação de acurácia e
requerimentos computacionais, especialmente para grandes sistemas [131].
57
Nos últimos anos houve um grande avanço nas simulações de primeiros
princípios para a água líquida, utilizando a técnica de Dinâmica Molecular em conjunto
com DFT [134,135,136]. Por outro lado, alguns trabalhos recentes [137,138]
questionaram tais resultados, argumentando que as simulações não tinham sido
longas o suficiente para a obtenção de médias convergidas.
Assim, ainda existem alguns aspectos relacionados à descrição ab initio
que devem ser melhor investigados, como a qualidade da aproximação utilizada para o
funcional da energia de troca e correlação na DFT e sua influência nos resultados.
Outro aspecto diz respeito a não inclusão dos efeitos quânticos no tratamento de
dinâmica molecular; embora simulações considerando tais efeitos ainda sejam
inviáveis computacionalmente e a influência quantitativa dessa inclusão nas
simulações ab initio permaneça indeterminada [139].
Dos potenciais empíricos para a água nas simulações clássicas, nenhum
ainda é capaz de fornecer de forma acurada propriedades dinâmicas, estruturais e
termodinâmicas para a água líquida em toda a faixa de extensão de pressão e
temperatura [139]. Além de não apresentar flexibilidade e transferabilidade suficiente
na descrição de problemas em que sistemas com íons e outras moléculas interagem
com a água [139]. Assim, os cálculos de primeiros princípios são de extrema
importância, pois podem ser usados em princípio para qualquer sistema. Sendo o
hidrogênio um átomo muito leve, tratá-lo classicamente pode não ser adequado. Por
outro lado, o tratamento de todos os graus de liberdade quanticamente ainda é
inviável na maioria dos casos, devido ao tempo computacional elevado [139].
Desse modo, apesar da construção de centenas de campos de forçamodelo para uso em simulações e de grandes avanços na tecnologia computacional,
bem como do desenvolvimento de poderosos métodos ab initio de dinâmica
molecular, permanecemos incapazes de calcular com precisão as propriedades da água
líquida
(como
a
capacidade de
calor, densidade,
constante dielétrica e
compressibilidade, por exemplo) sobre escalas significativas [140]. Os potenciais
utilizados em simulações são ajustados para descrever com precisão o sistema
próximo a certas configurações e não há nenhuma garantia de que a descrição será
58
igualmente apropriada em situações distintas dessas [12]. Ainda não há uma descrição
molecular satisfatória de como um próton se move no líquido, não entendemos
completamente a natureza molecular das superfícies de qualquer água no estado
sólido ou líquido [141], nem a origem das intrigantes anomalias e singularidades
encontradas na região de supercongelamento [142]. Embora seja claro que a rede de
ligação de hidrogênio, suas flutuações e a sua reorganização determinam as
propriedades do líquido, os estudos experimentais investigam a dinâmica da ligação de
hidrogênio indiretamente e podem ser interpretados apenas em formas qualitativas
[49]. Mais do que isso, a confiabilidade dos modelos da água para fenômenos de
solvatação e processos biológicos permanece relativamente não- testada [34].
No caso da água, uma descrição acurada de sua estrutura molecular
líquida pode ser obtida por meio de experimentos de espalhamento, como a
espectroscopia Raman [143]. Simulações computacionais das contribuições relevantes
da água no Espectro Raman têm sido relatadas recentemente e comparadas aos
valores dos dados experimentais [128]. Em suma, diversos aglomerados de água
podem ser calculados pelo uso de métodos de simulação computacional. Tais
aglomerados, (H2O)n, com n=1, 2, 3,..., são objetos de numerosos estudos moleculares
e utilizam diferentes simulações [24,35,30,45,47,33].
Neste trabalho foram utilizados cálculos vibracionais utilizando matrizes
hessianas pré-calculadas e o método DFT. A função de onda foi otimizada (single point
calculation) e foram feitas as análises vibracionais, com respostas em Raman. O intuito
foi obter os modos vibracionais da água confinada em colágeno.
2.7.2 Teoria [144]
2.7.2.1 Equação molecular de Schrödinger e aproximação de Born-Oppenheimer.
Quando estamos interessados em descrever detalhadamente a
distribuição eletrônica de um sistema atômico ou molecular qualquer, recorremos à
mecânica quântica. Em um tratamento mecânico-quântico de sistemas microscópicos,
59
o que precisamos basicamente é resolver a equação de Schrödinger para estados
estacionários:
Hˆ ψ = Eψ
(2.7.1)
Onde Ĥ é o operador Hamiltoniano para o sistema molecular com
energia total E e ψ é a função de onda molecular. A solução desta equação fornece as
informações necessárias para o estudo das propriedades microscópicas de sistemas de
moléculas. Porém, para sistemas multi-eletrônicos a resolução desta equação é uma
tarefa difícil de ser executada. Por isso, há a necessidade do uso de aproximações que
tornem viável a resolução da equação 2.7.1.
Daquelas utilizadas na resolução da equação de Schrödinger para
sistemas moleculares, a mais comum é a aproximação de Born-Oppenheimer [145]. A
inspiração para a aproximação de Born-Oppenheimer vem do fato de que os espectros
eletrônico e nuclear de um sistema molecular geralmente são distintos. Devido a essa
distinção espectroscópica, muitas vezes traduzida como diferenças entre as massas
dos elétrons e dos núcleos, podemos fazer a separação de Born-Oppenheimer que
consiste no tratamento em separado dos movimentos eletrônico e nuclear. Assim,
podemos reescrever a equação 2.7.1 de maneira mais específica, em função das
coordenadas dos núcleos e elétrons do sistema, assim:
Η (r , R )ψ (r , R ) = ε (r , R )ψ (r , R )
(2.7.2)
Nesta equação, tanto o operador Η quanto a função de onda ψ
dependem das coordenadas de todos os núcleos ( R ) e de todos os elétrons (r )
presentes no sistema. Na prática, para de fato resolvermos a equação 2.7.2 para um
sistema multi-eletrônico qualquer, precisamos reescrever esta equação de modo a
deixar explícitos os termos de Η ( r , R ) e ψ ( r , R ) . Para o Hamiltoniano, desprezamos
todos os termos relativísticos, devido às pequenas massas dos núcleos, e assim temos:
Η (r , R ) =
∑
A
TA +
Z AZ Be2
+
RAB
A< B
∑
∑
i
Ti +
∑
i< j
e2
−
rij
∑∑
i
A
Z Ae 2
riA
(2.7.3)
Os termos de Η ( r , R ) , na ordem em que aparecem na equação 2.7.3,
são a energia cinética dos núcleos, a repulsão eletrostática referente aos núcleos, a
60
energia cinética dos elétrons, a repulsão eletrônica e a energia de atração elétronnúcleo. Ou ainda, de forma mais simplificada:
Hψ (r , R) = −
h2
(TN + Te ) + V
2m
(2.7.4)
onde os termos Te,TN e V são, respctivamente, a energia cinética eletrônica, energia
cinética dos núcleos e energia potencial.
Visando a resolução da equação 2.7.2, aproximamos ψ ( r , R ) por um
produto tal que um dos fatores tenha uma dependência paramétrica das coordenadas
nucleares, ou seja,
ψ (r , R ) = Ψ (r ; R )φ ( R)
(2.7.5)
onde ψ depende parametricamente das coordenadas dos núcleos, R , e representa a
função de onda eletrônica do sistema, e φ representa a função de onda nuclear.
Substituindo 2.7.5 em 2.7.4 e resolvendo a equação, temos:
 h2

Hψ ( r , R ) =  −
(TN + Te ) + V  Ψ ( r ; R )φ ( R )
 2m

[
]
Hψ (r , R ) = −
h2
TN ( Ψ( r ; R )φ ( R ) ) + Te (Ψ( r ; R )φ( R ) ) + V ( Ψ( r ;R )φ ( R ) )
2m
Hψ ( r , R ) = −
h2  ∂ ∂

⋅
(Ψ( r ; R )φ ( R ) ) + Te (Ψ( r ; R )φ ( R ) ) + V ( Ψ( r ; R )φ ( R ) )
2m  ∂R ∂R

Hψ ( r , R ) = −


h2  ∂ 
∂
 ∂

φ ( R ) +  Ψ( r ;R ) φ ( R )  + Te ( Ψ( r ; R )φ ( R ) )  + V ( Ψ( r ;R )φ ( R ) )
  Ψ( r ; R )
2m  ∂R 
∂R
 ∂R



Hψ (r , R) = −

 ∂2

h 2 
∂2
∂Ψ ∂
∂
∂φ 


φ
+
φ
+
Ψ
φ
+
Ψ
+
T
(
Ψ
φ
)
 Ψ
e
( r ; R ) ( R )  + V ( Ψ( r ; R )φ ( R ) )
 ∂R 2

2m 
∂R ∂R
∂R ∂R 
∂R 2



Hψ ( r , R ) = −
h2
Ψ( r ;R )TN φ( R ) + φ( R )Te Ψ( r ;R ) + V Ψ( r ;R ) + φ ( R ) + W
2m
[
]
(2.7.6)
Onde,
 ∂Ψ ∂
 ∂2
  h 2
W = 2
φ +  2 Ψ φ  −
 ∂R ∂R
 ∂R
  2mi




(2.7.7)
61
Entretanto, conforme Atkins e Friedman [146], como mi é a massa dos
núcleos e esta ocorre no denominador, podemos supor que W é pequeno a ponto de
ser considerado desprezível. Assim:
Η el ( r , R ) Ψel ( r , R )
=
Η n ( R )φ n ( R )
E el ( r , R ) Ψ el ( r ; R )
=
(2.7.8)
Eφ n ( R )
Onde,
Η el (r , R) =
∑
Ti +
Η n (r , R) =
∑T
∑ ∑
i< j
i
A
e2
rij
TA −
∑∑
A
i
A
Z Ae 2
Z AZ Be2
+
riA
RAB
A< B
∑
(2.7.9)
+ E el ( R)
A
Esta separação do hamiltoniano em duas partes distintas, uma
eletrônica e outra nuclear, é conhecida como aproximação de Born-Oppenheimer
[145]. A possibilidade de separação dos movimentos eletrônico e nuclear se deve ao
fato de que os elétrons têm menor inércia e podem ajustar seus movimentos quase
que instantaneamente, a qualquer rearranjo das posições dos núcleos.
Tomando a função de onda eletrônica Ψel ( r ; R ) , e sabendo que esta é
dependente das coordenadas de todos os elétrons, se for possível obtermos um
conjunto completo ortonormal de funções de onda de muitos elétrons Ψi , podemos
expandir Ψel ( r ; R ) em termos deste conjunto. Deste modo,
Ψel (r ; R ) =
∑Ψ c ,
i i
Ψi Ψ j = δ ij
(2.7.10)
i
Pelo princípio de exclusão de Pauli [80], Ψel ( r ; R ) é antissimétrica com
respeito a qualquer troca de coordenadas dos elétrons, isto é,
Ψel ( r1 , r2 ,K , ri ,K , rk ,K ; R ) = − Ψel ( r1 , r2 ,K , ri ,K , rk ,K ; R )
(2.7.11)
Desta forma, para um sistema molecular de camada fechada, um
conjunto de funções multi-eletrônicas conveniente é um conjunto de determinantes
de Slater.
Estes determinantes são formados por um conjunto de spins-orbitais
ϕ i ( j ; R ) e podem ser expressos por
62
Ψel (1, 2, K , N ; R ) =
ϕ a (1; R )
ϕ a (2 ; R)
1
N!
ϕ b (1; R ) L ϕ n (1; R )
ϕ b (2 ; R ) L ϕ n (2 ; R )
M
M
O
M
(2.7.12),
ϕ a ( N ; R) ϕ b ( N ; R) L ϕ n ( N ; R)
onde N é o número de elétrons do sistema e ϕ i ( j ; R ) é o spin orbital do elétron j .
2.6.2.2 Teoria do Funcional da Densidade
Nos anos 60 Hohenberg, Kohn e Sham
[132,133] propuseram a
estrutura teórica que conhecemos hoje como Teoria do Funcional da Densidade (DFT).
A DFT considera o sistema eletrônico como um todo e possui a idéia
básica de que a energia de um sistema eletrônico pode ser escrita em termos da
densidade de probabilidade eletrônica, ρ [132,133]. Para um sistema com n elétrons,
ρ (r ) denota a densidade eletrônica total a uma distância r . A energia E é um
funcional da densidade eletrônica, denotada por E [ ρ ] , onde para uma dada função
ρ (r ) existe um único valor de energia E [ ρ ] correspondente. Se E [ ρ ] é conhecido,
podemos trocar o problema de determinar a energia e a densidade eletrônica do
estado fundamental em um dado potencial externo pela minimização do funcional
E [ ρ ] da função densidade tridimensional E [ ρ ] .
Computacionalmente, para aplicação desta teoria, é conveniente
representar a função densidade eletrônica em termos dos orbitais ocupados, ψ i ,
ρ ( r ) = ∑ ψ i (r )
2
(2.7.13)
i
e, deste modo fazer a minimização do funcional de energia E [ ρ ] em termos destes
orbitais. Esta aproximação resulta nas equações de Kohn-Sham de uma partícula [100],
hˆKSψ i = εψ i
(2.7.14)
que são semelhantes às equações de Hartree-Fock. Kohn e Sham propuseram o uso de
um sistema não-interagente auxiliar, sistema Kohn-Sham, para avaliar a densidade de
um sistema interagente. ĥKS é o operador de Kohn-Sham, composto de termos para
63
descrever as interações do sistema tratado, o que nos possibilita escrever a energia
como:
E [ ρ ] = T [ ρ ] + V [ ρ ] + C [ ρ ] + XC [ ρ ]
(2.7.15)
onde T [ ρ ] é a energia cinética e V [ ρ ] é o potencial de atração dos núcleos. A energia
elétron-elétron é descrita por dois termos: A repulsão Coulombiana clássica, C [ ρ ] , e a
energia de troca e correlação XC [ ρ ] onde estão inclusos todos os efeitos quânticos de
muitos corpos. A densidade eletrônica para o estado fundamental é obtida pela
minimização da energia e a decomposição da energia feita desta forma é formalmente
exata. Porém, as expressões para as interações de troca e correlação de muitos corpos
são desconhecidas e sua acurácia depende do funcional empregado na sua
determinação. Assim, é preciso fazer aproximações para se obter o termo XC [ ρ (r )]
Dependendo do problema a ser tratado, a aproximação utilizada poderá
fornecer uma acurácia maior para o termo XC [ ρ (r )] e conseqüentemente para o
cálculo da propriedade de interesse. A primeira aproximação para o termo XC [ ρ (r )] é
a aproximação LDA-Local Density Aproximation.
Nesta aproximação a densidade é tratada localmente como a densidade
de um gás de elétrons uniforme e ρ (r ) varia suavemente nas proximidades de r . Se a
densidade eletrônica ρ (r ) for altamente não-uniforme, então a aproximação LDA não
é uma boa opção. Esta aproximação foi então refinada em termos do gradiente da
densidade de carga total, conhecida como expansão generalizada em termos de
gradientes GGA-Generalized Gradient Aproximation. Dentre as expansões mais
utilizadas de GGA, neste trabalho será utilizada a aproximação BLYP [147,148].
64
3
METODOLOGIA
3.1
AMOSTRAS
Escolhemos como objeto de estudo amostras de tecidos provenientes
de mucosa bucal normal (MN – 6 pacientes) e com hiperplasia fibrosa inflamatória (HFI
– 6 pacientes). As amostras foram obtidas a partir de biopsias realizadas no
Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal - UNESP / BRASIL. Elas foram
identificadas e imediatamente congeladas e armazenadas em nitrogênio líquido (77K)
em frascos criogênicos antes da gravação técnica dos espectros FT-Raman.
3.2
ESPECTROSCOPIA VIBRACIONAL
Os espectros Raman foram medidos em 5 pontos diferentes (A1-A5), e
foram feitos em seis amostras de NM e seis amostras de HFI. Eles resultaram em 30
espectros de hiperplasia fibrosa inflamatória e 30 espectros de mucosa normal. Logo
após o procedimento, todas as amostras foram fixadas em formol a 10% para análise
histopatológica posterior. Foi usado um espectrômetro Bruker RFS 100/S FT-Raman, da
Universidade Vale do Paraíba, tendo como fonte de luz um laser Nd:YAG, em 1.064
nm. A potência do laser na amostra foi mantida a 230 mW e a resolução do
espectrômetro foi de 4 cm-1. Cada espectro foi gravado com 300 varreduras. Para a
coleta de dados FT-Raman, todas as amostras foram levadas à temperatura ambiente e
mantidas umedecidas em solução fisiológica 0,9%, para preservar as suas
características estruturais e um suporte de alumínio foi colocado nas janelas para a
coleta de espectros Raman. As substâncias químicas presentes na solução fisiológica
(Ca2+, Na+, K+, Cl- e água) não têm sinais mensuráveis em Raman e sua presença não
afeta o sinal espectral dos tecidos.
65
3.3
SIMULAÇÕES DE CÁLCULOS VIBRACIONAIS
Dentro das células, a água se comporta de forma diferente da água bulk
[13]. A viscosidade da água intracelular, por exemplo, é maior e sua capacidade de
propagação é menor, como observados por Ressonância Magnética Nuclear [149].
Como as moléculas de água ocupam sítios específicos e formam aglomerados
localizados com as estruturas que são determinadas pelas suas capacidades de ligação
de hidrogênio [13,149] elas são capazes de influenciar a grande maioria das
propriedades físicas e químicas dos tecidos. Assim, a água pode se auto-estruturar de
forma diferente, em tecidos normais e inflamatórios. Cada um desses agrupamentos
possui um espectro Raman característico [33].
Como o trabalho teve por objetivo avaliar o tipo de organização
estrutural da água confinada em tecidos biológicos e sondar se a mesma era capaz de
estruturar-se de modo diferenciado em tecidos sadios e patológicos, realizamos um
conjunto de simulações de cálculos vibracionais para várias estruturas de água (Figura
15), (H2O)n, sendo n = 1–8: (H2O), (H2O)2, (H2O)3, (H2O)4, (H2O)5-cíclico, (H2O)6-gaiola,
(H2O)7-baixo, (H2O)8-S4, usando o modelo TIP4P. O modelo TIP4P [150] é largamente
implementado em pacotes de programas de química computacional e frequentemente
utilizado na simulação de sistemas biomoleculares.
Figura 15 – Aglomerados das moléculas de água utilizadas na simulação: (a) (H2O), (b) (H2O)2, (c)
(H2O)3, (d) (H2O)4, (e) (H2O)5-cíclico, (f) (H2O)6-gaiola, (g) (H2O)7-baixo, (h) (H2O)8-S4. Tais estruturas
foram confinadas em colágeno. Adaptado de [33].
66
Como o colágeno é uma proteína de importância fundamental na
constituição da matriz extracelular e encontra-se amplamente presente em nosso
corpo, cada aglomerado de moléculas de água foi confinado em um recorte de um
trecho do colágeno hidratado proveniente do Banco de Dados de Proteínas (Protein
Data Bank) [151] (Figura 16).
Figura 16 – Estrutura do colágeno hidratado (perspectiva).
As moléculas de água do colágeno hidratado (Figura 16) foram
removidas, porém, como se pode perceber (Figuras 17, 18, 19 e 20), a estrutura do
colágeno é extremamente grande para a simulação.
67
Figura 17 – Estrutura do colágeno sem hidratação (perspectiva).
Figura 18 – Estrutura do colágeno sem hidratação (vista longitudinal).
Figura 19 – Estrutura do colágeno sem hidratação (vista transversal interna).
68
Figura 20 – Estrutura
rutura do colágeno sem hidratação (vista transversal).
Assim, fizemos um recorte na molécula de colágeno, na região ilustrada
na Figura 21,, de modo a prosseguir apenas com uma pequena parte do colágeno.
Figura 21 – Área de recorte do colágeno para utilização na simulação.
69
Nessa região fizemos os recortes necessários para obter o menor espaço
possível para confinamento dos aglomerados de água, resultando na Figura 22. Foi
utilizada uma pequena parte de apenas duas hélices de colágeno (Figura 22), uma com
três estruturas cíclicas e outra com duas, para que o cálculo pudesse ser simulado.
ESTRUTURA
CÍCLICA
Figura 22 – Recorte de colágeno utilizado na simulação. A figura corresponde a um pequeno trecho
de duas hélices do colágeno: uma com três estruturas cíclicas e a outra com duas.
Esse recorte, com 100 átomos, foi mantido fixo e cada aglomerado de
água foi então, um a um, confinado nesta região, próximo ao centro, como mostra a
Figura 23.
70
AGLOMERADO
ATÔMICO DE ÁGUA
CONFINADO
Figura 23 – Aglomerado de moléculas de água confinado em colágeno.
Os confinamentos foram denominados conforme abaixo:
Coll_0
Colágeno SEM água confinada
Coll_1
Colágeno com uma molécula de água confinada, (H2O)
Coll_2
Colágeno com duas moléculas de água confinada, (H2O)2
Coll_3
Colágeno com três moléculas de água confinada, (H2O)3
Coll_4
Colágeno com quatro moléculas de água confinada, (H2O)4
Coll_5
Colágeno com cinco moléculas de água confinada, (H2O)5-cíclico
Coll_6
Colágeno com seis moléculas de água confinada, (H2O)6-gaiola
Coll_7
Colágeno com sete moléculas de água confinada, (H2O)7-baixo
Coll_8
Colágeno com oito moléculas de água confinada, (H2O)8-S4
71
As simulações necessárias para a interpretação dos dados de
espectroscopia foram realizadas em colaboração com Prof. Dr. Mauricio Coutinho da
UFABC. Foram usados os métodos da DFT [132,133] e BLYP [147], com auxílio do
software CPMD [152]. Embora o conjunto (colágeno+água) não seja uma estrutura
cristalina, ele foi aproximado para os parâmetros cristalográficos a=13,5Å, b=11,5Å e
c=10,5Å, considerando simetria ortorrômbica.
Primeiro,
foram
calculadas
as
estruturas
eletrônicas
(estado
fundamental) do sistema como ponto de partida para os outros cálculos. Isso foi feito
através das otimizações das funções de onda (single point calculation) para cada
confinamento (coll_0 a coll_8), utilizando o hessiano (vibrational analysis IN Gauss).
Depois, foram feitas as análises vibracionais, com respostas em Raman. Por fim, foram
calculadas as respostas lineares (linear response) dos sistemas para se obter os valores
da polarização e dos tensores polares de cada átomo do sistema. Estes últimos dados
foram utilizados para verificar a vibração dos átomos em cada deslocamento Raman
equivalente ao experimental.
Em cálculos que utilizam ondas planas com funções de base, como os
realizados pelo programa CPMD [152], além da simetria e dos parâmetros de célula, o
sistema é caracterizado pelo parâmetro de corte (cutoff). Neste caso, o parâmetro de
corte é o valor mínimo de energia de modo que valores maiores que ele são ignorados.
Por isso, foram testados vários parâmetros de corte para a simulação de uma única
molécula de água isolada (Gráfico 1). Com base nestes resultados adotou-se 60Ry,
como padrão para o parâmetro de corte em todas as simulações.
72
Gráfico 1 – Relação entre energia total e corte para uma única molécula de água isolada.
Energia Total versus Corte
-15.0
ENERGIA TOTAL
(Eh)
-15.5
-16.0
-16.5
-17.0
-17.5
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CORTE (Cutoff)
(Ry)
Nota: O programa CPMD adota como padrão as unidades para corte do plano de onda,
Ry (1 Ry = 1/2 Eh = 13.60569193eV) e para energia, Eh (1 Eh = 27.21138386eV =
627.5094706kcal/mol = 2625.4996251kJ/mol).
Dessas simulações, obtiveram-se os modos vibracionais de cada
confinamento, os quais foram comparados aos valores experimentais dos picos de MN
e HFI. Assumiu-se uma variância de 4cm-1, de modo que os valores dos modos
vibracionais, obtidos pela simulação, maiores até 2cm-1 ou menores até 2cm-1 que os
deslocamentos Raman experimentais foram considerados equivalentes. Estes
resultados foram tabelados e descritos no item 4.2.
73
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1
CARACTERIZAÇÃO DE ÁGUA
ÁG
CONFINADA EM TECIDOS
DOS BIOLÓGICOS POR
ESPECTROSCOPIA RAMAN
Foram obtidos 60 espectros
es
(30 de MN e 30 de HFI) e foi analisada a
região espectral entree 2800 e 3600 cm-1, região típica de picos da água. Com o auxílio
do software Fityk [153], cada
ada espectro foi deconvoluído em 7 picos, conforme a forma
da linha (gaussiana ou lorentziana),
lorentziana resultando nas bandas em: 2854, 2885, 2934,
2
2991, 3071, 3220 e 3362 cm-1 para o tecido normal; e 2843, 2887, 2937, 2977, 3060,
3221 e 3387 cm-1 para o tecido inflamatório. Esse processo pode ser visualizado nos
Gráficos 2 e 3. Os números de 1 a 7 indicados nesses
ness gráficos representam os picos 1,
1
2, 3, 4, 5, 6 e 7.
Gráfico 2 – Exemplo de deconvolução
econvolução da região espectral de
d uma das amostras de MN em 7 picos.
74
Gráfico 3 – Exemplo de deconvolução
onvolução da região espectral de uma das amostras de HFI em 7 picos.
Uma vez que tanto a média como o desvio padrão podem não ser
medidas adequadas para representar um conjunto de valores, já que são afetados, de
forma exagerada, por valores extremos,
extremos foram construídos Box-plots
plots [154] de MN e
HFI (Gráfico 4). As linhas pretas correspondem à mediana do
o espectro e as regiões
coloridas são aquelas entre o primeiro e terceiro quartil.
É possível perceber que há uma diferença visual importante entre os
gráficos de MN e de HFI (Gráfico 4).
4 Há uma variância maior entre as amostras de MN
e existem diferenças tanto na
n posição dos picos, como por exemplo, o pico 7, com
modo vibracional em 3362cm-1 em MN e 3387cm-1 em HFI; quanto naa forma da curva,
como é o caso dos picos 1 a 3, que apresentam curvas bem distintas em MN e em HFI;
e até mesmo naa intensidade, sendo o pico 1 mais intenso em MN do que em HFI e o
pico 4, mais intenso em do que em MN, embora alterações na intensidade
nsidade dos picos
não tenha sido objeto de análise neste trabalho.
75
Gráfico 4 – Box-plots das amostras de MN e HFI. As setas com números de 1 a 7 indicam a posição dos
picos (pico 1 a pico 7).
76
Identificando os picos dos espectros obtidos em relação aos modos
vibracionais e os componentes estruturais a eles associados, observou-se que as
bandas Raman predominantes são de CH, CH2 e CH3 (2800-3100cm-1) e NH e OH (3100
- 3600 cm-1), bandas de estiramento de lipídios, proteínas e água, respectivamente
[155,33]. Os resultados podem mostrar como as macromoléculas interagem entre si
e/ou com moléculas de água, e como sua estrutura molecular é alterada quando
ocorre um processo inflamatório.
Realizando-se os testes estatísticos t-Student e o teste ANOVA [154] no
Microsoft Excel (Tabela 1), assumindo variâncias iguais entre as amostras NM e HFI, ao
nível de 0,05, observou-se que os picos 2 e 6 não apresentaram diferença estatística
significativa entre MN e HFI. Já para os picos 1, 3, 4, 5 e 7, as amostras de MN e HFI são
diferentes ao nível de 0,05 e, portanto, representam picos característicos de
diagnóstico.
Tabela 1 – Resultados dos testes estatísticos.
Testes/Picos
1
2
3
4
5
6
7
t-student P(T<=t)
<0.05
0.055
<0.05
<0.05
<0.05
0.372
<0.05
ANOVA p-value
<0.05
0.109
<0.05
<0.05
<0.05
0.744
<0.05
A fim de avaliar se alguns desses contribuiriam para a discriminação
entre MN e HFI, foram verificados quais deles seriam mais relevantes. Em especial,
observou-se que o pico 7 apresenta bandas bem evidentes, em modos vibracionais
bem diferentes em MN e em HFI, em 3362cm-1 e 3387cm-1, respectivamente. Assim,
utilizou-se o pico 7 como padrão para a construção dos gráficos das áreas dos picos 7
em função das áreas dos outros picos característicos de diagnóstico (Gráficos 5 a 8).
A área com maior concentração de amostras de HFI foi demarcada com
a finalidade de se calcular a sensibilidade e a especificidade. A primeira diz respeito a
77
identificar corretamente os que possuem a doença, enquanto a segunda consiste em
excluir corretamente aqueles que não a possuem. Assim:
sensibilidade =
VP
VP + FN
especificidade =
e
VN
VN + FP
(4.1.1)
VP (verdadeiro positivo) e FP (falso positivo) encontram-se no grupo dos
indivíduos com a doença (positivo), no entanto, o verdadeiro realmente pertence a
este grupo (possui a doença), enquanto o falso não possui a doença. Já VN (verdadeiro
negativo) e FN (falso negativo) encontram-se no grupo sem a doença (negativo), mas o
verdadeiro realmente pertence a esse grupo (não possui a doença), enquanto o falso
possui a doença.
Gráfico 5 – Área dos picos 7 versus área dos picos 1, para MN e HFI.
Area 7 versus Area 1
MN
HFI
5
4
A7
3
2
1
0
-0.2
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
A1
78
Gráfico 6 – Área dos picos 7 versus área dos picos 3, para MN e HFI.
Area 7 versus Area 3
5
MN
HFI
4
A7
3
2
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
A3
Gráfico 7 – Área dos picos 7 versus área dos picos 4, para MN e HFI.
Area 7 versus Area 4
MN
HFI
6
A7
4
2
0
0.0
0.4
0.8
1.2
A4
79
Gráfico 8 – Área dos picos 7 versus área dos picos 5, para MN e HFI.
Area 7 versus Area 5
5
MN
HFI
4
A7
3
2
1
0
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
A5
Em geral, HFI e MN encontram-se bem separados. Isso reforça o
resultado estatístico, comprovando claramente que HFI é muito diferente do tecido de
MN. É interessante notar que, no gráfico das áreas das bandas do pico 7 em função das
áreas das bandas do pico 3 (Gráfico 6), os resultados de HFI encontram-se bem
agrupados, enquanto os de MN são mais espalhados; e que, em relação aos picos 1, 4
e 5 (Gráficos 5, 7 e 8), há a concentração dos resultados de HFI em um dos eixos. A
sensibilidade e especificidade destes resultados podem ser conferidas na Tabela 2.
Tabela 2 – Resultados da sensibilidade e especificidade.
Gráfico
gráfico 5
gráfico 6
gráfico 7
gráfico 8
Referente ao
pico 7 versus pico1
pico 7 versus pico3
pico 7 versus pico4
pico 7 versus pico5
Sensibilidade
96,7%
96,7%
100,0%
96,7%
Especificidade
63,6%
93,3%
90,0%
93,3%
80
Visto que os picos das bandas 6 e 7 são bem largos, também plotou-se o
gráfico das áreas das bandas dos picos 6 e 7 em função das áreas das bandas dos picos
1 a 5 (Gráfico 9). Semelhante aos gráficos anteriores, HFI e MN separam-se de forma
que os resultados de HFI encontram-se mais agrupados e num eixo preferencial,
enquanto os resultados de MN são mais espalhados. Este resultado enfatiza a
importância dos picos, com sensibilidade de 100% e especificidade de 97,6%.
Gráfico 9 – Área dos picos 6-7 versus área dos picos 1-5, para MN e HFI.
Area 6-7 versus Area 1-5
MN
HFI
4.5
4.0
3.5
A6-7
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
A1-5
81
4.2
CARACTERIZAÇÃO DE ÁGUA
ÁG CONFINADA EM TECIDOS
DOS BIOLÓGICOS UTILIZANDO
SIMULAÇÕES
Para cada co
onfinamento construiu-se um gráfico dos mo
odos vibracionais
equivalentes aos resultado
os experimentais, assumindo a variância dee 4cm-1 (Gráficos
10 a 17). Os números de 1 a 7 indicados nesses
ness gráficos representam
sentam os picos 1, 2, 3, 4,
5, 6 e 7; a curva em preto representa a soma destes picos; e as curvas coloridas
representam cada modo vibracional equivalente ao experimental.
Gráfico 10 – Modos vibracionais de coll_0 equivalentes aos
aos resultados experimentais.
82
Gráfico 11 – Modos vibracionais de coll_2 equivalentes aos resultados experimentais.
Gráfico 12 – Modos vibracionais de coll_3 equivalentes aos resultados experimentais.
83
Gráfico 13– Modos vibracionais de coll_4 equivalentes aos resultados experimentais.
Gráfico 14– Modos vibracionais de coll_5 equivalentes aos resultados experimentais.
84
Gráfico 15 – Modos vibracionais de coll_6 equivalentes aos resultados experimentais.
Gráfico 16 – Modos vibracionais de coll_7 equivalentes aos resultados experimentais.
85
Gráfico 17 – Modos vibracionais de coll_8 equivalentes aos resultados experimentais.
O Quadro 3,, a seguir, mostra informações desses gráficos, comparando
os modos vibracionais em cada confinamento. Cada cor representa um pico
experimental.. Nas colunas (sentido vertical) estão representados
representados os picos de cada
colágeno (coll_0 a coll_8) e a região preenchida indica a presença de uma banda
equivalente ao experimental. Nas linhas (sentido horizontal) estão separados cada pico
de MN e cada pico de HFI. Assim, a região preenchida em roxo em coll_0,
l_0, por exemplo,
indica que o colágeno sem água possui uma banda equivalente ao pico 1 de HFI; a
região preenchida em verde
verd em coll_0 indica que colágeno sem água possui uma
banda equivalente ao pico 4 de MN; a região azul em coll_0 indica que o colágeno sem
água possui bandas equivalentes ao pico 5,
5 tanto em MN quanto em HFI; assim
sucessivamente para outras regiões de coll_0 e as regiões preenchidas de coll_2 a
coll_8. A “legenda” com os valores dos deslocamentos Raman experimentais de MN e
HFI pode ser vista na Tabela 3.
86
Quadro 3 – Comparação entre a presença/ausência de aglomerados de água para cada pico
experimental.
coll_0
coll_1
coll_2
coll_3
coll_4
coll_5
coll_6
coll_7
coll_8
MN - pico 1
HFI - pico 1
MN - pico 2
HFI - pico 2
MN - pico 3
HFI - pico 3
MN - pico 4
HFI - pico 4
MN - pico 5
HFI - pico 5
MN - pico 6
HFI - pico 6
MN - pico 7
HFI - pico 7
Nota: A região preenchida corresponde à presença de um aglomerado de água num determinado pico.
Cada banda dos picos está marcada com cores diferentes para facilitar a comparação.
Tabela 3 – Posição dos picos de MN e HFI. Cada
cor representa um pico
-1
MN (cm )
Referência
-1
HFI (cm )
*2854 pico 1
2843
2885 pico 2
2887
2934 pico 3
2937
2991 pico 4
2977
3071 pico 5
3060
3220 pico 6
3221
3362 pico 7
3387
OBS.: *Nenhuma freqüência dos resultados de
simulação corresponde ao obtido experimentalmente
Pelos resultados (Quadro 3), pode-se verificar que a presença da banda
de coll_8 é característica de HFI para o pico 1. De modo semelhante, a banda de coll_3
determina o quadro clínico de HFI para o pico 3; e coll_6 confirma a presença de um
87
tecido normal (MN) no mesmo pico. No caso do pico 4, coll_5 especifica o tecido com
HFI; e coll_0, coll_2 e coll_3 indicam MN. O pico 5 é o que apresenta o maior número
de bandas com água confinada, sendo coll_8 característico de HFI; e coll_2 a coll_6,
característicos de MN. O pico 7, no entanto, não apresenta bandas de colágeno com
água confinada em relação aos tipos de aglomerados simulados, mas possui coll_5 e
coll_6 como indicativos de MN. Por fim, embora os picos 2 e 6 não apresentem
diferença estatística significante ao nível de 0,05, é possível discriminar HFI pela
presença das bandas de coll_4 e coll_5, respectivamente.
Pela posição dos picos característicos de diagnóstico (Tabela 3) é
possível perceber que os picos 3 e 7 de HFI pertencem a regiões de freqüência mais
alta que os mesmos picos para MN; enquanto os picos 1, 4 e 5 de HFI pertencem a
regiões de menor freqüência que MN. Neste sentido (Quadro 3), os picos 1 e 5, que
possuem freqüência em MN mais alta que em HFI, referem-se a um maior número de
moléculas por aglomerado, no caso, (H2O)5-cíclico e (H2O)8-S4, respectivamente. Por
outro lado, os picos 3 e 7 de HFI referem-se a um menor número de moléculas por
aglomerado, no caso, (H2O)3 para o pico 3, considerando apenas as bandas
discriminantes de HFI, e o colágeno sem água no caso do pico 7.
A partir dessas simulações foram construídos os autovetores, a fim de
investigar a vibração das moléculas envolvidas em cada banda espectral. O objetivo foi
verificar quais eram os átomos envolvidos em cada banda espectral, de modo a
perceber quais deles contribuem, de fato, na obtenção daquele pico. Desse modo, com
auxílio do programa Molekel [156], pode-se visualizar a direção dos vetores dos
átomos vibrantes em cada uma dessas bandas, como os exemplos das Figuras 23 e 24,
e verificar a presença/ausência de vibrações.
88
-1
Figura 24 – Vibração de coll_3 (em 3073cm ) em um determinado momento. As linhas em azul-claro
representam a direção e o sentido dos vetores dos átomos vibrantes.
-1
Figura 25 – Vibração de coll_3 (em 3073cm ) em outro determinado momento. As linhas em azul-claro
representam a direção e o sentido dos vetores dos átomos vibrantes.
89
A Tabela 4 mostra o número de moléculas de água vibrando em cada
recorte de colágeno, assim, se apenas uma molécula vibra (apresenta os vetores de
vibração, visualizados no programa Molekel), o número de moléculas de água
vibrantes é 1; se duas moléculas de água vibram, o número de moléculas de água
vibrantes é 2; e assim por diante; se nenhuma molécula de água vibra, está escrito
“não vibra”. Novamente cada cor representa a região equivalente a cada pico obtido
experimentalmente (picos 1 a 7). Assim coll_0, por exemplo, possui duas bandas
marcadas em verde (2989cm-1 e 2991cm-1) equivalentes ao pico 4 de MN; duas bandas
marcadas em azul (3070cm-1 e 3071cm-1) equivalentes ao pico 5 de MN e, uma banda
em azul (3078cm-1) equivalente ao pico 5 de HFI; assim sucessivamente para as outras
bandas dos colágenos sem água e dos colágenos com água confinada.
Analisando-se os picos da região entre 2800 e 3600 cm-1 (Tabela 4) e
considerando as interações do coll_1 a coll_8, percebe-se que o pico 1 (marcado em
roxo) apresenta vibrações de colágeno ou colágeno com água confinada apenas em
amostras de HFI. As amostras de MN não apresentam vibrações correspondentes ao
colágeno e/ou colágeno com água confinada para o pico 1.
Para o pico 3 (marcado em rosa), a água vibra tanto em MN quanto em
HFI. Embora as comparações sejam limitadas no que se refere a esse pico, visto que a
freqüência 2936cm-1 (coll_4) aparece em tanto em MN quanto em HFI, o pico 3
apresenta duas bandas características de diagnóstico: 2938cm-1 (coll_3), que aparece
apenas em HFI; e 2932cm-1, que aparece apenas em MN.
O pico 4 (marcado em verde) apresenta duas bandas referentes ao
coll_3, uma em MN, 2989cm-1, e outra em HFI, 2977cm-1. Comparando-se estas bandas
observa-se que as moléculas de água não participam da vibração em MN, porém
participam da vibração em HFI. Observa-se ainda que para MN nenhuma água
confinada apresenta vibração (coll_0, coll_2, coll_3 e coll_6). Já em HFI, há apenas
duas bandas correspondentes, coll_3, conforme descrito acima, e coll_5. Neste último
a água também não apresenta vibração.
No pico 5 (marcado em azul), o CH3 da molécula de colágeno apresenta
vibração em HFI; enquanto que para MN, o CH3 não vibra. Observa-se que este pico
90
corresponde a bandas de coll_0 e colágeno com água confinada, tanto em MN quanto
em HFI. Para MN, a água não apresenta vibração em coll_2 e coll_5; em coll_3, apenas
uma molécula de água vibra em 3070cm-1 e todas as três moléculas de água vibram em
3073cm-1; e, em coll_6, quatro moléculas de água vibram. Para HFI, além da vibração
correspondente ao coll_0, coll_8 também apresenta vibração em duas de suas
moléculas de água.
No pico 7 (marcado em amarelo), há maior número de vibrações no
trecho da hélice do colágeno com três estruturas cíclicas para MN; e há maior número
de vibrações no trecho com duas estruturas cíclicas para HFI. As bandas
correspondentes a esse pico para MN são de coll_0, coll_5 ou coll_6, em que a maioria
dos átomos do colágeno vibra (60-100%); já para HFI foi encontrada apenas uma
banda correspondente ao coll_0.
Os picos 2 e 6 (marcados em cinza escuro e cinza claro,
respectivamente) não apresentam variação estatística ao nível de 0,05 para as
amostras de MN e HFI e, portanto, não são característicos de diagnóstico.
Dos picos característicos de diagnóstico (marcados em colorido: roxo,
rosa, verde, azul e amarelo), é interessante notar ainda que todas as bandas de MN
possuem uma, três, quatro ou seis moléculas de água vibrando, mas nenhum dos picos
com a vibração de apenas duas moléculas de água. Já em HFI, a única banda cujas
moléculas de água apresentam vibração no pico 5 possui apenas duas moléculas de
água vibrando; no pico 4, novamente a única banda com moléculas de água vibrantes
em HFI apresenta apenas duas moléculas de água vibrando; e no pico 3, a banda
característica de diagnóstico (em coll_3) também apresenta apenas duas moléculas de
água vibrando. Não é possível verificar este fato para o pico 7, uma vez que possui
apenas uma banda de colágeno sem água, assim como a comparação torna-se
complicada em relação ao pico 1, visto que detém apenas uma banda em HFI e
nenhuma em MN.
Na Tabela 4 é possível analisar também os resultados para cada
colágeno, comparando um por um na linha vertical. Em geral, os picos de coll_0 e do
coll_6 são os que apresentam maior quantidade de bandas correspondentes aos picos
91
de MN, referindo-se, respectivamente, a quatro e cinco picos. Em HFI, destacam-se as
bandas de coll_0 e coll_8, que se referem, a quatro e três picos, respectivamente.
O coll_7 possui freqüências correspondentes apenas a um pico não
característico de diagnóstico. Por outro lado, coll_3 e coll_2 são exclusivos de picos
característicos de diagnóstico. Considerando-se estes picos característicos de
diagnóstico, o coll_8 apresenta picos apenas em HFI, destacando os picos 1 e 5, em
que ambos expõem vibrações de moléculas de água. Curiosamente, nos picos
experimentais correspondentes ao coll_2, as moléculas de água não apresentam
vibração e também não apresentam picos referentes às amostras de HFI. Além disso,
as amostras de MN e HFI não possuem picos correspondentes ao coll_1.
A fim de analisar também as vibrações dos átomos de colágeno, dividiuse a região de cada célula (célula ortorrômbica, com o colágeno e as moléculas de
água) em quatro quadrantes (A, B, C e D). O critério de divisão foi a quantidade de
átomos de oxigênio. O recorte de colágeno utilizado na simulação possui duas cadeias,
uma com três estruturas cíclicas e outra com duas, mas ambas possuem quatro
oxigênios. Assim foram mantidos dois oxigênios em cada quadrante e o CH3 (presente
apenas na extremidade de uma das cadeias) foi mantido no último quadrante
(quadrante D). A Figura 26 ilustra melhor o processo.
92
Figura 26 – Indicação da posição dos quadrantes A, B, C e D em relação aos átomos do colágeno.
Os resultados dessa análise foram tabelados (Tabela 5) e, de modo
semelhante à Tabela 4, cada cor representa um pico. Pela Tabela 5, é possível notar
que muitas bandas apresentam átomos vibrando nos quatro quadrantes (ABCD). É
interessante notar ainda que, considerando os picos característicos de diagnóstico,
apenas dois quadrantes (AD, BC ou CD) apresentam vibração nas bandas em que a
água não vibra. Nesse sentido, pode-se inferir que a presença de moléculas de água
vibrantes e a vibração do colágeno como um todo são fatos correlacionados. Quando
as moléculas de água não vibram, apenas dois quadrantes apresentam vibração.
Quando as moléculas de água vibram, o número de quadrantes que apresentam
vibração é maior.
93
Tabela 4 - Comparação entre as vibrações das moléculas de água confinadas em colágeno para MN e HFI. Cada cor refere-se a um determinado pico.
MN
HFI
coll_0
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_1
desl.
Raman
-1
(cm )
coll_2
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_3
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_4
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
2989
0 *
2989 NÃO VIBRA
2989 NÃO VIBRA
2991
0
3069 NÃO VIBRA
3070
1
3070
0
3073
3
3071
coll_5
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_6
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
2936
3
3070 NÃO VIBRA
3069
2
3218
3
2991 NÃO VIBRA
3363
3
3070
4
0
3220
2
3219
0
3222
2
3220
0
3360
6
3364
0
coll_0
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_1
desl.
Raman
-1
(cm )
coll_2
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
*
*
coll_3
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_4
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_5
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
2938
2
2888
4
2977
2
2936
3
3
2886
coll_8
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
3
3220 NÃO VIBRA
3221
coll_6
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
coll_7
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
0 *
3058
0
3219
0
3220 NÃO VIBRA
3220
0
3221
3385
0
Legenda:
-1
MN (cm )
Referência
-1
HFI (cm )
2854 pico 1
2843
2885 pico 2
2887
2934 pico 3
2937
2991 pico 4
2977
3071 pico 5
3060
3220 pico 6
3221
3362 pico 7
3387
3220
2
3222
2
2886
6
coll_8
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
2844
* Nenhuma freqüência dos resultados de simulação corresponde ao obtido experimentalmente.
2979 NÃO VIBRA
2932
coll_7
Quantas
desl.
(H2O)n
Raman
vibram?
-1
(cm )
3
2843
3
3059
2
6
94
Tabela 5 - Comparação entre as vibrações do colágeno para MN e HFI, conforme os quadrantes. Cada cor refere-se a um determinado pico e cada letra (A, B, C, D) a um
quadrante.
MN
coll_0
coll_1
desl.
Quadran- desl.
Raman tes
Raman
-1
-1
(cm ) vibrando (cm )
2989 ACD
coll_2
coll_3
desl.
Quadran- desl.
Raman tes
Raman
-1
-1
(cm ) vibrando (cm )
*
2991 ABCD
coll_4
Quadran- desl.
Raman
tes
-1
vibrando (cm )
coll_5
Quadran- desl.
Raman
tes
-1
vibrando (cm )
coll_6
Quadran- desl.
Raman
tes
-1
vibrando (cm )
coll_7
Quadran- desl.
Raman
tes
-1
vibrando (cm )
2989 BD
2989 CD
2936 ABC
3070 AD
2932 ABC
3069 AD
3070 ABCD
3069 AD
3218 ABCD
2991 AD
3363 ABCD
3070 ABCD
3070 ABCD
3073 ABCD
3071 ABCD
3220 ABCD
3219 ABCD
3222 ABCD
3220 ABCD
3360 ABCD
coll_8
Quadran- desl.
Raman
tes
-1
vibrando (cm )
2886 ABCD
Quadrantes
vibrando
3220 ABCD
3221 ABCD
3364 ABCD
HFI
coll_0
coll_1
desl.
Quadran- desl.
Raman tes
Raman
-1
-1
(cm ) vibrando (cm )
2844 ABCD
coll_2
coll_3
desl.
Quadran- desl.
Raman tes
Raman
-1
-1
(cm ) vibrando (cm )
*
*
3058 ABCD
*
coll_4
Quadran- desl.
tes
Raman
-1
vibrando (cm )
coll_5
Quadran- desl.
tes
Raman
-1
vibrando (cm )
2938 ABCD
2888 ABCD
2977 ABCD
2936 ABC
coll_6
Quadran- desl.
tes
Raman
-1
vibrando (cm )
2979 CD
coll_7
Quadran- desl.
tes
Raman
-1
vibrando (cm )
3220 ABCD
3222 ABCD
coll_8
Quadran- desl.
tes
Raman
-1
vibrando (cm )
2886 ABCD
Quadrantes
vibrando
2843 ABCD
3059 ABCD
3219 ABCD
3220 ABCD
3220 ABCD
3221 ABCD
3385 ABCD
* Nenhuma freqüência dos resultados de simulação corresponde ao obtido experimentalmente
Legenda:
-1
MN (cm )
Referência
-1
HFI (cm )
2854 pico 1
2843
2885 pico 2
2887
2934 pico 3
2937
2991 pico 4
2977
3071 pico 5
3060
3220 pico 6
3221
3362 pico 7
3387
95
4.2.1 Discussão energética
Pelas simulações também foram obtidas as energias totais de cada
confinamento (coll_0, coll_1, coll_2, coll_3, coll_4, coll_5, coll_6, coll_7 e coll_8). Os
resultados podem ser visualizados nos Gráficos 18 e 19.
Gráfico 18 – Energia total para cada aglomerado de água confinada.
Energia total normalizada
-1.4
-1.35
-1.3
-1.25
-1.2
-1.15
-1.1
-1.05
-1
coll_0
coll_1
coll_2
coll_3
coll_4
coll_5
coll_6
coll_7
coll_8
Gráfico 19 – Energia total por molécula de água confinada.
Energia total por molécula de água
(normalizada)
-1.2
-1
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
coll_1
coll_2
coll_3
coll_4
coll_5
coll_6
coll_7
coll_8
96
É possível perceber, pelo Gráfico 18, que quanto maior o número de
moléculas de água confinadas, menor a energia total do aglomerado. Além disso,
dividindo-se a energia total pelo número de moléculas de água presentes em cada
aglomerado também é possível verificar que conforme o número de moléculas dentro
do colágeno aumenta, há uma redução exponencial do módulo da energia por
molécula (Gráfico 19).
Uma molécula só será formada se esta for mais estável e tiver menor
energia que os seus átomos individuais. Assim, em ordem crescente de estabilidade
temos: coll_0, coll_1, coll_2, coll_3, coll_4, coll_5, coll_6, coll_7 e coll_8, o mais
estável.
Park et al. [157] analisaram as estruturas e as energias do dímero ao
heptâmero de água usando a função potencial empírica revisada para análise
conformacional, e perceberam que as estruturas cíclicas de aglomerados de água, em
geral, são mais favoráveis que estruturas abertas, exceção ao heptâmero. Também
observaram que quanto mais ligações de hidrogênio um cluster tem, maior é a sua
estabilidade. Assim, a estabilidade da cadeia de aglomerados aumenta adicionando-se
uma molécula de água ao aglomerado, embora um aglomerado com cadeia
infinitamente longa possa não existir.
Nesse contexto, coll_8 é, dentre os colágenos com água confinada, o
que apresenta maior número de bandas em HFI, sugerindo que tecidos com HFI têm
uma maior afinidade a situações mais estáveis de aglomerados de água. Por outro
lado, MN apresenta maior número de bandas em coll_6, o terceiro aglomerado de
água mais estável. Talvez, mais simulações para colágenos com nove, dez ou mais
moléculas de água confinada exponham maior número de bandas que coll_8
referentes à HFI.
97
4.2.2 Polarização e momento de dipolo
Buscando encontrar uma correlação entre o momento de dipolo dos
aglomerados de água e a presença de inflamação, os módulos dos vetores de
polarização (momento de dipolo) foram calculados para cada colágeno simulado. Os
resultados podem ser observados no Gráfico 20.
Gráfico 20 – Momento de dipolo para cada aglomerado de água confinada.
Comparação do Momento de dipolo
45
Momento de dipolo (D)
40
35
30
25
20
15
10
5
0
coll_0 coll_1 coll_2 coll_3 coll_4 coll_5 coll_6 coll_7 coll_8
Colágeno
Um trauma, do mesmo modo que outros fatores externos como fatores
químicos ou a presença de microorganismos, pode gerar uma inflamação. Esta, por sua
vez, favorece as espécies reativas de nitrogênio e oxigênio (RNOS) e,
conseqüentemente, os processos de transferência eletrônica.
Por outro lado, quanto maior o momento de dipolo, maior a quantidade
de espécies reativas de nitrogênio e oxigênio o que, por sua vez, favorece os processos
de transferência eletrônica, promovendo uma maior suscetibilidade à inflamação.
Neste sentido, coll_2, que se refere apenas a picos de mucosa normal, é
o que apresenta o menor momento de dipolo, portanto, consiste em um ponto de
equilíbrio, que apresenta a quantidade mínima de água para que a transferência
98
eletrônica ocorra. Já os maiores valores de momento de dipolo são de coll_0 e coll_4,
que se referem também a tecidos inflamados. Como coll_0 é o colágeno sem água e a
proteína desidratada não apresenta atividade biológica, logo, coll_4 é aquele em que
os processos de transferência eletrônica são mais favorecidos.
99
5
DISCUSSÃO GERAL E CONCLUSÃO
A presença de moléculas de água interfere nas freqüências
características de cada pico, tanto de MN quanto de HFI. Em geral, a posição das
moléculas de água vibrantes funciona como uma espécie de “ponte”, ligando as duas
hélices do colágeno, interagindo com a estrutura protéica. Tal qual em materiais
cimentícios [158] a água confinada em colágeno funciona como um adesivo, ligando as
hélices dessa proteína.
Observou-se ainda que um maior número de moléculas em
aglomerados evidencia picos característicos de diagnóstico em que a freqüência de
MN é maior que a de HFI. Por outro lado, um menor número de moléculas em
aglomerados evidencia picos característicos de diagnóstico em que a freqüência de
MN é menor que a de HFI.
Pela discriminação entre MN e HFI, foi constatado que os picos 7, 5, 4 e
3 são os mais relevantes e que em todos eles há a presença da água confinada. Em
especial, destaca-se o pico 4, com 100% de sensibilidade, que apresenta vibração das
moléculas de água apenas em HFI. Além disso, sua banda no gráfico de espectroscopia
Raman é bem característica, exibindo maior intensidade em HFI e menor em MN.
É curioso notar que, dentre as bandas características de diagnóstico,
apenas aquelas referentes à HFI apresentam duas moléculas de água vibrantes e que
tal fato evidencie, portanto, um pico de HFI. Isto caracteriza os picos 5, 4 e 3. No pico
7, ao contrário, a ausência de bandas referentes à água confinada, bem como o
aumento do número de átomos vibrando no colágeno sem água confinada, caracteriza
o quadro clínico de HFI.
Outro fato interessante é que a única banda que apresenta apenas uma
molécula vibrando (3070 cm-1, em coll_3) possui outra banda que corresponde ao
mesmo pico 5 de MN (3073 cm-1), o qual detém três moléculas de água vibrantes. E
que coll_1 não apresenta nenhuma freqüência correspondente a picos de MN e/ou
HFI.
100
Por que duas águas ou nenhuma água? Isso leva a crer que quando um
quadro inflamatório é evidenciado ocorre a perda de água das regiões confinadas ou
redução das interações da água com colágeno. Conseqüentemente, o poder “adesivo”
da água torna-se menor e fatores externos podem interferir na biomolécula
caracterizando o diagnóstico de doenças.
Sabe-se que num processo inflamatório a água extravasa dos vasos
sanguíneos provocando edemas [78]. A inflamação pode ser descrita como: rubor,
tumor, calor e dor; sendo o tumor causado principalmente pelo acúmulo de líquido no
local [76]. Conforme Chung e colaboradores [159], os tumores estão mais associados à
água livre e o aumento da água livre pode estar relacionado a alterações na matriz
extracelular [159], as quais são ricas em colágenos. Desse modo, pode haver uma
redução de moléculas de água ligada ao colágeno em favorecimento de moléculas de
água livres.
De um modo geral, observaram-se diferenças entre NM e HFI,
demonstrando que as moléculas de água podem agrupar-se de modos diferentes
quando um processo inflamatório é evidenciado. Essas importantes alterações estão
relacionadas, sobretudo, ao estímulo aos processos de transferência eletrônica,
caracterizados pelos momentos de dipolo. Isso consiste numa importante informação
para o entendimento do processo inflamatório do ponto de vista bio-físico-químico e
fisiológico. Desperta ainda a criatividade no desenvolvimento de produtos
farmacêuticos e cosméticos preparados para “não perturbar” a estrutura de água em
tecidos humanos.
Mais estudos de água confinada são necessários para clarear seu papel
fundamental no funcionamento de sistemas vivos. Em prosseguimento a pesquisa
serão investigadas as propriedades da água em função da temperatura através do
estudo das interações água-água e água-cavidade para a água confinada em
nanoporos em regimes hidrofóbicos (nanotubos de carbono SWNT) e hidrofílicos
(nanoporos MGM). Essas informações, em conjunto com as simulações já realizadas,
possibilitarão uma melhor compreensão das propriedades físicas da água confinada e a
aplicação desses resultados à elucidação de propriedades de biomoléculas hidratadas.
101
Nós esperamos que os resultados aqui descobertos possam contribuir
para esclarecimento de algumas dessas propriedades.
102
6
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