UNIÃO DA TRANSCRIÇÃO E
TRADUÇÃO DENTRO DO NÚCLEO
DE CÉLULAS DE MAMÍFEROS
Coupled transcription and translation
within nuclei of mammalian cells
Francisco J. Iborra, Dean A. Jackson, Peter R. Cook
Science vol 293, 1139-1142
Agosto 2001
Introdução
Procariotos
X
Eucariotos
RNA pol
RNA pol
DNA
DNA
mRNA
Transcrição
Transcrição
Ribossomos
Citoplasma
mRNA
Núcleo
Transporte
Citoplasma
mRNA maduro
mRNA
degradado
Citoplasma
Tradução
Ribossomo
Tradução
Introdução
A membrana nuclear é a característica
que define os eucariotos.
 Ela divide a célula em dois
compartimentos e assume-se que a tradução está
restrita somente a um deles - o citoplasma.
 A idéia seria EVITAR a tradução antes
do splicing.
Introdução
 Três evidências para que ocorra tradução
no núcleo:
1. Núcleo contém componentes necessários, mas
estes podem não estar ativos;
Introdução
2. Experimentos “pouco” controlados levam a
acreditar que núcleos podem aminoacilar tRNAs e
incorporar aminoácidos radioativos em proteínas.
Suspeita de contaminação
Migração
Proteínas
Núcleo
Citoplasma
Introdução
3. Degradação dos transcritos que possuem stop
códons prematuros (fenômeno conhecido como
“nonsense-mediated decay” - NMD).
Stop códon
prematuro
Degradação
mRNA
mRNA
Introdução
 Como pode a única maquinaria capaz
de reconhecer um stop códon - um ribossomo
citoplasmático ativo - disparar a degradação de
um transcrito que ainda está no núcleo?
Metodologia Antiga
 Metodologia antiga de localização de
sítios de tradução no núcleo:
[ 3H ] leucina
tRNAleu - [ 3H ] leucina.
Proteína
 Desvantagem: tempo de incubação longo
para a conversão da [ 3H ] leucina o que dá tempo
à proteína recém sintetizada de entrar no núcleo.
Metodologia Atual
 Um sistema de tradução in vitro que
utilizasse temperatura baixa e concentrações
subótimas de precursores, de modo que poucas
proteínas, que continham em média 350 resíduos
de aminoácidos, fossem completadas durante a
reação e estivessem aptas a escapar dos sítios de
síntese.
Metodologia Atual
 Materiais a serem utilizados:
Mg2+
[ 3H ] leu
HCO3GTP
K+
ATP
Na+
19 aa
Aminoacil tRNA
sintetases
Metodologia Atual
 Condições do experimento:

Incubação a baixas temperaturas, 27.5o

Curto tempo, 3 minutos
 Consequentemente, poucas proteínas seriam
completadas durante a incubação.
 Somente 15 resíduos seriam polimerizados.
 Tamanho médio das proteínas seria de ~350aa.
Padronização do sistema
 Verificação do efeito de inibidores na
incorporação de [ 3H ] lisina durante a síntese de
proteínas.
9
%
Padronização do sistema
 A mesma verificação foi feita ao se
incorporar [35S] Met durante a síntese protéica.
 Produtos marcados
tinham o tamanho esperado de
uma população de polipeptídeos
recém-sintetizados normais.
Padronização do sistema
 Para garantir, verificaram que a
incorporação de [3H] Leu na presença de biotinalisina-tRNA não inibia a síntese de proteínas.
 Além disso, viram que a biotina era
melhor imunolocalizador que os precursores
radioativos.
Imunolocalização da biotina
A imunolocalização de polipeptídeos recémsintetizados com biotina é complicada pela existência
de biotina endógena.
 Esta é encontrada solúvel e/ou
covalentemente ligada a carboxilases na matriz
mitocondrial.
 A biotina solúvel foi extraída utilizando-se
tRNAs carregados. E a biotina covalentemente ligada
foi imunomarcada.
Imunolocalização da biotina
Biotina nas mitocôndrias foi
prontamente detectada, mas a dos
núcleos não.
Núcleo e citoplasma mais
marcados após incubação com
biotina-lisina-tRNA. A marcação
nuclear está concentrada em sítios
discretos.
Controle com cicloheximida
reduziu a marcação porque inibe a
síntese protéica.
Imunolocalização da biotina
 Alguns peptídeos com biotina poderiam
ter sido feitos no citoplasma e importados para
dentro do núcleo, mas marcação similar foi obtida
com núcleos isolados desprovidos de > 95% dos
ribossomos citoplasmáticos.
Célula
X
Núcleo
Imunolocalização da biotina
 Nenhum sinal mitocondrial foi visto
do lado de fora dos núcleos, confirmando que
a maior parte do citoplasma havia sido
removida.
 A remoção de > 95% dos ribossomos
citoplasmáticos não afetou a intensidade
nuclear.
Imunolocalização da biotina
A periferia nuclear não foi marcada,
por isso, a síntese de proteínas na membrana
nuclear externa seguida por importação não
foi a responsável pela marcação interna.
 A mesma intensidade nucleoplasmática
foi obtida em amostras de células e núcleos
isolados.
Imunolocalização da biotina
Células
50
Núcleo
25
Número
0
0
40
80
Intensidade
( unidade arbitrária)
Imunolocalização da biotina
 Para provar que ribossomos citoplasmáticos
não eram os responsáveis pela marcação do núcleo,
foi utilizada a droga “thapsigargin” (bloqueador de
importação nuclear).
Proteínas
Núcleo +
thapsigargin
> 40KDa
Imunolocalização da biotina
 Mesmo que os ribossomos citoplasmáticos
tivessem entrado, eles não poderiam iniciar a
tradução porque foi adicionado ATA (ácido
aurintricarboxílico). Este inibe o início da tradução
sem afetar a marcação do nucleoplasma.
 Todos estes controles serviram para
confirmar que a tradução citoplasmática não
poderia ser considerada na marcação nuclear.
BODIPY-lisina-tRNA
 Resultados similares foram obtidos
com BODIPY-lisina -tRNA que também marca
proteínas recém-sintetizadas em reações de
tradução.
 BODIPY-lisina -tRNA não tem o
imprevisto da biotina, pois não é um composto
endógeno.
BODIPY-lisina-tRNA
Células
permeabilizadas
Células
permeabilizadas
+ cicloheximida
BODIPY-lisina-tRNA
O sinal nucleoplasmático constitui 14% do
total.
A marcação citoplasmática foi cerca de 5
vezes mais forte que a nuclear.
Núcleo
mRNA
Citoplasma
mRNA
Biotina X BODIPY-lisina-tRNA
 A marcação com biotina-lisina-tRNA e
BODIPY-lisina-tRNA, que foi detectada com
métodos diferentes, deram resultados
similares.
Biotina X BODIPY-lisina-tRNA
100%
Biotina-lisina-tRNA
15%
BODIPY-lisina-tRNA
Immunogold
 Posteriormente, células permeabilizadas
e incubadas com biotina-lisina-tRNA foram
marcadas com “Immunogold” confirmando que o
interior nuclear continha cerca de 10% dos
peptídeos recém-sintetizados da célula.
Immunogold
Citoplasma
Núcleo
Immunogold
 Hipótese:
- Se toda a tradução ocorresse no citoplasma,
proteínas recém-sintetizadas entrariam e se
difundiriam por todo o núcleo; mas, se alguma
tradução estivesse unida à transcrição alguns
peptídeos nascentes teriam que ser encontrados
juntamente com transcritos nascentes.
Immunogold
 Polipeptídeos recém-sintetizados e
RNA foram estendidos na presença de biotinalisina-tRNA e Br-UTP e também marcados com
“Immunogold”. Os dois foram, muitas vezes,
encontrados juntos.
Resultado final
 Mostrou-se que :
- lisina ligada a três diferentes marcadores 3H,
biotina e BODIPY - é incorporada dentro de
sítios discretos no núcleo e que alguma desta
tradução nuclear depende de transcrição
simultânea pela RNA polimerase II.
Modelo
 A partir deste resultado combinado ao
resultado obtido no NMD propõe-se o seguinte
modelo:
- Ribossomos são montados dentro do nucléolo e
exportados para ambos nucleoplasma e citoplasma,
onde eles se associarão com transcritos e se tornarão
ativos;
- Exportação não precisa ser seletiva, talvez 10
vezes mais ribossomos terminem ativos no citoplasma,
enquanto o nucleoplasma está junto à cromatina.
Modelo
- Alguns ribossomos nucleares estão
incorporados dentro dos sítios de transcrição do
nucleoplasma que contêm muitas polimerases
ativas e unidades de transcrição.
- Estes ribossomos “corrigem” transcritos
recém-sintetizados enquanto eles emergem de
polimerases.
Modelo
- Qualquer ribossomo acoplado detecta stop
códons incorretamente posicionados, ativando a
degradação destes transcritos; simultaneamente
polipeptídeos truncados e indesejáveis são
degradados por proteasomas.
- Se nenhum stop códon prematuro for
encontrado, o transcrito deverá ser exportado para
o citoplasma onde sofrerá múltiplas iniciações.
Conclusão Geral
Isto leva a crer que os
precursores de transcrição e
tradução eucarióticos estão unidos,
tanto quanto em procariotos.