Claudine Maria Alves Feio
A Euterpe oleracea (açaí) modifica o
metabolismo de esteróis e atenua a
aterosclerose induzida experimentalmente
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo –
Escola Paulista de Medicina para obtenção
do título de Doutor em Ciências
São Paulo
2011
Claudine Maria Alves Feio
A Euterpe oleracea (açaí) modifica o
metabolismo de esteróis e atenua a
aterosclerose induzida experimentalmente
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo –
Escola Paulista de Medicina para obtenção
do título de Doutor em Ciências
Orientador: Prof. Dr. Francisco Antonio Helfenstein Fonseca
Co-orientador: Profa. Dra. Maria Cristina de Oliveira Izar
Co-orientador: Profa. Dra. Silvia Saiuli Miki Ihara
São Paulo
2011
Feio, Claudine Maria Alves
A Euterpe oleracea (açaí) modifica o metabolismo de esteróis e atenua a
aterosclerose induzida experimentalmente / Claudine Maria Alves Feio ; orientador,
Francisco Antonio Helfenstein ; co-orientadoras, Maria Cristina Oliveira Izar, Silvia
Saiuli Miki Ihara. - 2011
xiii, 53 p.
Tese (doutorado)-Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de
Medicina. Programa de Pós-Graduação em Cardiologia. São Paulo, 2011.
Título em inglês: Euterpe oleracea (açai) modifies sterol metabolism and
attenuates experimentally-induced atherosclerosis
1. Euterpe olerácea. 2. Aterosclerose. 3. Lípides. 4. Desmosterol. 5. Fitosteróis.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA – DISCIPLINA DE CARDIOLOGIA
Chefe do Departamento: Reinaldo Salomão
Coordenador do Curso de Pós Graduação: Valdir Ambrósio Moisés
Claudine Maria Alves Feio
A Euterpe oleracea (açaí) modifica o
metabolismo de esteróis e atenua a
aterosclerose induzida experimentalmente
Presidente da Banca: Prof. Dr. Francisco Antonio Helfenstein Fonseca
Banca Examinadora:
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Prof. Dr.
Aprovada em: ____ / _____/ ______
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos pais Antonio e Fernanda,
(in memoriam), pelo amor incondicional e
dedicação durante tantos anos.
Ao Max, meu marido, meu amigo e companheiro
obrigada por todo o amor, respeito e
felicidade durante todos esses anos .
Ao meu filho e amigo Thiago
obrigada pelo incentivo,
amor e carinho
ii
AGRADECIMENTOS
Um agradecimento especial ao meu orientador Prof. Dr. Francisco Fonseca, por toda a
confiança depositada em mim, pelo apoio constante e amizade, pela paciência,
orientações pertinentes e incentivo. Que Deus o conserve sempre assim e lhe dê toda
a felicidade que o senhor merece;
À minha querida co-orientadora e amiga Prof. Dra. Maria Cristina Izar, por toda a
paciência, ajuda e incentivo, sempre disposta a ajudar os mais necessitados;
À minha amiga e co-orientadora Prof. Dra. Sílvia Saiuli Miki Ihara, sempre disponível e
interessada na pesquisa;
Ao prof. Dr. Antonio Carvalho pela confiança e oportunidade deste doutorado;
A minha querida amiga e colaboradora Soraia Kasmas, pela inestimável ajuda;
Aos meus irmãos (ãs), cunhadas (os) e sobrinhos pela ajuda e compreensão em todos
os momentos;
À Universidade Federal do Pará (UFPA) pela oportunidade deste Doutorado;
À Universidade do Estado do Pará (UEPA) pela oportunidade deste Doutorado;
À professora Eliete da Cunha Araújo, Coordenadora do Instituto Ciências da Saúde da
Universidade Federal do Pará pela ajuda e incentivo na realização deste Doutorado;
À professora Tânia de Fátima D’Almeida Costa, Diretora da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Pará;
À professora Laélia Feio Brasil pela ajuda e apoio na realização deste projeto
Ao professor Paulo Amorim pela inestimável ajuda na concretização deste estudo;
Aos queridos amigos e funcionários do setor de Lípides, Aterosclerose e Biologia
Vascular (UNIFESP);
À secretária da pós-graduação a Sra. Christina Almeida, pela paciência e
disponibilidade;
Ao laboratório Paulo Azevedo pela grande ajuda na realização da bioquímica dos
coelhos em especial à pessoa do Dr. Paulo Azevedo e a Dra. Lígia;
iii
Às minhas queridas amigas Maria Elizabeth Caetano, Sonia Conde Cristino e Heloisa
Guimarães pelo constante incentivo e ajuda;
Aos meus colegas, professores da Disciplina de Cardiologia da UFPA, pela
compreensão e ajuda;
Aos meus colegas, professores da Disciplina de Propedêutica Médica da UEPA, pela
compreensão e ajuda;
Ao doutorando Luís Antonio Maués pela importante contribuição na realização dos
exames;
Às alunas Luana Relvas, Thais Tapajós e Daniel Charone, pela importante contribuição
em todas as fases da realização deste projeto;
À bibliotecária do Instituto de Ciências da Saúde, Sra. Vilma Bastos, pela inestimável
ajuda, durante todo este tempo;
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste
projeto.
iv
Este trabalho foi realizado, em parte, com auxílio financeiro da Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) processo: 2008/55443-6. Aprovado pelo
Comitê de Ética animal em Pesquisa da UFPA sob o número 002/2006.
v
SUMÁRIO
DEDICATÓRIA _______________________________________________ ii
AGRADECIMENTOS _________________________________________ iii
LISTA DE FIGURAS _________________________________________ viii
LISTA DE TABELAS _________________________________________ ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS _________________________ x
RESUMO __________________________________________________ xii
ABSTRACT________________________________________________ xiii
1 INTRODUÇÃO _____________________________________________ 1
1.1 EPIDEMIOLOGIA ___________________________________________________ 1
1.2 FATORES DE RISCO CARDIOVASCULAR ______________________________ 2
1.3 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE ______________________________ 7
1.3.1 Indução de Aterosclerose em coelhos ______________________________ 10
1.3.2 Evolução da Aterosclerose em Humanos ____________________________ 12
1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A EUTERPE OLERACEA ____________________ 13
2 OBJETIVOS ______________________________________________ 18
2.1 OBJETIVOS GERAIS ______________________________________________ 18
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS _________________________________________ 18
3 MÉTODOS________________________________________________ 19
3.1. DESENHO EXPERIMENTAL ________________________________________ 19
3.2 ANIMAIS ________________________________________________________ 21
3.3 DIETA __________________________________________________________ 21
3.4 INDUÇÃO DE HIPERCOLESTEROLEMIA ______________________________ 22
3.5. EUTERPE OLERACEA (AÇAÍ)_______________________________________ 22
3.5.1 Composição Química da Euterpe Oleracea_________________________ 22
3.6 PARAMETROS AVALIADOS NO PROTOCOLO EXPERIMENTAL ___________ 24
3.6.1 Aspectos laboratoriais ___________________________________________ 24
3.6.1.1 Dosagens bioquímicas __________________________________________ 24
3.6.1.2 Metodologia empregada ________________________________________ 24
3.6.1.3 Lípides _______________________________________________________ 24
3.6.1.4 Quantificação dos Esteróis ______________________________________ 25
3.7 SACRFÍCIO DOS ANIMAIS __________________________________________ 25
3.7.1 Aspectos cirúrgicos - Retirada da Artéria Aorta _______________________ 25
vi
3.7.2 Análise Histopatológica das Aortas ___________________________________ 26
3.7.2.1 Avaliação Macroscópica ________________________________________ 26
3.7.2.2 Avaliação da Extensão das Lesões Ateromatosas ___________________ 26
3.7.2.2.1 Avaliação Microscópica _______________________________________ 27
3.7.2.2.2 Avaliação Histológica por Microscopia óptica _____________________ 27
3.7.3 Estudo Imuno-histoquímico _______________________________________ 27
3.7.4 Estudo Histopatológico __________________________________________ 28
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA ___________________________________________ 29
4 RESULTADOS ____________________________________________ 30
5 DISCUSSÃO ______________________________________________ 36
6 CONCLUSÕES ____________________________________________ 39
REFERÊNCIAS _____________________________________________ 40
ANEXOS _____________________________________________________
Anexo 1: Parecer do Comitê de Ética Institucional ____________________
Anexo 2: Manuscrito _____________________________________________________
vii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mecanismo de ação do fitosterol________________________________33
Figura 2: Palmeira do Euterpe oleracea (açaí)_____________________________33
Figura 3: Cachos e frutos do Euterpe oleracea (açaí)_______________________33
Figura 4: Euterpe oleracea (açaí) sendo despolpado_______________________33
Figura 5: Extrato (vinho) do Euterpe oleracea (açaí)________________________33
Figura 6: Organograma do desenho experimental_________________________33
Figura 7: Box plots da área de placas no arco aórtico e relação íntima/média___33
Figura 8: Box plots da área das placas mensuradas por planimetria__________34
Figura 9: Box plots de imagens representativas de aortas coradas pelo Sudam
III__________________________________________________________________35
viii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Composição química da Euterpe oleracea_____________________22
Tabela 2. Pêso dos animais nas semanas 12 e 24________________________29
Tabela 3. Perfil lipídico e glicemia nas semanas 12 e 24__________________30
Tabela 4. Desmosterol, campesterol e beta-sitosterol ao final do estudo____31
Tabela 5. Composição das placas das aortas ao final do estudo por grupo__32
ix
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
AVC: Acidente vascular cerebral
CT : Colesterol total
DAC: Doença arterial coronariana
DCNT: Doenças crônicas não transmissíveis
DCV: Doenças cardiovasculares
DHA: Ácido graxo docosahexaenóico
DM2: Diabetes mellitus tipo 2
DNA: Ácido desoxirribonucleico
ECA: Enzima conversora de angiotensina
EDTA: Ácido etilenodiamino tetra-acético
EMI: Espessura médio-intimal
eNOS: Óxido nítrico sintetase endotelial
EPA: Ácido graxo eicosapentaenóico
FR: Fatores de risco
H2O2: Peróxido de hidrogênio
HÁ: Hipertensão arterial
HDL: Lipoproteína de alta densidade
HE: Hematoxilina e eosina
I/M: Relação íntima média
IAM: Infarto agudo do miocárdio
ICAM-1: Molécula de adesão inter-celular 1
IgG: imunoglobulinas G
IMC: Índice de massa corpórea
ICAM-1: Molécula de adesão intercelular 1
x
LDL: Lipoproteína colesterol de baixa densidade
LDLox: Lipoproteína de baixa densidade oxidada
NCEP: Programa de Educação Nacional do Colesterol
NF-KB: Fator nuclear kappa B
NPC1L1: Proteína Niemann-Pick C1 Like 1
PBS: Tampão fosfato salino
PCR: Proteína C-reativa
PECAM-1: Molécula de adesão de plaquetas/célula endotelial
RI: Resistência a insulina
SEM: Erro padrão da média
SM: Síndrome metabólica
VCAM-1: Molécula de adesão ao endotélio vascular
VLDL: Lipoproteína de muito baixa densidade
WHO: Organização mundial de saúde
xi
RESUMO
Introdução: Euterpe oleracea (açaí) é uma fruta da região amazônica, cuja
composição química pode ser benéfica para indivíduos com aterosclerose. Nós
hipotetizamos que o consumo de Euterpe oleracea poderia reduzir o desenvolvimento
da aterosclerose por uma redução na absorção e síntese de colesterol. Métodos:
Coelhos machos Nova Zelândia foram alimentados com uma dieta enriquecida em
colesterol (0.5%) por 12 semanas, quando foram aleatoriamente distribuídos para
tratamento com Euterpe oleracea ou água além de dieta enriquecida em colesterol
(0,05%) por 12 semanas adicionais. Fitosteróis plasmáticos e desmosterol foram
determinados por cromatografia líquida de alto desempenho e espectrometria de
massa. As lesões ateroscleróticas foram estimadas por planimetria computadorizada.
Resultados: Ao sacrifício, os animais tratados com Euterpe oleracea tiveram menores
níveis de colesterol total (p=0.03) e de colesterol não-HDL (p=0.03) em comparação
aos controles. Estes animais tiveram menores areas de aterosclerose em suas aortas
((p=0.001) e menor relação íntima/média (p=0.002) em comparação aos controles. Ao
final do estudo, os valores plasmáticos de campesterol, β-sitosterol, e desmosterol não
diferiram entre os grupos. Entretanto, os animais tratados com Euterpe oleracea
mostraram menores valores para as relações desmosterol/campesterol (p=0.026) e
desmosterol/β-sitosterol (p=0.006) em comparação aos controles. Conclusões:
Consumo do extrato de Euterpe oleracea marcadamente melhora o perfil lipídico e
atenua a aterosclerose. Estes efeitos foram em parte relacionados a um melhor
balanço entre síntese e absorção de esteróis.
Palavras-chave: Euterpe oleracea, aterosclerose, lípides, desmosterol, fitosteróis.
xii
ABSTRACT
Background: Euterpe oleracea (açaí) is a fruit from the Amazon region, whose
chemical composition may be beneficial for individuals with atherosclerosis. We
hypothesized that consumption of Euterpe oleracea would reduce therosclerosis
development by a decrease in cholesterol absorption and synthesis. Methods: Male
New Zealand rabbits were fed a cholesterol-enriched diet (0.5%) for 12 weeks, when
they were randomized to receive Euterpe oleracea extract or water plus a 0.05%
cholesterol-enriched diet for additional 12 weeks. Plasma phytosterols and
desmosterol were determined by ultra performance liquid chromatography and mass
spectrometry. Atherosclerotic lesions were estimated by computerized planimetry.
Results: At sacrifice, animals treated with Euterpe oleracea had lower levels of total
cholesterol (p=0.03) and non-HDL-cholesterol (p=0.03) as compared to controls.
These animals had smaller atherosclerotic plaque area in their aortas (p=0.001) and
a smaller intima/media ratio (p=0.002) in comparison with controls. At the end of the
study, campesterol, β-sitosterol, and desmosterol plasma levels did not differ
between groups. However, animals treated with Euterpe oleracea showed lower
values for the desmosterol/campesterol (p=0.026) and desmosterol/β-sitosterol
(p=0.006) ratios as compared to controls. Conclusion: Consumption of Euterpe
oleracea extract markedly improved the lipid profile and attenuated atherosclerosis.
These effects were related in part to a better balance in the synthesis and absorption
of sterols.
Key words: Euterpe oleracea, atherosclerosis, lipids, desmosterol, phytosterols
xiii
1
INTRODUÇÃO
1.1
EPIDEMIOLOGIA
As doenças cardiovasculares (DCV) assumem importante destaque na
mortalidade mundial, tanto em países desenvolvidos como em países em
desenvolvimento, sendo responsáveis por aproximadamente 50% das mortes em
países ocidentais. Desde a década de 1970 a taxa de mortalidade por idade foi
reduzida pela metade em países industrializados, inclusive nos Estados Unidos,
talvez devido ao maior controle de fatores de risco como hipercolesterolemia,
hipertensão arterial e tabagismo (FORD et al., 2007; CAPEWELL et al., 2010).
Estima-se que 2/3 das mortes por DCV ocorram em países em desenvolvimento,
como o Brasil, taxa que corresponde ao dobro da observada em países
desenvolvidos (LAURENTI; BUCHALLA, 2001). No Brasil, a principal causa de morte
ainda é o acidente vascular cerebral (AVC), entretanto em alguns locais, como o
Estado de São Paulo o perfil de mortalidade se assemelha ao de países mais
desenvolvidos, ou seja, a maior mortalidade decorre da doença coronária
aterosclerótica (DAC) e o AVC ocupa o segundo lugar (LOTUFO; LOLIO, 1993;
LOTUFO, 2005; WHO, 2008).
A doença
cardiovascular
tem custo
mais elevado
em países em
desenvolvimento que em países desenvolvidos (MARTINEZ et al., 2003; RIBEIRO et
al., 2005), e a previsão para esses países é de piora desse quadro nos próximos
anos se não conseguirmos realizar o controle adequado dos fatores de risco. (LUZ et
al., 2003; SCHERR; RIBEIRO, 2009; SPOSITO et al., 2007; BLASI, 2008), elas são
responsáveis por grande parte da mortalidade dos brasileiros, correspondendo a
31% do total, sendo proporcionalmente maior nas mulheres em relação aos homens
(BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006). Essas doenças representam um crescente
encargo para a sociedade, para a família e para o indivíduo (MURRAY; LOPEZ,
1996; WHO, 2005). Entre os 58 milhões de óbitos mundiais em 2005, 35 milhões
foram causados pelas doenças crônicas não transmissíveis (DCNT), o que
representa o dobro do número total de óbitos por todas as doenças de notificação
obrigatória. Em 2006 a World Health Statistics apontou que entre as doenças
crônicas não transmissíveis (DCNT), as doenças circulatórias despontam como a
2
principal causa de óbito, responsável por 31% de todos os casos, cerca de 17,5
milhões de óbitos (WHO, 2006).
A experiência de países desenvolvidos indica que intervenções sustentadas
na prevenção primária e secundária da doença aterosclerótica podem reduzir em até
4% a mortalidade média anual em pessoas na faixa etária entre 60 - 69 anos, e em
até 3% na faixa etária entre 70 - 79 anos. Essas faixas etárias, após intervenções
contínuas, foram as que mais evidenciaram queda na mortalidade em vários países
na década de 1990 (YACH, 2004; Australian Institute of Health And Welfare (AIHW),
2006; STRONG; MHATERS; BONITA, 2007). Além das medidas de intervenção na
prevenção primária e secundária, a efetiva implementação dos resultados de vários
ensaios clínicos aleatorizados, como, por exemplo, o uso de drogas trombolíticas, de
novas drogas antitrombóticas, a anticoagulação na fibrilação atrial crônica, a
disseminação de unidades de AVC, e a endarterectomia carotídea conseguiram
reduzir em até 80% a incidência de AVC (SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et al.,
2003; WALD; LAW, 2003).
Apesar dos grandes avanços nas áreas de diagnóstico e tratamento das
doenças cardiovasculares, a prevenção continua sendo o principal caminho para
combater esse problema. A prevenção tem como base o conhecimento dos fatores
de risco que levam à doença aterosclerótica, e entre esses fatores, a dislipidemia
destaca-se como um dos mais importantes, pois, representa um dos seus principais
desencadeantes, sendo o aumento dos níveis de colesterol o principal fator
envolvido no seu desenvolvimento (JALDIN et al., 2006).
1.2 FATORES DE RISCO
Na primeira metade do século passado, experimentos com animais e
observações
clínicas
hipercolesterolemia,
ligaram
ao
risco
certas
condições,
aumentado
de
como
eventos
por
exemplo,
a
aterotrombóticos
(BRAUNWALD, 2002). Após a avaliação de desfechos de estudos clássicos, como o
de Framingham e o Seven Countries Study, houve melhor compreensão das
doenças cardiovasculares e também, da relação entre alguns fatores e o risco de
desenvolver doenças cardiovasculares (DCV) (KEYS, 1970; PETER et al., 1998;
GORDON et al., 1981). A partir de então, a lista desses fatores continua crescendo,
3
dentre estes já implicados na patogênese da aterosclerose, podemos listar: idade,
sexo, hipertensão arterial, tabagismo, diabetes mellitus tipo 2 (DM2), dislipidemia,
história familiar de infarto precoce do miocárdio, resistência periférica à insulina (RI),
obesidade e sedentarismo. Atualmente outros fatores, como níveis séricos
aumentados de homocisteína, lipoproteína (a), fibrinogênio e proteína C reativa, bem
como algumas infecções crônicas por organismos do gênero Chlamydia vêm sendo
investigados quanto a suas possíveis implicações neste processo (BRAUNWALD et
al., 2002; RIDKER et al., 2009), assim como também, a idéia de que tais fatores
possam ter uma etiopatogenia comum, pois, um hábito de vida sedentário, um
ambiente ansiogênico e uma alimentação hipercalórica rica em carboidratos e
gorduras saturadas, ao longo do tempo, podem levar à obesidade, aumento gradual
da resistência a insulina (RI), dislipidemia, hipertensão arterial (HA), diabetes
mellitus tipo 2 e síndrome metabólica (SM) (KANNEL, 2000; NCEP, 2002; SILVA;
LIMA, 2002; LINDSAY; HOWARD, 2004; TEIXEIRA et al., 2005; BRANDÃO et al.,
2005; MICHA et al., 2010; CHEN et al., 2010).
Alguns estudos mostram os benefícios do controle dos FR, como o estudo de
Ciorlia e Godoy, com seguimento de até 20 anos (CIORLIA; GODOY, 2005), o de
Caterina, demonstrando a relação entre a redução do colesterol e a incidência de
AVC (DE CATERINA et al., 2010). No Brasil, por meio dos dados do estudo
AFIRMAR, foi verificado que a maioria dos fatores de risco (FR) para infarto agudo
do miocárdio (IAM) é passível de prevenção (PIEGAS et al., 2003). Outros estudos
no Brasil, também enfatizam a grande importância do controle dos fatores de risco
na prevenção do infarto agudo do miocárdio (AVEZUM; PIEGAS; PEREIRA, 2005;
BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006).
O INTERHEART (YUSUF, 2004), um estudo destinado ao exame de fatores
de risco para doença arterial coronariana, foi desenvolvido em 262 centros de 52
países dos cinco continentes, onde pacientes com infarto do miocárdio nas
primeiras 24 horas foram comparados com um grupo controle e se verificou que
nove fatores de risco explicaram mais de 90% do risco para o infarto do miocárdio.
O tabagismo e a dislipidemia representaram mais de dois terços deste risco. Em
outro estudo que incluiu 22 países e 6.000 pessoas, metade das quais tinha sofrido
um acidente vascular cerebral, os investigadores identificaram dez fatores de risco
4
comuns, entre os quais tabagismo, pressão arterial e gordura abdominal,
apresentado no World Congresso of Cardiology (O’DONNELL et al., 2010). Dentre
os fatores de risco encontrados no estudo INTERSTROKE, cinco foram mais
prevalentes a hipertensão arterial, o tabagismo, o consumo de álcool, a gordura
abdominal e a má alimentação que são fatores de risco passíveis de intervenção. De
acordo com uma revisão feita pela American Heart Association (AHA), três classes
de compostos encontrados nas frutas e vegetais como os esteróis, flavonóides e
compostos
contendo
enxofre,
ácidos
graxos
monoinsaturados
(AGMI)
e
poliinsaturados (AGPI), de vitaminas e minerais com ação antioxidante (A, C, E, Se),
de ligninas, podem ser importantes na redução do risco de arteriosclerose
(MOREIRA et al., 2006; NAGAO; YANAGITA, 2008; O’DONNELL et al., 2010).
Os esteróis vegetais ou fitosteróis são substâncias de origem vegetal, cuja
estrutura química é muito similar à do colesterol. A sua ação hipocolesterolêmica
parece resultar da inibição da absorção do colesterol no intestino delgado, resultante
do fato de haver competição entre os fitosteróis e o colesterol na solubilização da
micela, alterando a atividade de enzimas envolvidas no metabolismo e excreção do
colesterol. Os fitoesteróis são mais hidrofóbicos e têm maior afinidade pelas micelas
do que o colesterol, logo estes são menos absorvidos e mais excretados (Fig.1). Os
principais tipos de fitoesteróis são o β-sitosterol, sitostanol e campesterol. O βsitosterol, principal fitosterol extraído dos óleos vegetais, e o sitostanol-éster, produto
de sua esterificação, reduzem a absorção do colesterol alimentar, em torno de 30 a
40%
(ROBERFROID;
CALDERON,
1994;
LOTTENBERG, 2002; LU, 2007).
Alguns
estudos
clínicos
e
também
experimentais têm mostrado que a adição de 3
g/dia de fitoesteróis na dieta pode reduzir os
níveis plasmáticos tanto do colesterol total como
da fração LDL-colesterol, mas as concentrações
Fig.1 Mecanismo Ação do Fitosterol
de
HDL-colesterol
e
de
triglicérides
não
apresentam modificações significativas (SANTOS, 2001; SALGADO et al., 2008). O
consumo diário de 1,6g de esteróis vegetais reduziu eficazmente o LDL-colesterol
em indivíduos com hipercolesterolemia moderada sem efeitos deletérios nos
biomarcadores de stress oxidativo (LOTTENBERG et al., 2002; HANSEL et al.,
2007). O EPIC NORTFOLK, estudo realizado com mais de 22 mil pessoas, observou
5
que quanto maior o consumo de fitosteróis, menor é o valor plasmático do LDL, tanto
em homens quanto em mulheres (ANDERSSON et al., 2004). Uma metanálise que
envolveu mais de 6.000 pacientes observou que o consumo de aproximadamente
2,0 g/dia de fitosterol levou a uma redução de 10% do nível do LDL-C plasmático e
que existe uma relação linear, de forma que quanto maior o consumo de fitoesterol
maior é a redução do LDL, até 3,0 g/dia, consumidos num único período ou ao longo
do dia (DEMONTY et al., 2009). Os transportadores responsáveis pela eliminação
do colesterol e fitosteróis são ABCG5 e ABCG8, devolvendo estes esteróis à luz
intestinal. Foram também descritos no fígado, onde secretam na bile, pela mesma
via, os fitosterois e o colesterol, mecanismo este diferente da ação da ezetimiba que
também reduz a absorção do colesterol, mas por meio da inibição do transportador
NPC1L1 que é o responsável pela absorção de esteróis livres na parede intestinal
(KATRAGADDA; RAI; ARORA, 2010). Os fitosteróis, quando associados à estatina
podem reduzir em até 17% o colesterol plasmático (BLAIR et al., 2000).
Os flavonóides têm estruturas químicas variadas e são encontrados nas
frutas, vegetais, nozes e sementes. Alguns têm mostrado efeito antioxidante, outros
possuem efeitos antiplaquetários. As principais fontes de flavonóides incluem o
vinho tinto e os produtos da soja (isoflavonas). O Euterpe oleracea Mart. contém
78mg de fitosteróis por litro do suco da fruta, os habitantes locais costumam
consumir até um litro do suco dessa fruta /dia (ROGEZ, 2000), que contém 1,28 g de
flavonóides por litro de suco, sendo o principal a cianidina-3 glucosídeo,
comprovadamente três a cinco vezes mais forte do que o trolox (análogo da vitamina
E) e um volume 10 a 30 vezes maior de antocianinas que o vinho tinto (ROGEZ,
2000; O’DONNELL et al., 2010). Os compostos fenólicos, ou polifenóis, presentes no
Euterpe oleracea Mart., são os grandes responsáveis por sua atividade antioxidante,
que atuam na prevenção da aterosclerose reduzindo a oxidação do LDL-colesterol.
Também possuem alto teor de lipídios, o que lhes conferem alto valor energético. O
Euterpe oleracea Mart. é uma fruta tropical rica em compostos bioativos como
carotenóides, antocianinas e compostos fenólicos. Os carotenóides, como o betacaroteno e o licopeno, são pigmentos naturais com algumas propriedades como
atividade antioxidante, anticancerígena e pró-vitamina A. As antocianinas pertencem
à classe dos flavonóides e possuem ação hipolipemiante, antiplaquetária,
antitrombótica e antioxidante. Esta fruta possui aproximadamente 0,2 a 3,8mg/100g
de carotenóides totais, 14,0 a 54,0mg/100g de antocianinas e 183,0 a 600 mg/100g
6
de compostos fenólicos e encontra-se entre as frutas que apresentam maior
capacidade antioxidante, sendo também rica em proteínas, vitaminas, minerais e
fibras, mantendo suas propriedades mesmo sob a forma de polpa congelada
(KUSKOSKI et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006; ALMEIDA et al., 2006; SANTOS et
al., 2008).
Estudos experimentais e clínicos mostram ação protetora de vitaminas
antioxidantes (beta-caroteno e vitamina E) na aterosclerose (KANG; LEAF, 2000).
Os
flavonóides
também
são
antioxidantes,
encontrados
nos
alimentos,
principalmente verduras, frutas, grãos, sementes, castanhas, condimentos e ervas e
também em bebidas como vinho e chá (RIBEIRO; SHINTAKU, 2004).
O estudo realizado por Lin mostrou que a suplementação com fitosteróis na
dieta pode modificar o metabolismo do LDL-colesterol (LIN et al., 2010),
principalmente com o uso de doses mais elevadas (RACETTE et al., 2010).
Tão importante quanto os fitosteróis, são as fibras vegetais. Na década de
1970 começaram a surgir estudos relacionando as fibras com a saúde, em
pesquisas demonstrando que em comunidades que consumiam poucos alimentos
processados industrialmente, eram raras as doenças como hipertensão, infarto do
miocárdio, obesidade e distúrbios gastrointestinais, (NEVES, 1997; GONÇALVES,
2007). Em nosso País, não existe uma avaliação precisa do consumo de fibras
dietéticas, muito embora, alguns trabalhos já alertem para o baixo consumo de fibras
em todas as classes sociais, como conseqüência da ingestão reduzida de frutas e
hortaliças (MATTOS; MARTINS, 2000).
Estudos realizados tanto com animais (RIBEIRO et al., 1998; ROSA et al.,
1998:
PIEDADE;
CANNIATTI-BRAZACA,
2003;
ODETOLA;
IRANLOYE,
Y;
IRANLOYE, O, 2004), quanto com humanos (OLIVEIRA; SICHIERI, 2004; JENKINS
et al., 2005; DIKEMAN; MURPHY; FAHEY, 2006; ROGOVIC et al., 2006), permitem
evidenciar os efeitos benéficos das fibras solúveis na atenuação da dislipidemia, a
partir de diferentes mecanismos de ação, ligados principalmente a redução da
absorção intestinal do colesterol dietético, ao aumento da excreção fecal dos ácidos
biliares, forçando o fígado a degradar mais colesterol, para produzir novos ácidos
biliares, e pela própria inibição da síntese endógena do colesterol pela succinil-CoA,
formada a partir do propionato originado do metabolismo das fibras solúveis no
intestino (LÓPEZ et al., 1997; RAUP et al., 2000; MARLETT; MCBURNEY; SLAVIN,
2002).
7
Mais recentemente, num estudo transversal de menor porte com cerca de
2.000 mulheres que fizeram parte da população do estudo National Health and
Nutrition Examination Survey (1999-2000), onde se avaliou a relação entre a
ingestão de grãos integrais e o IMC, demonstrou que mulheres que costumavam
consumir mais frequentemente grãos integrais tinham valores de IMC e
circunferência da cintura menores, e menor predisposição para terem sobrepeso
(SAVAGE; MARINI; BIRCH, 2008; GOOD et al., 2008). Todavia, faz-se necessário
um maior número de estudos (GONÇALVES et al., 2007; MELLO; LAAKSONEN,
2009).
Várias pesquisas têm demonstrado uma redução da taxa de mortalidade para
doenças cardiovasculares após o uso de ácidos graxos poliinsaturados ômega 3 de
cadeia longa (EPA, DHA) e de cadeia mais curta (Ácido α-linolênico - ALA)
(CONNOR, 2000; MORISE, 2004; RIBEIRO; SHINTAKU, 2004).
1.3 FISIOPATOLOGIA DA ATEROSCLEROSE
Estudos
experimentais
e
clínico–epidemiológicos
comprovam
que
a
aterosclerose é uma doença multifatorial, e como tal é necessária uma abordagem
mais abrangente no controle dos múltiplos fatores de risco cardiometabólicos, dentre
estes fatores a hipercolesterolemia exerce um papel muito importante. (KANNEL,
2000; NCEP, 2002; LINDSAY; HOWARD, 2004; TEIXEIRA et al., 2005; BRANDÃO
et al., 2005). Atualmente não se discute mais a influência da hipercolesterolemia na
doença arterial coronária. Os níveis sanguíneos de colesterol são determinados em
grande parte por fatores genéticos e fatores ambientais (NCEP, 2001; POZZAN;
POZZAN, R; BRANDÃO, 2005; BAIGENT et al., 2006; GIROLDO; ALVES; BATISTA,
2007; KOLANKIEWICZ; GIOVELLI; BELLINASO, 2008).
Atualmente se sabe que a história natural da aterosclerose, vai muito além da
dislipidemia (LIBBY, 2002). Ela consiste em um processo crônico, progressivo,
sistêmico, degenerativo de etiologia multicausal caracterizada por resposta
inflamatória e fibroproliferativa da parede arterial, a qual é determinada por
agressões à superfície arterial (SOWERS; EPSTEIN; FROHLICH, 2001). O distúrbio
da função do endotélio vascular é o passo inicial para a aterogênese (GORDON et
al., 1981; BRAUNWALD, et al.,2002), sendo a hipercolesterolemia um dos seus
8
principais desencadeantes (NCEP, 2002).
Em 1999, Russel Ross, um dos principais estudiosos da fisiopatologia da
aterosclerose, mostrava a aterosclerose como doença inflamatória (ROSS, 1999),
demonstrou que a elevação dos níveis de lipídios e de lipoproteínas, além da
elevação de outras moléculas do sangue como a homocisteína, infecções e
hipertensão, podem, induzir ou promover inflamações associadas à aterosclerose
(ROSS, 1999). Essa pesquisa mudou a visão sobre a aterosclerose, surgindo então
o conceito da aterosclerose como uma doença inflamatória crônica de origem
multifatorial em resposta à agressão endotelial, uma doença generalizada da parede
arterial, que pode evolutivamente progredir, regredir ou estabilizar-se, na
dependência de uma série de fatores (AIKAWA; LIBBY, 2004). Esse processo
dinâmico é caracterizado por remodelamento na parede arterial que pode
permanecer silencioso por muito tempo ou pode manifestar-se como um evento
vascular agudo, tornando-se clinicamente aparente, ou seja, a doença vascular
aterosclerótica deve ser entendida como um complexo processo fisiopatológico, em
que a inflamação crônica vascular se associa com ciclos de agudização da
inflamação e de acentuação do estado pró-trombótico (NISSEN et al., 2004;
SOLIMAN; KEE, 2008), acomete principalmente a camada íntima de artérias de
médio e grande calibre, é um processo que se inicia na infância, apresenta
progressão lenta, acometendo basicamente as artérias elásticas, como a aorta,
carótidas e ilíacas e as artérias musculares de grande e médio calibre, como
coronárias e poplíteas (ROSS; GLOMSET, 1976; LIBBY, 2002; ENGELHORN et al.,
2005; SPOSITO et al., 2007).
A American Heart Association classifica as lesões ateroscleróticas em dois
grupos: lesões precursoras e avançadas. As lesões do tipo precursoras são
silenciosas, discretas e não provocam desorganização da íntima, da média e nem da
adventícia,
elas
podem
ainda
ser
subdivididas
segundo
um
critério
predominantemente morfológico em lesões do tipo I, II e III (ZHAN-LONG et al.,
2008).
As lesões do tipo avançadas envolvem a desorganização da íntima arterial,
promovem um aumento significativo de sua espessura, provocando sérios danos
como trombose, embolia, necrose, infarto e hemorragia, assim como também o
excesso de lipídios pode modificar a morfologia da média e da adventícia. Elas se
classificam em lesões do tipo IV a VIII. É indiscutível que as lesões avançadas
9
podem trazer conseqüências deletérias à saúde do indivíduo, entretanto, é
importante lembrar que as lesões precursoras provêm o caminho para que as lesões
avançadas se desenvolvam (FRANÇA, T; FRANÇA, N, 2001).
A formação da placa aterosclerótica tem início com a agressão ao endotélio
vascular que pode ocorrer por diversos fatores como, a hipertensão arterial, o
tabagismo, a elevação de lipoproteínas aterogênicas que levam a disfunção
endotelial, manifesta principalmente por deficiência de óxido nítrico (NO) e
prostaciclina e por aumento dos níveis circulantes de endotelina-1 (ET-1),
angiotensina II (ang. II) e inibidores do ativador do plasmonogênio-1(PAI-1)
(PACKARD; LIBBY, 2008), aumentando assim a permeabilidade da íntima às
lipoproteínas plasmáticas favorecendo
a retenção das mesmas no espaço
subendotelial. O mecanísmo inicial da aterogênese é o depósito de lipoproteínas na
parede arterial que ocorre de modo proporcional à concentração dessas
lipoproteínas no plasma. Outra manifestação da disfunção endotelial é o surgimento
de moléculas de adesão leucocitária na superfície endotelial processo esse
estimulado pela presença de LDL minimamente oxidada. Em uma edição de 1989,
do New England Journal of Medicine, o pesquisador Daniel Steinberg postulou que
os radicais livres alteram ou oxidam o colesterol LDL e que se a esses pacientes
fosse fornecido antioxidantes adequados seria possível evitar essa oxidação
(STEINBERG, 1989). As moléculas de adesão leucocitária são indutoras da
produção de substâncias quimiotáxicas pelos macrófagos, levando a um processo
de adesão monocitária e interiorização no espaço subendotelial, ou seja, são
responsáveis pela atração de monócitos e linfócitos T para a parede arterial. Os
monócitos migram para o espaço subendotelial onde se diferenciam em macrófagos
que captam as LDL oxidadas, ficam repletos de lípides e passam a ser chamados de
células espumosas, sendo os principais componentes das estrias gordurosas que
são as lesões macroscópicas iniciais da aterosclerose. Alguns mediadores da
inflamação estimulam a migração e proliferação das células musculares lisas da
camada média arterial que ao migrarem para a íntima passam a produzir citocinas,
fatores de crescimento e matriz extracelular que formará parte da capa fibrosa da
placa aterosclerótica. A placa aterosclerótica é constituída por elementos celulares,
componentes da matriz extracelular, núcleo lipídico que é rico em colesterol e uma
capa fibrosa rica em colágeno. (LIBBY, 2003; SPOSITO et al., 2007; ARAÚJO, 2007;
BLASI, 2008).
10
1.3.1 Indução de aterosclerose em coelhos
A primeira investigação sobre indução experimental de aterosclerose ocorreu
em 1908 com Ignatowski, que utilizou coelhos alimentados com leite, carne e ovo e
observou espessamento da íntima em suas aortas. Logo depois, Lubarsch (1910,
1912) e Steimbiss (1913) desenvolveram aterosclerose em aorta de coelhos com
dietas
envolvendo
fígado,
adrenal
e
músculo
(IGNATOWSKI,
1908;
MOGHADASIAN, 2002).
Na Rússia, em 1912, o pesquisador Nicolai Anitschkov induziu aterosclerose
em coelhos alimentados com gemas de ovos misturadas a óleo de girassol. No ano
seguinte o próprio Nicolai publicou o que veio a ser o primeiro experimento de
reprodução de aterosclerose em animais na história da medicina. Esses trabalhos
foram praticamente esquecidos, mas retornaram com toda força por volta de 1954,
quando também da Rússia o pesquisador David Kritchevsky confirmou que coelhos
alimentados com gorduras e colesterol apresentavam lesões ateromatosas, afirmou
também que a administração de gorduras poliinsaturadas tinha provocado
diminuição nos níveis de colesterol dos animais pesquisados (KRITCHEVSKY et al.,
1989; KRITCHEVSKY, 2001; PUPPIN, 2004).
Em 1926, Clarkson e Newburgh, alimentaram coelhos com dieta rica em
colesterol e encontraram moderada aterosclerose em 71% dos coelhos alimentados
com 507 mg/dia de colesterol por 47-87 dias. Meeker e Kesten (1940-1941)
dissolveram 60 ou 250 mg de colesterol em óleo vegetal e acrescentaram à dieta de
coelhos por três meses e verificaram que os animais desenvolveram lesões
ateroscleróticas típicas, similares àquelas vistas em humanos, permanecendo, deste
modo, a teoria de que o colesterol é o precursor para o desenvolvimento de doença
vascular aterosclerótica (KRITCHEVSKY, 1995).
Para induzir hipercolesterolemia em animais, têm-se utilizado dietas contendo
1% de colesterol em rações, em várias pesquisas, alcançando hipercolesterolemia
moderada com níveis de colesterol plasmáticos na faixa de 200 a 800 mg/dl
(HOLVOET; COLLEN, 1997; IHARA et al.,2001), mas essas lesões produzidas são
topográfica e morfologicamente dissimilares àquelas vistas em humanos, devido em
parte, ao fato de que humanos comumente não ingerem grandes quantidades de
colesterol, e em geral, seus níveis de colesterol plasmático não excedem 800mg/dl,
11
além do que processam e toleram o consumo de colesterol melhor do que os
coelhos (KOLODGIE et al., 1996). Essa indução é para investigarmos substâncias
que podem ser viabilizadas, no futuro, como medicamentos no controle do
metabolismo lipídico e no desenvolvimento de testes de potenciais terapias e
diagnósticos entre diferentes procedimentos experimentais (PERCEGONI et
al.,
2004; LIMA et al., 2008).
As lesões ateroscleróticas observadas são compostas por três componentes
maiores, o primeiro é o componente celular, que predominantemente compreende
células musculares lisas e macrófagos, o segundo componente é o tecido conectivo
matriz e lipídio extracelular e o terceiro componente é o lipídio intracelular, que se
acumula dentro de macrófagos, convertendo-se, então, em células espumosas
(CROWTHER, 2005). Tem sido observada a presença de leucócitos aderidos ao
arco aórtico torácico e abdominal de coelhos após três semanas de dieta
enriquecida com 0,2% de colesterol; ao se aumentar o tempo de indução para 3-5
semanas com essa mesma dieta, numerosas células espumosas são encontradas
no espaço subendotelial e constituem o desenvolvimento de camadas de gordura na
mesma localização em que monócitos aderentes foram observados anteriormente
(ROSENFELD et al., 1987).
O coelho é a espécie mais estudada, em especial a linhagem Nova Zelândia,
citada pela primeira vez por IGNATOWSKI (1908) e isso se deve ao fato desta
espécie desenvolver hipercolesterolemia, em poucos dias, quando se administra
uma dieta acrescida de colesterol entre 0,1 a 2% por aproximadamente 12 semanas
(BOCAN et al., 1993; YANNI, 2004; JALDIN et al., 2006; RIEDMÜLLER et al., 2010).
Esse modelo permite a formação de lesões ateroscleróticas nas aortas torácica e
abdominal (PATEL et al., 2008; DUCKWORTH et al., 2009) assim como, em
carotídas (YANNI, 2004; HERTZEL et al., 2008). Bocan et al (1993) forneceram a
coelhos uma dieta composta por níveis variáveis de colesterol, mostrando que a
extensão e o tipo de lesão aterosclerótica eram proporcionais à concentração de
colesterol plasmático, o qual, por sua vez, aumentava de acordo com a percentagem
de colesterol na dieta. As alterações no perfil lipídico ocorriam precocemente, cerca
de duas semanas após a introdução da dieta hipercolesterolêmica. Já as lesões nas
aortas de coelhos dependiam da concentração do colesterol, assim como também
da duração da dieta, sendo que uma baixa concentração de colesterol quando
administrada por um longo período provocava lesões na artéria aórtica bastante
12
semelhantes às lesões que ocorrem em humanos (KOLODGIE et al., 1996;
FINKING; HANKE, 1997; AIKAWA et al., 1998; SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et al.,
2003, HELFENSTEIN et al., 2011).
A extensão da aterosclerose em aorta de coelhos pode ser quantificada pela
superfície de lesões sudanofílicas (STAPRANS et al., 1998) e por análise imunohistoquímica (NAKAZATO et al., 1996). O grau de aterosclerose em coelhos tende a
ser maior na aorta abdominal do que na torácica, o que pode ser devido ao efeito
hemodinâmico ou pelo fato de que a aorta abdominal de coelhos diminui
gradualmente abaixo na bifurcação aórtica e dessa forma, a aorta mais distal pode
ter mais lesão em relação à aorta proximal (JOHNSTONE et al., 2001). Mudanças
ateromatosas com 08 semanas em coelhos alimentados com colesterol são
formadas na aorta torácica e, então, estendem para a aorta abdominal, artéria
coronária e outros vasos, predominando lesões concêntricas na aorta torácica e na
porção proximal da artéria coronária (KAMIMURA et al., 1999).
1.3.2 Evolução da aterosclerose em humanos
A
doença
aterosclerótica
quando
clinicamente
manifesta
progride
rapidamente, com conseqüências fatais, logo é fundamental a abordagem preventiva
na história natural das doenças cardiovasculares, sendo a prevenção um caminho
viável, pois estudos epidemiológicos como os de Framingham, o MRFIT, nos
Estados Unidos e o PROCAM na Europa (ASSMANN et al., 1998), já demonstraram
claramente a importância dos fatores de risco para o desenvolvimento da
aterosclerose e suas complicações e têm identificado fatores de risco que podem ser
modificáveis e que levam a redução do risco cardiovascular (GORDON et al., 1981;
PETER et al., 1998; NEATON et al., 1981; ASSMANN et al., 1998; NCEP, 2002;
BERTOLAMI, M; BERTOLAMI, A, 2006). A importância da redução dos níveis de
colesterol e LDL-C elevados na etiologia da doença arterial coronária (DAC) na
prevenção
tanto primária
quanto
secundária
desta
doença
já
está
bem
documentada, assim como também níveis elevados de HDL-C relacionados à
proteção cardiovascular, tanto na prevenção primária quanto secundária (CASTELLI,
1986; CONSENSUS, 2002; GRUNDY et al., 2004), pois, estudos indicam que o HDL
participa do transporte reverso do colesterol, inibindo o processo de aterogênese
13
(CASTELLI et al., 1986) e apesar da escassez de estudos que avaliem o benefício
da manutenção dos triglicerídeos abaixo de 150mg/dl, todas as diretrizes
aconselham a redução e manutenção como uma medida de prevenção
cardiovascular, particularmente nos diabéticos, onde a hipertrigliceridemia em geral
se associa a LDL-C pequena e densa e a redução do HDL-C, constituindo uma
dislipidemia aterogênica (DUCKWORTH et al., 2009).
O consumo de dietas ricas em ácidos graxos monoinsaturadas (ácido oléico)
e poliinsaturados, em substituição a gorduras saturadas, assim como também a
dieta rica em fitosteróis e fibras exercem efeitos fisiológicos sobre humanos,
reduzindo os níveis plasmáticos de colesterol (REBOLLO et al., 1998; TURATTI et
al., 1985; DE ANDELIS, 2001; MAGALHÃES;CHAGAS; LUZ, 2002; FEIO et al.,
2003; HU, 2003; OPAS, 2003).
1.4 CONSIDERAÇÕES SOBRE A EUTERPE OLERACEA (AÇAÌ)
O Brasil é o maior produtor, consumidor e exportador do açaí, bebida símbolo
do país, rica em gorduras mono e poliinsaturadas, em fitosteróis e fibras, produzida
a partir dos frutos do açaí. A bebida extraída da fruta é normalmente comercializada
à temperatura ambiente ou então na forma congelada (MENEZES; TORRES;
SABAA-SRUR, 2008). A Euterpe oleracea (açaí) é uma fruta típica da região
Amazônica largamente consumida no Brasil e exportada para muitos países da
Europa, Ásia e Américas. Estudos químicos revelam que a Euterpe oleracea é rica
em antocianinas e em vários polifenóis (DEL POZO- INSFRAN; BRENES;
TALCOTT, 2004; RODRIGUES et al.,, 2006; METENS-TALCOTT et al., 2008; CHIN,
2008; SANTOS, 2008). Alguns estudos demonstram que promove melhora da
função endotelial além de aumentar a biodisponibilidade do óxido nítrico e a
liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio (ROCHA et al., 2007).
Apresenta
na
sua
composição
ácidos
graxos
de
boa
qualidade
(60%
monoinsaturado e 13% poliinsaturado), e é também rico em fibras e vitamina E
(EMBRAPA, 2006). Recentemente, alguns benefícios da Euterpe oleracea no perfil
lipídico foram demonstrados num estudo envolvendo ratos hipercolesterolêmicos
(DE SOUZA et al., 2010). Apesar de todos esses aspectos interessantes, seus
efeitos no metabolismo lipídico e na aterosclerose são muito pouco conhecidos.
14
O açaí ocorre predominantemente na região Norte, e entre os estados mais
valorizados produtores de açaí podemos citar o Pará, o Maranhão, o Amapá, o Acre
e Rondônia, sendo o primeiro, responsável por 95% da produção, calculada em 100
a 180 mil litros/dia em Belém (HOMMA; FRAZÃO, 2002; OLIVEIRA et al., 2002;
MENDES, 2003). Atualmente sua expansão econômica, já atinge novos mercados,
no próprio país (sudeste) e até mesmo em alguns países da Europa, Estados
Unidos, Japão e China (SOUTO, 2001; SILVA, 2002).
O
açaizeiro
(Euterpe
oleracea)
destaca-se na rica floresta amazônica,
como sendo a palmeira mais produtiva
desse estuário, tanto em frutos como em
gêneros derivados, sendo o fruto o
principal produto oriundo da palmeira.
Faz parte da família das palmáceas
(MENEZES;
TORRES;
SABAA-SRUR,
2008). Esta palmeira brasileira é uma
Figura 2: Palmeira do açaí
planta que se desenvolve próxima aos ribeirões, rios, igapó, várzea e nas matas de
terra firme, e com menos freqüência, em terrenos mais afastados e locais
pantanosos (figura 2). É uma palmeira delgada
e alta que pode atingir uma altura de 20 a 25
metros. O açaizeiro apresenta farta perfilhação
e alcança, no estado nativo, cerca de 20
palmeiras por "touceira" (das quais pelo
menos três em produção). Cada touceira
produz entre 6 e 8 cachos com 2,5 kg cada
um, representando de 15 a 20 quilos de frutos
Figura 3: Cachos e frutos do açaí
por palmeira (em duas safras) e de 12 a 25
toneladas de frutos/ano. Os troncos são lisos, roliços, longos, de cor clara, sem
espinhos. A palmeira do açaí apresenta folhas grandes, compridas e recortadas em
tiras, de cor verde-escura, atingindo até 2 metros de comprimento. As folhas são
usadas na cobertura das casas (MATTOS, 1993). A frutificação mais intensa do
Euterpe oleracea
é de outubro a janeiro (MENEZES; TORRES; SABAA-SRUR,
2008).Os frutos são pequenos, redondos, roxos, quase pretos e agrupados em
15
cachos pendentes. Tem um caroço grande e polpa muito fina (figura 3). O fruto é
colhido subindo-se na palmeira com o auxílio
de um trançado de folha amarrado aos pés
(a peçonha).
O principal produto oriundo do fruto é
uma
bebida
de
consistência
pastosa,
denominada açaí. A consistência pastosa da
bebida é devido aos elevados teores de
Figura 4: Açaí sendo despolpado
amido
(9,30%)
e
pectina
(0,67%)
encontrados na parte comestível do fruto.
São necessários cerca de 2,5 quilos de frutos maduros para a produção de um litro
de suco de açaí. De cor arroxeada, a bebida é
assim extraída: colocam-se os caroços do açaí
de molho na água para amolecer a casca fina
que os reveste, em seguida os caroços são
amassados com certa quantidade de água e
com o auxilio de pequenas despolpadeiras
(Figura 4), originando assim o extrato de açaí
(Figura 5), seu armazenamento se faz em
pequenos
sacos
plásticos
lacrados.
(EMBRAPA, 2006).
Figura 5: Extrato (vinho) de açaí
No Estado do Pará existe um consumo extremamente elevado desta bebida
que é rica em fibras, fitosteróis, ácidos graxos mono e poliinsaturados e
antioxidantes (DEL POZO-INSFRAM; BRENES; TALCOTT, 2004). Segundo Rogez,
o açaí possuí, em grande quantidade, o mesmo corante presente nas uvas, a
antocianina e, segundo o pesquisador, um litro de açaí médio (entre a consistência
fina e grossa) contém 33 vezes mais antocianina que um litro de vinho tinto
“francês”. Na região, esta fruta é muito consumida sob a forma de “suco” ou “vinho”,
sorvetes, cremes, geléias e etc. (ROGEZ, 2000).
Alguns estudos sugerem vários benefícios à Euterpe oleracea (açaí), dentre
eles podemos citar a sua ação vasodilatadora, anti-hipertensiva, antiinflamatória, sua
ação na redução dos fatores de risco e nas desordens metabólicas como sugeriu
16
Oliveira, que realizou um estudo em que induziu a síndrome metabólica em ratos e
observou que no grupo alimentado com a Euterpe oleracea houve uma redução da
Síndrome metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010). Um estudo realizado por Udani,
também observou redução nos fatores de risco para síndrome metabólica ao
alimentar 10 adultos que apresentavam sobrepeso, com 100g de Euterpe oleracea
ao dia por um período de 30 dias e observou que ocorreu redução dos níveis dos
marcadores de risco selecionados para síndrome metabólica (UDANI, et al., 2011).
Noratto também sugeriu uma possível ação anti-inflamatória da Euterpe oleracea
num estudo realizado em que observou uma inibição da expressão das moléculas
de adesão e da atividade do NF-kB, por diminuírem a proteína ICAM-1 e a PECAM 1 (NORATTO et al.,2011).
Apesar de possuir um alto teor de gordura, 66% destas gorduras são
monoinsaturadas, que são gorduras benéficas ao organismo porque diminuem os
níveis de colesterol LDL e ajudam a aumentar os níveis de colesterol HDL,
auxiliando,
assim,
KUTHBERT;SPADY,
na
proteção
1993;
do
SESSIONS;
sistema
cardiovascular
SALTER,
1995).
(HORTON;
Segundo
as
recomendações nutricionais atuais o perfil ideal é 50% de ácidos graxos
monoinsaturados, máximo de 33% de ácidos graxos saturados e 17% de
poliinsaturados. No açaí temos a seguinte proporção de gorduras: 60% de gorduras
monoinsaturadas, 13% poliinsaturados e < 3% de saturadas. (EMBRAPA, 2006;
NEPA-UNICAMP, 2006).
O açaí contém 60% de ácido oleico, 22% de ácido palmítico, 12% de ácido
linoléico e quanto aos fitosteróis um número recente do Journal of Agricultural and
Food Chemistry, publicou uma pesquisa realizada com 12 voluntários saudáveis que
consumiam o suco de açaí diariamente. De acordo com a pesquisadora
responsável, Dra. Susanne Talcott, o açaí é pobre em açúcares e em sua visão, os
benefícios são tantos que a fruta pode ser considerada uma "mistura de vinho tinto e
chocolate". O estudo conduzido na Univesidade do Texas conseguiu mostrar que os
antioxidantes (antocianinas e vitamina C) do açaí são muito bem absorvidos, o que
pode contribuir para a prevenção de muitas doenças e condições como o câncer, os
problemas cardiovasculares e o envelhecimento precoce (DEL POZO-INSFRAN;
PERCIVAL; TALCOTT, 2006). Outros estudos, também referem importantes
propriedades antioxidantes da Euterpe oleracea (METENS-TALCOTT et al., 2008;
PACHECO-PALENCIA; MERTENS-TALCOTT; TALCOTT, 2008).
17
O açaí em si é uma fruta de grande valor energético e rico em valores
nutricionais e até mesmo funcionais, então a sua ingestão deve ser o mais natural
possível e em substituição a pequenas refeições. pois, como vimos na constituição
do açaí a concentração de fibras alimentares totais é notavelmente elevada (em
torno de 30g/100 g de matéria seca), lipídios totais em torno de 48g / 100g e as
antocianinas em torno de 1.28 g em 1 litro de açaí do tipo médio, ou seja 1% da
matéria seca. As fibras têm um papel muito importante na regulação do transito
intestinal, sendo sua ingestão diária recomendada de cerca de 35g / adulto. A
população do Pará consome esta fruta diariamente e em grande quantidade,
portanto, atingindo facilmente essa cota, pois 1 litro de açaí do tipo médio contém
31,5 g de fibras alimentares totais, o que corresponde a 90% da recomendação
diária, podendo o açaí realmente ser considerado uma excelente fonte de fibras e de
lípides, pois, representam cerca de 90% das calorias contidas nessa bebida. Logo, o
consumo de açaí permite assegurar um bom aproveitamento em ácidos graxos
mono e poliinsaturados, de antioxidantes (flavonóides) e também de proteínas (12,6
g em 1 litro de açaí médio), sendo o valor nutricional muito semelhante ao do ovo
(EMBRAPA, 2006). O Açaí é também uma importante fonte de fitoesteróis e
apresenta a seguinte proporção: Sitosteróis (78%), stigmasterol (6.5%), campesterol
(6.0%), avenasterol (6.5%) e colesterol (2.0%). (LUBRANO; ROBIN; KHAIAT, 1994;
LEEDES; HUSSAIN, 1998; SILLBERBERG, 2000; COOK-FULLER, 2000; ROGEZ,
2000; RODRIGUES et al., 2006; SCHAUSS et al., 2006; PACHECO-PALENCIA;
MERTENS-TALCOTT; TALCOTT, 2008; CHIN et al., 2008; METENS-TALCOTT et
al., 2008).
Segundo Rocha, o Euterpe oleracea Mart. melhora a função endotelial,
provavelmente por aumentar a vasodilatação endotélio dependente, assim como a
biodisponibilidade do óxido nítrico e do fator de hiperpolarização derivado do
endotélio (ROCHA et al., 2007).
Recentemente, foram relatados alguns benefícios do Euterpe oleracea nos
biomarcadores
do
estresse
oxidativo
e
no
perfil
lipídico
de
ratos
hipercolesterolêmicos induzidos experimentalmente (de SOUZA et al., 2010). Em
outro estudo semelhante, foi observado melhora dos componentes da síndrome
metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010).
18
2. OBJETIVOS
Gerais:
Avaliar os efeitos da Euterpe oleracea (açai) na aterosclerose induzida
experimentalmente.
Específicos:
Analisar as modificações induzidas pela Euterpe oleracea (açai) no perfil
lipídico e desenvolvimento de aterosclerose, no modelo de coelhos induzido por
dieta rica em colesterol.
Examinar as modificações na síntese e absorção de colesterol, pelas
quantificações plasmáticas de desmosterol e dos fitosteróis (campesterol e
sitosterol).
19
3. MÉTODOS
3.1 Desenho Experimental
O estudo foi constituído por 30 coelhos, da raça Nova Zelândia, brancos,
machos, com cerca de três meses de idade e peso entre 2,5 – 3,0 Kg, que
permaneceram os primeiros 15 dias em adaptação. Após este período inicial foram
coletados 10 ml de sangue total para as dosagens laboratoriais basais, sendo então
a ração normal consumida anteriormente substituída por uma ração enriquecida com
colesterol a 0,5%, para indução de hipercolesterolemia e desenvolvimento de
aterosclerose, por um período de 12 semanas. Após novas determinações
laboratoriais e verificação dos níveis de colesterolemia, os animais foram
aleatoriamente alocados em dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). Os
animais de ambos os grupos passaram a receber dietas enriquecidas com colesterol
a 0,05%, para indução de hipercolesterolemia moderada, mas diferenciadas como
descritas a seguir:

Grupo I – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol)+ 80 ml de açaí/dia
+ água

Grupo II – Dieta hipercolesterolêmica (0,05% de colesterol) + água
Após 12 semanas deste tratamento, novamente foram coletados 10 ml de
sangue total para avaliação dos parâmetros. Neste momento, os animais foram
sacrificados, retirando-se a artéria aorta em toda a sua extensão para quantificação
da área ocupada pelas lesões ateroscleróticas e estudo histopatológico das placas
de ateroma.
20
30 Coelhos
1º coleta de sangue - laboratório basal
Dieta hipercolesterolêmica
( 0,5% de colesterol)
12 semanas
2º coleta de sangue: Glicemia
Lipidograma
Randomização dos Animais
15 coelhos
Grupo Controle
12 semanas
excluído
sssssss
ss
Ração + 0,05%
colesterol +água
3 coelhos
morreram
12
coelhos
controle
15 coelhos
Euterpe oleracea
Ração + 0,05% CT
Euterpe oleracea
12 semanas
15 coelhos
Eut.. oleracea
3ª col. de sangue : Glicemia, Lipidograma e Fitosteróis
Sacrifício dos animais, retirada das
aortas e coloração pelo Sudam III
Coloração pelo SUDAM III
Análise Histopatológica das Aortas
- Avaliação macroscópica
- Aval. extensão lesões ateromatosas
- Avaliação microscópica
- Aval. histológica por microsc. óptica
- Estudo Imuno-histoquímico
- Estudo Histopatológico
Figura 6. – Organograma do desenho experimental do estudo
21
3.2 Animais
Os animais foram adquiridos da empresa Criex Cunicultura Ltda / Mogi das
Cruzes - São Paulo e durante todo o período do estudo foram alojados no biotério do
laboratório de cirurgia experimental da Universidade Federal do Pará, localizado no
"Hospital Universitário João de Barros Barreto", mantidos em gaiolas individuais (50
x 50 cm), de ferro galvanizado e pintadas, dispostas lado a lado, com fundo
removível, para que não tivessem contato com seus dejetos, sendo higienizadas
diariamente. A temperatura local foi mantida constante em torno de 22ºC, com ciclo
de luz claro-escuro de 12 h, receberam água à vontade e ração peletizada Nuvilab
cobaias (Nuvital, Brasil) nos primeiros 15 dias de adaptação. Posteriormente, como
indicado em nosso protocolo, a ração foi enriquecida com colesterol 0,5% nas
primeiras 12 semanas e 0,05% nas 12 semanas finais de forma similar em ambos os
grupos. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa animal da
Universidade Federal do Pará sob o número 002/2006.
Todos os dias pela manhã foram recolhidas as sobras de ração do dia
anterior, que era pesada para controle da ingestão de colesterol; foi realizado
também o controle da ingestão de açaí por animal, diariamente. Os animais foram
pesados mensalmente e o consumo de ração também foi controlado mensalmente.
3.3 Dieta
A ração oferecida aos coelhos (Nuvilab Cobaias Nuvital, Brasil) apresentava a
seguinte composição: milho integral moído, farelo de alfaia, farelo de soja, farelo de
trigo, calcário calcítico, fosfato bicálcico, cloreto de sódio e vitaminas A, B, C, D, E,
K, microelementos minerais e aminoácidos (DL- metionina).
Durante os primeiros 15 dias de adaptação a ração foi oferecida livremente e
se calculou a média da quantidade diária consumida por cada coelho que era cerca
de 100 g ao dia.
Os coelhos passaram então a receber a mesma ração acrescida de colesterol
conforme já descrito. O colesterol em pó (Sigma C8503, EUA) foi misturado à ração,
após a mesma ser moída, com uma pequena quantidade de água, para hidratá-la,
formando então uma massa semi-pastosa que em seguida era colocada em uma
22
máquina industrial de moer carne formando, como produto final, pequenos pellets
que foram colocados em uma estufa industrial a 60ºC, por 24 h, para secagem. Após
o preparo, a ração foi separada em porções individuais de 100 g, para uso diário,
sendo então colocada em sacos plásticos lacrados. Os animais foram pesados
mensalmente e o consumo de ração controlado diariamente.
3.4 Indução de Hipercolesterolemia
A hipercolesterolemia foi induzida por meio de uma dieta hipercolesterolêmica
preparada na proporção de 0,5 g de colesterol em pó para 100 g de ração (0,5%); o
colesterol foi obtido junto a empresa Sigma-Aldrich Brasil Ltda, representante
exclusivo da Sigma Corporation (Sigma C8503, EUA). Após o preparo, a ração foi
separada em porções individuais de 100 g, para uso diário, sendo então colocada
em sacos plásticos lacrados. Após 12 semanas de dieta hipercolesterolêmica para o
desenvolvimento de aterosclerose, os coelhos foram aleatoriamente designados
para compor dois grupos, o grupo I (açaí) e o grupo II (controle). O açaí foi fornecido
aos
coelhos
com
base
nos
estudos
realizados
anteriormente
por
CONSTANTINIDES,1960; FANI,1987; JORGE, 1997; IHARA, 2001.
3.5 Euterpe oleracea (Açaí)
A Euterpe oleracea foi obtida da região amazônica (Estado do Pará, Brasil). O
vinho do açaí do tipo médio foi obtido por meio dos frutos maduros colocados de
molho em água morna para que amoleçam e soltem do caroço. Em seguida, foram
amassados em pequenas despolpadeiras (máquinas de inox artesanais), diluídos
com uma pequena quantidade de água, na proporção de 2,5 Kg desses frutos para
40 ml de água, para se obter um litro do extrato, produzindo-se assim vinho de
consistência pastosa e de cor vermelha-arroxeada. Após produzido, o vinho do açaí
foi embalado em sacos plásticos que foram lacrados imediatamente para se evitar
possíveis contaminações, fornecido pela empresa Francisco Ltda, grande produtora
na cidade de Belém, que obedece às normas preconizadas de higienização. O
mesmo foi produzido diariamente e enviado ao biotério, sendo oferecido
imediatamente aos animais do grupo açaí em vasilhas de vidro, na quantidade de 80
23
ml/dia, puro sem acréscimos de água ou qualquer outra substância, durante 12
semanas.
3.5.1 COMPOSIÇÃO QUÍMCA DA EUTERPE OLERACEA
A composição do extrato de Euterpe oleracea é descrita na Tabela 1,
conforme dados de ROGEZ (2000).
Tabela 1: Composição Química da Euterpe oleracea
QT.
COMPOSIÇÃO
UNIDADE
Matéria Seca
%
15.00
Proteínas
g/100 g(1)
13.00
Lipídios Totais
g/100 g(1)
48.00
Gord. monoinsaturada
g/100 g(1)
28.8
Gord. Poliinsaturada
g/100 g(1)
6.24
Carboidratos
g/100 g(1)
1.50
Frutose
g/100 g(1)
0.00
Glicose
g/100 g(1)
1.50
Sacarose
g/100 g(1)
0.00
Fibras
g/100 g(1)
34.0
Energia
Kcal/100 g(1)
66.3
Cinza
g/100 g(1)
3.50
Sódio
mg/100 g(2)
56.9
Potássio
mg/100 g(2)
932
Cálcio
mg/100 g(2)
286
Magnésio
mg/100 g(2)
174
Ferro
mg/100 g(2)
1.50
Cobre
mg/100 g(2)
1.7
Zinco
mg/100 g(2)
7.0
Fósforo
mg/100 g(2)
124
Vitamina B1
mg/100 g(2)
0.25
Alfa-tocoferol
mg/100 g(2)
45.0
(1)Matéria seca; (2)Cálculo por diferença.
Fonte: Rogez (2000).
DE
SECA
MATÉRIA
24
Em adição aos dados fornecidos pela EMBRAPA sobre a composição
química da Euterpe oleracea (Tabela 1), quantificamos os níveis de fitosteróis da
mesma. Observamos uma concentração de 15 mg de fitosteróis por 100 g da fruta,
principalmente às custas de β-sitosterol, em nossa análise por espectrometria de
massa.
3.6. PARÂMETROS AVALIADOS DO PROTOCOLO EXPERIMENTAL
3.6.1 Aspectos Laboratoriais
Para a coleta da amostra de sangue, após jejum de 12-14 horas, foram
utilizados escalpes 21G (Becton Dickinson Indústrias Cirúrgicas Ltda), por meio dos
quais foram colhidas amostras de sangue da artéria central da orelha dos coelhos
que encontravam-se previamente imobilizados em uma caixa de contensão. Utilizouse o EDTA (BD VacutainerTM , Brasil) e o fluoreto de sódio (BD VacutainerTM , Brasil)
como anticoagulantes. Foram colhidos 10 ml de sangue que foram centrifugados por
10 min a 3000 rpm para obtenção do soro para dosagens bioquímicas de colesterol
total e do HDL-C, assim como dos triglicerídeos e glicemia. As dosagens
bioquímicas foram processadas no Laboratório Paulo Azevedo
.
3.6.1.1 DOSAGENS BIOQUÍMICAS
Foi realizado um total de três coletas sanguíneas para a dosagem do perfil
lipídico e glicemia dos animais, a 1ª, logo no início do estudo, para verificar o perfil
lipídico basal dos coelhos, a 2ª, após as 12 semanas de indução de
hipercolesterolemia, para poder se realizar a randomização dos animais e a 3ª, após
as 12 semanas seguintes, no final do estudo.
3.6.1.2 MÉTÓDOS EMPREGADOS
3.6.1.3 LÍPIDES
Os lípides foram determinados pelo método enzimático colorimétrico, usando
os reagentes apropriados (Olympus) para o colesterol total (CT), HDL- colesterol
25
(HDL-C) e triglicerídeos (TG). Os níveis de glicose no sangue foram dosados pelo
método enzimático colorimétrico (Advia, 1650, Bayer, Japan).
3.6.1.4 QUANTIFICAÇÃO DO FITOSTERÓIS
Para a quantificação do β-sitosterol e do campesterol (marcadores da
absorção do colesterol), assim como do desmosterol (precursor endógeno da
síntese do colesterol) foi usada a cromatografia líquida de ultra performance (UPLC)
e espectrometria de massas (MS). Estes esteróis foram quantificados em amostras
de plasma por um método desenvolvido pela Synchrophar (Campinas, SP, BRASIL).
O método consiste na extração líquido a líquido, seguido pela separação no sistema
UPLC e detecção com o ion APCI nascente da massa espectrofométrica operando
sobre “íon simples monitorados” para cada esterol (β-sitosterol, campesterol e
desmosterol). A extração foi realizada com uma mistura de dietil éter e hexanes (80 ∕
20; v ∕ v) por centrifugação seguida de evaporação da camada orgânica a 50ºC sob
um leve vapor de nitrogênio. O resíduo da evaporação foi reconstituído com
isoproterenol e injetado no sistema UPLC (Acquity Waters Co.,Milford). O sistema
MS (Quattro Premier-XE, Waters Co., Manchester) foi ajustado pela monitoração do
íon simples formado pela ionização química da pressão atmosférica (APCI) do íon
nascente. Os esteróis foram detectados em suas formas livres e não esterificadas;
monitoramos os íons com m ∕ z, 367.30 para desmosterol, 397.25 para β-sitosterol e
383.60 para campesterol. Os níveis dos compostos foram determinados pela
comparação da resposta pico sobre uma curva de calibração de 0.5 μg ∕ mL para
10.0 μg ∕ mL. As amostras que apresentaram altos níveis (mais do que 10.0 μg ∕ mL)
foram diluídas para comparar com os níveis de calibração.
3.7 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS E RETIRADA DAS AORTAS
3.7.1 Aspectos cirúrgicos do protocolo experimental
Ao final do experimento, os animais foram sacrificados retirando-se a artéria
aórtica em toda a sua extensão para avaliação da área ocupada por lesões
ateroscleróticas e estudo histopatológico das placas de ateroma. Na ocasião do
sacrifício os animais foram pesados e anestesiados com cloridrato de cetamina 35
26
mg/kg de peso (Ketalar, Parke-Davis, EUA ) e cloridrato de xilazina 15 mg/kg de
(Rompum, Bayer, EUA), por via intramuscular. A anestesia foi potencializada com
éter etílico quando necessário. Sob anestesia profunda, os animais foram colocados
em uma canaleta para dissecação e realizada incisão mediana toraco-abdominal,
sendo obtidas amostras de sangue por punção intra-cardíaca. Em seguida, os
órgãos abdominais foram rebatidos para isolamento da aorta que foi seccionada
desde o arco aórtico até a bifurcação ilíaca. Foram então perfundidas por uma
solução de papaverina a 12% em PBS – 37ºC, abertas longitudinalmente, presas em
placas de isopor e fixadas em formol tamponado por 24horas, quando então foram
retiradas do isopor e coradas pelo Sudam III, para que o conteúdo lipídico da placa
fosse evidenciado.
3.7.2 ANÁLISE HISTOPATOLÓGICA DAS AORTAS
3.7.2.1 Avaliação macroscópica
Após a fixação, as aortas foram coradas com Sudam III, para que o conteúdo
lipídico da placa fosse evidenciado. As aortas coradas foram analisadas
comparativamente em ambos os grupos I e II, para avaliação macroscópica em
relação à intensidade de presença de placas gordurosas.
3.7.2.2 Avaliação da extensão das lesões ateromatosas
As aortas abertas, fixadas e coradas, foram reproduzidas em folhas de
acetato, para quantificarmos a extensão da área de aorta comprometida por meio da
planimetria computadorizada, realizada em mesa digitadora acoplada a um
microcomputador. Os resultados foram expressos em percentagem de área lesada
em relação à área total da aorta.
27
3.7.2.2.1 Avaliação microscópica
Foram seccionados nove fragmentos de aproximadamente 5 mm cada, sendo
três do arco aórtico, três da aorta torácica e três da aorta abdominal.
3.7.2.2.2 Avaliação histológica por microscopia óptica
Estes fragmentos foram embebidos em parafina e obtidos cortes de 4 µm. A
histomorfometria foi realizada em cortes histológicos corados por Verhoeff para
melhor identificar os limites entre a camada média e a íntima da artéria (SILVA,
2002). As imagens obtidas em um aumento de 6,5 x foram capturadas com auxílio
de uma vídeo-câmera Sony CCD-IR15 (Sony, Japão) conectadas a um microscópio
Olympus BX-40. As imagens foram então digitalizadas e transmitidas a um
microcomputador, e com a utilização de um programa para morfometria, IMAGE
TOOL FOR WINDOWS VS 3.0 ( The University of Texas Health Science Center in
San Antonio UTHSCSA, EUA), foi mensurada então a maior altura das placas (µm),
as áreas das camadas íntima e média (mm2) e calculada a relação íntimamédia(I/M).
3.7.3 Estudo imuno-histoquímico
Por meio de reação imuno-histoquímica identificou-se macrófagos e células
musculares lisas, utilizando-se
os seguintes anticorpos monoclonais:
anti-
macrófagos de coelhos na diluição de 1:200 em BSA 1% (RAM-11, Dako
Laboratories, EUA) e anti-α actina para músculo liso humano na diluição de 1:200
em BSA 1% (HHF-35, Dako Laboratories, EUA). Este ensaio baseou-se no método
imunoenzimático indireto em três etapas, utilizando-se o complexo estreptoavidinabiotina-peroxidase. Foram colhidos cortes histológicos com 2 µm de espessura em
lâminas silanizadas (Sigma, St Louis, MD) e após serem desparafinizados, foi
realizado o bloqueio da peroxidase endógena com uma solução de H 2O2 na
concentração de 8% sendo após lavados em PBS (pH: 7,4). Os anticorpos primários
foram incubados à 4ºC overnight. Após a lavagem em solução de PBS, as seções
foram incubadas com o anticorpo secundário IgG de cabra anti IgG de camundongo
biotinilado na diluição de 1:100 (Dako Laboratories, Dinamarca) durante uma hora à
28
temperatura ambiente. Posteriormente, os cortes foram então incubados com a
solução do complexo estreptoavidina-peroxidase na concentração de 1:100 (Strept
ABComplex, Dako, Dinamarca) por uma hora, seguida de lavagens em PBS. A
revelação foi realizada com substrato cromógeno 3,3 diamino-benzidina (DAB)
(Sigma, A3648) 0,06% em PBS acrescido de 100 µL de H 2O2 30% (Merck,
Alemanha). Após, os cortes foram lavados em água corrente, contracorados com
Hematoxilina de Harris e montados em Entellan (Merck-Alemanha). As imagens
capturadas foram inicialmente tratadas no programa Corel Photo-paint 9 (Corel,
EUA), afim de se isolar as áreas positivamente coradas pela reação de imunohistoquímica. As áreas positivas foram determinadas utilizando-se novamente o
programa de morfometria citado anteriormente (ENGELMAN, 2001).
De acordo com este programa determinou-se a área marcada positivamente
pela reação imuno-histoquimica e a área da íntima na mesma imagem, calculandose a percentagem de área da íntima ocupada por macrófagos ou células musculares
lisas.
3.7.4 Estudo Histopatológico
Foram
analisados
os
aspectos
histopatológicos
da
placa
para
a
caracterização do seu estágio evolutivo nos fragmentos obtidos da aorta, em cortes
de 4 µm corados por HE, sendo avaliados os seguintes parâmetros: maior ou menor
celularidade, matriz extracelular, presença de cristais de colesterol, formação de
capa fibromuscular com colágeno e células musculares lisas, desestruturação da
camada média junto à limitante elástica interna (LEI), desestruturação da camada
média junto à limitante elástica externa (LEE) e processo inflamatório na adventícia.
A caracterização do estágio evolutivo das placas teve como base a
classificação de Stary (STARY, 1994), considerando-se como placas tipo II as
lesões nas quais havia predominância de células espumosas dispostas em camadas
estratificadas, com predomínio em relação à matriz. As lesões foram consideradas
tipo III quando apresentavam lipídeos extracelulares formando cristais confluentes e
grande quantidade de matriz extracelular, além da formação de capa fibromuscular.
29
3.8 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados numéricos foram expressos como média (EPM) ou mediana
(interquartis). As variáveis contínuas foram examinadas pela distribuição de
normalidade pelo teste kolmogorov-Smirnov. As variáveis com distribuição normal
foram comparadas entre os grupos usando o teste t de Student não pareado ou o
teste de Mann-Whitney em casos de distribuição não gaussiana. Teste de Friedman
foi utilizado para comparar o peso ao longo do estudo. O coeficiente de Spearman
foi usado para examinar a correlação entre as variáveis. A significância estatística
considerada foi de um risco alfa inferior a 5%. Todas as análises foram analisadas
usando o SPSS 17.0 por Windows (SPSS inc, Chicago, IL, USA).
30
4. RESULTADOS
4.1. Dieta e ganho de peso
Os animais consumiram uma média de 100 g/dia da dieta e 80 mL de água
contendo ou não o extrato da Euterpe oleracea. A dieta e o extrato de Euterpe
oleracea foram bem tolerados e os animais ganharam peso ao longo do estudo
(p<0,0005, teste de Friedman), em ambos os grupos.
A Tabela 2 mostra que não foram observadas diferenças no peso dos animais
no momento em que foram aleatoriamente alocados para o tratamento com Euterpe
oleracea ou controle com água (semana 12) ou ao final do estudo (semana 24).
Tabela 2. Peso dos animais nas semanas 12 e 24.
Euterpe oleracea
Controle
Valor de p
N=15
N=12
2893 (137)
2867 (171)
0,44
3108 (197)
2930 (267)
0,07
12 semanas
Peso, média (DP)
24 semanas
Peso, média (DP)
Valores expressos em gramas, DP = desvio-padrão. Diferenças entre os grupos
foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney.
31
4.2 Modificações no perfil lipídico e glicemia
As análises bioquímicas realizadas por ocasião da semana 12 mostraram que
a dieta enriquecida de colesterol (0,5%) promoveu expressiva hipercolesterolemia.
Os valores de colesterol total, HDL-colesterol, colesterol não-HDL e os triglicérides
não diferiram nesta ocasião. Entretanto, ao final do estudo, os animais tratados com
a Euterpe oleracea tiveram menores níveis destas variáveis lipídicas, com exceção
do HDL-colesterol. Os níveis de glicemia não diferiram entre os grupos (Tabela 3).
Tabela 3. Perfil lipídico e glicemia nas semanas 12 e 24
Euterpe oleracea
Controle
Valor de p
N=15
N=12
1124 (96)
1087 (84)
0,31
36 (11)
37 (12)
0,85
1088 (91)
1050 (86)
0,28
12 semanas
CT, média (DP)
HDL-C, média (DP)
Não-HDL-C, média (DP)
Triglicérides, média (DP)
305 (234)
424 (282)
0,25
Glicose, média (DP)
124 (13)
139 (36)
0,68
167 (113)
341 (224)
0,03
28 (9)
30 (10)
0,56
139 (109)
310 (220)
0,03
Triglicérides, média (DP)
83 (91)
164 (112)
0,02
Glicose, média (DP)
118 (19)
112 (17)
0,86
24 semanas
CT, média (DP)
HDL-C, media (DP)
Não-HDL-C, média (DP)
Valores expressos em mg/dL, DP = desvio-padrão; CT = colesterol total; HDL=
colesterol da lipoproteína de alta densidade. Diferenças entre os grupos foram
analisadas pelo teste t de Student, exceto para triglicérides e glicose, cujos valores
foram comparados pelo teste de Mann-Whitney.
32
4.3. Modificações nos parâmetros de absorção e síntese de colesterol
A Tabela 4 mostra, ao final do estudo, que os níveis dos marcadores de
absorção de colesterol analisados (campesterol e β-sitosterol) não diferiram entre os
grupos. Tampouco houve diferença entre os grupos para o marcador de síntese
endógena de colesterol avaliado (desmosterol).
Entretanto,
observamos
menores
valores
para
as
relações
desmosterol/campesterol e desmosterol/ β-sistosterol para os animais tratados com
o extrato de Euterpe oleracea (Tabela 4).
Tabela 4. Desmosterol, campesterol e β-sitosterol ao final do estudo
Euterpe
Controle
Valor
oleracea
N=12
de p
N=15
Campesterol, média (DP)
10,5 (11,0)
16,7 (15,6)
0,260
β-Sitosterol, média (DP)
3,00 (2,0)
3,90 (3,2)
0,370
Desmosterol, média (DP)
0,50 (0,6)
1,20 (1,3)
0,140
Desmosterol/campesterol, média (DP)
0,04 (0,04)
0,08 (0,04)
0,026
Desmosterol/β-sitosterol, média (DP)
0,12 (0,12)
0,25 (0,11)
0,006
Valores expressos em mg/dL, DP = desvio-padrão. Diferenças entre os grupos foram
analisadas pelo teste de Mann-Whitney.
33
4.4. Parâmetros histomorfométricos
Em nosso modelo experimental, os aspectos clássicos da aterosclerose
induzida pela dieta foram observados nas aortas dos animais controles. Entretanto,
uma marcante redução da aterosclerose foi observada no grupo de animais tratados
pela Euterpe oleracea. Nestes animais, uma menor área da placa foi observada,
especialmente no arco aórtico e na aorta torácica, bem como menores valores da
relação íntima/média, quando comparado com os controles (Figuras 7 e 8).
A camada média não diferiu entre os grupos, bem como o percentual das
aortas ocupadas por macrófagos e células musculares lisas (Tabela 5). Não foram
observadas diferenças nos aspectos histológicos das placas, bem como na
composição de fibras elásticas, colágeno, ou no conteúdo de células musculares
lisas ou de macrófagos, quanto analisados por histomorfometria (Tabela 5).
A Figura 9 mostra as características de espécimes de aortas, representativos
destes achados histológicos.
Tabela 5. Composição das placas das aortas ao final do estudo, por grupo
Componentes da placa
Controle
Valor
Euterpe
oleracea
N=12
de p
N=15
Macrófagos, média (DP)
20,4 (15,5)
22,7 (18,3)
0,56
Célula muscular lisa, média (DP)
13,3 (4,8)
12,7 (7,0)
0,66
0,5 (0,6)
1,2 (1,3)
0,26
Tecido elástico, média (DP)
Valores expressos em porcentagens das áreas das aortas; DP = desvio-padrão;
Diferenças entre os grupos foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney.
34
Figura 7: (A) Box plots da área das placas no arco aórtico. Uma marcada redução deste parâmetro
foi observada nos animais tratados com extrato de Euterpe oleracea (p=0.001 x grupo controle, teste
de Mann-Whitney). (B) Arco aórtico, relação íntima/média. Os animais tratados com Euterpe oleracea
apresentaram menores valores da relação íntima/média (p=0.002 x grupo controle, teste de MannWhitney).
Figura 8: Box plots da área da placa mensurada pela planimetria. (A) Box plots da área da placa.
Menores áreas de placa foram observadas nas aortas dos animais tratados com extrato de Euterpe
oleracea (p=0.005 x grupo controle, teste de Mann-Whitney). (B) Box plots do percentual da área da
placa da aorta. Áreas de placas reduzidas foram observadas nas aortas dos animais tratados com
extrato de Euterpe oleracea apresentavam menores taxas da relação íntima/média (p=0.0028 x grupo
controle, teste de Mann-Whitney).
35
Figura 9: Imagens representativas das aortas coradas pelo Sudam III dos coelhos alimentados de
uma dieta com elevado conteúdo de colesterol. (A) Grupo Controle; (B) Animais tratados com Euterpe
oleracea. A fotomicrografia mostra as secções da aorta coradas por HE (C e H), Verhoeff para fibras
elásticas (D e I magnificadas 100x); a reação de imunohistoquímica para macrófagos (E e J); actina
para músculo liso vascular (F e K); e colágeno corado por picrosirius polarizado (G e L; magnificadas
400x). A fotomicrografia nas colunas verticais de C para G são do grupo controle e de H para L são
do grupo de que recebeu extrato de Euterpe oleracea.
36
5. DISCUSSÃO
O estudo confirmou a nossa hipótese de que o consumo de Euterpe oleracea
pode atenuar a aterosclerose. Os mecanismos propostos para explicar a atenuação
da aterosclerose são, em parte, mecanismos previamente descritos, como suas
propriedades antioxidantes (DEL POZO-INSFRAN; BRENES; TALCOTT, 2004;
CHIN et al., 2008; RODRIGUES et al., 2006; PACHECO-PALENCIA; MERTENS;
TALCOTT, 2008a), ou a ação na função endotelial (ROCHA et al., 2007). Nosso
estudo mostrou adicionalmente, que esta substância tem uma ação sinérgica no
metabolismo do esterol, melhorando o balanço entre a absorção e a síntese do
colesterol, determinando, portanto, um melhor perfil lipídico.
O clássico modelo de indução de aterosclerose em coelhos por meio da dieta
é altamente dependente da absorção do colesterol, então a atenuação da
aterosclerose poderia ser uma conseqüência da inibição da absorção do colesterol,
entretanto não foram observadas diferenças nas taxas de absorção do colesterol,
estimadas pelos níveis plasmáticos de campesterol e β-sitosterol. Um segundo
mecanismo que poderia estar envolvido seria a inibição da síntese do colesterol,
mas não se observou diferença nos níveis plasmáticos de desmosterol. Entretanto,
nós observamos uma diferença nas relações entre síntese e absorção de esteróis,
evidenciada por redução em ambas as relações desmosterol/campesterol e
desmosterol/sitosterol, logo, o consumo da Euterpe oleracea parece ter contribuído
em ambas as direções para reduzir as taxas da síntese endógena e da absorção do
colesterol.
Esses achados interessantes sugerem que outros mecanismos possam estar
envolvidos na atenuação da aterosclerose pela Euterpe oleracea, tais como sua
ação antioxidante, pelo elevado conteúdo de compostos polifenólicos, além do alto
teor em ligninas e outros constituintes (SANTOS et al., 2008).
Além dos elementos já citados, a composição química da Euterpe oleracea
apresenta um elevado conteúdo de ácidos graxos mono e poliinsaturados, os quais
podem ter contribuído para a redução nos níveis de colesterol total e colesterol nãoHDL, possivelmente devido ao aumento da expressão dos receptores LDL
(HORTON; CUTHBERT; SPADY, 1993; SESSIONS; SALTER, 1995).
37
Outro mecanismo que pode estar envolvido na atenuação da aterosclerose é
a melhora da função endotelial. Rocha et al (2007), mostraram que o extrato de açaí
promove um aumento da vasodilatação endotélio dependente, efeito esse reduzido
pela adição de NG-nitro-L-arginina (L-NAME) e abolido pelo KCL+L-NAME.
Alguns estudos haviam mostrado previamente que a melhora da função
endotelial pela estatina ou pelo inibidor da enzima conversora da angiotensina foi
acompanhada pela redução da aterosclerose nos coelhos, independentemente das
alterações nos níveis plasmáticos do colesterol (SILVA; LIMA, 2002; FONSECA et
al., 2003).
Recentemente, efeitos favoráveis nos níveis de glicose e da resistência a
insulina foram mostrados com o uso do extrato da Euterpe oleracea, num modelo
experimental de síndrome metabólica (de OLIVEIRA et al., 2010).
Baseado nesses mecanismos e nos achados do nosso estudo, a redução da
aterosclerose observada nestes animais provavelmente resultou da ação conjunta
dos múltiplos benefícios da Euterpe oleracea, envolvendo redução da síntese e da
absorção dos esteróis, redução das modificações oxidativas das lipoproteínas e
melhora da função endotelial.
38
Limitações do estudo
Nós examinamos os efeitos da Euterpe oleracea em animais com estímulo
aterogênico pelos altos níveis de colesterol em suas dietas. É possível que os
efeitos benéficos na aterosclerose do extrato dessa fruta neste modelo possam ser
mais expressivos do que na aterosclerose em humanos, determinada por outros
fatores de risco que não apenas a hipercolesterolemia.
Não avaliamos a função endotelial e a ação antioxidante da Euterpe oleracea;
é possível que os efeitos benéficos nesses parâmetros tenham contribuído para
nossos achados anatômicos.
Sumarizando, o consumo da
Euterpe oleracea pelos coelhos com
hipercolesterolemia induzida pela dieta, marcadamente melhorou o perfil lipídico e
reduziu a aterosclerose em suas aortas. Estes efeitos foram observados em parte
pelo melhor balanço entre a síntese e a absorção dos esteróis.
39
6. CONCLUSÕES
A
aterosclerose
induzida
pela
dieta
aterogênica
em
coelhos
foi
significantemente atenuada pela adição à dieta do extrato de Euterpe oleracea
(açaí).
O consumo de Euterpe oleracea (açaí) em coelhos recebendo dieta
aterogênica, significantemente melhorou o perfil lipídico.
A análise de marcadores de síntese (desmosterol) e de absorção de
colesterol (campesterol e β-sitosterol) mostrou que as relações entre estes
marcadores
(desmosterol/campesterol;
desmosterol/β-sitosterol)
foram
significantemente reduzidas nos animais tratados pela Euterpe oleracea.
Os resultados em conjunto sugerem que a adição da Euterpe oleracea à
dieta, neste modelo experimental, promove marcante atenuação da aterosclerose,
em parte, por um melhor balanço dos marcadores de síntese e absorção de esteróis.
40
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COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA COM ANIMAIS
DE EXPERIMENTAÇÃO DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
PARECER MED002/2006
Projeto: Efeitos do açaí no perfil lipídico em coelhos hipercolesterolêmicos
Coordenador: Prof. Dr. Francisco Antonio Helfstein Fonseca
Área Temática: Medicina
Vigência: 05/2006 a 05/2010
N0 no CEPAE-UFPA: MED002/2006
O projeto acima identificado foi avaliado pelo Comitê de Ética Em Pesquisa Com
Animais de Experimentação da Universidade Federal do Pará (CEPAE). O tema eleito para
a investigação e de alto teor científico justificando a utilização do modelo animal proposto.
Os procedimentos experimentais utilizados seguem as normas locais e internacionais para
tratamento e manipulação de animais de experimentação. Portanto, o CEPAE, através de
seu presidente, no uso das atribuições delegadas pela portaria N 0 1568/2005 do Reitor da
Universidade Federal do Pará, resolve APROVAR a utilização de animais de
experimentação nas atividades do projeto em questão, no período de vigência estabelecido.
As atividades experimentais fora do período de vigência devem receber nova autorização
deste comitê.
Presidente do Comitê de Ética Em Pesquisa
Com Animais de Experimentação da Universidade
Federal do Pará
1
Journal of Atherosclerosis and Thrombosis Vol.18, No. ●
Basic Research
Euterpe Oleracea (Açai) Modifies Sterol Metabolism and Attenuates
Experimentally-Induced Atherosclerosis
Claudine A Feio 1, Maria C Izar 2, Silvia S Ihara 3, Soraia H Kasmas 2, Celma M Martins 2, Max N Feio 1,
Luís A Maués 1, Ney C Borges 4, Ronilson A Moreno 4, Rui M Póvoa 2 and Francisco A Fonseca 2
1
Department of Medicine, Federal University of Para, PA, Brazil
Department of Medicine, Federal University of Sao Paulo, SP, Brazil
3
Department of Pathology, Federal University of Sao Paulo, SP, Brazil
4
Synchrophar, Campinas, SP, Brazil
2
Background: Euterpe oleracea (açai) is a fruit from the Amazon region whose chemical composition
may be beneficial for individuals with atherosclerosis. We hypothesized that consumption of Euterpe
oleracea would reduce atherosclerosis development by decreasing cholesterol absorption and synthesis.
Methods: Male New Zealand rabbits were fed a cholesterol-enriched diet (0.5%) for 12 weeks, when
they were randomized to receive Euterpe oleracea extract (n = 15) or water (n = 12) plus a 0.05% cholesterol-enriched diet for an additional 12 weeks. Plasma phytosterols and desmosterol were determined by ultra-performance liquid chromatography and mass spectrometry. Atherosclerotic lesions
were estimated by computerized planimetry and histomorphometry.
Results: At sacrifice, animals treated with Euterpe oleracea had lower levels of total cholesterol
(p = 0.03), non-HDL-cholesterol (p = 0.03) and triglycerides (p = 0.02) than controls. These animals
had smaller atherosclerotic plaque area in their aortas (p = 0.001) and a smaller intima/media ratio
(p = 0.002) than controls, without differences in plaque composition. At the end of the study, campesterol, β-sitosterol, and desmosterol plasma levels did not differ between groups; however, animals
treated with Euterpe oleracea showed lower desmosterol/campesterol (p = 0.026) and desmosterol/
β-sitosterol (p = 0.006) ratios than controls.
Conclusion: Consumption of Euterpe oleracea extract markedly improved the lipid profile and attenuated atherosclerosis. These effects were related in part to a better balance in the synthesis and
absorption of sterols.
J Atheroscler Thromb, 2011; 18:000-000.
Key words; Euterpe oleracea (açai), Atherosclerosis, Lipids, Desmosterol, Phytosterols
Introduction
Euterpe oleracea (açai) is a typical fruit from the
Amazon region, largely consumed in Brazil and
exported to many countries in Europe, Asia, and the
Americas.
Chemical studies revealed that Euterpe oleracea is
rich in anthocyanic compounds and several polypheAddress for correspondence: Francisco A Fonseca, Departamento
de Medicina, Disciplina de Cardiologia, Rua Pedro de Toledo
276, São Paulo, SP, Brazil
E-mail: [email protected]
Received: AAA
Accepted for publication: AAA
nols 1-3). Beyond the presence of compounds with antioxidant properties, Euterpe oleracea improves endothelial function through the action of nitric oxide and
release of endothelium-derived hyperpolarizing factor 4).
The oil from Euterpe oleracea is composed of
fatty acids of nutritional value (60% monounsaturated
and 13% polyunsaturated) in addition to fiber and
vitamin E 5).
Recently, some beneficial effects of Euterpe oleracea on the lipid profile were reported in a study of
hypercholesterolemic rats 6); however, these properties
for lipid metabolism and atherosclerosis are poorly
reported and understood.
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
2
Feio et al .
Thus, we decided to investigate the potential
benefits of Euterpe oleracea in rabbits with dietinduced atherosclerosis. Beyond the effects of Euterpe
oleracea on the lipid profile and atherosclerosis, its
effects on markers of cholesterol absorption and synthesis were also examined. These markers and their
ratios have been studied in prospective studies and are
considered reliable surrogates for measures of cholesterol absorption and synthesis, and predictors of cardiovascular events 7-10).
Table 1. Chemical composition of Euterpe oleracea [5]
Content
Dried matter (%)
Proteins (g/100 g)
Lipids (g/100 g)
Monounsaturated fat (g/100 g)
Polyunsaturated fat (g/100 g)
Carbohydrates (g/100 g)
Fructose (g/100 g)
Glucose (g/100 g)
Sucrose (g/100 g)
Fibers (g/100 g)
Energy (kcal/100 g)
Ash (g/100 g)
Sodium (mg/100 g)
Potassium (mg/100 g)
Calcium (g/100 g)
Magnesium (g/100 g)
Iron (g/100 g)
Copper (g/100 g)
Zinc (g/100 g)
Phosphorus (g/100 g)
Vitamin B1 (g/100 g)
α-tocopherol (g/100 g)
Methods
Extract of Euterpe Oleracea
Fruits from Euterpe oleracea were obtained in the
Amazon region (Para State, Brazil) at the same food
store. Briefly, the extract was prepared daily by combining water and fruit in a blender. The extract was
filtered, separated from the seeds, packed in plastic
bags, which were sealed immediately to avoid contamination, and sent daily to the animal facility. Experimental and control animals were immediately offered
bowls containing water with and without fresh extract
(80 mL) from Euterpe oleracea, respectively.
The chemical composition of Euterpe oleracea was
provided by EMBRAPA 5) and the plant sterol content
was determined in samples of the Euterpe oleracea
extract by gas chromatography with flame ionization
detection (GC FID) 11) (presented in Table 1). Euterpe
oleracea has 15.4 mg plant sterols in 100 g extract, of
which 85.0% is β-sitosterol (13.1 mg/100 g), 8.2%
stigmasterol (1.3 mg/100 g), and 2.0% campestanol
(0.3 mg/100 g), with traces of other plant sterols.
Animals and Diet
Adult male New Zealand white rabbits (n = 27,
age = 3 months, weight = 2,600-3,000 g) were studied.
The study protocol was approved by the local ethics
committee and all animals received proper care, in
compliance with guidelines of the Brazilian College of
Experimental Animals. The animals were individually
housed and provided with a light/dark cycle. Every
day, the cages were cleaned and chow and water (with
or without the Euterpe oleracea extract) were changed.
The rabbits were weighed at the beginning of the
study and thereafter at 12 and 24 weeks. Before sacrifice, the animals were anesthetized with xylazine (5
mg/kg, Rompun; BayerAG, SP, Brazil) and ketamine
(35 mg/kg, Ketalar; Parke-Davis, USA). The animals
initiated the study protocol after an adaptation period
of 15 days. During the first 12 weeks, the animals
were fed a regular diet (Nuvilab; Nuvital, Brazil) plus
0.5% cholesterol (C8503; Sigma-Aldrich, San Diego,
＊
Amount＊
15.0
13.0
48.0
28.8
6.24
1.50
0.00
1.50
0.00
34.0
66.3
3.50
56.4
932
286
174
1.50
1.70
7.00
124
0.25
45.0
in dried form
CA, USA). After this period, the cholesterol content
of the diet was reduced to 0.05% and the animals
were randomized to receive the Euterpe oleracea extract
(n = 15) or water (n = 12) for an additional 12-week
period.
Biochemical Analyses
After a 12-h fasting period, blood samples were
collected from the central ear artery of all animals and
assayed. Samples were stored at −80 ℃ and defrosted
at room temperature for 2 h prior analysis. Measurements were assayed by automated techniques in an
Olympus AU-640 system (Olympus, Nagano, Japan).
Serum lipids were determined by enzymatic colorimetric methods using appropriate reagents (Olympus)
for total cholesterol (TC), HDL-cholesterol (HDL-C)
and triglycerides. Non-HDL-cholesterol was calculated by differences between TC and HDL-C. Blood
glucose levels were determined by an automated enzymatic method (Advia 1650; Bayer, Germany).
β-sitosterol and campesterol (markers of sterol
absorption) as well as desmosterol (precursor of
endogenous cholesterol synthesis) were measured at
week 24 by ultra-performance liquid chromatography
(UPLC) and mass spectrometry (MS). Plasma samples
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
3
Euterpe Oleracea (Açai), Lipids and Atherosclerosis
were evaluated for these sterols by a method developed
at Synchrophar (Campinas, SP, Brazil) 12). This method
consisted of liquid-liquid extraction, followed by separation in a UPLC system and detection in an Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) ionsource MS operating on “single-ion monitoring” for
each sterol (β-sitosterol, campesterol, and desmosterol). Extraction was carried out with diethyl ether
and n-hexane (80/20; v/v) by vortex mixing followed
by evaporation of the organic phase at 50 ℃ under a
gentle N2 stream. After evaporation, the residue was
reconstituted with isopropanol and injected onto the
UPLC column (Acquity Waters Co., Milford). The
MS system (Quattro Premier-XE; Waters Co., Manchester, UK) was adjusted to monitor single ions
formed by an APCI ion source. Sterols were detected
in their free (non-esterified) forms, monitoring the
ions for desmosterol (m/z = 367.30), β-sitosterol (m/z
= 397.25), and campesterol (m/z = 383.60). Compound concentrations were determined by comparing
the peak response with the linear portion of the calibration curve (0.5-10.0 μg/mL). Samples with concentrations higher than 10.0 μg/mL were properly
diluted for comparison with the calibration curve.
Results are presented in mg/dL. To evaluate the relation between cholesterol absorption and synthesis, the
ratios between desmosterol/campesterol and desmosterol/β-sitosterol were calculated 7).
Histopathology and Immunohistochemistry
Specimens of the aortas were excised from the
ascending arch to the iliac bifurcation and examined
as previously reported 13). The aortas were cut longitudinally, fixed in 10% buffered (pH 7.4) formalin
(Labsynth, SP, Brazil), and the lipid-enriched areas
were identified with 1-[4-(Phenylazo) Phenilazo]-2Naphthol (Sudan red Ⅲ) dye (Science Lab, TX, USA).
Plaque-containing areas in the aortas were estimated
by computerized planimetry using Image Tool software version 3.0 (University of Texas Health Science
Center at San Antonio (UTHSCSA), TX, USA). The
percentage of the lesion area was calculated as the ratio
between the lesion and the total areas of the aorta.
Fragments from the arch, thoracic and abdominal aortas were processed for histology with hematoxylin and
eosin (Nuclear, Alkimia, PR, Brazil) staining. Sections
(4-μm thick) of these specimens were stained with
Verhoeff ’s elastic fiber (Nuclear, Alkimia), evaluated
for intima (I) and media (M) areas using Image Tool
software version 3.0 and the I/M ratio was then calculated. Monoclonal antibodies were used to determine
macrophages (RAM-11; DAKO Corp., CA, USA)
and smooth muscle actin (HHF-35; DAKO Corp.).
The streptavidin-biotin-peroxidase complex (C-004;
DAKO Corp.) method was used; the sections were
stained by adding diaminobenzidine solution and
counterstained with Harris hematoxylin (Nuclear,
Alkimia). For quantification of macrophages and
smooth muscle cells in the intima layer, the greatest
lesion observed in the histological section was analyzed. Digitalized images of two atherosclerotic plaque
sections (magnification: 400) including the most
stained areas were recorded using an imaging system
QColor3 (Olympus America Inc.), and positively
stained areas were determined by morphometric
Image Tool software version 3.0. The histological
structure of the atherosclerotic lesions was analyzed in
HE-stained sections, the collagen content was
observed under polarized light in sections stained by
Sirius red, and collagen was quantified by a computerassisted image system. All histological analyses were
performed in a blinded fashion.
Statistical Analysis
Numerical data were expressed as the mean (SD).
Continuous variables were examined for normal distribution by the Kolmogorov-Smirnov test. Variables
with normal distribution were compared between
groups using Student’s unpaired t test; in the case of
non-Gaussian distribution, the Mann-Whitney U-test
was used. The Friedman test was used to compare
repeated measures of weight throughout the study. All
tests were two-tailed and statistical significance was set
at p ＜ 0.05. Analyses were performed using SPSS 17.0
for Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).
Results
Food Intake and Weight Gain
The animals consumed an average of 100 g/day
of the diet and 80 mL water with/without Euterpe
oleracea extract. The diet and the extract of Euterpe
oleracea were well tolerated and the animals gained
weight throughout the study (p ＜ 0.0005, Friedman
test) in both groups. No difference in animal weight
was observed between groups at randomization in
week 12 and week 24 (Table 2).
Biochemistry
The biochemical analyses performed at week 12
(before randomization) showed that the cholesterolenriched diet (0.5%) promoted marked hypercholesterolemia. All lipid values were comparable between
groups at this time point. Conversely, at the end of
the study, animals treated with Euterpe oleracea extract
showed lower serum levels of total cholesterol, non-
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
4
Feio et al .
Table 2. Body weight, lipids and glucose serum levels at 12 and 24 weeks, by group
Euterpe oleracea
(n = 15)
12 weeks
Body weight, mean (SD)
Total cholesterol, mean (SD)
HDL-C, mean (SD)
Non HDL-C, mean (SD)
Triglycerides, mean (SD)
Glucose, mean (SD)
24 weeks
Body weight, mean (SD)
Total cholesterol, mean (SD)
HDL-C, mean (SD)
Non HDL-C, mean (SD)
Triglycerides, mean (SD)
Glucose, mean (SD)
Control
(n = 12)
p values
2,893 (137)
1,124 (96)
36 (11)
1,088 (91)
305 (234)
124 (13)
2,867 (171)
1,087 (84)
37 (12)
1,050 (86)
424 (282)
139 (36)
0.44
0.31
0.85
0.28
0.25
0.68
3,108 (197)
167 (113)
28 (9)
139 (109)
83 (91)
118 (19)
2,930 (267)
341 (224)
30 (10)
310 (220)
164 (112)
112 (17)
0.07
0.03
0.56
0.03
0.02
0.86
Abbreviations: HDL-C: high-density lipoprotein-cholesterol; SD: standard deviation; TC: total cholesterol.
Mean values and SD are expressed in mg/dL; comparisons between groups were made using Student’s t test,
except for body weight, glucose levels and triglycerides, compared using the Mann-Whitney U-test.
Table 3. Plasma markers of cholesterol absorption and synthesis at week 24, by group
Campesterol, mean (SD)
Sitosterol, mean (SD)
Desmosterol, mean (SD)
Desmosterol/campesterol, mean (SD)
Desmosterol/β-sitosterol, mean (SD)
Euterpe oleracea
(n = 15)
Control
(n = 12)
p value
10.5 (11.0)
3.0 (2.0)
0.5 (0.6)
0.04 (0.04)
0.12 (0.12)
16.7 (16.7)
3.9 (3.2)
1.2 (1.3)
0.08 (0.04)
0.25 (0.11)
0.260
0.370
0.140
0.026
0.006
SD: standard deviation. Mean values and SD are expressed in mg/dL; comparisons between groups were made
using the Mann-Whitney U-test.
HDL-C and triglycerides than control animals. Serum
glucose levels did not differ between groups at weeks
12 and 24 (Table 2).
At the end of the study, plasma levels of campesterol, β-sitosterol, and desmosterol did not differ
between groups; however, lower desmosterol/campesterol and desmosterol/β-sitosterol ratios were observed
in animals treated with Euterpe oleracea extract (Table 3).
Histopathology and Immunohistochemistry
In our model, classic atherosclerosis was observed
in the aortas of control rabbits challenged by the cholesterol-enriched diet; however, marked attenuation in
the degree of atherosclerosis was observed among animals treated with Euterpe oleracea extract. In these animals, a smaller plaque area was observed, especially in
the aortic arch and thoracic aorta, as well as smaller
intima/media ratios in the same regions than in controls (Fig. 1 and 2). No differences were observed
between groups regarding the media layer in the areas
of the arch, thoracic or abdominal aortas and the percent areas occupied by macrophages and smooth muscle cells in their aortas (Table 4). No difference was
observed either in the histological aspect of the
plaques or in plaque composition regarding elastic
fibers, collagen, smooth muscle cells, and macrophage
content when analyzed by histomorphometry (Table 4).
Fig. 3 shows pictures of representative specimens of
the aortas from animals in both groups and photomicrographs of the aorta sections.
Discussion
The present study confirmed our initial hypothe-
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
5
Euterpe Oleracea (Açai), Lipids and Atherosclerosis
A
B
Fig. 1. (A) Box plots of aortic arch plaque area. A marked reduction in this parameter was observed in animals
treated with Euterpe oleracea extract (p = 0.001 vs control group, Mann-Whitney U-test). (B) Box plots of
the aortic arch intima/media ratio. Animals treated with Euterpe oleracea extract had lower intima/media
ratios (p = 0.002 vs control group, Mann-Whitney U-test).
A
B
Fig. 2. Box plots of plaque area as measured by planimetry. (A) Box plots of plaque area. Smaller plaque areas were
observed in the aortas of animals treated with Euterpe oleracea extract (p = 0.005 vs control group, MannWhitney U-test). (B) Box plots of the aortic plaque percent area. Reduced plaque areas were observed in the
aortas of animals treated with Euterpe oleracea extract (p = 0.028 vs control group, Mann-Whitney test).
sis that consumption of Euterpe oleracea can attenuate
atherosclerosis. In addition to the previously reported
possible antiatherosclerotic properties of Euterpe oleracea, mainly based on the high content of antioxidant
compounds in their fruits 14-16), our study has shown
that consumption of Euterpe oleracea extract improved
the balance between cholesterol absorption and synthesis, decreased serum cholesterol and triglycerides,
and attenuated atherosclerosis. It has been reported by
Matthan et al. that impaired cholesterol homeostasis,
reflected by increased cholesterol absorption and low
synthesis markers, is the profile associated with preva-
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
6
Feio et al .
A
C
H
D
I
E
J
F
K
G
L
B
Fig. 3. Representative images of the aorta stained by Sudan Ⅲ of rabbits fed a high-cholesterol diet-Euterpe oleracea-treated animal
(A) and Control (B). The photomicrographs show histological aorta fragments stained by HE (C and H), Verhoeff for elastic fibers (D and I); immunohistochemical reaction for macrophages (E and J) and SMA (F and K) and picrosirius polarized
stain for collagen ( G and L) (magnification 100x). Photomicrographs C to G are from Euterpe oleracea group and H to L
are from Control group.
HE = hematoxylin & eosin; SMA = smooth muscle actin
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
7
Euterpe Oleracea (Açai), Lipids and Atherosclerosis
Table 4. Plaque composition of aortas at week 24, by group
Plaque component
Macrophages, mean (SD)
Smooth muscle actin, mean (SD)
Elastic tissue, mean (SD)
Euterpe oleracea
(n = 15)
Control
(n = 12)
p value
20.4 (15.5)
13.3 (4.8)
0.5 (0.6)
22.7 (18.3)
12.7 (7.0)
1.2 (1.3)
0.56
0.66
0.26
Macrophages, smooth muscle actin and elastic tissue are expressed as the percentages of aortic areas. Comparisons between groups were made using the Mann-Whitney U-test.
lent cardiovascular disease in the Framingham Offspring population 8). In addition, in the Prospective
Cardiovascular Munster Study high β-sitosterol or
campesterol levels were markers of cardiovascular
events among middle-aged males 9); however, recent
data from the Spanish EPIC cohort have shown that
phytosterols levels were inversely associated with incident cardiovascular disease 17). Furthermore, Gylling et
al. have demonstrated that cholesterol absorption and
synthesis are inherited traits 18).
The classic rabbit model of diet-induced atherosclerosis is highly dependent on the rates of cholesterol
absorption and the levels of serum cholesterol
achieved. Thus, attenuation of atherosclerosis by the
Euterpe oleracea extract could be a consequence of
decreased absorption of dietary cholesterol; however,
this hypothesis appears insufficient to explain our
findings, since there were no significant differences
between the two groups of animals for markers of
cholesterol absorption (β-sitosterol and campesterol).
Inhibition of cholesterol synthesis could be the
second mechanism involved in the reduced development of atherosclerosis among animals receiving the
Euterpe oleracea extract. Again, attenuation of atherosclerosis in animals treated by the Euterpe oleracea
extract may not be explained by reduced synthesis of
cholesterol, since these animals did not differ in the
levels of desmosterol; however, differences in the desmosterol/campesterol and desmosterol/β-sitosterol
ratios were observed between groups. Thus, consumption of Euterpe oleracea seems to contribute to a better
balance between cholesterol synthesis and absorption.
We investigated the content of phytosterols in
Euterpe oleracea and found that 15 mg in 100 g extract
were plant sterols, of which β-sitosterol was the most
abundant. This amount of plant sterols may have contributed, at least in part, to the lower absorption of
cholesterol added to the diet, explaining the reduction
in total cholesterol observed in our study 19). In fact,
previous studies have shown that a high content of
fiber and phytosterols can decrease the rate of cholesterol absorption 20, 21). The composition of the extract
of Euterpe oleracea, which has these two constituents,
may be associated with a lower rate of cholesterol
absorption by the small intestine.
In addition, part of the benefits in the lipid profile could also be attributed to the fatty acids present
in the Euterpe oleracea extract 5). One or more compounds in the chemical composition of Euterpe oleracea, with a high content of monounsaturated and
polyunsaturated fatty acids, can reduce cholesterol levels due to increased expression of LDL receptors in the
liver 22, 23) followed by cholesterol excretion via the biliary tract.
It is also possible that other cholesterol-independent mechanisms of absorption and synthesis are
involved in decreased atherosclerosis development, as
observed among animals treated with Euterpe oleracea
extract. In this context, the high content of antioxidants, mainly polyphenolic compounds, lignans, and
other constituents, may have contributed to the
decrease in plaque formation 24).
Improved endothelial function is another mechanism that might be involved in atherosclerosis attenuation. Rocha et al. 4) showed that Euterpe oleracea
extract increases endothelium-dependent vasodilation,
an effect that is attenuated by the addition of N?nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME) and abolished by the addition of KCl＋L-NAME.
We previously demonstrated improved endothelial function by statins 25) and by angiotensin converting-enzyme inhibitor 26), accompanied by attenuation
of atherosclerosis development in rabbits, independent
of changes in serum cholesterol levels.
Recently, favorable effects on glucose levels and
insulin resistance were reported following the use of
Euterpe oleracea extract in an experimental model of
metabolic syndrome 27).
Based on the findings of our study and the
mechanisms discussed above, the reduction of atherosclerosis observed in these animals probably results
from the sum of multiple beneficial actions of Euterpe
oleracea, including decreased ratios of markers of cholesterol synthesis and absorption, reduced oxidative
㪈㪈㪉㪇㪌㩿㪈㪀㪉㪊㪅㪈㪇㪅㪈㪐
8
Feio et al .
modification of lipoproteins, increased expression of
LDL receptors, and improved endothelial function. In
addition, preliminary data involving the use of Euterpe
oleracea extract in humans have shown favorable findings among subjects with metabolic syndrome, which
includes improvement in the lipid profile and
decreased post-prandial glucose levels 28). Furthermore,
a novel anti-inflammatory property of Euterpe oleracea
was recently reported, involving inhibition of the gene
expression of adhesion molecules and nuclear factor
kappa B activation induced by glucose and lipopolysaccharide 29).
Study Limitations
Our study examined the effects of Euterpe oleracea in animals challenged by an atherogenic diet. It is
possible that the beneficial effects observed on atherosclerosis in this model could be of a higher magnitude
than on atherosclerosis related to other classic risk factors observed in humans.
Our study did not evaluate endothelial function
or the antioxidant actions of Euterpe oleracea. Regarding these parameters, the known beneficial effects of
antioxidant compounds present in the Euterpe oleracea
extract may have contributed to our histological findings.
We did not assess intestinal expression of
NPC1L1 due to the unavailability of commercial antibodies for rabbits.
Conclusion
Consumption of Euterpe oleracea extract by rabbits with diet-induced hypercholesterolemia markedly
improved the lipid profile and attenuated aortic atherosclerosis. These effects were related, at least in part,
to a better balance between synthesis and absorption
of sterols, surrogate markers of cholesterol homeostasis.
Conflicts of Interests
None.
Acknowledgements
This study was supported in part by the National
Council of Science and Technology (CNPq), grant
# 2008/57685-7. We acknowledge Dr. Paulo Boschcov, former professor at the Federal University of
Sao Paulo, for his assistance with revising the manuscript.
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and red muscadine grape (Vitis rotundifolia ) protect
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from glucose- and lipopolysaccharide (LPS)-induced
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