R.
1076
Bras.R.Bras.Zootec.
Zootec., v.27, n.6, p.1076-1081, 1998
Uso da Técnica da Espectrofotometria de Refletância no Infravermelho Proximal
(NIRS) na Predição da Composição Química da Alfafa (Medicago sativa, L.)1
Flávio Flores Pires2, Ênio Rosa Prates3
RESUMO - Esta pesquisa foi conduzida para avaliar o potencial da técnica da espectrofotometria de refletância no infravermelho
proximal (NIRS) na predição da composicao química das foragens (matéria seca [MS], matéria orgânica [MO], proteína bruta [PB], fibra
em detergente neutro [FDN], fibra em detergente ácido [FDA], lignina em detergente ácido [LDA] e relação folha-caule [F/C] da alfafa).
Trezentos e quinze amostras foram usadas, sendo 211 amostras para a calibração e 104 para a validação. O espectro das amostras secas
a 60oC e moídas em moinho tipo Wiley, com peneira de crivo de 1mm, foi obtido por intermédio de um aparelho NR6500 da NIRSystems.
Os coeficientes de determinação (R2) para as frações MS, MO, PB, FDN e FDA, LDA e F/C foram, respectivamente: 0,94; 0,92; 0,96;
0,95; 0,96; 0,90; e 0,79 e os erros-padrão da calibração, 0,48; 0,36; 0,51; 1,06; 0,79; 0,31; e 0,09, respectivamente. No processo de
validação, retirando-se todos os outliers, foram obtidos os seguintes R2 para as mesmas frações, respectivamente: 0,87; 0,87; 0,93; 0,90;
0,93; 0,85; e 0,68 e erros-padrão de validação de 0,49; 0,46; 0,62; 1,43; 1,07; 0,38; e 0,10. De acordo com os padrões da técnica, para
seu uso, somente as frações MO, PB, LDA e F/C poderiam ser estimadas. Entretanto, pelo teste em par de “t”, todas as frações podem
ser estimadas, por propiciar resultados aceitáveis dentro dos limites de precisão.
Palavras-chave: alfafa, análise, NIRS
Use of Near Infrared Spectroscopy Analysis (NIRS) for Prediction of Alfalfa Chemical
Composition (Medicago sativa, L.)1
ABSTRACT - This research aimed to evaluate the near infrared spectroscopy (NIRS) technique potential in the prediction of
chemical composition of forages (dry matter [DM], organic matter [OM], crude protein [CP], neutral detergent fiber [NDF], acid detergent
fiber [ADF], acid detergent lignin [ADL] and the leaf/stem [L/S] relationship of alfalfa (Medicago sativa, L). A total of 315 alfalfa samples,
were used, being 211 for calibration and 104 for validation studies. The spectra of the samples dried at 600C and ground by type Wiley
mill fitted with a 1 mm mesh screen was obtained through a NR6500 monochromatic from NIRSystems. The determination coefficients
(R 2) for the the fractions DM, OM, CP, NDF, ADF, ADL and L/S were: .94, .92, .96, .95, .96, .90 and .79, respectively. The standard
errors of calibration were .48, .36, .51, 1.06, .79, .31 and .09, respectively. In the validation process, excluding all outliers, the R2 for
the same fractions were .87, .87, .93, .90, .93, .85 and .68 with the standard error of: .49, .46, .62, 1.43, 1.07, .38 and .10. According
to the technique standard for its use only the fractions OM, CP, ADL and L/S could be estimated. However, by paired t test, all fractions
could be estimated, to provide acceptable results within the limits of precision.
Key Words: alfalfa, analysis, NIRS
Introdução
A espectrofotometria de refletância no infravermelho
proximal (NIRS) é utilizada por várias áreas da ciência.
A expansão desta técnica é atribuída ao desenvolvimento dos computadores, tanto na parte de programas, para
esta área específica, como em programas de estatística,
possibilitando seu uso em grande escala na área da
química analítica (MOORE et al., 1994).
Esta técnica se baseia na utilização de curvas
espectrais dos materiais analisados. Estes espectros
são obtidos por meio da radiação da amostra no
infravermelho proximal (entre 1100 e 2500 nm),
sendo, portanto, o resultado da absorção de energia
na forma de luz por moléculas orgânicas, particularmente as que possuem grande número de ligações do tipo
CH, NH e OH. A energia absorvida por par de átomos
é específica, assim como para o tipo e o número de
átomos em questão (SHENK e WESTERHAUS, 1994).
A radiação no infravermelho, quando absorvida
pelas ligações entre os átomos de determinada molécula, provoca movimentos de distensão, de rotação e
1Parte da Dissertação de Mestrado do primeiro autor.
2Aluno do Curso de Pós Graduação em Zootecnia da UFRGS, bolsista CNPq.
3Professor do Curso de Pós Graduação em Zootecnia da UFRGS e bolsista CNPq.
1077
PIRES e PRATES
vibratórios, que são específicos para cada tipo de
24/03/93, tendo seis cultivares (três populações meligação covalente presente. Os espectros resultantes
lhoradas da cultivar crioula, uma cultivar crioula da
desta absorção podem ser utilizados para identificar
CRA com sementes produzidas no Chile, uma cultivar
compostos puros ou compostos complexos, pois as
crioula obtida da Estação Experimental Agronômica
curvas espectrais do composto no infravermelho
da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal
proximal podem ser comparadas a uma “impressão
do Rio Grande do Sul, a partir de sementes oriundas
digital” do composto (VOGEL, 1992).
da região produtora do Estado e a cultivar WL 520).
O processamento de valores espectrofotométricos
Todas as amostras foram analisadas de acordo com a
de amostras, com seus valores de análise laboratorial
AOAC (1995), para se determinarem os teores de
previamente determinados, torna-se necessário para
matéria seca (MS), matéria orgânica (MO) e proteína
a realização da calibração. Logo, a calibração é, em
bruta (PB). As análises de fibra em detergente neutro
termos estatísticos, a criação de um modelo mate(FDN), fibra em detergente ácido (FDA) e lignina em
mático que descreve a composição química da amostra
detergente ácido (LDA) foram realizadas de acordo com
a partir da absorção da energia na faixa do infravermelho
o método descrito por GOERING e VAN SOEST (1970).
proximal pelo material submetido à radiação (AISHIMA
A relação folha-caule foi feita em cada corte
e NAKAI, 1991). Esta equação de calibração torna
coletando-se 10 hastes por parcela, sendo realizada a
possível a predição da composição de amostras descoseparação dos dois componentes com o material
nhecidas, mas pertencentes à população que originou a
ainda fresco. Após a separação, o material foi seco
calibração, com bom grau de confiabilidade.
em estufa a 65oC e pesado.
A partir da leitura do espectro, são realizadas
Foi utilizado o programa NEWISI, 1993 (Infrasoft
transformações matemáticas que possibilitam a
International, Port Matilda, PA, USA) para a obtenotimização da informação disponível e correção dos
ção dos espectros das curvas de calibração, validaefeitos causados por diferenças no tamanho de parção e processamento dos dados.
tícula (densidade e orientação) das amostras, para
Todas as amostras foram moídas em moinho tipo
predizer sua composição.
Wiley, com tamanho de crivo da peneira de 3,0 mm,
Os parâmetros mais utilizados na avaliação da
e, posteriormente, moídas no mesmo moinho com
equação de calibração são: comprimento de onda;
peneira de crivo de 1,0 mm.
erro-padrão da calibração, ou seja, o desvio-padrão
Do total das amostras, 2/3 foram utilizadas para a
da diferença entre os cálculos do aparelho e os
curva de calibração, ou seja, 211 amostras. As amostras
resultados do método de referência; e o coeficiente
para a calibração foram selecionadas aleatoriamente,
de determinação simples (r2) ou múltipla (R2) (Júlio
tomando-se 2/3 das amostras de cada corte.
Petersen, informação pessoal).
A leitura foi realizada utilizando-se os comprimentos
Existem problemas quanto à utilização do NIRS
de onda de 400 a 2500 nanômetros (nm) em um aparelho
para a análise de forragens. No Brasil, os trabalhos
NR6500 da NIRSystems. As leituras dos espectros
são muito incipientes, existindo pouca literatura a
foram gravadas na forma do logaritmo da recíproca da
respeito. É preciso maior padronização, inclusive em
refletância (log 1/R), a intervalos de 2 nm.
nível internacional, e mais pesquisas na área da
Antes de se processarem os dados, os espectros das
análise em silagens e minerais.
amostras foram avaliados pelo algoritmo CENTER
Devido às lacunas existentes no país a respeito da
(SHENK e WESTERHAUS, 1991), no qual as amostécnica NIRS, foi realizado este trabalho, para avaliar
tras que apresentaram elevado valor “H” (acima de
o potencial da utilização desta técnica na predição dos
três) foram lidas novamente para se ajustarem à
teores de matéria seca, matéria orgânica, proteína
população de calibração.
bruta, fibra em detergente neutro, fibra em detergente
A regressão foi calculada utilizando-se os
ácido, lignina em detergente ácido e a relação folhaModified Partial Least Squares e Partial Least
caule em amostras de alfafa (Medicago sativa, L.).
Squares. Para corrigir a dispersão da luz, utilizaramse os tratamentos matemáticos SNV e DT (BARNES
Material e Métodos
et al., 1989).
O processo de leitura das amostras para validaForam utilizadas 315 amostras de alfafa obtidas
ção foi o mesmo utilizado para a calibração.
de nove cortes (com aproximadamente 1/3 do
Para avaliar a equação, utilizou-se o valor residuflorescimento), realizados no período de 10/11/92 a
al da diferença entre a média das análises laboratoriais
1078 R.Bras.Zootec.
e dos valores estimados e o valor “H” dos outliers, a
quantidade de outliers e também a resposta do conjunto
de validação, de acordo com WINDHAM et al. (1989).
Outra análise realizada na curva de validação foi o teste
t emparelhado (MARKUS, 1974) entre os valores de
laboratório e os valores estimados pelo aparelho.
Resultados e Discussão
A Tabela 1 mostra os valores obtidos no processo
de calibração para os teores de MS, MO, PB, FDN,
FDA, LDA e F/C. Estes valores são comparáveis aos
de calibração obtidos por diversos autores (Tabela 2).
As diferenças entre os valores podem ser atribuídas
principalmente às diferenças de instrumentação, método de regressão utilizado, dispersão das amostras ao
longo da curva e, também, às formas de apresentação das
amostras (feno, pastagem, amostra congelada, silagem,
haylage) e calibração múltipla, isto é, utilização de mais
de uma espécie forrageira na curva de calibração.
Pode-se observar que os valores para proteína
são os que apresentaram os melhores resultados, ou
seja, alto coeficiente de determinação (R2) e baixo
erro-padrão de calibração (EPC). Para este tipo de
análise, a técnica NIRS possui uso mais difundido.
Para as análises de FDN, FDA e LDA, a precisão
da técnica NIRS é menor, pois existe uma complexidade muito grande. Ocorrem muitas misturas químicas nestas frações, ainda não bem definidas quimicamente, além de ocorrer influência da espécie, grau de
desenvolvimento e método utilizado na armazenagem
da amostra (TEMPLETON et al., 1983; SHENK e
WESTERHAUS, 1994).
Na literatura, a apresentação de valores para MS,
MO e F/C são muito escassos. Neste trabalho, a
princípio, os valores são adequados, pois apresentam
baixo EPC e elevado R2. Apenas a fração F/C
apresentou R2 considerado baixo, mas este fato pode
ser explicado pelo elevado grau de erro associado na
determinação desta fração. Também deve ser considerado que nesta fração não foi realizada a análise em
duplicata. Para se obterem melhores resultados nesta
análise, dever-se-ia ter realizado a curva por intermédio
de mistura sintética, ao invés de determinar esta fração
com amostras de campo em que o erro é muito elevado.
A melhor forma de avaliar os resultados obtidos é
por intermédio da realização da curva de validação.
Neste procedimento é possível retirar algumas amostras
desta curva. Esta retirada de amostras torna-se necessária porque algumas delas não pertencem à população.
Também é possível retirar algumas amostras (outliers),
por não apresentarem boa predição. Nesta retirada de
amostras, permite-se o máximo em torno de 10% do
total das amostras contidas na curva de validação.
A avaliação dos resultados, conforme o sugerido
por WINDHAM et al.(1989), na qual o erro-padrão
da validação deve ser no máximo 1,3 vezes o valor do
erro-padrão da calibração (Tabela 3), mostra que se
obteve sucesso com os resultados para PB, MO,
LDA e F/C, entretanto, os teores de MS, FDN e FDA
não foram satisfatórios.
O erro-padrão da predição ficou acima do valor
máximo permitido, tanto para as análises de FDN
como FDA (1,43 e 1,37; 1,07; e 1,02, para os valores
Tabela 1- Valores obtidos no processo de calibração das amostras de alfafa para a determinação de MS, MO, PB, FDN, FDA,
LDA e F:C
Table 1-
Obtained values in the calibration process of alfalfa samples for the determination of DM, OM, CP, NDF, ADF, ADL and L:S
Método de
Tratamento
DesvioMédia
Intervalo
EPC
R2
n
EPL
Componente
Component
MS (DM)
MO (OM)
PB (CP)
FDN (NDF)
FDA (ADF)
LDA (ADL)
F:C (L:S)
regressão
matemático
padrão
Regression
method
Mathematic
treatment
Standard
deviation
MPLS
MPLS
MPLS
MPLS
MPLS
PLS
MPLS
3551
2641
2641
3551
1441
1441
3551
1,97
1,32
2,47
4,57
4,02
0,98
0,21
Mean
Interval
SEC
86,19
88,67
23,27
47,49
34,62
8,35
0,89
81,03-90,07
84,71-91,35
19,01-30,21
36,73-58,18
25,53-44,92
6,01-11,16
0,45-1,33
0,46
0,36
0,51
1,06
0,79
0,31
0,09
SEL
0,94
0,92
0,96
0,95
0,96
0,90
0,79
176
202
199
193
198
198
199
Método de regressão (regression method).
MPLS = L S parcialmente modificado (modified partial least squares).
PLS = LS parcial (partial least squares).
Tratamento matemático= derivada, segmento, distância, segunda distância (Mathematic treatment= derivative, gap, smooth, second smooth).
EPC = erro-padrão da calibração (SEC= standard error of calibration).
R2 = coeficiente de determinação múltiplo (R2= coefficient of multiple determination).
n = número de amostras usadas na calibração (n= number of samples used for calibration).
EPL= erro-padrão da análise laboratorial (SEL= standard error of laboratorial analysis).
0,14
0,16
0,43
-
1079
PIRES e PRATES
Tabela 2 - Valores de EPC e R 2 de calibração obtidos por diversos autores
Table 2 -
Values of SEC and R2 of calibration obtained for different authors
Autor
EPV
NORRIS et al. (1976)
BURDICK et al. (1981)
MARTEN et al. (1983)
VALDEZ et al. (1985)
PETERSEN, J.C. (1986)
BROWN e MOORE (1987)
FLINN e MURRAY (1987)
BROWN et al. (1990)
PB (CP)
FDN (NDF)
FDA (ADF)
LDA (ADL)
R2
EPV
R2
EPV
R2
EPV
R2
SEC
SEC
SEC
SEC
0,74
0,99
2,39
0,98
1,56
0,96
0,80
1,01
2,78
1,78
0,54
0,51
0,99
1,40
0,94
0,61
0,98
0,24
0,64 a 0,87 0,93 a 0,95
1,44 a 2,42 0,75 a 0,92 0,63
0,97
1,56
0,97
0,75
0,96
0,14 a 0,79 0,73 a 0,98 0,75 a 1,21
0,70 a 0,95
1,10
0,92
0,61
0,41 a 1,31 0,83 a 0,98 1,34 a 1,73
0,90 a 0,96
0,73
0,92
1,52
0,82
Author
0,96
0,96
0,87
-
EPV= erro-padrão da validação (SEP= standard error of prediction).
R2 = coeficiente de determinação múltiplo (R2= coefficient of multiple determination).
Tabela 3 - Valores obtidos no processo de validação retirados todos osoutliers para a determinação de MS, MO, PB, FDN, FDA,
LDA e F:C
Table 3 -
Values obtained in the validation process without all outliers for the determination of DM, OM, CP, NDF, ADF, ADL and L:S
DesvioDesvioMédia
Intervalo
EPV
Vício
R2
N
1
2
padrão
padrão
estimada
Interval
SEP
Bias
Componente
Component
Standard
deviation1
Standard
deviation2
Predicted
mean
MS (DM)
MO (OM)
PB (CP)
FDN (NDF)
FDA (ADF)
LDA (ADL)
F/C (L/S)
1,71
1,25
2,25
4,31
3,90
0,95
0,18
1,84
1,29
2,23
4,44
3,71
0,95
0,18
86,26
88,77
23,00
47,74
34,70
8,36
0,88
1
81,90-89,92
85,85-90,70
19,44-28,48
36,90-57,10
26,32-42,64
6,02-10,13
0,54-1,32
0,48
0,46
0,62
1,43
1,07
0,38
0,10
-0,04
-0,02
0,08
-0,15
-0,17
-0,08
0,00
0,93
0,87
0,93
0,90
0,93
0,85
0,68
74
94
92
92
93
95
98
Valores estimados (Estimate values).
2 Valores de análise laboratorial (Values from laboratorial analysis).
EPV= erro-padrão da validação (SEP= standard error of prediction).
Vício = diferença entre a média do laboratório e do valor estimado (Bias = difference between the lab mean and the estimated value).
R2= coeficiente de determinação múltiplo ( R2= coefficient of multiple determination).
n= número de amostras usadas no processo de validação (n= number of samples used in the validation process).
obtidos e válidos para FDN e FDA, respectivamente). Nestas frações (FDN e FDA), a retirada dos
outliers não foi suficiente para aceitar, segundo
WHINDMAN et al.(1989), as respectivas equações
de calibração. Deve-se levar em conta que nestas
frações (FDN e FDA) a dispersão dos dados são
menores, o que ajuda a obtenção de resposta de
menor qualidade (TEMPLETON et al., 1983; SHENK
e WESTERHAUS, 1994).
A fração MS foi a que apresentou os piores
resultados. O número de outliers foi muito elevado,
indicando que, apesar de boa calibração, esta não foi
capaz de estimar os valores adequadamente. Este é
um dos motivos de se realizar a validação da equação
de calibração. A importância desta etapa tem sido
destacada há pouco tempo e seu erro geralmente é
superior, pois apresenta os erros acumulados da
curva de calibração mais o erro do aparelho na
predição (HRUSCHKA, 1990).
Outro problema apresentado é a variação da umidade no local das análises. Ao se realizarem as análises, a
temperatura e a umidade relativa do ar deveriam ser
controladas. Para a determinação de MS, o efeito da
temperatura e umidade relativa é muito grande. Entretanto, para as demais frações, este efeito é pequeno. De
acordo com FALES e CUMMINS (1982), amostras
armazenadas em sacos plásticos podem variar até 10
pontos percentuais de umidade, dependendo das condições
do ambiente (temperatura e umidade relativa) em que se
encontram. Os resultados obtidos por FERREIRA et al.
(1994) demonstraram variação no teor de MS em amostras
armazenadas em vidros com tampa de rosca. O fato de se
manipularem as amostras para a realização das análises
laboratoriais colabora para que estas tenham seu teor de
umidade modificado.
Os espectros das análises foram obtidos antes das
1080 R.Bras.Zootec.
análises laboratoriais, o que pode ter colaborado para o
resultado insatisfatório na análise da MS via NIRS. É
possível que, ao se realizarem as análises laboratoriais
posteriormente às leituras dos espectros, as amostras
tenham alterado seu teor de umidade.
Ao se realizar outro tipo de análise estatística, o
teste t emparelhado, com todas as amostras, foram
obtidos os resultados apresentados na Tabela 4. Podese verificar que as frações PB, MO, FDN, FDA, MS e
F/C foram bem estimadas, ou seja, os valores estimados
e os de laboratório não diferiram. Apenas a fração LDA
foi diferente (P<0,05). Este resultado inclui todas as
amostras, ou seja, amostras com espectros não pertencentes à população, amostras fora do intervalo de
calibração e os outliers.
A realização de teste t emparelhado, retirando-se
todos os outliers (Tabela 5) mostra que todas as frações, inclusive LDA, podem ser estimadas. Este teste
ratifica o resultado obtido via análise NIRS, confirmando seu uso para estas frações.
A calibração apresentou valores muito adequados
para uso, sendo inclusive superior à de muitos trabalhos apresentados na literatura. Entretanto, a comparação com trabalhos já publicados fica um pouco
prejudicada. No Brasil não existe trabalhos científicos
sobre esta área de pesquisa. Devido à versatilidade
que apresenta esta técnica, cada autor deve realizar
seu julgamento, a fim de verificar se os resultados
podem ser aplicados ou não.
Tabela 4 - Valores do teste de t em par para a determinação
de MS, MO, PB, FDN, FDA, LDA e F:C, usado-se
todas as amostras
Tabela 5 - Valores do teste de t em par para a determinação
de MS, MO, PB, FDN, FDA, LDA e F:C, retirandose todos os outliers
Table 4 -
Table 5 -
Values of paired t test for the determination of DM, OM,
CP, NDF, ADF, ADL and L:S, using all samples
Componente
Valor t
EPD
Component
MS (DM)
MO (OM)
PB (CP)
FDN (NDF)
FDA (ADF)
LDA (ADL)
F:C (L:S)
t value
STD
0,77
-1,10
-0,27
1,24
-0,91
-2,15 *
0,42
1,38
0,31
0,63
4,34
1,71
0,19
0,01
d
0,086
-0,0605
-0,0210
0,2539
-0,1163
-0,0913
0,0047
EPD= erro-padrão da diferença (STD = standard error of difference).
d= diferença média (Mean difference).
* Significativo a P<0,05 (Significant at P<.05).
Conclusões
Os teores de MO e PB da alfafa podem ser
determinados pela técnica NIRS com alta precisão.
As determinações do teor de LDA e da relação
folha-caule também podem ser obtidas pela técnica
NIRS, porém com menor grau de precisão.
As equações obtidas para a determinação dos
teores de FDA e FDN, apesar do resultado inferior ao
das equações para MO, PB, LDA e F/C, podem ser
utilizadas em determinadas situações em que o resultado não exija precisão muito elevada.
A determinação do teor de MS pela técnica NIRS
foi prejudicada pela metodologia empregada, não se
recomendando sua utilização.
Values of paired t test for the determination of DM, OM,
CP, NDF, ADF, ADL and L:S, without all outliers
Componente
Valor t
EPD
Component
MS (DM)
MO (OM)
PB (CP)
FDN (NDF)
FDA (ADF)
LDA (ADL)
F/C (L/S)
t value
STD
-0,84
0,41
0,32
0,99
-1,58
1,95
0,34
0,0567
0,0477
0,0651
0,1487
0,1098
0,0385
0,0106
d
-0,0476
-0,0196
0,0209
-0,1472
-0,1731
0,0754
-0,0037
EPD= erro-padrão da diferença (STD: standard error of the difference).
d= diferença média (Mean difference).
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Recebido em: 05/12/97
Aceito em: 22/06/98