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PAPEL DA CORTICOSTERONA NA AQUISIÇÃO DOS PROCESSOS
DE CONDICIONAMENTO E SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL
INDUZIDOS POR ADMINISTRAÇÕES SISTÊMICAS DE
APOMORFINA EM RATOS
PRÍSCILA QUINTANILHA BRAGA
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO NORTE FLUMINENSE DARCY RIBEIRO
CAMPOS DOS GOITACAZES – RJ
JULHO – 2004
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PAPEL DA CORTICOSTERONA NA AQUISIÇÃO DOS PROCESSOS
DE CONDICIONAMENTO E SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL
INDUZIDOS POR ADMINISTRAÇÕES SISTÊMICAS DE
APOMORFINA EM RATOS
PRÍSCILA QUINTANILHA BRAGA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Produção Animal
Orientadora: Profa. Dra. Marinete Pinheiro Carrera
CAMPOS DOS GOYTACAZES – RJ
JULHO – 2004
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PAPEL DA CORTICOSTERONA NA AQUISIÇÃO DOS PROCESSOS
DE CONDICIONAMENTO E SENSIBILIZAÇÃO COMPORTAMENTAL
INDUZIDOS POR ADMINISTRAÇÕES SISTÊMICAS DE
APOMORFINA EM RATOS
PRÍSCILA QUINTANILHA BRAGA
Tese apresentada ao Centro de Ciências e
Tecnologias Agropecuárias da Universidade
Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro, como parte das exigências para
obtenção do título de Mestre em Produção
Animal
Aprovada em 22 de julho de 2004
Comissão Examinadora:
________________________________________________________________
Profa. Cristiane Salum (D. Sc, Psicobiologia) – USP
________________________________________________________________
Profa. Sylvia Beatriz Jofilly (D. Sc, Psicologia) – UENF
________________________________________________________________
Prof. Luís Fernando Cardenas (D. Sc, Psicobiologia) – UNESA
Profa. Marinete Pinheiro Carrera (D. Sc, Psicobiologia) – UENF
(Orientadora)
i
ii
“Não te lastimes. Age.
Tens o tempo ao teu dispor.
Não reproves. Destaca
O melhor do que vejas.
Não grites. Baixa a voz,
Se queres que te escutem.
Não desprezes. Socorre,
Caso intentes ser útil.
Não te irrites. Aguarda
O alheio entendimento.
Não desanimes. Ama,
Se pretendes vencer.”
Francisco Cândido Xavier
“O ser humano é condicionado por hábitos. Habitue-se a pensar e agir
positivamente, bondosamente, calmamente. A mente é tudo! O que pensamos é o
que nos tornamos. A solução está sempre dentro de nós.”
Alan Kardec
ii
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Ao meu pai, por todo o amor, incentivo, mas principalmente pela insigne contribuição
na conclusão desta Tese, por sempre ter-me feito acreditar que com coragem nada
seria impossível.
Dedico
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AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por ser minha fortaleza e meu refúgio.
A minha mãe, de cuja magnanimidade tenho o privilégio de usufruir.
Ao meu pai, que deixou, além de tanta saudade, um exemplo de generosidade.
Aos meus queridos irmãos, Douglas e Juninho, porque não poderia haver outros
melhores.
A minha querida filha “Tita", por todo o amor que me concede.
Aos meus estimados avós, que não medem esforços para que eu seja feliz.
Ao meu tio e tias, especialmente a tia Lourdes, que tanto torcem pelo meu sucesso
profissional.
Ao meu padrasto Sérgio, sempre disposto a me ajudar em tudo de que preciso.
À minha orientadora, Profa. Dra. Marinete Carrera, pela paciência diante dos
imprevistos surgidos em minha vida, o que foi determinante para a realização e
conclusão deste trabalho.
Aos grandes amigos, Flávia, Rose, Enrico, Michelle e Aline, que sempre me
incentivaram e se mostraram solícitos nos momentos mais difíceis.
Aos amigos, Viviane, Samuel, Lívia e Stefania, que, mesmo distantes, torceram para
que tudo desse certo na realização desta Tese.
À amiga Fernanda, por seu auxílio inestimável na conclusão desta Tese.
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v
À coordenação de pós-graduação, especialmente, a Etiene Marques, Elenita
Lacerda e Profa. Célia Raquel Quirino, por todo auxílio e esclarecimentos prestados,
fundamentais para a conclusão desta Tese.
Aos professores que contribuíram para minha formação acadêmica no curso de
mestrado, principalmente Profa. Marinete Carrera (LSA), Prof. Antonio Henrique
Almeida (LBCT), Profa. Silvia Jofilly (LCL), Prof. Alberto Magno (LZNA), Profa.
Rosemary Bastos (LMGA), Profa. Rita da Trindade (LZNA) e Prof. Marcos Matta
(LMGA).
Ao Prof. Dr. Francisco Carlos Rodrigues Medeiros, pela confiança depositada em
meu trabalho.
As ex-bibliotecárias Jovana e Magda, pela amizade e por todas as informações
fornecidas que muito me auxiliaram na reunião do material-base desta Tese.
Ao funcionário “Seu Daniel”, pelos “galhos” quebrados ao longo deste período.
Aos meus colegas de laboratório, Francimar, Ludimila, Nalígia, Lígia, Rachel e Cíntia
pela torcida e pela ajuda quando precisei.
Aos técnicos do laboratório de Sanidade Animal, principalrmente à Gina Nunes, pelo
auxílio no fornecimento de materiais indispensáveis à realização deste trabalho.
A todos os funcionários da xerox que pelo CCTA passaram, principalmente Fabiana,
Lucélia, Renatinha e Dani, pela simpatia e eficiência na entrega das tantas xerox de
aulas, artigos e livros.
Aos guardas sempre presentes, garantindo a segurança nos dias de semana, fins de
semana e feriados.
Ao casal, Paulo Márcio e Ana Paula, pela venda dos tantos “lanches-almoço” nos
horários de experimento.
Aos funcionários da limpeza, por tornarem o ambiente de trabalho salutar e
agradável para se trabalhar.
Aos funcionários do Biotério, particularmente a Joana, pelo fornecimento do
instrumento principal para realização deste trabalho.
À UENF e ao CCTA, pela oportunidade de exercer minha profissão.
À CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado.
v
vi
BIOGRAFIA
Príscila Quintanilha Braga, filha de José Geraldo Braga e Rosely Quintanilha
Braga, nasceu em 26 de dezembro de 1976, na cidade de Campos dos Goytacazes
– RJ.
Ingressou no curso de graduação em Medicina Veterinária na Universidade
Estadual do Norte Fluminense em março de 1997 e formou-se em fevereiro de 2002.
Foi admitida em agosto de 2002 no curso de Pós-graduação em Produção
Animal, Mestrado, Farmacologia, da Universidade Estadual do Norte Fluminense,
em Campos dos Goytacazes-RJ, submetendo-se à defesa de Tese para a conclusão
do curso em julho de 2004.
vi
vii
CONTEÚDO
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................
ix
RESUMO ...............................................................................................................
x
ABSTRACT ............................................................................................................
xii
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................
1
2. REVISÃO DE LITERATURA ..........................................................................
4
2.1. O condicionamento induzido por drogas ...................................................
4
2.2. O processo de sensibilização comportamental .........................................
6
2.3. O sistema dopaminérgico .........................................................................
8
2.3.1. Relação do sistema dopaminérgico com o processo de
condicionamento .................................................................................
10
2.3.2. O sistema dopaminérgico e a sensibilização comportamental ...........
11
2.3.3. Apomorfina ........................................................................................
11
2.4. Hormônios Glicocorticóides ......................................................................
13
2.4.1. Receptores Corticosteróides ...............................................................
15
2.4.2. Metirapona .................................................. ......................................
17
2.5. Interação entre a corticosterona e o sistema dopaminérgico ...................
19
2.6. Relação entre a corticosterona e o processo de condicionamento ..........
21
2.7. Corticosterona e o processo de sensibilização .........................................
22
3. MATERIAL E MÉTODOS ...............................................................................
25
3.1. Sujeitos .....................................................................................................
25
3.2. Ambiente experimental .................................................. ..........................
25
vii
viii
3.3. Drogas .......................................................................................................
26
3.4. Procedimento experimental ......................................................................
26
3.4.1. Período de habituação ........................................................................
26
3.4.2. Fase de condicionamento ...................................................................
27
3.4.3. Período de retirada de droga 1 ...........................................................
27
3.4.4. Teste de condicionamento ..................................................................
27
3.4.5. Período de retirada de droga 2 ...........................................................
27
3.4.6. Teste de sensibilização comportamental ............................................
27
3.4.7. Quadro 1: Cronograma do procedimento experimental .....................
28
3.5. Experimento 1: efeitos de administrações sistêmicas de apomorfina na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental ....
28
3.6. Experimento 2: efeitos de administrações sistêmicas de metirapona na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental ....
30
3.7. Experimento 3: efeito da metirapona sobre a atividade locomotora
condicionada e a sensibilização comportamental produzidas por
administrações sistêmicas de apomorfina ...............................................
32
3.8. Análise comportamental ...........................................................................
33
3.9. Análise estatística .....................................................................................
33
4. RESULTADOS ...............................................................................................
36
4.1. Experimento 1: efeitos de administrações sistêmicas de apomorfina na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental ......
36
4.2. Experimento 2: efeitos de administrações sistêmicas de metirapona na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental ......
41
4.3. Experimento 3: efeito do metirapona sobre a atividade locomotora
condicionada e a sensibilização comportamental produzidas por
administrações sistêmicas de apomorfina ................................................
45
5. DISCUSSÃO ...................................................................................................
50
5.1. Experimento 1: efeitos de administrações sistêmicas de apomorfina na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental ......
50
5.2. Experimento 2: efeitos de administrações sistêmicas de metirapona na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental ......
54
5.3. Experimento 3: efeito do metirapona sobre a atividade locomotora
condicionada e a sensibilização comportamental produzidas por
administrações sistêmicas de apomorfina ................................................
56
6. CONCLUSÕES ...............................................................................................
62
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...............................................................
63
viii
ix
LISTA DE ABREVIATURAS
6-OH-DOPA – 6-hidroxi-dopamina
ACTH – Hormônio Adrenocorticotrópico
AMP – Adenosina Monofosfato
APO – Apomorfina
ASS – Associado
CRF – Fator de Liberação de Corticotropina
CYP-450 – Citocromo P-450
DAT – Transportador de Dopamina
EC – Estímulo Condicionado
EI – Estímulo Incondicionado
EN – Estímulo Neutro
GRs – Receptores Glicocorticóides
HHA – Hipotálamo – Hipófise – Adrenal
HVA – Ácido Homovanílico
MAO – Monoamina Oxidase
MET – Metyrapone
MRs – Receptores Mineralocorticóides
N-ASS – Não-associado
NMDA – N-metil-D-aspartato
RC – Resposta Condicionada
RI – Resposta Incondicionada
VEIC – Veículo
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x
RESUMO
BRAGA, Príscila Quintanilha. Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy
Ribeiro; julho de 2004. Papel da corticosterona na aquisição dos processos de
condicionamento e sensibilização comportamental induzidos por administrações
sistêmicas de apomorfina em ratos; Profa. Orientadora: Profa. Dra. Marinete Pinheiro
Carrera.
Estímulos estressantes, recompensadores naturais e farmacológicos aumentam a
secreção de corticosterona que, por sua vez, eleva a liberação de dopamina. Dessa
forma, a corticosterona potencializa os efeitos motores e reforçadores de drogas
psicoestimulantes como a apomorfina (APO) – agonista direto dos receptores
dopaminérgicos D1 e D2. Acréscimos na atividade dopaminérgica medeiam os
processos de condicionamento e sensibilização a psicoestimulantes. Este trabalho
investigou o papel da corticosterona na aquisição do condicionamento e
sensibilização comportamental induzidos por apomorfina. Foram realizados três
experimentos. No primeiro, ratos Wistar foram divididos em três grupos: controle;
APO (0,5 e 2,0 mg/kg) associado ao ambiente experimental, onde os animais
receberam APO e foram colocados na arena-teste por trinta min para registro de sua
atividade locomotora (número de cruzamentos) e APO não-associado ao ambiente
experimental, onde os animais receberam veículo foram colocados na arena-teste e,
após trinta min foram retirados da arena, tendo recebido APO na caixa-viveiro. Este
procedimento foi realizado durante 5 dias consecutivos (fase de condicionamento –
FC). Após o término da FC, houve um período de retirada da droga por dois dias e,
x
xi
durante este período, os animais não foram manipulados farmacológica e
comportamentalmente. Em seguida, deu-se o teste de condicionamento (TC), no
qual todos os animais receberam veículo e foram colocados na arena por trinta min.
Após um segundo período de retirada de droga, procedeu-se o teste de
sensibilização (TS), no qual os animais dos grupos APO receberam apomorfina e
aqueles do grupo controle receberam veículo e foram colocados na arena-teste. Os
resultados demonstraram que na FC o grupo APO associado 2 mg/kg apresentou
maior número de cruzamentos quando comparado aos demais grupos. No TC, os
grupos APO associados (0,5 e 2,0 mg/kg) apresentaram maior número de
cruzamentos quando comparados ao controle, indicando o desenvolvimento do
processo de condicionamento. No TS, o grupo APO associado 2 mg/kg apresentou
nº de cruzamentos maior que os demais grupos, sugerindo o desenvolvimento da
sensibilização. No segundo experimento, os ratos receberam administrações de
metirapona (MET – 50 mg/kg), inibidor da síntese de corticosterona, obedecendo ao
protocolo experimental citado anteriormente. Os resultados mostraram que, na FC e
no TC, o grupo MET associado apresentou maior número de cruzamentos que os
demais grupos, indicando condicionamento. No terceiro experimento, os ratos foram
pré-tratados com metirapona e, após, submetidos ao mesmo procedimento do
primeiro experimento. Os resultados demonstraram que, na FC, o grupo MET + APO
associado 2 mg/kg apresentou maior número de cruzamentos quando comparado
aos demais grupos. No TC, os grupos MET + APO associados (0,5 e 2,0 mg/kg)
apresentaram maior número de cruzamentos quando comparados ao controle,
indicando o desenvolvimento do processo de condicionamento. No TS, o grupo MET
+ APO associado 2 mg/kg apresentou número de cruzamentos maior que os demais
grupos, indicando sensibilização. Estes resultados mostraram que a APO produziu
condicionamento nas duas doses utilizadas, enquanto apenas a maior dose produziu
sensibilização. A MET sozinha produziu condicionamento. O pré-tratamento com
metirapona não bloqueou o condicionamento e a sensibilização à apomorfina. Estes
resultados sugerem que a corticosterona não está diretamente relacionada ao
desenvolvimento do condicionamento e sensibilização comportamental induzidos
pela apomorfina.
Palavras-chave: apomorfina, atividade locomotora, condicionamento pavloviano,
corticosterona, metirapona, sensibilização comportamental.
xi
xii
ABSTRACT
BRAGA, Príscila Quintanilha. State University of Norte Fluminense Darcy Ribeiro;
July, 2004. The role of corticosterone in the acquisition of conditioning and behavioral
sensitization induced by systemic administrations of apomorphine in rats; Advisor:
Dra. Marinete Pinheiro Carrera
Stressful and rewarding stimuli, both natural and pharmacological, stimulates adrenal
secretion of corticosteroid, that in turn, cause the release of dopamine. Thus,
corticosteroid increase motor and reinforcing effects of psycho-stimulant drugs such
as apomorphine (APO) a direct agonist of dopaminergic D1 and D2 receptors.
Increases in dopaminergic activity mediate the conditioning and sensitization
processes to psycho-stimulants. The present work investigated the role of
corticosterone in the acquisition of conditioning and behavioral sensitization induced
by apomorphine. Three experiments were performed. In the first experiment, Wistar
rats were divided in three groups: control; APO (0.5 and 2.0 mg/kg) paired to the
experimental environment, in which the rats received apomorphine and were placed
into the test environment during 30 min to register locomotor activity (number of
crossings) and APO unpaired to the experimental environment, in which the animals
received vehicle and then placed in the arena-test and 30 min later they were
removed from experimental arena and received APO in their home cage. This
procedure was performed during five consecutive days (conditioning phase – CF).
After the end of CF a two-days drug withdrawal period was used, in which the
animals were not handled. After the conditioning test (CT), all of the animals received
xii
xiii
non-drug vehicle and were placed in the experimental environment. After a second
drug free period, the sensitization test (ST) was carried out, in which the animals
belonging the APO–paired groups received apomorphine and the control group
received vehicle and were then placed in the test arena. Results showed that during
the CF, the APO–paired (2,0 mg/kg) group had higher number of crossings when
compared to the other groups. In the CT, the APO–paired groups (90.5 and 2.0
mg/kg) showed higher locomotor activity than the control group, suggesting the
development of a conditioning process. In the ST, the APO–paired (2.0 mg/kg) group
showed a higher number of crossings when compared to the other groups,
suggesting development of behavioral sensitization. In the second experiment, rats
received metyrapone (MET–50 mg/kg) an inhibitor of corticosterone synthesis, using
the same experimental protocol previously mentioned. Results showed that in the CF
and CT the MET–paired group had higher locomotor activity than the other groups,
suggesting a conditioning reponse. In the third experiment, rats were pre-treated with
metyrapone and then submitted to the same procedure as the first experiment.
Results showed that in the CF the MET+APO–paired (2.0 mg/kg) group had higher
number of crossings when compared to the other groups. In CT, the MET+APO–
paired groups (90.5 and 2.0 mg/kg) had higher motor activity than the control group,
suggesting development of conditioning. In ST, the MET+APO–paired (2.0 mg/kg)
group had a higher number of crossings than other groups, suggesting sensitization.
These results showed that APO produced conditioning at the two doses used while
only the largest dose produced sensitization. Metyrapone alone produced
conditioning.
Pre-treatment
with metyrapone did not block conditioning or
sensitization to apomorphine. These results suggest that corticosterone is not directly
involved in the development of conditioning and apomorphine-induced behavior
sensitization.
Keywords: apomorphine, behavior sensitization corticosterone, locomotor activity,
metyrapone, Pavlovian behavior.
xiii
1
1. INTRODUÇÃO
O processo de condicionamento induzido por drogas constitui um modelo de
aprendizagem postulado, nas primeiras décadas do século XX, pelo fisiologista
russo, Ivan Petrovick Pavlov. Este cientista admitiu que a associação entre os efeitos
produzidos por uma droga e o ambiente, no qual tais efeitos são experimentados,
representa um processo de condicionamento.
Num de seus experimentos, o cientista emitia um som aproximadamente
dois a três minutos após administrar apomorfina, por via subcutânea, em cães, e os
efeitos observados eram sialorréia, inquietação e tendência à êmese. Pavlov, então,
denominou o som, estímulo neutro, que seria o estímulo que não evoca uma
resposta específica. A apomorfina, Pavlov denominou estímulo incondicionado, ou
seja, estímulo que produz uma mesma resposta em todos os organismos de uma
mesma espécie. As respostas naturais (salivação, inquietação e êmese) ao estímulo
incondicionado foram denominadas respostas incondicionadas.
Contudo, após várias associações entre o som emitido e a administração de
apomorfina, Pavlov verificou que apenas a apresentação do som era suficiente para
evocar os efeitos produzidos pela droga. Pavlov passou a designar o som, estímulo
condicionado,
já
que
sozinho
produziu
a
mesma
resposta
do
estímulo
incondicionado e denominou a resposta resultante do estímulo aprendido – resposta
condicionada. Deste modo, quando uma droga é administrada repetidamente num
ambiente específico, o estímulo ambiental, através de sua história de associação
2
com a exposição à droga, promoverá a expressão seletiva de ambos os efeitos
comportamentais e bioquímicos da droga.
Uma outra forma de aprendizagem é o processo de sensibilização
comportamental que é caracterizado por um aumento progressivo da atividade
locomotora, induzido pela administração repetida de psicoestimulantes, além de uma
hipersensibilidade comportamental duradoura, mesmo cessada a administração da
droga.
A administração de psicoestimulantes acarreta um acréscimo na atividade
dopaminérgica. A literatura científica estabelece que uma atividade dopaminérgica
elevada, advinda do emprego de agonistas dopaminérgicos, de modo geral, implica
uma hiperatividade locomotora do mesmo modo que um decréscimo na
neurotransmissão dopaminérgica redunda em hipomotilidade. A hiperatividade
locomotora condicionada a psicoestimulantes, como anfetamina e apomorfina,
resulta principalmente de acréscimos nas atividades dopaminérgicas mesolímbica e
nigroestriatal. Além disso, o processo de sensibilização também parece ser mediado
pelos sistemas dopaminérgicos mesolímbico e nigroestriatal.
Por
outro
lado,
os
psicoestimulantes,
estímulos
recompensadores
farmacológicos, aumentam a secreção adrenal de corticosterona que, por sua vez,
aumenta a liberação de dopamina, potencializando os efeitos psicomotores e
reforçadores dos psicoestimulantes.
Os
corticóides
compartilham
as
principais
ações
neuroquímicas
e
comportamentais com os psicoestimulantes. Neuroquimicamente, ambos elevam as
concentrações extracelulares de dopamina em projeções estriatais ventrais de
neurônios dopaminérgicos mesencefálicos. Comportamentalmente, assim como os
psicoestimulantes, a corticosterona tem efeitos motores e facilita a aprendizagem do
comportamento de auto-administração de drogas, ambas as respostas por meio da
ativação da transmissão dopaminérgica mesencefálica. Desde que a aquisição da
resposta locomotora condicionada aos psicoestimulantes depende da ativação dos
sistemas dopaminérgicos, não seria possível, então, que a corticosterona, ao elevar
a atividade dopaminérgica, participasse do desenvolvimento do condicionamento
clássico?
Similarmente ao observado com os psicoestimulantes, a exposição repetida
ao estresse resulta no desenvolvimento do processo de sensibilização. Sujeitos
sensibilizados pelo estresse exibem uma insigne resposta locomotora aos
3
psicoestimulantes, um fenômeno conhecido como sensibilização cruzada. Ambos,
estresse e psicoestimulantes, promovem
a ativação do eixo HHA (hipotálamo –
hipófise – adrenal) que culmina na elevação dos níveis de corticosterona circulante.
Postula-se que o acréscimo produzido nos efeitos dos psicoestimulantes produzido
pelo estresse depende de um aumento nos níveis de corticosterona.
Basicamente, três linhas de evidência indicam que a corticosterona
potencializa os efeitos psicomotores e reforçadores dos psicoestimulantes. Primeiro,
há uma correlação positiva entre a secreção de corticosterona e a sensibilidade aos
efeitos
reforçadores
corticosterona,
dos
anterior
psicoestimulantes.
à
Segundo,
auto-administração
de
a
administração
anfetamina,
aumenta
de
as
propriedades reforçadores desta droga. Terceiro, a supressão crônica da secreção
de
corticosterona
pela
adrenalectomia
ou
metirapona
diminui
os
efeitos
psicomotores e reforçadores dos psicoestimulantes.
Dado o exposto, o escopo deste trabalho foi avaliar a participação da
corticosterona, por meio do bloqueio da sua síntese, no desenvolvimento dos
processos de sensibilização comportamental e condicionamento induzido por
drogas. Para tal, avaliou-se o efeito de administrações sistêmicas de diferentes
doses de apomorfina (0,5 e 2,0 mg/kg), agonista dopaminérgico D1 e D2, sobre a
aquisição da resposta locomotora condicionada e sensibilização comportamental.
Além disso, investigou-se o papel do pré-tratamento com metirapona (50 mg/kg),
inibidor
da
síntese
de
corticosterona,
na
aquisição
dos
processos
de
condicionamento e sensibilização produzidos por apomorfina. Supôs-se que o efeito
indireto da apomorfina, como estimuladora da secreção de corticosterona a qual
aumenta a liberação de dopamina, teria papel relevante no desenvolvimento dos
processos de condicionamento e sensibilização comportamental. Portanto, o objetivo
foi verificar se a ausência de corticosterona afetaria o papel da apomorfina nos
processos de condicionamento e sensibilização comportamental. Vale ressaltar que,
até o momento, não foi proposto um papel consistente para os hormônios
glicocorticóides no processo de condicionamento clássico.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1- O Condicionamento induzido por drogas
O condicionamento constitui um modelo de aprendizagem, ou seja, um
processo de modificação comportamental dos indivíduos que resulta de suas
interações
com
o
ambiente
(BEAVER,
2001).
Existem
dois
tipos
de
condicionamento, o clássico (pavloviano) e o operante (instrumental). Neste
trabalho, no entanto, apenas o primeiro esteve em foco.
Sabe-se que um estímulo incondicionado (EI) resulta numa resposta
igualmente incondicionada (RI), o que significa que o mesmo estímulo elicia a
mesma resposta em todos os organismos de uma mesma espécie. Porém, estímulos
originalmente neutros (EN) que, automaticamente, não evocam uma resposta
específica, quando associados a um estímulo incondicionado são capazes de
provocar reflexos. O estímulo neutro torna-se um estímulo condicionado (EC), já que
sozinho passa a produzir a mesma resposta de um estímulo incondicionado. Essa
resposta, resultante do estímulo aprendido, é denominada resposta condicionada
(RC) e o processo envolvido, condicionamento clássico ou pavloviano (PAVLOV,
1927, apud MCKIM, 2000).
Este remoto conceito data das primeiras décadas do século XX, quando o
fisiologista russo, Ivan Petrovick Pavlov, estudando o processo de digestão,
observou que um cão salivava à mera visão da tigela de alimento, ou seja, este cão
aprendera a associar a visão da tigela com o sabor do alimento. Tratava-se de um
caso de aprendizagem associativa e Pavlov decidiu verificar se o cão seria capaz de
associar o alimento com outros estímulos, como luz, som, entre outros (ATKINSON
5
et al., 1995). Num de seus experimentos, Pavlov colocava o cão em frente a uma
tigela e, após alguns segundos, um pouco de pó de carne era enviado
automaticamente à tigela quando, então, a luz era desligada. O cão faminto salivava
copiosamente, Pavlov denominou a salivação resposta incondicionada e o pó de
carne, estímulo incondicionado. O procedimento foi repetido dezesseis vezes, ou
seja, dezesseis apresentações associadas da luz e do alimento. Finalmente, o
cientista ligava a luz, mas não enviava o alimento e, mesmo assim, o cão salivava. A
esta salivação denominou-se resposta condicionada e à luz, estímulo condicionado.
Em outras palavras, durante a aquisição da resposta condicionada, o estímulo
condicionado tornou-se um substituto do estímulo incondicionado, ou seja, o cão
aprendeu que a luz significava alimento (ATKINSON et al., 1995).
Pavlov (1927, apud DREW e GLICK, 1988) também sugeriu que a
associação entre os efeitos produzidos por uma droga e o ambiente no qual tais
efeitos são experimentados representa um processo de condicionamento. Num de
seus experimentos posteriores, o cientista emitia um som (EN) aproximadamente
dois a três minutos após administrar apomorfina (EI) em cães, por via subcutânea, e
os efeitos fisiológicos ou incondicionados (RI) observados eram sialorréia,
inquietação e tendência à êmese. Contudo, após várias associações entre o som
emitido e a administração de apomorfina, Pavlov verificou que apenas a
apresentação do som (EC) era suficiente para evocar os efeitos produzidos pela
droga (RC) (PAVLOV,1927, apud MCKIM, 2000). Deste modo, quando uma droga é
administrada repetidamente num ambiente específico, o estímulo ambiental, por
meio de sua história de associação com a exposição à droga, promoverá a
expressão seletiva de ambos os efeitos comportamentais e bioquímicos da droga
(DREW e GLICK, 1988).
O processo de condicionamento induzido por drogas apresenta relevância
na identificação dos substratos neurais envolvidos nos processos de aprendizagem
e memória. Isto pode ser comprovado pela resposta (RC) expressa diante de um
estímulo ambiental (EC) similar à resposta incondicionada promovida pela
administração de uma droga (EI). Isso significa que tal resposta, inicialmente
armazenada na memória, foi evocada pela simples apresentação do estímulo
condicionado (DAMIANOPOULOS e CAREY, 1992).
Este modelo também tem contribuído insignemente para o entendimento dos
distúrbios motores associados a anormalidades dos núcleos basais, tais como, Mal
6
de Parkinson, Doença de Huntington, Síndrome de Tourette, entre outras. Esta
asserção provém do fato de que os núcleos da base estão relacionados não apenas
ao controle de movimentos voluntários, mas também a processos de aprendizagem,
o que pode ser verificado tanto pelas alterações motoras quanto pelas cognitivas
observadas nessas patologias (MARTIN, 1998).
2.2- O processo de sensibilização comportamental
A administração repetida de psicoestimulantes resulta num fenômeno
denominado tolerância reversa ou sensibilização comportamental, a qual é
caracterizada por um aumento progressivo da atividade locomotora induzido pela
droga, além de uma hipersensibilidade comportamental duradoura, mesmo cessada
a administração da substância (ROBINSON e BECKER, 1986; CADOR et al., 1995).
Para O’Brien (1996), a sensibilização consiste no aumento da reposta com a
repetição da mesma dose da droga. Por exemplo, a injeção diária de uma dose de
cocaína, capaz de elevar a atividade locomotora, gera um acréscimo significativo do
efeito motor após vários dias, mesmo se a dose permanecer constante. Com a
sensibilização, há um desvio da curva dose-resposta para a esquerda de modo que,
para uma determinada dose, há um efeito maior do que o observado após a dose
inicial. A denominação tolerância reversa se justifica, tendo em vista que, ao
contrário desta, na tolerância, doses maiores que as iniciais são necessárias para se
obterem os mesmos efeitos, tendo-se então um desvio para a direita da curva doseresposta (O’BRIEN, 1996).
A importância do processo de sensibilização comportamental reside em sua
associação com o desenvolvimento de diversas patologias comportamentais, como a
esquizofrenia (KOKKINIDIS e ANISMAN, 1980; ROBINSON e BECKER, 1986),
estresse pós-traumático e doença do pânico (ANTELMAN, 1988). Em humanos, este
fenômeno pode culminar em episódios psicóticos paranóicos e, em indivíduos com
história prévia de abuso de drogas, os episódios psicóticos tendem a rescindir ,
quando da reexposição à droga ou a condições estressantes, passados meses ou
até anos de abstinência à droga (CADOR et al., 1995).
Para Segal e Kuczenski (1991), as adaptações neuroplásticas relacionadas
ao processo de sensibilização comportamental acarretariam o desenvolvimento do
7
comportamento compulsivo de ingestão, desejo e recaída por drogas. Robinson e
Berridge (1993) propõem uma teoria na qual a sensibilização representaria um
incentivo para o uso abusivo de drogas. Esta teoria aponta que o desejo de buscar a
droga seria um estado de incentivo resultante da liberação de dopamina por
neurônios dopaminérgicos, sensibilizados pela exposição repetida a drogas
psicoestimulantes, principalmente, em áreas mesocorticolímbicas. Em outras
palavras, indivíduos com seus sistemas dopaminérgicos sensibilizados seriam mais
vulneráveis ao abuso e à dependência de drogas.
Algumas hipóteses têm sido propostas na tentativa de explicar o
desenvolvimento
da
sensibilização
comportamental
induzida
por
agonistas
dopaminérgicos, entre as quais, incluem-se a do condicionamento, tolerância dos
auto-receptores e aumento da liberação de dopamina induzida por agonistas
(ROBINSON e BECKER, 1986). Uma possível explicação para a participação do
condicionamento na expressão da sensibilização comportamental seria que o
aumento progressivo na atividade locomotora induzida por psicoestimulantes está
relacionado ao desenvolvimento de uma resposta locomotora condicionada a um
estímulo ambiental associado com a exposição à droga. Na hipótese da tolerância
dos auto-receptores, propõe-se que estes tornam-se subsensitivos com a exposição
repetida a agonistas dopaminérgicos não-seletivos, havendo um decréscimo em seu
efeito inibitório sobre a síntese e liberação de dopamina, com conseqüente elevação
da atividade locomotora (ROBINSON e BECKER, 1986).
Por outro lado, num de seus experimentos, Mattingly e colaboradores (1991)
observaram que o antagonista dopaminérgico D2, sulpiride em concentração
suficiente para bloquear ambos os receptores D2 pré e pós-sinápticos, não impediu
o desenvolvimento da sensibilização produzida pela apomorfina. Além disso, estes
autores constataram que a administração de SCH 23390, antagonista dos
receptores dopaminérgicos D1, obstaculizou o desenvolvimento do processo de
sensibilização à apomorfina. E embora se acredite, que realmente haja uma certa
perda de sensibilidade pelos auto-receptores diante de tratamentos repetidos com
drogas agonistas, este fato sozinho não é suficiente para explicar a ocorrência do
fenômeno de sensibilização comportamental.
Os resultados obtidos por Mattingly e colaboradores (1991) também revelam
que, mesmo diante do bloqueio da resposta condicionada, há manifestação da
sensibilização comportamental produzida pela apomorfina. Apesar de apenas este
8
achado não excluir o envolvimento do condicionamento na expressão de efeitos
sensibilizantes, ele é consistente com outros trabalhos que sugerem que esses
efeitos desenvolvem-se por meio de processos associativos e não-associativos
(GOLD et al., 1988; MATTINGLY e GOTSICK, 1989).
Finalmente, acredita-se que a sensibilização comportamental resulte de um
aumento na liberação de dopamina (ROBINSON e BECKER, 1986). Por exemplo, a
sensibilização comportamental à cocaína relaciona-se a um aumento nos níveis
extracelulares de dopamina no núcleo acumbens (KALIVAS e DUFFY, 1991). Esta
teoria inclui somente os efeitos pré-sinápticos e, portanto, a atuação de agonistas
dopaminérgicos indiretos, como a anfetamina e cocaína que exercem seus efeitos
basicamente por meio da liberação e/ou bloqueio da recaptação de dopamina,
desconsiderando então o papel dos agonistas dopaminérgicos diretos, como a
apomorfina, no processo de sensibilização (MATTINGLY et al., 1991).
Não
obstante,
existem
evidências
mais
recentes
que
propõem
o
envolvimento das alterações pós-sinápticas, estimuladas pela atuação de agonistas
nos receptores dopaminérgicos, na expressão do processo de sensibilização a
psicoestimulantes. Dentre tais alterações, incluem-se o aumento da atividade da
proteína G, a ativação da adenilato ciclase com subseqüente aumento na produção
de AMP cíclico e a estimulação da proteínaquinase A. Esta descoberta indica que
tanto as alterações pré quanto as pós-sinápticas, principalmente no sistema
dopaminérgico
mesoacumbens,
devem
contribuir
para
a
sensibilização
comportamental por drogas psicoestimulantes (PIERCE e KALIVAS, 1995).
2.3- O sistema dopaminérgico
Até 1959, a dopamina não era considerada um neurotransmissor do sistema
nervoso central, mas simplesmente um precursor da noradrenalina. Atualmente, são
reconhecidas no cérebro quatro importantes vias dopaminérgicas (HOLLISTER,
1998). Uma via é a nigroestriatal que se projeta da substância negra mesencefálica
para os núcleos caudado e putâmen (corpo estriado) no telencéfalo. Outra via é a
mesolímbica que se projeta da área tegmentar ventral mesencefálica para parte da
amígdala e hipocampo, núcleo acumbens, septo lateral, córtex entorrinal, cingulado
anterior e medial frontal. A terceira via é a mesocortical que vai da área tegmentar
9
ventral para o neocórtex inervando densamente o córtex pré-frontal. A quarta e
última via é a túbero-infundibular que vai do núcleo arqueado do hipotálamo para a
eminência mediana e neuro-hipófise (BRANDÃO, 1993; HOLLISTER, 1998).
Este neurotransmissor atua em sítios específicos denominados receptores
dopaminérgicos. Até o momento foram identificados cinco tipos de receptores
dopaminérgicos, dispostos em duas famílias distintas. Os receptores D1 e D5 são
classificados como D1-like, enquanto os subtipos D2, D3 e D4 como, D2-like
(MISSALE et al., 1998).
Os receptores D1 são os mais amplamente distribuídos, além de serem
expressos em níveis mais altos que qualquer outro receptor dopaminérgico
(MISSALE et al., 1998). Estes receptores têm sido detectados no estriado, núcleo
acumbens, tubérculo olfatório, substância negra, córtex frontal, hipotálamo e tálamo
(MISSALE et al., 1998; STRANGE, 2001). Os receptores D1 são codificados por um
gene no cromossoma cinco e atuam através da ativação da enzima adenilato ciclase
,gerando aumento na síntese do mensageiro secundário intracelular AMP cíclico. Os
receptores D5, que são codificados por um gene no cromossoma quatro, também
produzem acréscimos na concentração de AMP cíclico e localizam-se principalmente
no hipocampo e hipotálamo (HOLLISTER, 1998).
Os receptores D2 são encontrados no estriado, núcleo acumbens,
substância negra, amígdala, córtex, globo pálido e tubérculo olfatório (MISSALE et
al., 1998; STRANGE, 2001). Estes receptores, que são codificados no cromossoma
onze, reduzem a concentração de AMP cíclico através da inibição da adenilato
ciclase e bloqueiam os canais de cálcio, mas abrem os canais de potássio
(HOLLISTER, 1998). Os receptores D3 também são codificados no cromossoma
onze, estes diminuem o AMP cíclico e localizam-se no núcleo acumbens, córtex
cerebral e tubérculo olfatório (HOLLISTER, 1998). Os receptores D4, os mais
recentemente descobertos, são encontrados no hipocampo, hipotálamo, medula e
córtex frontal (MISSALE et al., 1998; STRANGE, 2001).
10
2.3.1- Relação do sistema dopaminérgico com o processo de condicionamento
A administração de estimulantes psicomotores acarreta um acréscimo na
liberação de dopamina, ao passo que sua suspensão gera uma redução na
transmissão dopaminérgica (MISSALE et al., 1998). A literatura científica estabelece
que uma atividade dopaminérgica elevada, advinda do emprego de agonistas
dopaminérgicos, de modo geral, implica uma hiperatividade locomotora, do mesmo
modo que um decréscimo na neurotransmissão dopaminérgica redunda em
hipomotilidade (BENINGER et al., 1989).
Segundo Schiff (1982), a hiperatividade locomotora condicionada a
psicoestimulantes como anfetamina e apomorfina resulta principalmente de
acréscimos nas atividades dopaminérgicas mesolímbica e nigroestriatal. Em seu
experimento,
Schiff
(1982) constatou aumento na concentração de ácido
homovanílico – HVA (metabólito da dopamina) em estruturas como núcleo
acumbens e estriado dorsal sugerindo, então, sua participação no processo de
condicionamento. Carrera e colaboradores (1998) apontam que administrações intraestriatais de apomorfina resultam numa resposta condicionada, desde que o
pareamento dessas administrações com um ambiente específico produziu uma
atividade
locomotora
condicionada.
Portanto,
os
agonistas
dopaminérgicos
funcionam como um estímulo incondicionado para aquisição de uma resposta
locomotora condicionada (SCHIFF, 1982). Por outro lado, o pré-tratamento com
antagonistas dopaminérgicos, como SCH 23390 e o sulpiride, bloqueia a atividade
locomotora
produzida
por
agonistas
dopaminérgicos
como
a
apomorfina
(MATTINGLY, 1991). Hinson e Siegel (1983) verificaram que o antagonista
dopaminérgico, pimozide, bloqueia a resposta locomotora condicionada induzida por
administrações de morfina na área tegmentar ventral.
Lesões dos terminais mesoacumbens com a neurotoxina 6-OH-DOPA, póscondicionamento, bloqueia a hiperatividade condicionada evocada por um ambiente
emparelhado com a anfetamina (FRANKLIN e DRUHAN, 2000). De acordo com
Pert e colaboradores (1990), lesões com 6-OH-DOPA no núcleo acumbens obstam
a atividade locomotora condicionada à cocaína. O núcleo acumbens tem sido
considerado um elemento crucial do circuito neural que regula a expressão de
respostas condicionadas pavlovianas a estímulos relacionados a psicoestimulantes
(FRANKLIN e DRUHAN, 2000).
11
2.3.2- O sistema dopaminérgico e a sensibilização comportamental
A
administração
repetida
de
agonistas
dopaminérgicos
resulta
no
desenvolvimento do processo de sensibilização comportamental (MATTINGLY et al.,
1991). A sensibilização cruzada entre diferentes tratamentos, que compartilham a
capacidade de elevar a neurotransmissão dopaminérgica, reforça a hipótese de que
este neurotransmissor é crucial para a expressão da sensibilização comportamental
a psicoestimulantes (PIERCE e KALIVAS, 1995).
A sensibilização parece ser mediada pelos sistemas dopaminérgicos
mesolímbico (ROBINSON e BECKER, 1986; MATTINGLY et al., 1991; PIERCE e
KALIVAS, 1995) e nigroestriatal (ROBINSON e BECKER, 1986; MATTINGLY et al.,
1991). Todavia, Carrera e colaboradores (1998) constataram que administrações de
apomorfina no estriado dorsal, constituinte da via nigroestriatal, não resultam em
sensibilização comportamental.
De acordo com Cador e colaboradores (1995), a ação de drogas
psicomotoras no nível do núcleo acumbens responde pela expressão da
sensibilização, enquanto a ação dessas drogas no nível dos corpos celulares
dopaminérgicos na área tegmentar ventral induz mudanças responsáveis pela
iniciação deste fenômeno. Desse modo, psicoestimulantes no nível da área
tegmentar ventral são necessários e suficientes para indução da sensibilização que
pode ser mais tarde revelada por uma atuação desses estimulantes no núcleo
acumbens. O processo de sensibilização encontra-se associado à alta capacidade
de drogas psicoestimulantes de elevar a concentração de dopamina extracelular no
estriado ventral (PIERCE e KALIVAS, 1995).
2.3.3- Apomorfina
A apomorfina é um alcalóide cristalino pertencente à classe dibenzoquinolona.
Este composto é formulado como um sal hidrocloreto de peso molecular igual a
312,79 , tendo como descrição química 6 αβ-aporfina-10,11 diol hidrocloreto
hemihidrato. Trata-se de uma droga bastante hidrossolúvel e susceptível à oxidação
pelo ar e luz. A apomorfina pode ser obtida a partir do aquecimento da morfina num
12
ambiente ácido e, apesar de derivado da morfina, não detém propriedades
narcóticas (LE WITT, 2004).
As ações farmacológicas primárias da apomorfina resultam de sua estrutura
amina terciária e policíclica que apresenta homologia com a molécula de dopamina.
Portanto, a apomorfina exerce potente atividade dopaminérgica nos receptores
dopaminérgicos. “In vitro”, a apomorfina exibe alta afinidade pelos receptores D4,
moderada afinidade pelos recptores D2, D3 e D5 e baixa afinidade pelos receptores
D1 (NEWMAN e CUSSAC, 2002). Segundo Creese e colaboradores (1983) a
apomorfina atua como agonista total nos receptores D2 e como agonista parcial nos
receptores D1. Além disso, os receptores D2 pré-sinápticos são seis a dez vezes
mais sensíveis à apomorfina que os receptores D2 pós-sinápticos. De acordo com
Newman e Cussac (2002), a apomorfina também apresenta afinidade moderada
pelos receptores adrenérgicos 1D, 2B e 2C e pelo receptores serotonérgicos 5HT1A,
5HT2A, 5HT2B e 5HT2C.
O alto metabolismo hepático de primeira passagem da apomorfina impede
sua eficácia quando administrada por via oral. A administração oral de apomorfina
tem sido associada ao desenvolvimento de nefrotoxicidade, provavelmente, devido
às altas doses requeridas em virtude do elevado metabolismo de primeira
passagem. Por outro lado, a rota de administração parenteral mais utilizada é a via
subcutânea, tendo-se o início do efeito da apomorfina em, sete a dez minutos e sua
duração por mais de noventa minutos em pacientes parkisonianos (LE WITT, 2004).
Esta droga tem papel relevante no tratamento da Doença de Parkinson, quando não
controlada com levodopa ou outros medicamentos anti-parkisonianos.
A apomorfina é um fármaco com elevada porcentagem de ligação às
proteínas plasmáticas, após sofrer distribuição. Seu metabolismo ocorre através de
várias
vias
enzimáticas,
incluindo
oxidação,
N-desmetilação,
sulfatação,
glicuronidação e metabolismo pela COMT (catecol-o-metil transferase), assim como,
por oxidação não-enzimática. A complexidade dos processos de absorção,
distribuição e eliminação da apomorfina deve contribuir para a variabilidade de seus
efeitos clínicos (LE WITT, 2004).
13
2.4- Hormônios glicocorticóides
Durante o ciclo circadiano, os hormônios corticóides são secretados pela
glândula adrenal em duas faixas distintas. Tendo-se, então, durante a fase clara,
período de repouso em roedores, a faixa baixa correspondente a concentrações
plasmáticas de corticosterona que giram em torno de 1 J PO H D IDL[D DOWD
estendendo-VH GH D JPO QR SHUíodo ativo, fase escura em roedores (MC
EWEN et al., 1986).
Os glicocorticóides endógenos são sintetizados pelas zonas fasciculada e
reticulada do córtex adrenal. A síntese e liberação destes hormônios dependem da
adrenocorticotropina (ACTH), sendo este um hormônio peptídio produzido pela
adeno-hipófise, cuja liberação é controlada pelo CRH (Hormônio Liberador de
Corticotropina). O CRH é sintetizado na parte anterior dos núcleos paraventriculares
hipotalâmicos e secretado no plexo capilar do hipotálamo, sendo, em seguida,
transportado até a adeno-hipófise, onde induz a secreção do ACTH. O ACTH ativa,
então, a adenilato ciclase na membrana das células adrenocorticais com
conseqüente formação de AMP (Adenosina Monofosfato) cíclico. O AMP cíclico
catalisa a transferência de energia do ATP (Adenosina Trifosfato) para a fosforilação
da proteinaquinase A que, secundariamente, fosforila outras proteínas que
produzem os glicocorticóides (FELDMAN, 1997). Tensões físicas, emocionais e
químicas, como a dor, traumatismo, cirurgia, infecção, hipóxia, hipoglicemia aguda,
exposição ao frio, pirógenos (FELDMAN, 1997), restrição alimentar e hídrica,
restrição espacial, isolamento social, exposição a um ambiente novo (MARINELLI et
al., 1996), entre outros; estimulam a secreção do CRH, e subseqüente liberação de
ACTH e corticóides (FELDMAN, 1997). Todo esse processo é regulado por um
sistema de retroalimentação negativo, no qual os níveis circulantes de corticosterona
atuam diretamente sobre o hipotálamo e a adeno-hipófise para a regulação dos
níveis plasmáticos de corticosterona. A secreção de CRF e ACTH é estimulada por
baixos níveis de corticosterona, sendo inibida por níveis elevados deste hormônio
(FELDMAN, 1997).
Por outro lado, estímulos recompensadores naturais como água, comida,
companhia sexual receptiva (PIAZZA e LE MOAL, 1997) e farmacológicos, tais
como, psicoestimulantes (FULLER e SNODY, 1981), nicotina (CAGGUILA et al.,
1991) e etanol (TRUDEAU et al., 1990) aumentam a secreção adrenal de
14
corticosterona
(PIAZZA
e
LE
MOAL,
1997).
A
auto-administração
de
psicoestimulantes, por exemplo, eleva notavelmente a secreção de glicocorticóides
(GOEDERS, 1997; GALICI et al., 2000). Entremente, o papel dos glicocorticóides na
recompensa não estaria em contrapartida ao papel fisiológico clássico desses
hormônios? Como explicar que os mesmos estímulos ditos estressores e, por vezes,
aversivos, incitem não só a ativação de respostas contrárias a eles como também os
substratos da recompensa, pelos glicocorticóides?
Em primeiro lugar, do mesmo modo que, perifericamente, tais hormônios
contraponham-se às ameaças externas pelo controle das respostas primárias do
organismo, ao ativarem o sistema cerebral de recompensa, os glicocorticóides
estariam contrapondo-se às respostas psicológicas e comportamentais às ameaças
externas, diminuindo os efeitos aversivos desta condição. Em segundo lugar,
praticamente, todos os modelos experimentais de estresse aumentam a liberação de
dopamina, substrato neurobiológico da recompensa, em regiões mesolimbocorticais
(PIAZZA e LE MOAL, 1997).
Em suma, os glicocorticóides responderiam às agressões externas não se
contrapondo diretamente às mesmas, mas controlando as respostas primárias às
ameaças externas. Por exemplo, os efeitos antiinflamatórios e imunossupressores
desses hormônios controlam a ativação das respostas imune e inflamatória
induzidas por uma ameaça (MUNCH et al., 1984). Por outro lado, os efeitos
relacionados à recompensa dos glicocorticóides abrangem a regulação das
respostas psicológicas e comportamentais frente às agressões externas. Entre
essas respostas, incluem-se a aversão e a esquiva de situações ameaçadoras. No
entanto, se, em resposta a estímulos aversivos e ameaçadores, a única reação
exibida fosse a esquiva, o potencial adaptativo dos indivíduos seria extremamente
pobre. Na verdade, indivíduos de diferentes espécies são capazes de desenvolver
estratégias complexas de aprendizagem e adaptação diante de estímulos aversivos
e que são consideradas modelos de estresse (PIAZZA e LE MOAL, 1997).
Portanto, as reações biológicas eliciadas por situações ameaçadoras têm a
função de reduzir a aversão e a esquiva induzidas pela ameaça. Tem sido proposto
que o mecanismo pelo qual a esquiva é controlada consiste na ativação paralela dos
substratos biológicos da recompensa, ou seja, ativação dos sistemas biológicos que
conduzem o comportamento em direção oposta. Esta observação indica que a
ativação dos substratos biológicos da recompensa durante uma situação
15
ameaçadora reduziria os efeitos aversivos desta condição (PIAZZA e LE MOAL,
1997).
Em contraste, a supressão dos glicocorticóides aumenta o impacto de
eventos aversivos, reduzindo a adaptação dos indivíduos aos mesmos. Tal asserção
é corroborada por alguns testes experimentais baseados na exposição a estímulos
aversivos. No teste de Porsolt, os ratos são colocados num cilindro com água onde
seu comportamento é registrado. Os ratos-controle, após um período inicial de várias
tentativas de escape, exibem um período de imobilidade que, progressivamente,
aumenta após repetidos testes. Os ratos com supressão de glicocorticóides
mostram, durante quase todo o teste, tentativas de escape e pouca imobilidade
(PIAZZA e LE MOAL, 1997). Nos teste de esquiva ativa (o animal aprende a evitar o
choque, escapando de um compartimento) e passiva (o animal não entra no
compartimento do choque), os ratos com supressão de corticosterona mostram
aumento de suas respostas de esquiva em relação ao estímulo aversivo (PIAZZA e
LE MOAL, 1997). No teste de Morris, no qual o animal deve aprender como usar
dicas espaciais para encontrar uma plataforma escondida que o permite escapar da
piscina, a adrenalectomia prejudica a aquisição da tarefa (OITZL e DE KLOET,
1992). Esses efeitos são consistentes com o papel dos glicocorticóides de se
contraporem à aversão mediada por situações ameaçadoras, o que permite uma
melhor adaptação dos indivíduos a agressões externas.
2.4.1- Receptores corticosteróides
Os glicocorticóides circulantes atravessam prontamente a barreira hematoencefálica e adentram o cérebro onde se ligam a receptores intracelulares tipo I
(mineralocorticóides – MRs) ou tipo II (glicocorticóides – GRs) (MC EWEN et
al.,1986; LE DOUX, 1993). Ao penetrarem nas células, os esteróides glicocorticóides
ligam-se ao complexo receptor-proteína de choque térmico (HSP 90) no citoplasma,
induzindo uma mudança alostérica no receptor e dissociação da proteína HSP 90.
Então, o dímero receptor-hormônio dirige-se ao núcleo no qual interage com
seqüências específicas de DNA sobre vários genes, também denominadas
elementos responsivos aos glicocorticóides (GREs), ponto no qual a transcrição
gênica é ativada ou inibida (SCHIMMER e PARKER, 1996; GOLDFIEN, 1998).
16
Em consequência do tempo necessário para as alterações na expressão
genética e na síntese protéica, a maior parte dos efeitos dos corticosteróides não é
imediata, mas torna-se aparente depois de várias horas. Em contraste com as ações
genômicas lentas dos glicocorticóides, constataram-se ações esteróides imediatas
ocorrendo dentro de minutos após a exposição a estes hormônios (SCHIMMER e
PARKER, 1996). Tem sido postulado que os corticosteróides modificariam a
atividade neural rapidamente modulando canais iônicos e sistemas de segundos
mensageiros por meio de interações com proteínas receptoras associadas à
membrana (REICHARDT e SCHUTZ, 1998). Sze e Yu (1995) sustentam que os
efeitos rápidos da corticosterona sobre a atividade neuronal são oriundos de sua
ação estimulante sobre o influxo de cálcio através da membrana.
Os receptores MRs e GRs diferem quanto à afinidade pela corticosterona.
Os MRs possuem alta afinidade pela corticosterona e aldosterona, estando quase
saturados em condições basais, enquanto os GRs têm afinidade dez vezes mais
baixa que os MRs pela corticosterona, tornando-se ocupados no pico circadiano
diário e após o estresse, quando os níveis de glicocorticóides são elevados (REUL e
DE KLOET, 1985; BRADBURY et al., 1994; TSUTSUMI et al., 2002).
Inquisitivo à distribuição neuroanatômica, pode-se dizer que os receptores
MRs e GRs encontram-se co-localizados no hipocampo, septo e amígdala (VAN
EKELEN, 1987; LE DOUX, 1993). Porém, os receptores glicocorticóides (GRs), mais
heterogeneamente distribuídos, estão situados em maior densidade no núcleo
paraventricular do hipotálamo, hipocampo e hipófise, cujas estruturas estão
envolvidas na regulação por retroalimentação da resposta hormonal do estresse
(REUL e DE KLOET,1985; RATKA et al., 1989). Já o sistema límbico, implicado nos
processos de aprendizagem e memória, contém os dois receptores. Incluem-se no
sistema límbico: hipocampo, giro parahipocampal, córtex entorrinal e insular,
amígdala, núcleo septal, hipotálamo e tálamo, núcleo acumbens, córtex cingulado e
bulbo olfatório (LUPIEN e MC EWEN, 1997). Aproximadamente, 90 % da população
neuronal no núcleo acumbens contêm ambos os tipos de receptores MRs e GRs,
sendo razoável afirmar que a maioria destes neurônios co-expressam receptores
dopaminérgicos e corticosteróides (CZYRAK et al., 1996).
Os receptores GRs estão envolvidos nos processos de aquisição e
consolidação da memória. A administração de um
antagonista dos receptores
glicocorticóides (RU 38486) redunda no detrimento da performance do animal ,
17
quando este ainda está adquirindo e consolidando uma tarefa. Uma vez consolidada
a tarefa, a administração deste antagonista não exerce mais qualquer efeito sobre a
performance do indivíduo. Já os receptores MRs estão implicados no processo de
formação da memória por meio da integração sensorial. Nesta fase, o animal deve
interpretar o ambiente e selecionar a informação relevante (SANDI e ROSE, 1994).
O bloqueio ou deficiência de receptores tipo I (MRs) causaria déficit em
funções básicas de atenção seletiva e integração sensorial, o que torna mais difícil
para um indivíduo discriminar os estímulos relevantes daqueles irrelevantes. Isto
afetaria o processo de aquisição da memória sem interferir em certos aspectos da
mesma, como a consolidação e evocação. Nessas condições, um indivíduo
manifestaria déficits globais na aprendizagem e memória (LUPIEN e MC EWEN,
1997). Em contraste, a deficiência ou bloqueio de receptores tipo II (GRs) afetaria os
processos de consolidação e evocação da memória. Ou seja, tal distúrbio
possibilitaria a um indivíduo aprender novas informações e reter experiências
passadas por um tempo limitado, estando, todavia, bastante susceptível ao
esquecimento, quando da interferência por outras informações ou fatores, tais como,
tratamento cirúrgico ou farmacológico, estresse, evento concomitante ao tempo de
aprendizagem, entre outros. Portanto, o esquecimento ocorre porque a memória
estaria obliterada ou mascarada por tais eventos (LUPIEN e MC EWEN, 1997).
2.4.2- Metirapona
A metirapona pertence a um grupo de agentes farmacológicos designados
inibidores da biossíntese de esteróides adrenocorticais, entre os quais, incluem-se:
mitotano, trilostano, cetoconazol e aminoglutetimida (SCHIMMER e PARKER, 1996).
Cada uma dessas drogas atua sobre diferentes esteróide-hidroxilases, o que confere
um certo grau de especificidade para suas ações.
A metirapona reduz a síntese de corticóides, inibindo a enzima P-450-esteróide-hidroxilase, que converte a 11-desoxicorticosterona e o 11-desoxicortisol
em corticosterona e cortisol, respectivamente (SCHIMMER e PARKER, 1996;
GOLDFIEN, 1998). Esta droga é um inibidor da síntese estimulada de corticosterona
sem afetar, entretanto, seus níveis basais. Por exemplo, a metirapona nas doses de
12,5 e 25 mg/kg obsta o aumento na concentração de corticosterona em resposta ao
18
estresse, mas não, os níveis basais de corticosterona de ratos não-estressados (LIU
et al., 1999).
Segundo Goeders e Guerin (1996), a metirapona atenua as propriedades
estimulatórias locomotoras e recompensadoras dos psicoestimulantes. Estes
pesquisadores observaram que o pré-tratamento com metirapona reduz o
comportamento de auto-administração de cocaína sugerindo que a redução nos
níveis
circulantes de corticosterona diminui os efeitos reforçadores deste
psicoestimulante
(GOEDERS
e
GUERIN,
1996).
O
aumento
nos
efeitos
psicomotores da cocaína produzido por um estresse crônico é revertido pela redução
aguda da secreção de corticosterona (MARINELLI et al., 1996). A administração
aguda de metirapona reduz a ativação psicomotora induzida pela cocaína em
animais sujeitos à restrição alimentar (MARINELLI et al., 1996). Segundo Deroche e
colaboradores (1992), o tratamento crônico com metirapona ou adrenalectomia
bloqueia a capacidade de vários estressores em induzir altos níveis plasmáticos de
corticosterona e subseqüente desenvolvimento da sensibilização aos efeitos
estimulantes locomotores da anfetamina e cocaína.
Por outro lado, o tratamento com metirapona parece potencializar a
expressão da sensibilização motora induzida pelo estresse. Reid e colaboradores
(1998) verificaram que o efeito da anfetamina sobre a liberação de dopamina
aumentou em
animais estressados tratados
com
metirapona (50 mg/kg).
Curiosamente, estes pesquisadores também constataram tal efeito quando
administraram a metirapona em animais controle. Sugeriram, então, que a
metirapona
portaria
propriedades
sensibilizadoras
locomotoras
intrínsecas,
propriedade esta responsável por seu efeito potencializador sobre a ação
psicomotora da anfetamina. Entretanto, Bratt e colaboradores (2001) observaram
que, apesar da metirapona (25 mg/kg) elevar os efeitos comportamentais da
anfetamina,
este
composto
sozinho
não
produziu
estimulação
locomotora
significativa. Este achado indica pelo menos dois fatos. Primeiro, a metirapona não
possuiria uma ação sensibilizadora intrínseca. Segundo, essa ação seria dosedependente e, por isso, apenas a dose de 50 mg/kg produziu aumento da atividade
locomotora nos animais que receberam metirapona mais anfetamina, do mesmo
modo que naqueles que receberam somente administrações de metirapona. Um
segundo mecanismo potencial proposto, na tentativa de explanar como a metirapona
aumentaria os efeitos da anfetamina, seria uma interação farmacocinética entre
19
estas drogas, ao competirem pela enzima hepática citocromo P-450 2DI requerida
ao metabolismo de ambas (SILL et al., 1999). Ou seja, a metirapona se ligaria à
enzima citocromo P-450 2DI, inibindo o metabolismo da anfetamina, a qual teria sua
ação sobre a neurotransmissão dopaminérgica prolongada. De acordo com Bratt e
colaboradores (2001), o tratamento combinado conduziria a níveis mais altos de
dopamina, produzindo estimulação locomotora similar àquela obtida com níveis mais
altos de anfetamina.
2.5- Interação entre a corticosterona e o sistema dopaminérgico
A corticosterona potencializa os efeitos psicomotores (DEROCHE et al.,
1992; PATACHIOLI et al., 1998) e reforçadores (PIAZZA et al., 1994) das drogas de
abuso. A administração de anfetamina (SWERDLON et al., 1993) e cocaína (PIAZZA
et al., 1994) aumenta a secreção de corticosterona conforme a dose administrada,
em paralelo com aumentos na locomoção induzidos por drogas. A supressão dos
glicocorticóides pela adrenalectomia reduz os efeitos psicomotores da cocaína
(MARINELLI et al., 1997) e anfetamina (CADOR et al., 1993).
Conforme Piazza e Le Moal (1997), a corticosterona facilita a aquisição do
comportamento de auto-administração de anfetamina. Igualmente exerce efeito
sobre o processo de retomada do uso abusivo de drogas. Por exemplo, ratos
treinados a auto-administrarem cocaína e, após, submetidos a um período de
remoção da droga, ao receberem a administração de corticosterona, exibem um
recaída ao uso da cocaína (DEROCHE et al., 1992). Além disso, o tratamento com a
metirapona durante oito dias, após a extinção da auto-administração de cocaína,
reduz o restabelecimento do consumo de cocaína quando os animais têm a
oportunidade de voltar a consumi-la (PIAZZA et al., 1994).
Desde que altos níveis de glicocorticóides aumentem a liberação de
dopamina, preferencialmente em projeções estriatais ventrais de neurônios
dopaminérgicos mesencefálicos (PIAZZA et al., 1994), justificam-se, portanto, seus
efeitos sobre as atividades locomotora e de recompensa.
Todavia, esse efeito sobre a liberação de dopamina é estado-dependente
(PIAZZA e LE MOAL, 1997). Doses de corticosterona equivalentes àquelas da faixa
fisiológica alta geram um acréscimo de 20% na concentração basal de dopamina, se
20
administrada no período de atividade em roedores, sem qualquer efeito, quando
administradas no período claro. Adicionalmente, a administração deste hormônio em
associação com estímulos recompensadores promove um acréscimo de 80% na
concentração basal de dopamina (PIAZZA et al., 1994). Em contrapartida, a
adrenalectomia reduz em cerca de 50% a liberação basal de dopamina no núcleo
acumbens,
como
também
a
resposta
dopaminérgica
a
estímulos,
como
psicoestimulantes e opióides. A atividade locomotora induzida por uma injeção de
morfina na área tegmentar ventral e/ou cocaína no núcleo acumbens, a qual
depende da dopamina mesolímbica, sofre redução após adrenalectomia, que não
modifica, porém, o aumento na liberação e resposta da dopamina induzidas por
injeção de morfina no estriado dorsal (MARINELLI et al., 1994). De outro modo, o
aumento na locomoção induzido pela corticosterona é bloqueado por 6-OH-DOPA,
em terminais mesoacumbens (PIAZZA et al., 1994).
Além da expressão de receptores para glicocorticóides em neurônios
dopaminérgicos, conforme apontam Harfstrand e colaboradores (1986), outros
mecanismos tentam deslindar os efeitos facilitatórios desses hormônios sobre a
liberação de dopamina. Primeiro, a corticosterona atuaria sobre uma enzima-chave
no processo de síntese de dopamina, a tirosina hidroxilase – TH (ORTIZ et al.,
1995). Estes autores constataram os efeitos estimulatórios dos glicocorticóides sobre
a tirosina hidroxilase na área tegmentar ventral. Segundo, a corticosterona
modificaria o catabolismo da dopamina ao inibir a atividade da monoaminaoxidase –
MAO (ROUGÉ-PONT et al., 1998). Fato consistente com as mudanças induzidas por
este hormônio nos metabólitos da dopamina. A injeção de dexametasona
(glicocorticóide sintético de ação longa), por exemplo, reduz a concentração de HVA,
metabólito resultante da atividade da MAO (LERET et al., 1998). Terceiro, os
glicocorticóides facilitariam a taxa de disparo de neurônios dopaminérgicos
mesolímbicos (OVERTON et al., 1996). Quarto, os glicocorticóides modulam a
atividade dopaminérgica, tendo em vista que a adrenalectomia diminui a densidade
de receptores dopaminérgicos D1 e D2 (BIRON et al., 1992), enquanto a
administração de corticosterona aumenta a atividade dopaminérgica, alterando a
resposta dos receptores dopaminérgicos a agonistas da dopamina (FAUNT e
CROCKER, 1988). Finalmente, Gilad e colaboradores (1987) assertam que a
corticosterona decresceria a recaptação de dopamina. Os gicocorticóides são
capazes de adentrar livremente o cérebro, no qual interagem com sistemas
21
neurotransmissores como a dopamina, serotonina e noradrenalina (MCEWEN et al.,
1986). Ao interagir com sistemas de recaptação como o DAT (transportador de
dopamina) – este, alvo primário de compostos dopaminérgicos indiretos tal como a
anfetamina e cocaína – os glicocorticóides bloqueariam a remoção sináptica de
dopamina, evento que geraria um aumento na concentração de dopamina na fenda
sináptica. Portanto, o DAT poderia constituir um substrato potencial através do qual
os esteróides agiriam sobre o sistema dopaminérgico (SARNYAI et al., 1998).
2.6- Relação entre a corticosterona e o processo de condicionamento
Uma das características fundamentais dos indivíduos é sua capacidade de
adquirir, reter e usar informações ou conhecimentos, ou seja, sua capacidade
mnemônica. A memória está intimamente relacionada à aprendizagem. Enquanto a
aprendizagem corresponde ao primeiro estágio da memória, a aquisição de novas
informações, a memória refere-se ao processo de retenção, a curto ou longo prazo,
de conhecimentos ou eventos, associado à capacidade de evocá-los, ou relembrálos (TOMAZ, 1993).
Desse modo, a formação de memórias inicia-se com a aquisição da
informação que chega aos sistemas neurais. Após a aquisição, a informação é
armazenada no sistema de memória a curto prazo e, para que perdure, deve ser
consolidada, isto é, transferida para o sistema de memória estável ou a longo prazo
(TOMAZ, 1993). Finalmente, pela evocação ou lembrança tem-se acesso à
informação armazenada para utilizá-la na cognição e emoção ou exteriorizá-la num
determinado comportamento (LENT, 2002). Em outras palavras, a aprendizagem
consiste num processo de aquisição de novas informações a serem retidas na
memória. Já o processo mnemônico consiste num armazenamento seletivo de
informações, enfim, uma série de processos neurobiológicos que permitem a
aprendizagem. O condicionamento clássico e a sensibilização comportamental
constituem formas de aprendizagem e, portanto, refletem operações de memória
que o sistema nervoso deve executar (LENT, 2002).
Neste trabalho, especula-se que a estreita relação entre os processos de
aprendizagem e memória associada à alta densidade de receptores corticosteróides
em sistemas neurais implicados em tais processos sugerem o possível envolvimento
22
da corticosterona no processo de condicionamento clássico. Por exemplo, a
interação de constituintes do sistema límbico, os quais regulam o processo de
memória e expressam alta densidade de ambos os tipos de receptores
corticosteróides (LUPIEN e MC EWEN, 1997), pode ser de particular relevância na
determinação dos efeitos da corticosterona sobre o processo de condicionamento
clássico. Vale ressaltar, porém, que, até o momento, não foi proposto um papel
consistente para os hormônios glicocorticóides no processo de condicionamento
clássico.
Outro fato a ser considerado é que os corticóides compartilham as principais
ações
neuroquímicas
e
comportamentais
com
os
psicoestimulantes.
Neuroquimicamente, ambos elevam as concentrações extracelulares de dopamina
em projeções estriatais ventrais de neurônios dopaminérgicos mesencefálicos
(PIAZZA
e
LE
MOAL,
1997).
Comportamentalmente,
assim
como
os
psicoestimulantes, a corticosterona tem efeitos motores e facilita a aprendizagem do
comportamento de auto-administração de drogas, ambas as respostas por meio da
ativação da transmissão dopaminérgica mesencefálica (PIAZZA e LE MOAL, 1997).
Finalmente, o tratamento repetido com glicocorticóides, similarmente ao observado
com os psicoestimulantes, induz o processo de sensibilização comportamental
(DEROCHE et al., 1992).
Desde que a aquisição da resposta locomotora condicionada pelos
psicoestimulantes dependa da ativação de sistemas dopaminérgicos, em particular,
das vias mesolímbica e nigro-estriatal (SCHIFF, 1982), não seria possível, então,
que
a
corticosterona,
ao
atuar
basicamente
no
nível
desses
sistemas
dopaminérgicos, participasse do desenvolvimento do condicionamento clássico?
2.7- Corticosterona e o processo de sensibilização
A administração repetida de psicoestimulantes ou exposição repetida ao
estresse resulta no desenvolvimento do processo de sensibilização (REID et al.,
1998). A sensibilização comportamental consiste na elevação progressiva dos
efeitos motores das drogas psicoestimulantes. O tratamento repetido com
estressores também redunda num processo de sensibilização. Aqui, os sujeitos
sensibilizados pelo estresse exibem uma insigne resposta locomotora aos
23
psicoestimulantes, um fenômeno referido como sensibilização cruzada (PRASAD et
al., 1998).
Condições estressantes acrescem não só a resposta locomotora aos
psicoestimulantes, como também a auto-administração destas drogas aumentando a
vulnerabilidade
dos indivíduos ao abuso de drogas (MARINELLI et al., 1996;
PRASAD et al., 1998; MARINELLI e PIAZZA, 2002). Postula-se que o acréscimo nos
efeitos dos psicoestimulantes produzido pelo estresse depende de um aumento nos
níveis
de
corticosterona
(MARINELLI
et
al.,
1996).
Ambos,
estresse
e
psicoestimulantes promovem a ativação do eixo HHA que culmina na elevação dos
níveis de corticosterona circulante (PRASAD et al., 1998).
Basicamente, três linhas de evidência indicam que a corticosterona
potencializa os efeitos psicomotores e reforçadores dos psicoestimulantes. Primeiro,
há uma correlação positiva entre a secreção de corticosterona e a sensibilidade aos
efeitos
reforçadores
dos
psicoestimulantes.
Segundo,
a
administração
de
corticosterona, anteriormente à auto-administração de anfetamina, aumenta as
propriedades reforçadores desta droga. Terceiro, a supressão crônica da secreção
de corticosterona pela adrenalectomia ou pela administração de metirapona diminui
os efeitos psicomotores e reforçadores dos psicoestimulantes (DEROCHE et al.,
1992; PIAZZA et al., 1994; MARINELLI et al., 1996).
Embora esteja estabelecido o papel crítico da corticosterona para o
desenvolvimento da sensibilização induzida pelo estresse, pouco se conhece acerca
do papel dos glicocorticóides na manutenção dessa sensibilização (REID et al.,
1998). Um estudo (PRASAD et al., 1998) investigatório sobre a sensibilização
induzida pela cocaína indicou que a adrenalectomia bloqueou a resposta locomotora
sensibilizada diante de uma subseqüente exposição à cocaína, mas apenas quando
tal exposição era realizada logo após a retirada da droga (um dia). Em contraste, a
adrenalectomia não afetou a sensibilização à cocaína quando a exposição foi feita
após um período de retirada de doze dias. Em suma, a sensibilização a longo prazo
à cocaína não seria afetada pela supressão da adrenal. Estes resultados entram em
desacordo com prévios registros que sugerem que a sensibilização cruzada,
induzida pelo estresse, aos efeitos da anfetamina, cocaína e morfina, depende dos
hormônios adrenais (DEROCHE et al., 1992). Segundo Piazza e Le Moal (1997), a
relevância psicopatológica da sensibilização induzida pelo estresse apóia-se
justamente no fato de tratar-se de um fenômeno a longo prazo. Estes autores
24
explanam que as respostas dopaminérgica e comportamental às drogas podem ser
visualizadas por bastante tempo após o término dos eventos estressantes.
25
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Sujeitos
Foram utilizados 83 ratos machos, albinos, Wistar, pesando entre 250-300 g,
provenientes do Biotério Central da UENF, Campos dos Goitacazes, RJ. Os animais
foram mantidos em gaiolas individuais de plástico, tendo livre acesso à água e à
ração padronizada de laboratório. As gaiolas ficavam em uma sala do setor de
Farmacologia do Laboratório de Sanidade Animal (LSA), com temperatura
controlada (22 ± 2.0 C) e com ciclo de luz claro e escuro de 12 em 12 horas (luz das
7 às 19 horas). O experimento foi conduzido na fase clara, no horário entre 13 e 19
horas, tendo em vista que o laboratório não se encontra adaptado para realização
dos experimentos durante a fase escura, período de atividade dos roedores. Os
animais foram manipulados individualmente por 5 minutos diários, durante 7 dias
antes do início do procedimento experimental.
3.2- Ambiente experimental
A sala experimental consistiu de iluminação vermelha, temperatura
controlada e som de um ventilador como ruído de fundo. Os testes para atividade
locomotora foram realizados em uma arena quadrada medindo 60x60x45 cm, com
paredes pintadas na cor preta. Objetivando gravar cada sessão-teste para
subseqüente análise da atividade horizontal, avaliada por meio do número de
26
cruzamentos, um sistema de filmagem, contendo uma câmera, foi montado a uma
altura de 60 cm acima da arena, acoplado a uma televisão e um vídeo cassete,
ambos localizados fora da sala.
3.3- Drogas
A apomorfina-Hcl (Sigma, ST. Louis, Mo, USA), – nas doses de 0,5 mg/kg
(volume de administração: 1 ml/kg) e 2 mg/kg (volume de administração: 1 ml/kg),
dissolvida numa solução 0,1% m/v de ácido ascórbico – foi administrada por via
subcutânea. A metirapona (2-Methyl-1,2-di-3-pyridyl-1-propanone) foi administrada
igualmente, por via subcutânea, numa dose de 50 mg/kg (volume de administração:
2 ml/kg) dissolvida em solução salina 0,9% m/v. As soluções de ácido ascórbico
0,1% m/v e salina 0,9% m/v também foram utilizadas como veículo.
3.4- Procedimento experimental
3.4.1- Período de habituação (1º- 3º dia)
Os ratos foram habituados à arena-teste por 30 minutos diários durante 3
dias consecutivos. O objetivo deste procedimento era eliminar quaisquer atitudes
comportamentais resultantes de uma conduta exploratória normal por parte dos
roedores, tendo em vista sua exposição a um ambiente inteiramente novo. Nesse
período, os ratos ainda foram habituados ao procedimento de injeção, administração
de veículo, antes e após a caixa experimental, com a finalidade de excluir qualquer
influência sobre a expressão da resposta locomotora durante a fase de
condicionamento. Nesse período, os animais foram randomicamente designados
para seus respectivos grupos experimentais.
27
3.4.2- Fase de condicionamento (4º- 8º dia)
Terminado o período de habituação, seguiu-se a fase de condicionamento na
qual ao longo de consecutivos 5 dias os animais receberam tratamentos
farmacológicos. Posteriormente, os ratos foram avaliados comportamentalmente
durante 30 minutos na arena-teste.
3.4.3- Período de retirada da droga 1 (9º- 10º dia)
Findada a fase de condicionamento, durante 2 dias, os ratos não sofreram
manipulação farmacológica nem comportamental, o escopo era eliminar a influência
dos tratamentos farmacológicos.
3.4.4- Teste de condicionamento (11° dia)
Neste teste, todos os animais do experimento 1 receberam o veículo da
apomorfina, ácido ascórbico; os do experimento 2, receberam o veículo da
metirapona, solução salina; e aqueles do experimento 3, receberam o veículo da
apomorfina, ácido ascórbico. E, posteriormente, foram colocados na arena-teste
para registro de sua atividade locomotora durante 30 minutos.
3.4.5- Período de retirada da droga 2 (12º- 13° dia)
Seguinte ao teste de condicionamento, os ratos foram novamente
submetidos a um período de remoção da droga ao longo de 2 dias.
3.4.6- Teste de sensibilização comportamental (14º dia)
Neste teste, os animais do experimento 1 receberam apomorfina, os do
experimento 2
receberam metirapona e aqueles do experimento 3 receberam
28
apomorfina sendo, posteriormente, colocados na arena-teste para registro de sua
atividade locomotora durante 30 minutos.
3.4.7- Quadro 1: Cronograma do procedimento experimental
Habituação
1º - 3º Dia
Fase de Condicionamento
4º - 8º Dia
Período de Retirada da Droga 1
9º - 10º Dia
Teste de Condicionamento
11º Dia
Período de Retirada da Droga 2
12º - 13º Dia
Teste de Sensibilização
14º Dia
3.5- Experimento 1: efeitos de administrações sistêmicas de apomorfina na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental
Este experimento teve como objetivo verificar se as administrações
sistêmicas de diferentes doses de apomorfina (0,5 e 2,0 mg/Kg) produziriam
aumento da atividade locomotora incondicionada e desenvolvimento dos processos
de sensibilização comportamental e de condicionamento induzido por drogas.
Para isso, utilizou-se o procedimento experimental descrito no item 3.4 com
os seguintes grupos experimentais:
ƒFase de condicionamento:
•
Grupo 1 (n=5): Apomorfina 0,5 mg/Kg-associada ao ambiente experimental
(APO0,5-ASS)
•
Grupo 2 (n=6): Apomorfina 2,0 mg/Kg-associada ao ambiente experimental
(APO2,0-ASS)
Os animais receberam administração de apomorfina e, após 20 minutos,
foram colocados na arena-teste para o registro da atividade locomotora durante 30
minutos. Após 30 minutos da retirada dos animais da arena-teste, já na caixa-viveiro,
29
os ratos receberam o veículo da apomorfina (solução de ácido ascórbico 0,1% m–v).
Assim, os animais desses grupos experimentaram os efeitos da droga na caixaviveiro.
APOMORFINA
(0,5 ou 2,0 mg/kg)
•
20’
30’
ARENA 30’
VEÍCULO
Grupo 3 (n=6): Apomorfina 0,5 mg/Kg-não associada ao ambiente experimental
(APO0,5-NASS)
•
Grupo 4 (n=6): Apomorfina 2,0 mg/Kg-não associada ao ambiente experimental
(APO2,0-NASS)
Os animais receberam administração de veículo e, após 20 minutos, foram
colocados na arena-teste para registro de sua atividade locomotora por 30 minutos.
Após 30 minutos da sua retirada do ambiente experimental, os animais receberam
administração de apomorfina e foram colocados na caixa-viveiro. Os animais desses
grupos receberam concentrações da droga equivalentes às recebidas pelos animais
dos grupos associados, porém os efeitos da droga não foram associados ao
ambiente experimental.
VEÍCULO
•
20’
ARENA 30’
30’
APOMORFINA
(0,5 ou 2,0 mg/kg)
Grupo 5 (n=6): Controle (APO-VEIC)
Os ratos do grupo-controle receberam veículo (solução de ácido ascórbico
0,1%) tanto na arena-teste como na caixa-viveiro.
VEÍCULO
20’
ARENA 30’
30’
VEÍCULO
30
ƒTeste de condicionamento:
Todos os animais dos 5 grupos experimentais receberam administração do
veículo da apomorfina, solução de ácido ascórbico 0,1% m-v e, após 20 minutos,
foram colocados na arena-teste por 30 minutos.
ƒTeste de Sensibilização:
Os animais dos grupos apomorfina-associada e apomorfina-não associada
receberam administração de apomorfina e, 20 minutos após, foram colocados na
arena-teste durante 30 minutos. Os animais do grupo controle receberam veículo, no
ambiente experimental, 20 minutos antes do registro de sua atividade locomotora.
3.6- Experimento 2: efeitos de administrações sistêmicas de metirapona na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental
Este experimento teve como objetivo verificar se as administrações
sistêmicas de metirapona (50,0 mg/Kg) produziriam desenvolvimento do processo de
sensibilização e condicionamento induzido por drogas. Para isso, utilizou-se o
procedimento experimental, descrito no item 3.4, com os seguintes grupos
experimentais:
ƒFase de condicionamento:
•
Grupo 1 (n=8): Metirapona- associada ao ambiente experimental (MET-ASS)
Os animais receberam metirapona (50 mg/kg) e, 3 horas depois, o veículo
(solução salina 0,9 % m–v). Após 20 minutos, foram colocados na arena-teste por 30
minutos. Depois de 30 minutos de sua retirada da arena-teste, os ratos receberam
veículo.
METYRAPONE
(50 mg/kg)
3h
VEÍCULO
20’
ARENA 30’
30’
VEÍCULO
31
•
Grupo 2 (n=8): Metirapona-não-associada ao ambiente experimental (MET-
NASS)
Os ratos receberam veículo nas 2 administrações e, 20 minutos após a
segunda administração, foram colocados na arena-teste por 30 minutos. Passados
30 minutos de sua retirada da arena, os animais receberam metirapona.
VEÍCULO
•
3h
VEÍCULO
20’
ARENA 30’
30’
METYRAPONE
(50 mg/kg)
Grupo 3 (n=9): Controle (MET-VEIC)
Os ratos do grupo controle receberam veículo (solução salina 0,9% m/v) nas
3 administrações.
VEÍCULO
3h
VEÍCULO
20’
ARENA 30’
30’
VEÍCULO
ƒTeste de condicionamento:
Os animais dos 3 grupos experimentais receberam administração do veículo da
metirapona, solução salina 0,9% m-v e, após 3 horas, receberam uma segunda
administração de veículo e, 20 minutos após, foram colocados na arena-teste por 30
minutos.
ƒTeste de sensibilização:
Os animais dos grupos metirapona-associada e metirapona não-associada
receberam administração de metirapona, sendo, posteriormente, colocados na
arena-teste durante 30 minutos. Os animais do grupo controle receberam veículo, na
arena-teste, 20 minutos antes do registro de sua atividade locomotora.
32
3.7- Experimento 3: efeito da metirapona sobre a atividade locomotora
condicionada e sensibilização comportamental produzidas por administrações
sistêmicas de apomorfina
Este experimento teve como objetivo verificar o efeito da metirapona (50,0
mg/Kg)
sobre
o
desenvolvimento
dos
processos
de
condicionamento
e
sensibilização comportamental produzidos por apomorfina. Para isso, utilizou-se o
procedimento experimental, descrito no item 3.4, com os seguintes grupos
experimentais:
ƒFase de condicionamento:
•
Grupo 1 (n=6): Metirapona + Apomorfina 0,5 mg/Kg-associada ao ambiente
experimental (MET+APO0,5-ASS)
•
Grupo 2 (n=6): Metirapona + Apomorfina 2,0 mg/Kg-associada ao ambiente
experimental (MET+APO2,0-ASS)
Os animais receberam metirapona e, 3 horas depois apomorfina. Após 20
minutos, foram instalados na arena por um período de 30 minutos. Então, 30
minutos após sua retirada da arena, receberam o veículo da metirapona (solução
salina) e, 3 horas depois, o veículo da apomorfina (solução de ácido ascórbico).
METYRAPONE
(50 mg/kg)
•
3h
APOMORFINA
(0,5 ou 2,0 mg/kg)
20’
ARENA 30’
30’
VEÍCULO
3h
VEÍCULO
Grupo 3 (n=6): Metirapona + Apomorfina 0,5 mg/Kg-não associada ao ambiente
experimental (MET+APO0,5-NASS)
•
Grupo 4 (n=6): Metirapona + Apomorfina 2,0 mg/Kg-não associada ao ambiente
experimental (MET+APO2,0-NASS)
Os ratos receberam o veículo da metirapona na primeira administração,
veículo da apomorfina na segunda administração, metirapona na terceira
administração e apomorfina na quarta administração.
VEÍCULO
3h
VEÍCULO
20’
ARENA 30’
30’
METYRAPONE
(50 mg/kg)
3h
APOMORFINA
(0,5 ou 2,0 mg/kg)
33
•
Grupo 5 (n=6): Controle (MET+APO-VEIC)
Os ratos do grupo controle receberam, respectivamente, salina, ácido
ascórbico, salina, ácido ascórbico nas 4 administrações.
VEÍCULO
3h
VEÍCULO
20’
ARENA 30’
30’
VEÍCULO
3h
VEÍCULO
ƒTeste de condicionamento:
Os animais dos 5 grupos experimentais receberam administração do veículo
da apomorfina e, após 20 minutos, foram colocados na arena-teste por 30 minutos.
ƒTeste de sensibilização:
Os animais dos grupos metirapona + apomorfina-associada e metirapona +
apomorfina-não-associada receberam apomorfina 20 minutos antes do registro de
sua atividade locomotora no ambiente experimental.
3.8- Análise comportamental
A avaliação comportamental foi realizada por meio da quantificação da
atividade locomotora dos ratos na arena-teste. Esta arena-teste foi, para tal, dividida
em 8 quadrados de mesma dimensão, sendo registrado, durante 30 minutos, o
número de cruzamentos (número de quadrados percorridos pelo animal com as
quatro patas) dos ratos.
3.9- Análise estatística
O experimento foi instalado no delineamento inteiramente casualizado (DIC),
em um esquema fatorial com 6 repetições para os experimentos 1 e 3 e 8 repetições
para o experimento 2. Para o período de habituação, no experimento 2, teve-se um
34
fatorial 3x3, sendo 3 grupos experimentais e 3 dias de habituação, e nos
experimentos 1 e 3, teve-se um fatorial 5x3, sendo 5 grupos experimentais e 3 dias
de habituação. Para a fase de condicionamento, no experimento 2, teve-se um
fatorial 3x5, sendo 3 grupos experimentais e 5 dias de tratamento farmacológico, e
nos experimentos 1 e 3, teve-se um fatorial 5x5, sendo 5 grupos experimentais e 5
dias de tratamento farmacológico.
Modelo estatístico: Yijk = M + Ai + Bj + ABij + eijk
Yijk = observação referente ao animal k do grupo experimental i e dia de
administração j;
M = média de todos os animais para a variável em estudo (média geral);
Ai = efeito do subgrupo experimental i, sendo i = 1,2 e 3;
Bj = efeito do dia de administração j, sendo j = 1,2,e 3 no período de habituação e j =
1,2,3,4 e 5 na fase de condicionamento;
ABij = efeito da interação entre o grupo experimental i e o dia de administração j;
eijk = erro aleatório associado à observação yijk , supostamente independente e
normalmente distribuído;
Os dados concernentes à atividade locomotora foram interpretados pela
Análise de Variância (ANOVA) de 2 fatores, adotando-se o nível de 5% de
probabilidade para o teste F. As diferenças entre as médias dos níveis dos fatores
foram analisadas, por meio do teste de comparações múltiplas de Duncan,
adotando-se também o nível de 5% de probabilidade.
Para os testes de condicionamento e sensibilização comportamental,
realizou-se um experimento, com 6 repetições para os experimentos 1 e 3 e 8
repetições para o experimento 2, instalados no delineamento inteiramente
casualizado (DIC) com 3 grupos experimentais no experimento 2 e 5 grupos
experimentais nos experimentos 1 e 3.
Modelo estatístico: Yij = M + Ti + eij
Yij = observação referente ao animal j do grupo experimental i;
M = média de todos os animais para a variável em estudo (média geral);
35
Ti = efeito do subgrupo experimental i, sendo i = 1, 2 e 3 no teste de
condicionamento e i = 1,2 ,3 e 4 no teste de sensibilização comportamental;
eij = erro aleatório associado à observação Yij , supostamente independente e
normalmente distribuído;
Os dados comportamentais foram interpretados pela Análise de Variância
(ANOVA) de 1 fator, adotando-se o nível de 5% de probabilidade para o teste F. O
teste de comparações múltiplas de Duncan foi efetuado para avaliar as diferenças
entre as médias dos níveis dos fatores.
36
4. RESULTADOS
4.1- Experimento 1: efeitos de administrações sistêmicas de apomorfina na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental
4.1.1- Período de habituação
A figura 1 demonstra a atividade locomotora de todos os animais
experimentais no período de habituação. A análise de variância (ANOVA) de 2
fatores indicou haver efeito principal do fator dia [F(2,72)=31,22; p=0,00], não havendo
diferença estatisticamente significativa entre os grupos [F(4,72)=0,75; p=0,56], assim
como interação dia x grupo [F(8,72)=0,31; p=0,96]. O teste de comparações múltiplas
de Duncan demonstrou que, no 3º dia
os animais apresentaram atividade
locomotora menor que no 1º e no 2º dia (p<0,05). A atividade locomotora no 2º dia
também foi menor que no 1º dia (p<0,05). A redução do número de cruzamentos ao
longo dos dias evidencia a habituação dos ratos à arena-teste.
37
PERÍODO DE HABITUAÇÃO-APOMORFINA
600
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
500
400
300
200
#
*
100
0
DIA 1
DIA 2
DIA 3
Figura 1: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no período de habituação. * Indica diferença significativa do 3º dia em
relação aos 1º e 2º dias (Teste de Duncan; p<0,05). # Indica diferença
significativa do 2º dia em relação ao 1º dia (Teste de Duncan; p<0,05).
4.1.2- Fase de condicionamento
A figura 2 demonstra a atividade locomotora dos grupos apomorfina-veículo ,
apomorfina-0,5 mg/kg-associada, apomorfina-0,5 mg/kg-não-associada, apomorfina2,0
mg/kg-associada
e
apomorfina-2,0
mg/kg-não-associada
na
fase
de
condicionamento. A análise de variância (ANOVA) de 2 fatores indicou haver efeito
principal do fator grupo [F(4,120)= 7,81; p= 0,00] e interação dia x grupo [F(16,120)= 2,23;
p=0,03] não havendo diferença estatisticamente significativa entre os dias [F
(4,120)=
2,06; p=0,07]. O teste de comparações múltiplas de Duncan mostrou que no 3º dia
da fase de condicionamento o grupo apomorfina-0,5 mg/kg-associada apresentou
atividade locomotora maior que a dos grupos apomorfina 0,5 e 2,0 mg/kg nãoassociada, apomorfina-2,0 mg/kg associada e grupo veículo. O teste de
comparações múltiplas de Duncan também mostrou que a atividade locomotora do
38
grupo apomorfina-2,0 mg/kg-associada foi maior que a atividade locomotora dos
grupos apomorfina 0,5 e 2,0 mg/kg não-associada, apomorfina-0,5 mg/kg associada
e grupo veículo a partir do 4º dia da fase de condicionamento (p <0,05). Estes
resultados indicam que a administração de apomorfina na dose de 2,0 mg/kg,
associada ao ambiente experimental, produziu um aumento progressivo na atividade
locomotora.
FASE DE CONDICIONAMENTO - APOMORFINA
APO-VEIC
APO 0,5-ASS
APO 0,5-NASS
APO 2,0-ASS
APO 2,0-NASS
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
600
500
*
400
*
300
#
200
100
0
4
5
6
7
8
Dias
Figura 2: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais na fase de condicionamento. # Indica diferença significativa do grupo
apomorfina 0,5 mg/kg em relação aos demais grupos (Teste de Duncan; p<0,05).
* Indica diferença significativa do grupo apomorfina 2,0 mg/kg-associada em
relação aos demais grupos (Teste de Duncan; p<0,05).
39
4.1.3- Teste de condicionamento
A figura 3 demonstra a atividade locomotora de todos os grupos
experimentais no teste de condicionamento. A análise de variância (ANOVA) de 1
fator [F(4,17)=6,92; p=0,00] seguida do teste de comparações múltiplas de Duncan,
evidenciou maior atividade locomotora dos grupos apomorfina-0,5 mg/kg-associada
e apomorfina-2,0 mg/kg- associada em relação a dos demais grupos (p<0,05), não
havendo diferença estatisticamente significativa entre os demais grupos. Estes
resultados indicam que a apomorfina nas doses de 0,5 e 2,0 mg/kg produz
condicionamento.
TESTE DE CONDICIONAMENTO- APOMORFINA
600
APO-VEIC
APO 0,5-ASS
APO 0,5-NASS
APO 2,0-ASS
APO 2,0-NASS
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
500
400
300
200
*
*
100
0
Grupos
Figura 3: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no teste de condicionamento. * Indica diferença significativa dos grupos
apomorfina 0,5 mg/kg-associada e apomorfina 2,0 mg/kg-associada em relação
aos demais grupos (Teste de Duncan; p<0,05).
4.1.4- Teste de sensibilização
40
A figura 4 demonstra a atividade locomotora dos grupos apomorfina-veículo,
apomorfina-0,5 mg/kg-associada, apomorfina-0,5 mg/kg-não-associada, apomorfina2,0
mg/kg-associada
e
apomorfina-2,0
mg/kg-não-associada
no
teste
de
sensibilização. A análise de variância (ANOVA) de 1 fator [F(4,24)=5,83; p=0,00]
seguida do teste de comparações múltiplas de Duncan, mostrou que o
grupo
apomorfina-2,0 mg/kg-associada apresentou atividade locomotora maior que a dos
outros grupos (p<0,05), não havendo diferença estatisticamente significativa entre os
grupos apomorfina-veículo , apomorfina-0,5 mg/kg associada, apomorfina-0,5 mg/kgnão-associada e apomorfina-2,0 mg/kg-não-associada. Estes resultados indicam que
a apomorfina na dose de 2,0 mg/kg produz sensibilização comportamental.
TESTE DE SENSIBILIZAÇÃO- APOMORFINA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
600
APO- VEIC
APO 0,5- ASS
APO 0,5- NASS
APO 2,0- ASS
APO 2,0- NASS
*
500
400
300
200
100
0
0
1
2
3
4
5
6
Grupos
Figura 4: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no teste de sensibilização. * Indica diferença significativa do grupo
apomorfina 2,0 mg/kg-associada em relação aos demais grupos (Teste de
Duncan; p<0,05).
41
4.2 - Experimento 2: efeitos de administrações sistêmicas de metirapona na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental
4.2.1- Período de habituação
A figura 5 demonstra a atividade locomotora de todos os animais
experimentais no período de habituação. A análise de variância (ANOVA) de 2
fatores mostrou haver diferença significativa entre os dias [F(2,66)=9,85; p=0,00], não
havendo efeito dos grupos [F(2,66)=0,83; p=0,44] e nem interação dia x grupo [F
(4,66)=0,20;
p=0,94]. O teste de comparações múltiplas de Duncan mostrou que, no 1º
dia, os animais apresentaram atividade locomotora maior que no 2º e no 3º dia
(p<0,05). A atividade locomotora no 2º dia também foi maior que no 3º dia (p<0,05).
Estes resultados indicam habituação dos ratos à arena-teste.
PERÍODO DE HABITUAÇÃO- METIRAPONA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
300
250
200
#
*
150
100
50
0
DIA 1
DIA 2
DIA 3
Figura 5: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no período de habituação. * Indica diferença significativa do 3º dia em
relação aos 1º e 2º dias (Teste de Duncan; p<0,05). # Indica diferença
significativa do 2º dia em relação ao 1º dia (Teste de Duncan; p<0,05).
42
4.2.2- Fase de condicionamento
A figura 6 demonstra a atividade locomotora dos grupos metirapona-veículo,
metirapona-associada e metirapona-não-associada na fase de condicionamento.
Segundo a análise de variância (ANOVA) de 2 fatores, houve efeito dos grupos
[F(2,109)=11,77; p=0,00], entretanto, não houve efeito dos dias [F(4,109) = 0,06; p=0,99],
assim como interação dia X grupo [F(8,109) = 1,33; p=0,24]. O teste de comparações
múltiplas de Duncan mostrou que o grupo metirapona-associada apresentou
atividade locomotora maior que a dosdemais grupos (p<0,05). Estes resultados
indicam que a administração de metirapona na dose de 50 mg/Kg produziu aumento
da atividade locomotora.
FASE DE CONDICIONAMENTO- METIRAPONA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
300
250
200
*
150
100
50
0
MET-VEIC
MET-ASS
MET-NASS
Figura 6: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais na fase de condicionamento. * Indica diferença significativa do grupo
metirapona-associada em relação aos demais grupos (Teste de Duncan; p<0,05).
43
4.2.3 – Teste de condicionamento
A figura 7 demonstra a atividade locomotora dos grupos metirapona-veículo,
metirapona-associada e metirapona-não-associada no teste de condicionamento. A
análise de variância (ANOVA) de 1 fator [F(2,22)=4,78; p=0,02], seguida do teste de
comparações
múltiplas
de
Duncan,
mostrou
que
o
grupo
metirapona-
associadoaapresentou atividade locomotora maior que a dos grupos metiraponaveículo
e
metirapona-não-associada
(p<0,05),
não
havendo
diferença
estatisticamente significativa entre estes grupos. Tais resultados evidenciam que a
metirapona na dose de 50 mg/Kg produz condicionamento.
TESTE DE CONDICIONAMENTO- METIRAPONA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
300
MET- VEIC
MET- ASS
MET- NASS
250
*
200
150
100
50
0
0
1
2
3
4
Grupos
Figura 7: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no teste de condicionamento. * Indica diferença significativa do grupo
metirapona-associada em relação aos demais grupos (Teste de Duncan; p<0,05).
4.2.4 – Teste de sensibilização
44
A figura 8 demonstra a atividade locomotora dos grupos metirapona-veículo,
metirapona-associada e metirapona-não-associada no teste de sensibilização. A
análise de variância (ANOVA) de 1 fator [F(2,22)=2,25; p=0,13] mostrou que não
houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos metirapona-veículo,
metirapona-associada e metirapona-não-associada. Estes resultados evidenciam
que a metirapona na dose de 50 mg/Kg não produz sensibilização comportamental.
TESTE DE SENSIBILIZAÇÃO- METIRAPONA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
300
MET- VEIC
MET- ASS
MET- NASS
250
200
150
100
50
0
0
1
2
3
4
Grupos
Figura 8: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no teste de sensibilização.
45
4.3– Experimento 3: efeito da metirapona sobre a atividade locomotora
condicionada e sensibilização comportamental produzidas por administrações
sistêmicas de apomorfina
4.3.1 – Período de habituação
A figura 9 demonstra a atividade locomotora de todos os animais
experimentais no período de habituação. A análise de variância (ANOVA) de 2
fatores
indicou haver efeito principal do fator dia [F(2,75)=21,45; p=0,00], não
havendo diferença estatisticamente significativa entre os grupos [F(4,75)=0,86; p=0,49]
assim como interação dia x grupo [F(8,75)=0,76; p=0,64]. O teste de comparações
múltiplas de Duncan mostrou que no 3º dia os animais apresentaram atividade
locomotora menor que no 1º e 2º dias (p<0,05). A redução do número de
cruzamentos ao longo dos dias indica habituação dos animais à arena-teste.
PERÍODO DE HABITUAÇÃO- METIRAPONA + APOMORFINA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
1000
800
600
400
*
200
0
DIA 1
DIA 2
DIA 3
Figura 9: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no período de habituação. * Indica diferença significativa do 3º dia em
relação aos 1º e 2º dias (Teste de Duncan; p<0,05).
46
4.3.2 – Fase de condicionamento
A
figura
10
demonstra
metirapona+apomorfina-veículo,
metirapona+apomorfina-0,5
a
atividade
locomotora
metirapona+apomorfina-0,5
mg/Kg-não-associada,
dos
grupos
mg/Kg-associada,
metirapona+apomorfina-2,0
mg/Kg-associada e metirapona+apomorfina-2,0 mg/Kg-não-associada na fase de
condicionamento. Segundo a análise de variância (ANOVA) de 2 fatores houve
efeito do fator principal grupo [F(4,125)=32,99; p=0,00], e interação dia X grupo
[F(16,125)=3,15; p=0,00], sem efeito dos dias [F(4,125)=1,70; p=0,15]. O teste de
comparações múltiplas de Duncan mostrou que o grupo metirapona + apomorfina
2,0 mg/kg-associada
apresentou atividade locomotora maior que a dos outros
grupos (p<0,05) a partir do 2º dia da fase de condicionamento. Estes resultados
indicam que a administração de metirapona na dose de 50 mg/Kg, anterior à
apomorfina, na dose de 2,0 mg/Kg, associada ao ambiente experimental, produziu
um aumento progressivo na atividade locomotora.
47
FASE DE CONDICIONAMENTO-METIRAPONA + APOMORFINA
MET+APO-VEIC
MET+APO0,5-ASS
MET+.APO0,5-NASS
MET+APO2,0-ASS
MET+APO2,0-NASS
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
1000
*
*
800
*
600
*
400
200
0
4
5
6
7
8
Dias
Figura 10: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais na fase de condicionamento. * Indica diferença significativa do grupo
metirapona+apomorfina 2,0 mg/kg-associada em relação aos demais grupos no
mesmo dia (Teste de Duncan; p<0,05)
4.3.3 – Teste de condicionamento
A
figura
11
demonstra
metirapona+apomorfina-veículo,
metirapona+apomorfina-0,5
a
atividade
locomotora
metirapona+apomorfina-0,5
mg/Kg-não-associada,
dos
grupos
mg/Kg-associada,
metirapona+apomorfina-2,0
mg/Kg-associada e metirapona+apomorfina-2,0 mg/Kg-não-associada no teste de
condicionamento. A ANOVA de 1 fator [F(4,25)=6,07; p=0,01], seguida do teste de
comparações múltiplas de Duncan, evidenciou maior atividade locomotora dos
48
grupos metirapona + apomorfina-0,5 mg/kg-associada, metirapona + apomorfina-0,5
mg/kg-não-associada e metirapona + apomorfina-2,0 mg/kg-associada em relação
aos demais grupos (p<0,05), não havendo diferença estatisticamente significativa
entre os demais grupos experimentais. Estes resultados indicam que a metirapona
não bloqueou a aquisição do condicionamento à apomorfina.
TESTE DE CONDICIONAMENTO - METIRAPONA + APOMORFINA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
1000
800
MET+APO- VEIC
MET+APO 0,5- ASS
MET+APO 0,5- NASS
MET+APO 2,0- ASS
MET+APO 2,0- NASS
600
400
*
*
200
*
*
*
0
Grupos
Figura 11: Média e Erro-Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no teste de condicionamento. * Indica diferença significativa dos grupos
metirapona + apomorfina 0,5 mg/Kg –associada, metirapona + apomorfina 0,5
mg/Kg -não-associada e metirapona + apomorfina 2,0 mg/kg-associada em
relação aos demais grupos (Teste de Duncan; p<0,05).
4.3.4 – Teste de sensibilização
A
figura
12
demonstra
metirapona+apomorfina-veículo,
metirapona+apomorfina-0,5
a
atividade
locomotora
metirapona+apomorfina-0,5
mg/Kg-não-associada,
dos
grupos
mg/Kg-associada,
metirapona+apomorfina-2,0
mg/Kg-associada e metirapona+apomorfina-2,0 mg/Kg-não-associada no teste de
sensibilização. A
análise de variância (ANOVA) de 1 fator [F(4,25)=6,89; p=0,01],
49
seguida do teste de comparações múltiplas de Duncan, mostrou que o grupo
metirapona + apomorfina-2,0 mg/kg-associada apresentou atividade locomotora
maior que a dos demais grupos, não havendo diferença estatisticamente significativa
entre os grupos metirapona+apomorfina-veículo, metirapona+apomorfina 0,5 mg/Kgassociada,
metirapona+apomorfina-0,5
mg/Kg-não–associada
e
metirapona+apomorfina 2,0 mg/Kg-não-associada . Estes resultados indicam que a
metirapona não bloqueou a expressão da sensibilização comportamental induzida
pela apomorfina.
TESTE DE SENSIBILIZAÇÃO- METIRAPONA + APOMORFINA
Número de Cruzamentos
(Média + EPM)
1000
*
800
MET+APO- VEIC
MET+APO 0,5- ASS
MET+APO 0,5- NASS
MET+APO 2,0 - ASS
MET+APO 2,0 - NASS
600
400
200
0
0
1
2
3
4
5
6
Grupos
Figura 12: Média e Erro- Padrão da Média (EPM) do número de cruzamentos emitidos pelos
animais no teste de sensibilização. * Indica diferença significativa do grupo
metirapona + apomorfina 2,0 mg/kg-associada em relação aos demais grupos
(Teste de Duncan; p<0,05).
50
5. DISCUSSÃO
5.1- Experimento 1: efeitos de administrações sistêmicas de apomorfina na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental
No presente trabalho, os resultados mostraram que a administração repetida
de apomorfina nas doses de 0,5 e 2,0 mg/kg produziu condicionamento. Como
índice de desenvolvimento do processo de condicionamento induzido por drogas,
comparou-se o nível de atividade locomotora exibido pelos animais do grupo
apomorfina-associada em relação aos outros grupos, particularmente ao grupo
controle. Durante a fase de condicionamento, os animais receberam apomorfina 20
minutos antes de serem colocados na arena-teste para registro de sua atividade
locomotora. A apomorfina atuou como um estímulo incondicionado que promoveu
uma resposta comportamental também incondicionada – o aumento estatisticamente
significativo da atividade locomotora no caso do grupo apomorfina-2,0 mg/kgassociada. No dia do teste de condicionamento, os animais de todos os grupos
receberam salina. Os grupos que receberam apomorfina associada ao ambiente
experimental apresentaram atividade locomotora maior que a dos demais grupos,
particularmente em relação grupo controle. Ou seja, o ambiente experimental,
através de sua história de associação com a exposição à droga atuou como um
estímulo condicionado, promovendo aumento da locomoção, na ausência da
apomorfina.
51
Estes resultados corroboram aqueles verificados por Schiff (1982), nos quais
a administração de apomorfina e anfetamina associada a um estímulo ambiental
produziu acréscimos nas atividades dopaminérgicas mesolímbica e nigroestriatal e
desenvolvimento de uma resposta locomotora condicionada. Segundo Schiff (1982),
os agonistas dopaminérgicos funcionam como um estímulo incondicionado para
aquisição da resposta condicionada. Franklin e Druhan (2000) observaram que
lesões dos terminais mesoacumbens com a neurotoxina, 6-hidroxidopamina,
obstaram a hiperatividade condicionada induzida por administrações sistêmicas de
anfetamina. Pert e colaboradores (1990) também verificaram que a locomoção
condicionada induzida por cocaína foi bloqueada por lesões com 6-hidroxidopamina
na amígdala e núcleo acumbens. Desse modo, os efeitos comportamentais oriundos
do uso de agonistas dopaminérgicos diretos, como a apomorfina, e agonistas
indiretos, como a anfetamina e cocaína, podem se tornar condicionados (GOLD et
al., 1988; MATTINGLY e GOTSICK, 1989; DAMIANOPOULOS e CAREY, 1992).
Por outro lado, tem sido sugerido que os efeitos condicionados das drogas,
na verdade, representariam uma conduta exploratória normal por parte dos
roedores. Em outras palavras, o tratamento com agonistas dopaminérgicos
prejudicaria a capacidade dos ratos em se habituarem ao ambiente experimental. A
resposta condicionada resultaria de uma atividade exploratória dos ratos, tendo em
vista sua exposição a um
ambiente inteiramente novo (FILE et al., 1977). Esta
hipótese, denominada ausência de habituação, surgiu de observações nas quais a
resposta locomotora condicionada exibida pelos ratos, que haviam recebido droga
associada ao ambiente experimental, era similar àquela exibida pelos ratos-controle,
em sua primeira exposição ao ambiente-teste (TIRELLI e HEIDBREDER, 1999).
Entremente, os resultados deste trabalho demonstraram que os grupos que
receberam apomorfina não associada ao ambiente experimental apresentaram
atividade locomotora menor que os grupos-associados, ratificando a relevância do
contexto ambiental na aquisição da resposta condicionada.
Apesar da administração de apomorfina em ambas as doses ter produzido
condicionamento, apenas o grupo apomorfina 2,0 mg/kg-associada apresentou um
aumento estatisticamente significativo na atividade locomotora incondicionada. Este
achado indica que existe uma dissociação entre as respostas condicionada e
incondicionada. Ou seja,
a aquisição da resposta locomotora condicionada
independe do aumento na atividade locomotora incondicionada ao longo da fase de
52
condicionamento, sugerindo que, possivelmente, mecanismos diferentes medeiem
essas respostas comportamentais.
Consistentes com os prévios relatos (CASTRO et al., 1985; MATTINGLY et
al., 1988), os presentes resultados também mostraram que administrações repetidas
de apomorfina produziram sensibilização. O aumento progressivo da resposta
locomotora, durante a fase de condicionamento, e sua exacerbação, no dia do teste
de sensibilização, foram utilizados como índices de desenvolvimento do processo de
sensibilização comportamental. Contudo, os resultados mostraram que o efeito do
tratamento repetido com apomorfina sobre a locomoção é dose-dependente. Neste
trabalho, verificou-se que apenas a dose de 2,0 mg/kg de apomorfina resultou em
sensibilização. Sabe-se que a administração repetida de agonistas dopaminérgicos
resulta no desenvolvimento do processo de sensibilização comportamental
(MATTINGLY et al., 1991).
A literatura científica estabelece que uma atividade dopaminérgica elevada,
advinda do emprego de agonistas dopaminérgicos, de modo geral, implica uma
hiperatividade
locomotora,
do
mesmo
modo
que
um
decréscimo
na
neurotransmissão dopaminérgica redunda em hipomotilidade (BENINGER et al.,
1989). Segundo Mattingly e colaboradores (1989), altas doses de apomorfina (> 1,0
mg/kg) produzem aumento progressivo da locomoção, enquanto baixas doses (< 1,0
mg/kg) geram redução desta atividade. Kinion e colaboradores (1984) apontam que
baixas doses de apomorfina (< 0,1 mg/kg) redundam na sensibilização do
comportamento estereotipado. Acredita-se que as atividades locomotora e
estereotipada induzidas pela apomorfina constituam comportamentos mediados por
distintas vias dopaminérgicas. Especificamente, a estereotipia resultaria da
estimulação de receptores estriatais, ao passo que a locomoção seria mediada pelo
sistema dopaminérgico mesolímbico (MATTINGLY et al., 1988).
Baixas doses de apomorfina atuam preferencialmente sobre auto-receptores
dopaminérgicos D2. Apesar dos receptores D2 serem encontrados pré e póssinapticamente, os sítios pré-sinápticos são 6 a 10 vezes mais sensíveis à
apomorfina. Por outro lado, altas doses estimulam tanto os auto-receptores quanto
os receptores pós-sinápticos (CREESE et al., 1983).
A literatura tem sugerido que a sensibilização motora induzida por agonistas
dopaminérgicos, como apomorfina, estaria relacionada à tolerância dos autoreceptores (ROBINSON e BECKER, 1986). Nesta hipótese, os auto-receptores D2
53
tornar-se-iam menos sensíveis ou sofreriam regulação decrescente (“downregulation”) diante de repetidas exposições a agonistas dopaminérgicos (ROBINSON
e BECKER, 1986). Esta hipótese, porém, não explica a sensibilização motora com a
dose de 2,0 mg/kg, e não com 0,5 mg/kg, observada no presente trabalho.
Desde que 0,5 mg/kg de apomorfina represente uma baixa dose
(MATTINGLY et al., 1989), haveria uma estimulação preferencial dos autoreceptores D2 que, ao se tornarem subsensitivos, apresentariam um decréscimo em
seu efeito inibitório sobre a síntese e liberação de dopamina promovendo uma
hipersensibilidade dos receptores dopaminérgicos pós-sinápticos e, conseqüente,
aumento da atividade locomotora o que, neste caso, não ocorreu. Creese e
colaboradores (1993) mencionam que o efeito de baixas doses equivale ao
tratamento
repetido
com
antagonistas.
O
tratamento
com
antagonistas
dopaminérgicos promoveria uma hipersensibilidade comportamental a agonistas que
seria mediada por um acréscimo no número de receptores dopaminérgicos
(CREESE et al, 1983).
Além disso, a dose de 2,0 mg/kg produziu sensibilização comportamental.
Nesta dose, a apomorfina estaria atuando nos auto-receptores e nos receptores
pós-sinápticos. Portanto, seria razoável afirmar que a sensibilização a esta dose alta
de apomorfina resultou de seus efeitos pós-sinápticos, ou seja, a estimulação dos
receptores pós-sinápticos gerou aumento na atividade locomotora (MATTINGLY et
al., 1988). Esta hipersensibilidade comportamental não está relacionada a um
aumento na densidade de receptores, visto que o número de receptores encontra-se
reduzido ou inalterado após o tratamento repetido com agonistas dopaminérgicos
(RIFFEE et al., 1982). Não obstante, existem evidências que propõem o
envolvimento de alterações pós-sinápticas duradouras na expressão do processo de
sensibilização
a
psicoestimulantes.
Dentre
essas
alterações,
incluem-se
,respectivamente: aumento da atividade da proteína G, ativação da adenilato ciclase
com subseqüente aumento na produção de AMP cíclico e estimulação da
proteínaquinase A (PIERCE e KALIVAS, 1995).
Por outro lado, Kinion e colaboradores (1984) aventam que somente doses
inferiores a 0,1 mg/kg seriam consideradas baixas, logo, a dose de 0,5 mg/kg
consistiria numa alta dose. Mas, como explicar que a dose de 2,0 mg/kg, e não de
0,5 mg/kg, produziu sensibilização? Provavelmente, a dose de 0,5 mg/kg seja uma
dose intermediária, não suficientemente alta a ponto de promover as alterações pós-
54
sinápticas necessárias para o desenvolvimento do processo de sensibilização
motora à apomorfina. A estimulação dopaminérgica também encontra-se envolvida
na mediação de outros comportamentos como autolimpeza (“grooming”) e
movimentos
orais
estereotipados
–
roer,
lamber
e
cheirar
repetidamente
(BENINGER et al., 1989). É possível, portanto, que nesta dose (0,5 mg/kg)
predomine qualquer um desses comportamentos em detrimento da atividade
locomotora. Afinal, ratos mais estereotipados, em geral, locomovem-se menos.
Uma outra hipótese que tenta explicar a sensibilização a agonistas
dopaminérgicos é a hipótese do condicionamento. De acordo com esta hipótese, o
aumento progressivo na atividade locomotora induzido por psicoestimulantes estaria
subordinado ao desenvolvimento de uma resposta locomotora condicionada a um
estímulo ambiental associado com a exposição à droga (ROBINSON e BECKER,
1986). No presente trabalho, constatou-se que, apesar de ambas as doses de
apomorfina produzirem condicionamento, somente a dose de 2,0 mg/kg resultou em
sensibilização comportamental. Além disso, os animais do grupo apomorfina 0,5
mg/kg-associada exibiram uma atividade locomotora similar a dos animais do grupo
apomorfina 0,5 mg/kg-não-associada. Estes resultados são inconsistentes com a
hipótese do condicionamento. Entretanto, a sensibilização motora à apomorfina só
ocorreu no grupo apomorfina 2,0 mg/kg-associada ao ambiente experimental, o
qualapresentou aumento progressivo da atividade locomotora ao longo da fase de
condicionamento, assim como uma atividade locomotora maior que os demais
grupos no teste de sensibilização. De onde se infere que o condicionamento,
embora não seja um fator determinante na indução do fenômeno de sensibilização,
tem participação relevante no desenvolvimento desse processo.
5.2- Experimento 2: efeitos de administrações sistêmicas de metirapona na
atividade locomotora condicionada e sensibilização comportamental
Os resultados demonstraram que a administração de metirapona na dose de
50 mg/kg produziu aumento da atividade locomotora e condicionamento. Os animais
do grupo metirapona-associada exibiram maior locomoção que a dos animais dos
grupos metirapona-não-associada e controle durante a fase de condicionamento e
no teste de condicionamento.
55
Segundo Conte-Devolx e colaboradores (1992), a administração de
metirapona inibe a síntese de corticosterona promovendo aumento compensatório
na síntese e secreção do fator de liberação de corticotropina (CRF), do hormônio
adrenocorticotrópico (ACTH) e outros neuropeptídeos hipotalâmicos e hipofisários. A
secreção de corticosterona é controlada por uma alça de retroalimentação
(“feedback”) negativa, ativada por atuação da corticosterona circulante. Esta
corticosterona, por sua vez, atua sobre receptores corticosteróides hipocampais,
hipotalâmicos e hipofisários inibindo a secreção de CRF, ACTH e de outros
neuropeptídeos (KELLER-WOOD e DALLMAN, 1984).
A ausência de corticosterona impede a ativação da alça de “feedback”
inibitório sobre os neurônios parvocelulares dos núcleos paraventriculares do
hipotálamo que, então, liberam secretagogos do hormônio adrenocorticotrópico,
dentre os quais, os mais importantes são o CRF e a arginina-vasopressina – AVP
(HERMAN e CULLINAN, 1997). A arginina-vasopressina atua como um secretagogo
para corticotropina potencializando significativamente os efeitos do CRF sobre a
liberação de ACTH (SCHIMMER e PARKER, 1996).
De acordo com Shaham e colaboradores (1997), a metirapona atua como
um estressor farmacológico inespecífico que além de promover um aumento
compensatório na secreção de CRF e ACTH, ativa sistemas neurotransmissores,
como noradrenalina e glutamato, mobilizados em resposta ao estresse. A exposição
a eventos estressantes facilita a aquisição do processo de condicionamento
pavloviano. Vale ressaltar que o efeito do estresse sobre o condicionamento é
específico para a aquisição, não afetando a retenção ou a performance de uma
resposta após ter sido adquirida. Estes resultados mostram que o estresse facilita a
aprendizagem (SHORS et al., 2000). Tais autores propuseram que esta facilitação
da aprendizagem promovida pelo estresse envolveria a participação da amígdala e a
ativação de receptores glutamatérgicos do tipo NMDA (N-Metil-D-Aspartato).
Os resultados do presente trabalho entram em desacordo com aqueles
obtidos por Liu e colaboradores (1999), nos quais a administração de metirapona
nas doses de 12,5 e 25 mg/kg obstou o aumento na concentração de corticosterona
em resposta ao estresse, mas não o aumento na concentração basal de
corticosterona de ratos-controle não-estressados. Estes autores assertam que a
metirapona inibe apenas a síntese estimulada de corticosterona sem afetar seus
níveis basais. Estes resultados sugerem que a metirapona reduz a ligação da
56
corticosterona aos receptores tipo II (GRs) enquanto a ligação deste hormônio aos
receptores tipo I (MRs) permance pelo menos parcialmente inalterada. Os
receptores MRs possuem alta afinidade pela corticosterona e aldosterona, estando
quase saturados em condições basais, enquanto os receptores GRs têm afinidade
10 vezes mais baixa que os MRs pela corticosterona, tornando-se ocupados no pico
circadiano diário e após o estresse, quando os níveis de glicocorticóides são
elevados (REUL e DE KLOET, 1985; BRADBURY et al., 1994; TSUTSUMI et al.,
2002). No presente trabalho,
constatou-se que a administração de metirapona,
apesar de ter suprimido a concentração basal de corticosterona, produziu
condicionamento
em
inespecífico.
obstaculização
A
virtude de
seu
dos
efeito como estressor farmacológico
níveis
basais
de
corticosterona
e,
conseqüentemente, de sua atuação basicamente nos receptores MRs foi
assegurada pela dose de metirapona – 50 mg/kg – utilizada neste trabalho.
Segundo Roozendaal e colaboradores (1996), a metirapona gera uma
inibição temporária dose-dependente da síntese de glicocorticóides.
Estes
pesquisadores também sustentam que a metirapona na dose de 50 mg/kg bloqueia
os processos mediados por ambos os receptores, tipo I e tipo II. Desse modo, a
dose de metirapona de 50 mg/kg utilizada neste trabalho inibiu a síntese basal de
corticosterona. Assim, a metirapona, apesar de ter inibido a síntese desse hormônio,
atuou como um estressor farmacológico que ao promover aumento compensatório
de CRF, ACTH e outros neuropeptídeos, facilitou o processo de aprendizagem. Isso
mostra que o papel facilitatório do estresse sobre a aprendizagem não é dependente
da ação da corticosterona e também mostra que substâncias como CRF, ACTH,
glutamato e noradrenalina, provavelmente, estariam envolvidas na aquisição do
processo de condicionamento pavloviano induzido por psicoestimulantes.
5.3- Experimento 3 (Metirapona + Apomorfina): efeito da metirapona sobre a
atividade
locomotora
condicionada
e
sensibilização
comportamental
produzidas por administrações sistêmicas de apomorfina
Neste trabalho, os resultados apontaram que o pré-tratamento com
metirapona gerou uma elevação diminuta nos efeitos condicionados da apomorfina
nas doses de 0,5 e 2,0 mg/kg. Em outras palavras, a metirapona, apesar de ter
57
inibido a síntese de corticosterona, não bloqueou o desenvolvimento da resposta
locomotora condicionada à apomorfina. De tal modo que, os grupos metirapona+
apomorfina-associada 0,5 mg/kg e metirapona+apomorfina-associada 2,0 mg/kg
apresentaram uma atividade locomotora maior que a dos grupos metirapona+
apomorfina-não-associadas e o grupo controle no teste de condicionamento. Faz-se
mister ressaltar que, neste experimento, a administração de metirapona seguida de
apomorfina na dose de 0,5 mg/kg produziu condicionamento, mas não promoveu
aumento significativo na atividade locomotora incondicionada ratificando os
resultados do experimento 1 para a administração exclusivamente de apomorfina.
Pôde-se observar também que a metirapona exacerbou o efeito da apomorfina na
dose de 2,0 mg/kg sobre a atividade locomotora incondicionada, igualmente,
corroborando os resultados do experimento 1. Sustenta-se, portanto, a dissociação
entre as respostas condicionada e incondicionada. Ademais, esses achados indicam
que
o
efeito
da
metirapona
como
estressor
farmacológico
inespecífico,
provavelmente, somou-se ao efeito agonista direto da apomorfina.
A metirapona, freqüentemente, é usada como uma alternativa para
adrenalectomia, por ser um potente e seletivo bloqueador da síntese de
corticosterona, atuando como uma adrenalectomia química parcial, cujos efeitos
comportamentais são dose-dependentes (KORTE, 2001). Doses baixas de
metirapona como 25 mg/kg obstam predominantemente as respostas mediadas por
receptores GRs, ao passo que uma alta dose (50 mg/kg) bloqueia as respostas
mediadas por GRs e MRs (ROOZENDAAL et al., 1996). Assim pode-se inferir que a
dose de 50 mg/kg empregada neste trabalho foi capaz não só de inibir a síntese de
corticosterona estimulada pela apomorfina, mas também os níveis basais de
corticosterona. Este fato sustenta a hipótese do aumento compensatório de CRF,
ACTH e outros neuropeptídeos, devido à não-ativação da alça de “feedback”
inibitório, controlada pelos níveis circulantes de corticosterona que, neste caso,
estariam diminuídos por efeito da metirapona. Conforme explanado anteriormente, o
CRF, ACTH e outros peptídeos, mobilizados em resposta ao estresse facilitam a
aprendizagem pavloviana (SHORS et al., 2000). O CRF, por exemplo, atua em
diversas áreas cerebrais, tais como, amígdala e locus coerulus, implicadas nos
processos de memória e aprendizagem (SHAHAM et al., 1997).
Interessantemente, os resultados deste trabalho também evidenciaram a
potencialização dos efeitos psicomotores incondicionados da apomorfina pela
58
metirapona. Assim sendo, houve aumento progressivo da atividade locomotora do
grupo
metirapona+apomorfina-2,0
mg/kg-associada,
ao
longo
da
fase
de
condicionamento, e da hiperatividade motora exibida por este grupo em relação aos
demais, no teste de sensibilização. Diante do exposto, pode-se dizer que o efeito da
apomorfina sobre o processo de sensibilização é dependente de sua ação direta
sobre a atividade dopaminérgica, mas não de seu efeito indireto proveniente de sua
ação estimuladora sobre a secreção adrenal de corticosterona.
Contrariamente, vários trabalhos relatam que a supressão de corticosterona
pela adrenalectomia ou pelo tratamento crônico com metirapona (mínimo de 7 dias)
reduz os efeitos psicomotores e reforçadores de psicoestimulantes, como
anfetamina e cocaína (DEROCHE et al., 1992; CADOR et al., 1993; PIAZZA et al.,
1994; MARINELLI et al., 1996; MARINELLI et al., 1997). Postula-se que a
potencialização dos efeitos dos psicoestimulantes produzida pelo estresse dependa
de um aumento nos níveis de corticosterona (MARINELLI et al., 1996; PRASAD et
al., 1998; PATACHIOLI et al., 1998). Afinal, ambos estresse e psicoestimulantes
,elevam a secreção adrenal de corticosterona (PRASAD et al., 1998). Contudo,
Badiani e colaboradores (1995) constataram que a sensibilização motora à
anfetamina manteve-se inalterada após a adrenalectomia. Este achado é
consistente com a observação de Schmidt e colaboradores (1999) de que, embora
os psicoestimulantes elevem a secreção de corticosterona, este aumento não tem
relação com a locomoção induzida por estas drogas.
Reid e colaboradores (1998) observaram que a administração de metirapona
na dose de 50 mg/kg aumentou os efeitos estimulantes locomotores da anfetamina
tanto em animais estressados quanto em animais-controle não-estressados,
sugerindo que este fármaco portaria propriedades sensibilizantes locomotoras
intrínsecas. Ou seja, a administração repetida da metirapona sozinha pode produzir
sensibilização comportamental. Tal propriedade, entretanto, entraria em desacordo
com os resultados deste trabalho, no qual a administração de metirapona (50 mg/kg)
sozinha não produziu sensibilização comportamental. Bratt e colaboradores (2001)
também verificaram que, apesar da metirapona na dose de 25 mg/kg elevar os
efeitos comportamentais da anfetamina, este composto sozinho não produziu
estimulação
locomotora
significativa.
Portanto,
o
efeito
potencializador
da
metirapona sobre a ação motora dos psicoestimulantes não pode ser explicado por
uma ação sensibilizadora intrínseca à metirapona.
59
Apesar da necessidade imperiosa de mais estudos acerca dos efeitos da
metirapona sobre a atividade locomotora induzida por psicoesatimulantes, alguns
mecanismos tentam deslindar a natureza precisa desses efeitos. A metirapona
atuaria como um estímulo estressor agudo que ativa o eixo neuroendócrino
(CONTE-DEVOLX
et al., 1992; SHAHAM et al., 1997; BRATT et al., 2001).
Evidências neuroquímicas sustentam que a metirapona na dose de 40 mg/kg
estimula a síntese de secretagogos do hormônio adrenocorticotrópico pelos
neurônios parvocelulares dos núcleos paraventriculares hipotalâmicos (HERMAN et
al., 1992).
Cador e colaboradores (1993) verificaram que o CRF produziu sensibilização
aos efeitos psicomotores da anfetamina e aumentou a utilização de dopamina no
córtex pré-frontal e núcleo acumbens. A literatura também tem postulado o
envolvimento do CRF na sensibilização cruzada entre estresse e drogas de abuso
(STOHR et al., 1999). Esta sugestão é sustentada por achados, como o de Shaham
e colaboradores (1997), segundo os quais, o CRF, mas não a corticosterona,
responde pela recaída induzida pelo estresse à auto-administração intravenosa de
heroína em ratos. Estes autores afirmam que estes efeitos seriam atribuídos, em
parte, ao aumento na síntese e liberação de ACTH induzido pelo CRF.
Um segundo mecanismo potencial que poderia explicar a potencialização
dos efeitos da apomorfina pela metirapona seria a interação farmacocinética entre
estas drogas durante seu processo de biotransformação hepática. Estudos
farmacológicos têm mostrado a potencialização dos efeitos comportamentais da
anfetamina seguinte ao tratamento com inibidores específicos da isoenzima
citocromo (CYP) P-450 2D1 (TOMKINS et al., 1997) como a quinina e budipina
(DANIEL et al., 1999; DANIEL et al., 2002; BISTOLAS et al., 2004). Tomkins e seus
colaboradores (1997) observaram que as administrações de quinina produziram uma
elevação nos níveis séricos de anfetamina, assim como, um decréscimo nos níveis
plasmáticos de seu metabólito, 4-hidroxi-anfetamina. Sills e colaboradores (1999)
propuseram que a potencialização dos efeitos motores da anfetamina pela fluoxetina
resultaria de um efeito inibitório desta sobre o metabolismo da anfetamina pela
isoenzima CYP-450 2D1. Bratt e colaboradores (2001) também adotaram este
mecanismo como uma das possíveis explicações para o efeito potencializador da
metirapona sobre a hiperatividade locomotora induzida pela anfetamina.
60
A metirapona é um inibidor seletivo das isoenzimas CYP-450 2B1 e CYP450 2B2 (DANIEL et al., 1999; DANIEL et al., 2002; BISTOLAS et al., 2004). Estas
enzimas participam de processos como a N-desmetilação e sulfoxidação (DANIEL et
al., 2002) que ocorrem no metabolismo da apomorfina (LEWITT, 2004). Dado o
exposto, seria possível propor que a potencialização do efeito locomotor da
apomorfina pela metirapona, observada neste trabalho, resultaria do prolongamento
da ação da apomorfina.
Com o intuito de explicar a exacerbação dos efeitos da apomorfina
produzida pela metirapona, discutem-se os dois mecanismos anteriormente citados.
De acordo com o primeiro mecanismo, a potencialização dos efeitos da apomorfina
pela metirapona seria oriunda da ação do CRF e ACTH. Porém, a estimulação da
neurotransmissão dopaminérgica pela apomorfina ativa a alça de retroalimentação
negativa, controladora da liberação de ACTH. Sabe-se que a secreção de ACTH é
controlada por uma alça de “feedback” positiva, ativada pelo CRF e por uma alça de
retroalimentação
negativa,
ativada
pela
dopamina.
Logo,
a
estimulação
dopaminérgica ativaria esta última, promovendo diminuição na liberação do ACTH, e
conseqüentemente, acréscimos na secreção de CRF. Dado o exposto, propõe-se
que o CRF
responderia pelos efeitos potencializadores da metirapona sobre a
sensibilização induzida pela apomorfina.
O segundo mecanismo sugere que essa potencialização resultaria do efeito
inibitório da metirapona sobre as enzimas microssomais hepáticas CYP-450. Em
outras palavras, a metirapona inibiria o metabolismo da apomorfina, prolongando a
duração de seus efeitos. Em contrapartida, é imperativo que se considere que,
mesmo havendo um efeito cumulativo da apomorfina durante a fase de
condicionamento, seria improvável que esta droga se acumulasse por até 5 dias
após o término dessa fase. Ou seja, como atribuir a sensibilização observada no dia
do teste (5 dias após a última administração de apomorfina), à interação
farmacocinética entre a metirapona e a apomorfina? O fato é que os efeitos
sensibilizadores da apomorfina potencializados pela metirapona na fase de
condicionamento
seriam
responsáveis
por
alterações
neuroquímicas
e
comportamentais duradouras. Segundo Mattingly e colaboradores (1989), a
sensibilização à apomorfina é mantida por pelo menos 18 dias após a última
administração deste fármaco, podendo também desenvolver-se em intervalos tão
longos quanto 7 dias entre as administrações. Dessa forma, os efeitos
61
neurobiológicos de uma única dose de apomorfina são mantidos por pelo menos
uma semana. Do mesmo modo, o efeito de administrações intermitentes repetidas
desta droga permanece durante um período bastante prolongado. Em suma,
acredita-se que ambos os mecanismos combinados determinem o papel da
metirapona na sensibilização induzida por altas doses de apomorfina.
62
6. CONCLUSÕES
•
O efeito da apomorfina sobre a sensibilização comportamental é dose-
dependente.
•
A apomorfina em baixas doses produz condicionamento, mas não, sensibilização
comportamental.
•
Altas doses de apomorfina estão relacionadas ao desenvolvimento de uma
atividade locomotora condicionada e do processo de sensibilização comportamental.
•
A metirapona facilita a aprendizagem pavloviana.
•
A corticosterona não tem participação direta na aquisição dos processos de
condicionamento e sensibilização induzidos por apomorfina.
63
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