Universidade Nova de Lisboa
Faculdade de Ciências e Tecnologia
Grupo de Disciplinas de Ecologia da Hidrosfera
Avaliação da Actividade
Antioxidante em Diferentes Tipos
de Bebidas: Vinho e Cerveja
Pedro Leal de Paula Poejo
Dissertação apresentada na Faculdade de Ciências
e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa para
obtenção do grau de Mestre em Tecnologia
Alimentar/Qualidade
Orientadora: Professora Doutora Catarina Duarte
Co-orientadora: Professora Doutora Ana Luísa Fernando
Lisboa
2009
"Que o teu alimento seja o teu remédio
e o teu remédio o teu alimento"
Hipócrates
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Agradecimentos
Para a realização deste trabalho foi imprescindível a ajuda e colaboração
de todos quantos me acompanharam durante este período, a quem devo
um profundo e sincero agradecimento.
À Professora Doutora Catarina Duarte por me ter proporcionado a realização de um estágio no ramo da tecnologia alimentar, o qual me permitiu
enraizar conhecimentos e experiência dentro da minha área de formação,
e pelo mesmo ter sido efectuado no Laboratório de Nutracêuticos e Libertação Controlada.
À Professora Doutora Ana Luísa Fernando pela disponibilidade que demonstrou para que este trabalho fosse viabilizado.
Ao IBESA e, em particular, ao Engenheiro José Machado Cruz pela generosa bolsa que me foi concedida.
À Professora Doutora Maria do Rosário Bronze pelos seus conselhos científicos e pelo seu contributo nos ensaios de HPLC.
À Teresa Serra e à Ana Matias pela sua inestimável contribuição, ajudando-me a tornar este trabalho numa realidade. Pelos seus conselhos
científicos e pela sua ajuda na resolução de problemas.
A todos os colaboradores do Laboratório Nutracêuticos e Libertação
Controlada pelo bom acolhimento que me prestaram durante o tempo de
realização do trabalho e por toda a generosa disponibilidade para esclarecimentos científicos e resolução de problemas.
À Helena Calado pela sua incondicional disponibilidade para me ajudar.
Às minhas colegas e ao meu colega de mestrado.
Ao ITQB/IBET pela disponibilização das suas instalações para a realização do trabalho prático.
iii
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Resumo
Este estudo teve como principal objectivo avaliar a actividade antioxidante de vinhos e cervejas in vitro. Para o efeito, determinou-se a
capacidade antioxidante pelos métodos ORAC, HORAC, oxidação da LDL e
HPLC-ED. Determinou-se, ainda, a cor dos vinhos, o teor polifenólico total
pelo método de Folin-Ciocalteau e as antocianinas totais pelo método do
pH diferencial. A identificação de compostos fenólicos foi efectuada por
HPLC-DAD e HPLC-FL.
Os resultados não mostraram qualquer correlação entre a região de
produção dos vinhos e a sua capacidade antioxidante. As cervejas pretas
apresentaram maior capacidade antioxidante do que as cervejas brancas;
as cervejas com álcool apresentaram maior capacidade antioxidante do
que as cervejas sem álcool.
v
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Abstract
This study was conducted in order to evaluate antioxidant activity of
wines and beers in vitro. For this purpose, antioxidant capacity was
determined by ORAC, HORAC, LDL oxidation and HPLD-ED methods. Wine
color, total phenolic contents (using the Folin–Ciocalteu method) and total
anthocyanins (using pH differential method) were also determined. The
identification of phenolic compounds was carried out by HPLC-DAD and
HPLC-FL.
The results showed no correlation between production region and
antioxidant capacity of wines. Dark beers showed more antioxidant
capacity than pilsner style beers; alcoholic beers showed more antioxidant
capacity than alcohol free beers.
vii
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Lista de Abreviaturas e Simbologia
ºC – grau centígrado
1
O2 – Singuleto de oxigénio
A – Absorvância
AAPH – Dicloridrato de 2,2’-azobis-2-amidinopropano
Aç. – Açores
ADN – ácido desoxirribonucleico
Ale. – Alentejo
Alg. – Algarve
B – Beiras
CA – Califórnia
CAEAC – Capacidade Antioxidante Equivalentes Ácido Cafeico
CAET - Capacidade Antioxidante Equivalentes Trolox
CIE – Comissão Internacional de Iluminação (Comission International
d'Eclairage)
cm – centímetro
Co(II) – ião cobalto
CoF2 – Fluoreto de cobalto
d – percurso óptico
D – Douro
DAD – detector de díodos (diode array detector)
ε – coeficiente de absortividade molar
E – Estremadura
EAG – Equivalentes de ácido gálico
EM3G – Equivalentes de malvidina-3-glucósido
EUA – Estados Unidos da América
FD = Factor de diluição
g = grama
H2O2 – Peróxido de hidrogénio
HDL – Lipoproteína de alta densidade (high density lipoprotein)
HORAC – Hydroxyl Radical Averting Capacity
HPLC – Cromatografia líquida de alta eficiência
HPLC-ED – Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector
electroquímico
HPLC-FD – Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a detector de
fluorescência
I – Intensidade
IPR – Indicações de Proveniência Regulamentada
λ – comprimento de onda
L – Litro
L*, a* e b* - eixos estruturantes da cor sengundo o método CIELAB
LDL – lipoproteína de baixa densidade
λem – comprimento de onda de emissão
λex – comprimento de onda de excitação
λvis-max – comprimento de onda com máximo de absorção
mg – miligrama
min. – minuto
ix
Lista de Abreviaturas e Simbologia
μL – microlitro
mL – mililitro
μm – micrómetro
μM – micromolar
mm – milímetro
MM – massa molar
MoO4+ – óxido de molibdénio
nm – nanómetro
O2˙- – Anião superóxido
OH˙ – Radical hidroxilo
OIV – Organização Internacional da Vinha e do Vinho (Office International
de la Vigne et du Vin)
ONOO¯ - Radical peroxinitrito
ORAC – Oxygen radical absorbance capacity
PBS – Solução-tampão de fosfato (phosphate buffer solution)
pH – potencial hidrogeniónico
R – Ribatejo
ROO˙ – Radical peroxilo
ROS – Espécies reactivas de oxigénio (reactive oxygen species)
rpm – Rotações por minuto
SOD – Superóxido dismutase
T – Tonalidade
t14 – tempo de armazenagem de 14 dias
TM – Trás-os-Montes
Tp. Amb – Temperatura ambiente
Trolox – ácido (±)-6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromano-2-carboxílico
TS – Terras do Sado
UV – ultra-violeta
V - Volt
x
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Índice de Matérias
Agradecimentos..............................................................................iii
Resumo..........................................................................................v
Abstract........................................................................................vii
Lista de Abreviaturas e Simbologia.....................................................ix
Índice de Matérias...........................................................................xi
Índice de Figuras............................................................................xv
Índice de Quadros..........................................................................xix
1. Introdução..................................................................................1
1.1. Alimentação e saúde...............................................................3
1.2. Vinho....................................................................................7
1.2.1. Pressupostos que podem influenciar a capacidade antioxidante
do vinho...................................................................................9
1.2.2. Regiões vitivinícolas de Portugal........................................10
1.2.2.1. Trás-os-Montes.........................................................10
1.2.2.2. Douro.....................................................................11
1.2.2.3. Beiras.....................................................................11
1.2.2.4. Estremadura............................................................12
1.2.2.5. Ribatejo..................................................................12
1.2.2.6. Terras do Sado.........................................................13
1.2.2.7. Alentejo..................................................................13
1.2.2.8. Algarve...................................................................14
1.2.2.9. Açores....................................................................14
1.3. Cerveja...............................................................................15
1.4. Actividade antioxidante.........................................................16
2. Materiais e Métodos....................................................................19
2.1. Amostras.............................................................................21
2.1.1. Vinho............................................................................21
2.1.2. Cerveja.........................................................................21
2.1.3. Preparação das amostras.................................................21
2.2. Análise e caracterização das amostras.....................................21
2.2.1. Quantificação dos polifenóis totais.....................................21
xi
Índice de Matérias
2.2.1.1. Método de Folin-Ciocalteau.........................................22
2.2.2. Quantificação das antocianinas totais.................................22
2.2.2.1. Método do pH diferencial............................................22
2.2.3. Determinação da cor.......................................................25
2.2.4. Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com
detectores de díodos (DAD), de fluorescência (FD) e electroquímico
(ED)......................................................................................27
2.2.5. Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙).............28
2.2.5.1. Método de ORAC.......................................................29
2.2.6. Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (OH˙)..............29
2.2.6.1. Método de HORAC.....................................................29
2.2.7. Capacidade de inibição/retardação da oxidação da lipoproteína
de baixa densidade (LDL)..........................................................31
2.2.8. Estudo de envelhecimento das amostras............................31
3. Resultados e Discussão................................................................33
3.1. Vinho..................................................................................35
3.1.1. Caracterização das amostras............................................35
3.1.1.1. Quantificação dos polifenóis totais...............................35
3.1.1.2. Análise química das amostras (polifenóis).....................36
3.1.1.3. Quantificação das antocianinas totais...........................37
3.1.1.4. Cor dos vinhos.........................................................38
3.1.2. Avaliação da capacidade antioxidante................................40
3.1.2.1. Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)........40
3.1.2.2. Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙).........41
3.1.2.3. Detecção electroquímica (HPLC-ED).............................42
3.1.2.4.
Capacidade
de
inibição/retardação
da
oxidação
da
lipoproteína de baixa densidade (LDL).....................................43
3.1.3. Estudo do Envelhecimento...............................................44
3.1.3.1. Quantificação dos polifenóis totais...............................44
3.1.3.2. Quantificação das antocianinas totais...........................45
3.1.3.3. Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)........47
3.1.3.4. Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙).........48
3.1.4. Capacidade antioxidante..................................................49
xii
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
3.2. Cerveja...............................................................................50
3.2.1. Caracterização das amostras............................................50
3.2.1.1. Quantificação dos polifenóis totais...............................50
3.2.1.2. Quantificação das antocianinas totais...........................52
3.2.2. Avaliação da capacidade antioxidante................................52
3.2.2.1. Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)........52
3.2.2.2. Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙).........54
3.2.3. Estudo do envelhecimento...............................................54
3.2.3.1. Quantificação dos polifenóis totais...............................54
3.2.3.2. Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)........55
3.2.3.3. Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙).........56
3.2.4. Capacidade antioxidante..................................................56
4. Conclusão..................................................................................59
5. Perspectivas Futuras...................................................................63
6. Bibliografia................................................................................67
ANEXOS........................................................................................73
Anexo 1: Amostras analisadas (vinhos)..........................................75
Anexo 2: Polifenóis (vinhos).........................................................78
Anexo 3: Antocianinas (vinhos).....................................................79
Anexo 4: Capacidade antioxidante (vinhos).....................................80
Anexo 5: Amostras analisadas (cervejas)........................................82
Anexo 6: Polifenóis (cervejas).......................................................83
Anexo 7: Capacidade antioxidante (cervejas)..................................84
xiii
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Índice de Figuras
Figura 1.1: Nova Roda dos Alimentos (desde 2003)..............................4
Figura 1.2: Estrutura química de: A – Resveratrol; B – Quercetina;
C – Epicatequina; D – Epigalocatequina...............................................8
Figura 1.3: Regiões vitivinícolas de Portugal.......................................10
Figura 1.4: Estrutura química do xanto-humol....................................16
Figura 1.5: ROS.............................................................................17
Figura 1.6: Ataque de uma espécie reactiva de oxigénio a uma estrutura
lipídica..........................................................................................17
Figura 1.7: Actuação da SOD sobre ROS............................................18
Figura 2.1: Características dos espectros de antocianinas de rábano
purificadas (derivadas de pelargonidina-3-soforósido-5-glucósido acilada)
em tampões com pH = 1,0 e pH = 4,5..............................................23
Figura 2.2: Formas estruturais dominantes das antocianinas a diferentes
níveis de pH..................................................................................24
Figura 2.3: Esquema da reacção do peróxido de hidrogénio (H2O2) em
presença de iões metálicos (M)........................................................30
Figura 3.1: Representação gráfica da quantificação dos polifenóis totais
presentes nas amostras de vinho (método de Folin-Ciocalteau).............35
Figura 3.2: Cromatograma obtido por HPLC-DAD para identificação de
polifenóis......................................................................................36
Figura 3.3: Cromatograma obtido por HPLC-FD para identificação de
trans-resveratrol e trans-piceid........................................................37
Figura 3.4: Representação gráfica da quantificação das antocianinas totais
presentes nas amostras de vinho (método do pH diferencial)................38
Figura 3.5: Distribuição das amostras analisadas de acordo com o sistema
de cores CIELAB.............................................................................39
Figura 3.6: Representação gráfica da capacidade de resgate de radicais
peroxilo (método de ORAC) por parte dos compostos antioxidantes
presentes nas amostras de vinho......................................................40
Figura 3.7: Representação gráfica da capacidade de inibição de radicais
hidroxilo (método de HORAC) por parte dos compostos antioxidantes
presentes nas amostras de vinho......................................................41
Figura 3.8: Representação gráfica dum cromatograma obtido por HPLCED...............................................................................................42
Figura 3.9: Representação gráfica das áreas totais dos picos obtidos por
HPLC-ED para as diferentes amostras analisadas................................43
Figura 3.10: Representação gráfica da capacidade inibição/retardação da
oxidação de LDL das amostras Boa Memória e Periquita.......................44
xv
Índice de Figuras
Figura 3.11: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da
evolução dos polifenóis totais (método de Folin-Ciocalteau) presentes nas
amostras de vinho desde o momento da abertura até ao final do período
de armazenamento (14 dias)...........................................................45
Figura 3.12: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da
evolução das antocianinas totais (método do pH diferencial) presentes nas
amostras de vinho desde o momento da abertura até ao final do período
de armazenamento (14 dias)...........................................................46
Figura 3.13: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica evolução
da capacidade de resgate de radicais peroxilo (método de ORAC) por parte
dos compostos antioxidantes presentes nas amostras de vinho desde o
momento da abertura até ao final do período de armazenamento (14
dias)............................................................................................47
Figura 3.14: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da
evolução da capacidade de inibição de radicais hidroxilo (método de
HORAC) por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras
de vinho desde o momento da abertura até ao final do período de
armazenamento (14 dias)................................................................48
Figura 3.15: Representação gráfica da inter-relação de métodos utilizados
na determinação da capacidade antioxidante dos vinhos (ORAC, HORAC e
HPLC-ED) com a presença de polifenóis.............................................49
Figura 3.16: Representação gráfica da quantificação dos polifenóis totais
presentes nas amostras de cerveja (método de Folin-Ciocalteau)..........51
Figura 3.17: Representação gráfica da capacidade de resgate de radicais
peroxilo (método de ORAC) por parte dos compostos antioxidantes
presentes nas amostras de cerveja...................................................53
Figura 3.18: Representação gráfica da capacidade de inibição de radicais
hidroxilo (método de HORAC) por parte dos compostos antioxidantes
presentes nas amostras de cerveja...................................................54
Figura 3.19: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da
evolução dos polifenóis totais (método de Folin-Ciocalteau) presentes nas
amostras de cerveja desde o momento da abertura (0 horas) até ao final
do período de armazenamento (48 horas), a 4ºC................................55
Figura 3.20: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da
evolução da capacidade de resgate de radicais peroxilo (método de ORAC)
por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras de cerveja
desde o momento da abertura (0 horas) até ao final do período de
armazenamento (48 horas), a 4ºC....................................................55
Figura 3.21: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da
evolução da capacidade de inibição de radicais hidroxilo (método de
HORAC) por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras
de cerveja desde o momento da abertura (0 horas) até ao final do período
de armazenamento (48 horas), a 4ºC................................................56
Figura 3.22: Representação gráfica da inter-relação de métodos utilizados
na determinação da capacidade antioxidante das cervejas (ORAC e
xvi
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
HORAC) com a presença de polifenóis...............................................57
xvii
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Índice de Quadros
Quadro 2.1: Programa de eluentes usado na análise por HPLC-DAD.......28
Quadro 2.2: Programa de comprimentos de onda usado na análise por
HPLC-FL........................................................................................28
Quadro 3.1: Cor dos vinhos de acordo com o parâmetros CIELAB..........39
Quadro A.1: Amostras de vinho seleccionadas....................................75
Quadro A.2: Polifenóis totais presentes nas amostras de vinho..............78
Quadro A.3: Área total dos picos obtidos por HPLC-DAD (280 nm), traduzindo os polifenóis presentes nas amostras de vinho............................78
Quadro A.4: Antocianinas poliméricas totais presentes nas amostras de vinho..............................................................................................79
Quadro A.5: Área total dos picos obtidos por HPLC-DAD (527 nm), traduzindo as antocianinas presentes nas amostras de vinho.......................79
Quadro A.6: Capacidade de resgate de radicais peroxilo pelas amostras de
vinho............................................................................................80
Quadro A.7: Capacidade de inibição de radicais hidroxilo pelas amostras
de vinho.......................................................................................80
Quadro A.8: Área total dos picos obtidos por HPLC-ED, traduzindo a actividade electroquimica dos polifenóis presentes nas amostras de vinho......81
Quadro A.9: Amostras de cerveja seleccionadas..................................82
Quadro A.10: Polifenóis totais presentes nas amostras de cerveja.........83
Quadro A.11: Capacidade de resgate de radicais peroxilo pelas amostras
de cerveja.....................................................................................84
Quadro A.12: Capacidade de inibição de radicais hidroxilo pelas amostras
de cerveja.....................................................................................84
xix
1. Introdução
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
1.1.
Alimentação e saúde
Uma alimentação equilibrada é um dos princípios básicos para uma vida
saudável. Comer saudavelmente contribui para o bem-estar e ajuda a
prevenir doenças crónico-degenerativas [1].
Uma alimentação adequada obtém-se pelo equilíbrio entre as porções
ingeridas de cada um dos grupos de alimentos sugeridos pela Roda dos
Alimentos (fig. 1.1) bem como pelo modo de confeccionar os alimentos,
devendo este ser variado de modo a que os torne saborosos mas sem
grande adição de sal ou gordura, por forma a conservar o sabor próprio de
cada alimento e a proporcionar uma digestão fácil [2].
A dieta mediterrânica é, por excelência, um contributo para uma
alimentação saudável, já que privilegia os ingredientes da época, o peixe,
a fruta e os legumes na alimentação diária, bem como o tempero baseado
no azeite em moderação que substitui molhos condimentados e altamente
calóricos. O consumo de carnes vermelhas é moderado e a sua confecção
respeita as exigências de um estilo de vida equilibrado, pelo que é sempre
uma boa opção cumprir estes requisitos.
Para os adultos, um copo de vinho tinto à temperatura ambiente é uma
boa combinação com um prato mediterrânico; as crianças, por seu lado,
deverão adquirir o hábito de beber água e de deixar os sumos para os intervalos das refeições. Beber um chá morno ou um café facilita a digestão
e ajuda a beneficiar de todas as propriedades da dieta mediterrânica.
Os alimentos devem ser distribuídos por cinco a seis refeições, de
pequeno volume tendo em conta a variedade e não repetitividade de
nutrientes.
O
valor
energético
ingerido
deve
ser
adequado
às
características biológicas, às necessidades das fases sucessivas do ciclo de
vida e à actividade física praticada pelo indivíduo diariamente, sendo
importante adequar as refeições à época do ano, pois, se por um lado se
aproveita os ingredientes naturais, por outro, está-se a partir do
pressuposto de que, em cada fase do ano, consoante a temperatura que
se faça sentir, vão sendo diferentes as necessidades do nosso organismo.
3
Introdução
O grupo dos cereais e tubérculos, fornecedor de glúcidos, é o que mais
deve contribuir para o total calórico ingerido. São ricos em vitaminas do
complexo B, ferro e fibras, devendo ser dada preferência aos integrais,
pois os cereais pouco refinados são ricos em fibras, melhorando a função
intestinal [3].
Figura 1.1: Nova Roda dos Alimentos (desde
2003).
Constituída por sete grupos distintos: cereais e
derivados
e
tubérculos
(28%);
produtos
hortícolas (23%); frutos (20%); lacticínios
(18%);
carne,
pescado
e
ovos
(5%);
leguminosas (4%) e gorduras e óleos (2%).
Fonte: Portal do consumidor [4]
O grupo dos hortícolas é rico em vitaminas, minerais e fibras; pobre em
calorias e gorduras. Deve estar presente em abundância em duas
refeições, ou na sopa ou como acompanhamento do prato; a sopa de
legumes com adição de leguminosas deve ser o prato principal e/ou único
numa das refeições. Quando se está a controlar o peso, estes alimentos
podem dar uma contribuição importante [3]. Os brócolos, por exemplo,
têm um baixo valor energético, bem como um baixo teor de proteínas,
hidratos de carbono e lípidos. Têm um teor moderado de fibra alimentar e
são ricos em carotenos (pró-vitamina A), vitamina C e ácido fólico.
4
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Relativamente aos minerais, são ricos em potássio, cálcio e fósforo. O
sulforafano presente nos brócolos é um fitonutriente, que potencia a acção
de enzimas responsáveis pela eliminação de agressores ao organismo,
ajudando na prevenção de doenças cardiovasculares e do cancro, como o
cancro do cólon e do estômago; a cebola regula a pressão arterial e
previne doenças cardiovasculares. Tem flavonóides que funcionam como
antioxidantes. É uma alimento que ajuda a regular o metabolismo das
gorduras; o alho, "o antibiótico natural", combate muitas infecções, ajuda
a reduzir o colesterol (LDL), protege o coração e favorece a circulação.
Hoje em dia também se lhe reconhece outras propriedades como o seu
efeito antioxidante [5].
A fruta deve ser variada ao longo do dia, sendo três peças diárias
suficientes para a maioria dos indivíduos. O tomate é um dos fruto mais
ricos em substâncias protectoras e antioxidantes, ideal para evitar
doenças cardiovasculares e cancro da próstata. Ao seu baixo valor calórico
associam-se valores baixos de gordura, de proteínas e de glícidos. Como
em qualquer vegetal o colesterol está ausente. A maçã, sendo altamente
nutritiva e digestiva, tem uma elevada percentagem em vitaminas A, B e
C, sais minerais, água e fibras. Protege a pele e ajuda a prevenir o cancro
do fígado [5].
Os lacticínios são um grupo fundamental durante toda a fase de
crescimento. São excelentes fontes de proteínas, vitaminas, cálcio e
magnésio. No entanto, é importante não esquecer que os lacticínios são
fontes de gorduras saturadas, pelo que deve ser dada preferência aos
meio-gordos ou mesmo aos magros [3]. O leite e derivados são também
ricos em proteínas, indispensáveis para a formação e reparação do nosso
organismo [5].
Do grupo do pescado, da carne e dos ovos é suficiente uma pequena
porção, bastando a uma das refeições. Para além de serem ricos em
proteínas, os alimentos deste grupo são bons fornecedores de vitaminas,
ferro, iodo e selénio. Tal como nos lacticínios, as gorduras presentes
principalmente na carne e na gema do ovo, são saturadas, sendo
5
Introdução
igualmente uma fonte de colesterol [3]. O consumo de peixes gordos
previne alguns tipos de doenças cardiovasculares, por conter uma elevada
quantidade de ácidos gordos essenciais do tipo ómega 3 (gordura
polinsaturada) na sua composição nutricional. Destaca-se a sardinha, o
salmão, a cavala e o sável. Estes ajudam a baixar os níveis de colesterol
LDL, elevar os níveis de colesterol HDL, intervindo, ainda, na tensão
arterial, na coagulação sanguínea, na resposta imune e nas reacções
inflamatórias [5].
Os lípidos são fornecedores de energia ricos em vitaminas A, D e E. As
gorduras de origem vegetal, para além de fornercerem ácidos gordos
essenciais, são polinsaturadas, devendo ser preferidas em relação às de
origem animal [3].
A água, fonte de vida, representa cerca de 70% da massa corporal e é
indispensável a todas as funções do organismo. Deve ser ingerida em
quantidades superiores a 1,5 L por dia. Uma forma fácil de reforçar a sua
ingestão diária passa por comer muita fruta e legumes, sobretudo
melancia (constituída por água em 98%), pepino (96%) e alface (94%)
[5].
O consumo abusivo de bebidas alcoólicas, de alimentos engordurados
ou açucarados, e a escassez de consumo de hortícolas, frutos e mesmo de
leite e seus derivados são alguns dos principais erros na alimentação dos
portugueses. Por outro lado, o grande volume de comida ingerido às
poucas refeições que são feitas leva a um desequilíbrio nutricional e
metabólico do organismo [1].
Deve ser dada a preferência a alimentos naturais, naturalmente ricos
em nutrimentos reguladores como as vitaminas, os sais minerais e as
fibras. Os nutrimentos adicionados aos alimentos processados, com o
objectivo de os enriquecer, são menos aproveitados do que os que se
encontram nos alimentos naturais e essenciais [1].
6
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
1.2.
Vinho
A produção de vinhos tem uma dimensão global, não se limitando às
fronteiras europeias; hoje em dia é possível apreciar bons vinhos oriundos
de países como o Chile, o Brasil, os EUA (Califórnia) ou o Canadá (Colômbia Britânica), por exemplo. Com a diversificação dos pontos de produção,
cresce também a oferta, ou seja, aumenta a concorrência entre produtores. Este aumento implica que se tenha de descobrir novas vias de
valorização do produto final por forma a se conquistar o mercado: o estudo de eventuais proveitos para a saúde humana devidos ao consumo de
vinho, nomeadamente pela presença de determinados compostos com
propriedades reconhecidamente benéficas, é uma dessas vias, havendo, a
nível internacional, múltiplos estudos nesse sentido.
Na verdade, num passado recente, as preocupações relativas às consequências para a saúde humana resultantes do consumo de bebidas
alcoólicas, nomeadamente vinho e cerveja, estavam centradas no efeito
tóxico do álcool. De algum tempo a esta parte, no entanto, têm sido vários os estudos que, pelo contrário, visam estabelecer uma ponte entre o
consumo moderado de vinho e cerveja e o seu efeito benéfico para a saúde. Em Portugal, apesar de haver um esforço crescente na valorização de
produtos nacionais através de melhorias tecnológicas dos processos de fabrico (ex.: queijos [6, 7], bagaceira de vinho verde [8], pão de milho [9])
ou através da investigação de benefícios para a saúde associados ao seu
consumo (ex.: uvas e azeitonas [10]), não existe um estudo que, por forma a criar uma mais valia para os vinhos, estabeleça uma relação entre as
suas características antioxidantes, e eventuais benefícios para a saúde resultantes do seu consumo, com a sua origem de produção.
É sabido que o consumo de vinho, sobretudo o tinto, tem influência na
redução do risco de ocorrência de doenças cardiovasculares (designadamente por aumento do colesterol HDL, redução da relação ómega6/ómega-3, redução da coagulação sanguínea ou aumento da fibrinólise),
na diminuição do risco de desenvolvimento de doenças cancerígenas [11],
na acção anti-inflamatória [12], na actividade anti-microbiana [13], no
7
Introdução
controlo do peso [14], na protecção renal [15], na acção neuroprotectora
[16], entre outras.
Os efeitos benéficos associados ao consumo de vinho podem ser atribuídos a variados compostos, sendo que, no entanto, é aos polifenóis que se
atribui a maioria desses efeitos [17, 18] devido à sua elevada capacidade
antioxidante. Entre estes destaca-se o resveratrol (fitoestrogénio), a quercetina, o canferol e a catequina (flavonóides) (fig. 1.2), os quais estão
envolvidos nos processos de prevenção contra a ocorrência de doenças
cardiovasculares. Os compostos que mais têm sido estudados no que se
refere ao seu envolvimento no combate a doenças cancerígenas são o resveratrol e a quercetina [19]. A sua acção resulta na diminuição da
iniciação/promoção de tumores, na antimutagénese [12] e na antiangiogénese [19]. O controlo de peso é atribuído à acção da catequina e da
epigalocatequina [14].
A
B
C
D
Figura
1.2:
Estrutura
química
de:
C – Epicatequina; D – Epigalocatequina.
A – Resveratrol;
B – Quercetina;
Fonte: Wikipédia [20]
Devido à relevância dos polifenóis em termos de capacidade antioxidante, têm sido vários os trabalhos realizados com o objectivo de determinar
8
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
o conteúdo fenólico nos vinhos bem como a sua capacidade antioxidante
total [17, 18, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27].
Em Portugal, têm sido realizados alguns estudos que visam determinar
a capacidade antioxidante dos vinhos nacionais e/ou o seu teor em polifenóis. Bravo et al. (2006) [28] determinaram a composição fenólica de
vinhos Moscatel. Numa cooperação luso-galaica, Castillo-Sánchez et al.
(2008) [29] analisaram a influência do processo de fabrico na composição
fenólica de vinhos Vinhão. Um trabalho semelhante, mas realizado com a
casta Castelão, foi desenvolvido por Spranger et al. (2004) [30].
No entanto, em nenhum outro estudo, como neste agora apresentado,
se recorreu a uma amostragem de âmbito nacional a partir da qual se tentará, se possível, estabelecer uma relação entre as características
edafoclimáticas, processos de fabrico e castas com o teor em polifenóis e
a capacidade antioxidante dos vinhos.
1.2.1. Pressupostos que podem influenciar a capacidade antioxidante do vinho
Os compostos activos com poder antioxidante são, geralmente, produzidos pelas plantas como reacção a agressões por parte do ambiente
envolvente, sejam essas agressões provocadas por outros seres vivos, pelas
características
do
solo
ou
por
características
climáticas.
Por
conseguinte, é natural que o teor em antioxidantes naturais presente em
produtos de regiões tão distintas como os Açores ou o Alentejo, por exemplo, não seja exactamente igual, podendo essa variação também estar
associada à utilização de diferentes matérias-primas, ou seja, diferentes
castas.
O processamento do vinho é outro factor que pode influenciar o nível de
polifenóis e, por conseguinte, a sua capacidade antioxidante. O recurso a
diferentes tecnologias pode resultar em diferentes produtos finais, mesmo
que partindo da mesma matéria-prima. Por exemplo, Spranger et al.
(2004) [30] concluíram que recorrendo à maceração carbónica (fermentação intracelular) se obtém uma composição polifenólica e volátil inferior
quando comparada com a obtida por recurso à fermentação tradicional.
9
Introdução
1.2.2.
Regiões vitivinícolas de Portugal
A produção de vinho em Portugal está distribuída por 10 regiões vitivinícolas tal como mostra a figura 1.3, variando a produção anual total entre
os 5,5 e os 7,5 milhões de hL, de acordo com o Instituto Nacional Estatística.
Figura 1.3: Regiões vitivinícolas de Portugal.
Fonte: Instituto da Vinha e do Vinho [31]
1.2.2.1.
Trás-os-Montes
Já durante a ocupação romana se cultivava a vinha e se fazia vinho nesta região. Na generalidade, os vinhos da região de Trás-os-Montes são
bastante diferenciados, segundo os microclimas a que estão sujeitos (altitude, exposição solar, continentalidade, pluviosidade, temperatura, etc.),
apresentando características de qualidade dignas de menção. Está dividida
em 3 sub-regiões: sub-região de Chaves, sub-região de Valpaços e
sub-região do Planalto Mirandês. Os solos são predominantemente xistosos, aparecendo porém, algumas manchas graníticas e, numa pequena
10
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
área, manchas calcárias, de gnaisses e aluvião. São, de uma maneira geral, solos ricos em potassa mas pobres em cal e ácido fosfórico [31].
1.2.2.2.
Douro
A região vinhateira do Douro estende-se ao longo das íngremes encostas do rio Douro e afluentes. A região está protegida dos ventos atlânticos
pelas serras do Marão e de Montemuro, tendo um clima continental, com
verões quentes e secos e invernos frios.
Divide-se em 3 sub-regiões, de oeste para leste:
•
Baixo Corgo – a sub-região com o clima mais ameno e com mais
precipitação. Tem
14.000 hectares de vinhas. Embora seja a sub-
região que primeiro foi plantada, é considerada, em geral, a que fornece vinhos de qualidade inferior dentro da região.
•
Cima Corgo – é a maior sub-região com 19.000 hectares de vinhas
localizadas em torno de Pinhão; é onde são produzidas as marcas
mais afamadas.
•
Douro Superior – é a mais quente e seca das 3 sub-regiões, seguindo até à fronteira com Espanha. Tem 8.700 hectares de vinhas e é a
fonte de muitos vinhos de muito boa qualidade. Uma vez que é a
menos acessível das 3 sub-regiões, é a que foi mais recentemente
plantada, estando ainda em expansão.
As vinhas dedicadas ao Vinho do Porto são geralmente plantadas em
xisto enquanto que solos à base de granito são usados na produção de vinho de mesa [31].
1.2.2.3.
Beiras
A produção de vinhos na região das Beiras remonta ao tempo dos romanos, fazendo disso prova os diversos lagares talhados nas rochas
graníticas (lagares antropomórficos), onde na época o vinho era produzi11
Introdução
do. A sua qualidade foi sendo alvo de destaque ao longo da nossa história.
Esta região estende-se, no sentido longitudinal, desde o Oceano Atlântico até Espanha, fazendo fronteira a norte com o Minho e as Terras
Durienses e a sul com a Alta Estremadura, o Ribatejo e o Alentejo. Como
tal, apresenta uma grande diversidade de condições ambientais.
Factores como a maior ou menor proximidade do oceano Atlântico, a influência dos vários acidentes orográficos nas condições climáticas ou,
ainda, as diferenças de solos existentes, determinam que os vinhos produzidos nesta região apresentem características bem diferenciadas que
justificam o reconhecimento de três sub-regiões para a produção de vinho
regional: "Beira Litoral", "Beira Alta" e "Terras de Sicó" [31].
1.2.2.4.
Estremadura
A Estremadura é, a nível nacional, a região com maior produção de vinho e área de vinha. O relevo, não muito elevado mas sempre presente,
estabelece a separação da parte ribatejana, de terrenos mais baixos, na linha onde o Secundário se diferencia do Terciário e Quaternário, pela
cadeia de Montejunto e Candeeiros. Salvo a sul, onde aparecem alguns
estratos de basalto e de granito, a região assenta, na sua quase totalidade, em formações secundárias de argilo-calcários e argilo-arenosos. O
clima é temperado, sem grandes amplitudes térmicas, situando-se a queda pluviométrica anual entre os 600-700 mm.
O Vinho Regional Estremadura atinge, hoje em dia, uma quota de mercado significativa a nível nacional. De destacar também a produção de
Vinho Leve, com características bastante próprias, que o tornam muito
apreciado, o Vinho Licoroso com a indicação geográfica Estremadura, de
grande tradição, e ainda o vinho tinto palhete produzido na região de Ourém, com a designação complementar "Palhete de Ourém". Dentro da sua
área geográfica está reconhecida a sub-região "Alta Estremadura" [31].
1.2.2.5.
Ribatejo
Ao percorrer o Ribatejo e atendendo à sua paisagem, distinguem-se de
imediato três regiões de características completamente diferenciadas, de12
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
signadas por "lezíria", "bairro" e "charneca". A "lezíria", corresponde à planície, inundável pelo rio Tejo e compreende solos de aluvião, de óptima
qualidade, ostentando aqui a vinha todo o seu vigor; o "bairro", que se
estende na margem direita do Tejo, surge com um relevo pouco acentuado, de formações arenosas, calcárias e argilosas, que lhe conferem
tonalidades variadas; a "charneca", apresentando solos mais pobres, ocupa a margem esquerda do Tejo. O clima ribatejano é sul-mediterrânico
temperado, dada a proximidade do rio que o percorre, com uma queda
pluviométrica anual de cerca de 500-600 mm.
Os vinhos produzidos nesta região possuem características bem marcadas e diferenciadas que os tornam bastante apreciados e que justificam a
fama que os tem acompanhado desde tempos remotos [31].
1.2.2.6.
Terras do Sado
Esta região, especialmente famosa pela produção do apreciado Moscatel
de Setúbal, apresenta, no entanto, uma longa tradição na produção de vinhos que remonta ao tempo dos Fenícios e dos Gregos e que foi evoluindo
até aos nossos dias.
Compreende todo o distrito de Setúbal. As vinhas encontram-se instaladas em solos muito diversificados, que vão desde os solos calcários aos
mediterrânicos derivados de arenitos, argilas, argilitos e xistos, a solos litólicos não-húmicos, a solos podzolizados, ou, ainda, a regossolos
psamíticos. O clima é misto, sub-tropical e mediterrânico, com fracas amplitudes térmicas e um índice pluviométrico que se situa entre os
500-700 mm, características que lhe são conferidas pela proximidade do
mar, pela bacia hidrográfica do Sado, e pela orografia da região.
As condições edafoclimáticas da região e a tipicidade das castas utilizadas influenciam de forma determinante os atributos de qualidade deste
vinho regional [31].
1.2.2.7.
Alentejo
A imensidão de horizontes planos, ou quase planos, aliada à sua meridionalidade,
oferecem
ao
Alentejo
características
Mediterrâneas
e
13
Introdução
Continentais. A insolação tem valores bastante elevados, o que se reflecte
na maturação das uvas, principalmente nos meses que antecedem as vindimas, conferindo-lhes uma perfeita acumulação de açúcares e de
matérias corantes na película dos bagos. As vinhas localizam-se, na sua
maioria, em substrato geológico de rochas plutónicas (granitos, tonalitos,
sienitos e sienitos nefelínicos) sendo contudo de salientar, a diversidade
de manchas pedológicas nas quais as vinhas são instaladas (nomeadamente manchas xistosas e argilo-calcárias). É igualmente de referir que os
melhores terrenos são eleitos para a cultura cerealífera e a exploração
agro-pecuária, pelo que a vinha e a oliveira, dada a sua rusticidade, assentam nos solos com fraca capacidade de uso.
Satisfazendo os requisitos de qualidade e de tipicidade conformes com a
tradição do vinho desta região, o Vinho Regional Alentejano apresenta características próprias, sendo muito apreciado [31].
1.2.2.8.
Algarve
No extremo sul de Portugal Continental, o Algarve é uma região bem
definida, um compartimento com feições características, que lhe são conferidas pela proximidade do mar, clima, vegetação natural e cultura
marcada pela longa ocupação árabe. A localização meridional e a protecção assegurada pela barreira montanhosa, contra os ventos frios do norte,
aliada à exposição em anfiteatro virado ao sul, fazem com que o clima
seja acentuadamente mediterrânico: quente, seco, pouco ventoso, reduzidas amplitudes térmicas e uma média de insolação acima das 3 000 horas
por ano.
Para além do Vinho Regional Algarve produz-se também nesta região
um vinho licoroso, de grande tradição, com a indicação geográfica Algarve
[31].
1.2.2.9.
Açores
A cultura da vinha nas Ilhas Terceira, Pico e Graciosa, que fazem parte
do Arquipélago dos Açores, remontam à época do seu povoamento em
meados do Séc. XV, pensando-se terem sido os frades franciscanos os responsáveis pela introdução do plantio da vinha nas referidas Ilhas.
14
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
De acordo com alguns autores, desde muito cedo estes religiosos constataram semelhanças entre as condições edafoclimáticas da Sicília e as de
algumas Ilhas deste Arquipélago, ao trazerem de Itália a variedade então
mais conhecida – o Verdelho (antigo Verdecchio) – que se expandiu rapidamente.
Os vinhos então produzidos tornaram-se famosos. Em 1917 foram encontradas garrafas de Vinho do Pico armazenadas nas caves dos antigos
czares da Rússia.
Com vista à defesa da qualidade destes vinhos, foram reconhecidas em
1994, através de Diploma Legal, as Indicações de Proveniência Regulamentada (IPR) “Pico”, “Biscoitos” e “Graciosa”.
Reconhecida a tipicidade própria para a produção de vinhos de qualidade, associada a uma evolução tecnológica verificada nos últimos anos, foi
estabelecida a designação “Vinho Regional” seguida da Indicação Geográfica Açores para os vinhos de mesa tinto e branco, produzidos em todo o
Arquipélago, de acordo com as condições fixadas na Portaria N.º
853/2004, publicada em 19 de Julho [31].
1.3.
Cerveja
Tal como se sucede com os vinhos, os benefícios associados ao consumo de cerveja estão relacionados, sobretudo, com a ingestão de
polifenóis, sendo que os fornecidos pelo lúpulo (20% a 30%) têm sido os
mais estudados em termos de bioactividade, embora a maioria dos polifenóis presentes na cerveja tenha origem no malte (70% a 80%). Este
maior interesse pelos polifenóis do lúpulo levou mesmo à realização de estudos tendo por objectivo aumentar o rendimento de extracção destes
compostos aquando do fabrico de cerveja [32]. Entre os benefícios para a
saúde atribuídos ao consumo de cerveja destaca-se a actividade quimiopreventiva do cancro, o tratamento de osteoporose e afrontamentos
pós-menopausa, a actividade antioxidante, a inibição de aterosclerose, a
inibição da síntese de triglicéridos, a inibição da angiogénese e a actividade antiviral [33, 34, 35, 36, 37, 38, 39].
15
Introdução
São vários os estudos que apresentam dados concretos quanto à actividade anti-cancerígena de compostos presentes na cerveja, verificando-se
resultados positivos para a acção do xanto-humol (fig. ), do isoxanto-humol e da naringerina. A actividade quimiopreventiva foi verificada com a
inibição das fases cancerígenas de iniciação, latência e progressão [33]. A
actividade antioxidante foi verificada principalmente para o xanto-humol;
sendo extremamente elevada, supera mesmo a do α-tocoferol e a da isoflavona genisteína [34].
Actualmente, a produção anual total de cerveja em Portugal varia entre
os 7,5 e os 8,5 milhões de hL, de acordo com o Instituto Nacional de Estatística.
Figura 1.4: Estrutura
xanto-humol.
química
do
Fonte: Barth-Haas Group [40]
1.4.
Actividade antioxidante
O stress oxidativo, resultante da formação e acção das espécies reactivas de oxigénio (ROS - Reactive Oxygen Species), está relacionado com o
processo de envelhecimento celular assim como com o aparecimento de
várias doenças degenerativas e inflamatórias como o cancro, doenças cardiovasculares, diabetes, e doenças neuronais (Alzheimer e doenças
relacionadas) [41].
As ROS são produzidas essencialmente a nível celular, surgindo durante
o próprio metabolismo da célula (respiração aeróbia). Também a exposição a determinados agentes agressores externos, como é o caso da
16
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
poluição ambiental, o fumo do tabaco, toxinas, radiações, etc., pode conduzir à acumulação de radicais livres no organismo [42].
As principais ROS (fig. 1.5), que geralmente reagem com as macromoléculas biológicas (proteínas, lípidos e ADN) (fig. 1.6), são: anião
superóxido (O2˙-), peróxido de hidrogénio (H2O2) radical hidroxilo (OH˙),
radical peroxilo (ROO˙ e singuleto de oxigénio (1O2) [42].
Figura 1.5: ROS.
Fonte: Universidade do Colorado [42]
Figura 1.6: Ataque de uma espécie reactiva de oxigénio a
uma estrutura lipídica.
Fonte: Universidade do Colorado [42]
O consumo de antioxidantes naturais provenientes de uma dieta rica
tem sido relacionado com a prevenção de doenças relacionadas com o
stress oxidativo celular. A sua acção sobre a diminuição do stress oxidativo
é realizada através de uma série de mecanismos, nomeadamente o resga17
Introdução
te das ROS, complexação de iões metálicos, e modelação de uma resposta
celular [42].
Figura 1.7: Actuação da SOD sobre ROS.
Fonte: Universidade do Colorado [42]
18
2. Materiais e Métodos
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
2.1.
2.1.1.
Amostras
Vinho
Existem em Portugal 11 regiões vitivinícolas, sendo que neste trabalho
foram seleccionadas 18 amostras de 9 dessas regiões, de acordo com a
quadro A.1 do Anexo 1.
2.1.2.
Cerveja
As amostras de cerveja foram seleccionadas de entre as marcas de maior expressão em Portugal, havendo amostras de cerveja branca e preta,
com álcool e sem álcool, e de “receita artesanal”, como mostra a quadro
A.9 do Anexo 5.
2.1.3.
Preparação das amostras
As amostras de vinho foram recolhidas e filtradas com papel de filtro
com poros de 10-13 μm, de modo a remover eventuais partículas suspensas que pudessem estar presentes. Em seguida, foram armazenadas em
alíquotas de 500 μL, a -20ºC. Com o armazenamento a temperatura pretendeu-se
desacelerar
o
processo
de
oxidação
das
amostras,
preservando-se, deste modo, as suas características originais.
As amostras de cerveja foram recolhidas e desgaseificadas com ultra-sons, seguindo-se uma centrifugação a 3000 rpm, durante 5 minutos.
Tal como aconteceu com as amostras de vinho, as amostra de cerveja foram armazenadas em alíquotas de 500 μL, a -20ºC, para estudos
posteriores.
2.2.
2.2.1.
Análise e caracterização das amostras
Quantificação dos polifenóis totais
Os polifenóis são elementos importantes em enologia, estando presentes nas uvas, nos mostos e nos vinhos em quantidades abundantes.
As características organolépticas dos vinhos são influenciadas pelos polifenóis ao nível da intensidade e tonalidade da cor, das características
sápidas, da adstringência e “dureza”, do aroma, da evolução e maturação
21
Materiais e Métodos
dos vinhos ao longo do envelhecimento [43].
A quantidade total de compostos fenólicos foi determinada pelo método
de Folin-Ciocalteau [44].
2.2.1.1.
Método de Folin- Ciocalteau
Este método baseia-se na capacidade dos compostos fenólicos presentes na amostra reduzirem o reagente de Folin-Ciocalteu (composto por
molibdato e tungstato) em condições básicas. Os compostos fenólicos são
fortemente oxidados em meio básico, resultando na libertação de O2˙-;
este, por sua vez, vai reagir com o molibdato, formando óxido de molibdénio, MoO4+, o qual apresenta uma intensa absorvância a 765 nm.
À amostra, diluída em água destilada, adicionou-se reagente de Folin-Ciocalteu.
Em
seguida,
adicionou-se
uma
solução
saturada
de
carbonato de cálcio. A mistura foi aquecida a 40ºC durante 30 min. e, ao
final deste tempo de espera, mediu-se a absorvância da solução resultante num espectrofotómetro (Thermo Spectronic, Genesys 10 UV), a
765 nm.
Os resultados finais são expressos em equivalentes de ácido gálico (mg
EAG/L) – composto escolhido para a obtenção da recta de calibração. A
recta de calibração foi feita a cada dia de ensaio.
O reagente de Folin foi adquirido à Panreac (Espanha). Método com um
erro associado de 2%.
2.2.2.
Quantificação das antocianinas totais
A quantificação das antocianinas totais foi efectuada de acordo com o
método do pH diferencial descrito por Lee et al. (2005) [45].
2.2.2.1.
Método do pH diferencial
O método do pH diferencial permite medir com rapidez e precisão o total
de
antocianinas,
mesmo
quando
na
presença
de
pigmentos
polimerizados e de outros compostos interferentes.
O método tem por base alterações estruturais reversíveis que ocorrem
nas antocianinas quando estas são sujeitas a variações de pH; uma das
22
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
consequências destas alterações estruturais é a existência de espectros de
absorvância distintos (figura 2.1). A pH = 1,0 a forma predominante é o
oxónio colorido e a pH = 4,5 a forma predominante é o hemicetal incolor
(figura 2.2).
Começou-se por determinar o factor de diluição apropriado a cada uma
das amostras de modo a que as respectivas absorvâncias ficassem compreendidas
entre
a
região
linear
do
espectrofotómetro
(Thermo
Spectronic, Genesys 10 UV) ao λvis-max considerado (520 nm) – correspondente ao λvis-max da malvidina-3-glucósido. As diluições foram efectuadas
em tampão de cloreto de fosfato, pH = 1,0, sendo que a percentagem da
amostra na solução final não pôde exceder os 20%, pois, caso contrário, a
capacidade do tampão seria excedida.
Figura 2.1: Características dos espectros de antocianinas de rábano purificadas
(derivadas de pelargonidina-3-soforósido-5-glucósido acilada) em tampões com pH = 1,0
e pH = 4,5.
Fonte: Lee et al. (2005) [45].
Com os factores de diluição determinados, foram preparadas diluições
das amostras tanto em tampão de cloreto de fosfato, pH = 1,0, como em
tampão de acetato de sódio, pH = 4,5, deixado-se estabilizar as soluções
por um período de 15 minutos; em seguida procede-se à leitura das absorvâncias a λ520 nm e a λ700 nm. O registo da absorvância a um comprimento
23
Materiais e Métodos
de onda de 700 nm permite eliminar desvios na leitura provocados pela
eventual presença de materiais coloidais; a este comprimento de onda
não existe absorvância por parte das antocianinas (figura 2.1).
Figura 2.2: Formas estruturais dominantes das antocianinas a diferentes níveis de pH.
Fonte: Lee et al. (2005) [45]
O cálculo da concentração das antocianinas, expressa em equivalentes
de malvidina-3-glucósido, é feito do seguinte modo:
[ Antocianinas totais ] mg/L =
A×MM×FD×103
, onde
ε ×d
A = (A520 nm - A700 nm)pH 1,0 - (A520 nm - A700 nm)pH 4,5;
MM = 510,5 g.mol-1 (massa molar da malvidina-3-glucósido);
FD = factor de diluição;
103 = factor de conversão de g para mg;
d = percurso óptico;
24
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
-1
ε = 26900 L.mol .cm-1 (coeficiente de absortividade molar da malvidina-3-glucósido).
Método com erro associado de 4%.
2.2.3.
Determinação da cor
Sudraud (1958) [46] estudou profundamente a absorção de vinhos
tintos na gama de comprimentos de onda da zona visível, designadamente
em função do seu envelhecimento, principal factor responsável pelas
variações de cor; o máximo de absorção a 520 nm, característico dos
vinhos novos, e devido à sua composição antociânica, vai-se atenuando
no decurso do processo de envelhecimento; por outrolado, a aborção a
420 nm, a que corresponde um mínimo nos vinhos novos, aumenta com o
envelhecimento. Estes factos, hoje bem conhecidos, interpretam de uma
forma satisfatória a evolução da cor dos vinhos tintos, e constituem a
base dos métodos mais vulgarmente empregues para a avaliação da sua
cor [43].
Sudraud
(1958)
[46]
definiu
assim
as
principais
características
cromáticas dos vinhos tintos e rosados, com base em dois índices, obtidos
a
partir
das
absorvâncias
a
420 nm
e
520 nm:
a
intensidade
I = A420 + A520 e a tonalidade (nuance) T = A420 / A520.
O método actual consiste no cálculo do índices de Sudraud, tendo sido
adoptada uma nova definição para a intensidade: I = A420 + A520 + A620. De
facto, para vinhos tintos jovens com valores elevados de pH, é
significativa a absorvância a 620 nm, característica da coloração violácea
destes vinhos [43, 47].
Para a determinação das absorvâncias, os vinhos não podem ser
diluídos, não havendo proporcionalidade entre o factor de diluição e a
absorvância [43, 48]. Desta forma, o percurso óptico deve ser escolhido
para que as absorvâncias sejam medidas com precisão, isto é, devendo
estar compreendidas entre 0,3 e 0,7. Para vinhos tintos, dever-se-á
utilizar um percurso óptico de 0,1 cm e para os vinhos rosados, de 0,5 cm
ou 1,0 cm. Contudo, os valores deverão ser sempre referidos a 1 cm [43].
25
Materiais e Métodos
Se o vinho se encontrar turvo, clarificá-lo por centrifugação; se contiver
quantidades notáveis de CO2, eliminá-las com agitação sob vácuo.
As absorvâncias são medidas a 420 nm, 520 nm e 620 nm, utilizando
células com um percurso óptico adequado às amostras, utilizando água
como branco. As absorvâncias obtidas (Ad420, Ad520 e Ad620) são divididas
pelo percurso óptico (d) por forma a ficarem referentes a 1 cm. Assim:
A420 = Ad420/d, A520 = Ad520/d e A620 = Ad620/d.
Este método agora descrito tem sido a referência do OIV (Office
International de la Vigne et du Vin) desde 1990 [49]. No entanto, já em
1986,
a
Comissão
Internacional
de
Iluminação
(CIE – Comission
International d'Eclairage) [50] adoptara um novo modelo baseado num
sistema anteriormente estabelecido por Hunter (1942) designado por L, a,
b. Os valores das cores obtidos por este método são mais exactos e
apresentam um menor desvio relativamente ao método de referência do
OIV [51].
Este modelo tem por base a estruturação da cor em 3 eixos: o eixo
vertical L* e os eixos horizontais a* e b*. L* representa a luminosidade
(lightness), variando os valores entre 0 (preto) e 100 (branco). Os eixos
das cores baseiam-se no facto de uma cor não poder ser simultaneamente
vermelha e verde ou azul e amarela, uma vez que as cores se opõem
entre si. Em cada eixo, os valores variam entre o positivo o negativo. No
eixo a-a', valores positivos indicam cor vermelha, enquanto que valores
negativos indicam cor verde. No eixo b-b', o amarelo é positivo e o azul é
negativo. Em ambos os eixos, o zero indica cinzento neutro. [52].
Pérez-Magariño e González-Sanjosé (2002) [51] estabeleceram uma
relação entre o método de referência do OIV e o modelo CIELAB, da qual
resultaranm as seguintes equações:
a*=-11,666+52,425*(A520)^0,5;
b*=-0,711+91,194*A420-41,672*A520-54,220;
26
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
h*=-53,777+86,298*(A420/A520);
L*=exp(4,611-0,70*A520);
C*=-9,81+52,16*(A520)^0,5.
2.2.4. Análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
com detectores de díodos (DAD), de fluorescência (FD) e
electroquímico (ED)
A análise foi efectuada com equipamento Thermo Finnigan Surveyor
equipado com três detectores em série: detector de díodos (Thermo Finnigan Surveyor, San José, CA, EUA), detector electroquímico (Dionex ED40)
e detector de fluorescência (Thermo Finnigan FL3000).
A separação de compostos foi efectuada com uma coluna LiChrospher
RP-18 (5 mm, 250×4 mm i.d.) da Merck, a 35ºC, estando instalada uma
pré-coluna com o mesmo tipo de enchimento. As amostras foram injectadas utilizando um loop de 20 μL. A fase móvel, composta pelos eluentes
A – água : ácido ortofosfórico (99,9 : 0,1) – e B – água : acetonitrilo : ácido ortofosfórico (59,9 : 40,0 : 0,1), teve um fluxo de 700 μL.min-1, a
35ºC. O programa de eluentes foi aplicado de acordo com o descrito na
quadro 2.1.
A detecção com o DAD foi efectuada entre 200-600 nm, com uma aquisição mais rápida a diferentes comprimentos de onda (254, 272, 280,
306, 320 ou 324 nm), seleccionados de acordo com os compostos a analisar. O detector de fluorescência estava equipado com uma lâmpada de
xénon que emite nos comprimentos de onda entre 200 nm e 650 nm. Os
comprimentos de onda seleccionados para excitação (λex) e emissão (λem)
variaram de acordo com o objectivo da análise: quando se queria ter uma
ideia
sobre
todos os compostos
presentes na amostra utilizou-se
λex = 280 nm e λem = 320 nm; para compostos específicos utilizou-se os
comprimentos de onda (emissão e excitação) mais adequados a cada uma
delas, conforme se apresenta na quadro 2.2.
O detector electroquímico, composto por um eléctrodo de carbono
27
Materiais e Métodos
vítreo, efectua as medições de sinal por voltametria integrada na gama de
potenciais entre -1,0 V e 1,0 V, com um varrimento num intervalo de
tempo de 1,00 segundos.
Quadro 2.1: Programa de eluentes usado na análise
por HPLC-DAD.
Sistema Surveyor-ThermoFinnigan.
Tempo de
análise (min.)
0-15
15-25
25-70
70-75
75-85
85-100
100-101
101-110
Eluente B
(%)
0-20 (gradiente linear)
20
20-70 (gradiente linear)
70
70-100 (gradiente linear)
100
0
0
Os resultados obtidos com o detector de fluorescência e electroquímico
foram adquiridos à frequência de 50 Hz com um conversor analógico/digital utilizando o programa 4880 da Unicam. No detector de díodos usou-se
o sistema de controlo e aquisição de dados Chromquest versão 4.0 (Thermo Finnigan Surveyor, San José, CA, EUA).
Quadro 2.2: Programa de comprimentos de onda usado na
análise por HPLC-FL.
Tempo (min.)
0,00 – 50,00
50,00 – 50,01
50,01 – 56,80
56,80 – 56,81
56,81 – 60,79
60,79 – 60,80
60,80 – 66,39
66,39 – 66,40
66,40 – 72,15
72,15 – 72,16
72,16 – 90,00
2.2.5.
Comprimentos de onda
(nm)
280 – 320 (fenóis)
290 – 390 (trans-piceid)
290 – 390
260 – 400 (cis-piceid)
260 – 400
300 – 390 (trans-resveratrol)
300 – 390
260 – 400 (cis-resveratrol)
260 – 400
280 – 320 (fenóis)
280 – 320
Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)
A actividade antioxidante relativamente a radicais peroxilo (ROO˙) é determinada pelo método de ORAC [53].
28
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
2.2.5.1.
Método de ORAC
O método baseia-se na capacidade de determinados compostos presentes nas matrizes em estudo, inibirem a oxidação da fluoresceína
(disodium fluorescein) induzida por radicais peroxilo (ROO˙) gerados pelo
AAPH (dicloridrato de 2,2’-azobis-2-amidinopropano).
O ensaio consistiu na adição de amostra a uma solução de fluoresceína
pré-incubada a 37ºC. Após adição de AAPH (Fluka, Alemanha), a fluorescência da mistura reactiva foi medida num fluorímetro (BioTek FLx800) em
intervalos regulares de 1 min, ao longo de 30 min à temperatura de 37ºC
(λem = 515 nm, λex = 493 nm). Todas as soluções foram preparadas em
PBS (pH = 7,4).
As soluções padrão para a realização da curva de calibração foram realizadas com Trolox (Aldrich, Alemanha). Os resultados finais de ORAC são
calculados através da regressão linear entre os valores de concentração de
Trolox e a área da curva de decaimento da fluoresceína, sendo expressos
em equivalentes de Trolox (Capacidade Antioxidante Equivalentes Trolox – μM CAET).
Método com erro associado de 3%.
2.2.6.
2.2.6.1.
Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (OH˙)
Método de HORAC
O método de HORAC (Hydroxyl Radical Averting Capacity) [54]
quantifica, principalmente, a capacidade dos extractos bioactivos em
quelar iões metálicos reactivos, catalisadores de reacções de oxidação. De
forma indirecta, relacionando a actividade como agentes quelantes com a
não geração de radicais hidroxilo, é possivel determinar a capacidade dos
extractos em inibir a formação desta espécie reactiva.
Neste método, inicia-se uma reacção "Tipo Fenton" entre um metal
(Co(II)) e peróxido de hidrogénio que, ao formarem espécies intermédias
reactivas, oxidam o fluorófero com o qual entram em contacto. Neste
trabalho, o fluorófero escolhido para optimização do método foi a
fluoresceína que, na sua forma oxidada, se torna incolor. Tal como no
29
Materiais e Métodos
método de ORAC, é possivel acompanhar a cinética da reacção medindo a
redução da fluorescência da solução e, dessa forma, quantificar a
capacidade protectora dos antioxidantes testados.
Na Figura 2.3 estão esquematizadas as reacções que podem ocorrer.
Numa placa de 96 poços, adicionou-se a amostra (ou PBS) a uma
solução de fluoresceína pré-incubada a 37ºC durante 10 min. Após
incubação, adicionou-se H2O2 a cada um dos poços. Mesmo antes da
leitura, e em simultâneo, adicionou-se CoF2 (Aldrich, Alemanha) a cada
um dos poços (injector). A fluorescência da mistura reactiva foi medida no
fluorímetro em intervalos regulares de 1 min, ao longo de 30 min, à
temperatura de 37ºC (λem = 515 nm, λex = 493 nm). Todas as soluções
foram preparadas em PBS (pH = 7,4).
Figura 2.3: Esquema da reacção do peróxido
de hidrogénio (H2O2) em presença de iões
metálicos (M).
A reacção gera o radical hidroxilo HO˙. Este
radical é bastante reactivo e ao reagir com
espécies antioxidantes (R-H) capta um
hidrogénio originando uma espécie com um
electrão desemparelhado (R˙). Por sua vez
esta espécie reage com o O2 molecular,
formando o radical peroxilo ROO˙.
Fonte: Ou et al. (2002) [54].
As soluções-padrão utilizadas na realização da curva de calibração foram realizadas com ácido cafeico. Os resultados finais de HORAC são
calculados através da regressão linear entre os valores de concentração de
ácido cafeico e a área da curva de decaimento da fluoresceína sendo expressos em equivalentes de ácido cafeico (Capacidade Antioxidante
Equivalentes Ácido Cafeico – μM CAEAC).
Método com erro associado de 6%.
30
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
2.2.7. Capacidade de inibição/retardação da oxidação da lipoproteína de baixa densidade (LDL)
Os compostos fenólicos de origem vegetal com elevada actividade antioxidante têm sido relacionados com a capacidade de proteger a
lipoproteína de baixa densidade (LDL) da oxidação. Os efeitos da forma
oxidada da LDL estão relacionados com a maioria das alterações observadas no mecanismo de desenvolvimento da aterosclerose. Devido a esta
correlação, a comunidade científica tem atribuído a estes compostos fenólicos
a
propriedade
de
ajudarem
na
prevenção
de
doenças
cardiovasculares.
A avaliação da capacidade das amostras sobre a protecção da oxidação
da LDL in vitro, faz-se segundo Esterbauer H. et al. (1991) [55], isto é,
através da monitorização da formação de dienos conjugados ao longo de
oito horas a 37ºC após i) incubação da lipoproteína com um agente oxidante (AAPH – gerador de radicais peroxilo) e ii) incubação da lipoproteína
com um agente oxidante (AAPH) juntamente com uma amostra. A formação dos dienos conjugados é seguida por espectrofotometria UV (234 nm).
2.2.8.
Estudo de envelhecimento das amostras
O estudo de envelhecimento tem por base os ensaios atrás descritos. É
um estudo feito por comparação dos resultados das amostras recolhidas
aquando da abertura das garrafas com os resultados das amostras recolhidas
após
armazenamento,
a
4ºC
e
à
temperatura
ambiente,
subsequente à abertura das ditas garrafas.
O período de armazenamento aplicado foi de 14 dias, pretendendo-se
simular um intervalo de tempo de armazenamento de uma garrafa de vinho por parte de um consumidor comum – ao fim de duas semanas de
armazenamento após a abertura, é pouco provável que o vinho ainda
mantenha as características organolépticas iniciais, pelo que não se justifica prolongar o estudo do envelhecimento por um período de tempo
superior.
O armazenamento foi efectuado a 4ºC e à temperatura ambiente, simulando-se, deste modo, o armazenamento no frigorífico e na prateleira,
31
Materiais e Métodos
respectivamente.
O estudo de envelhecimento das amostras de cerveja é em tudo
semelhante ao das amostras de vinho, variando, somente, o período de
armazenamento, que, no caso da cerveja, foi de 48 horas, ao contrário
dos 14 dias para as amostras de vinho.
32
3. Resultados e
Discussão
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
3.1.
Vinho
3.1.1.
Caracterização das amostras
3.1.1.1.
Quantificação dos polifenóis totais
A quantificação dos polifenóis totais foi efectuada segundo o método de
Folin-Ciocalteau, estando os resultados obtidos de acordo com outros previamente
estabelecidos [27,
56].
Os
referidos
resultados
permitem
agrupar as amostras em 4 grupos (fig. 3.1). O primeiro grupo de
amostras com concentrações de polifenóis totais entre 3300-3700 mg/L
(EAG), onde estão incluídas as amostras Porta Velha (TM), Vega e Vinha
do Mazouco (D), Quinta da Garrida (B), Quinta de Pancas (E) e Boa
Memória
(Ale.);
o
segundo
grupo,
com
concentrações
entre
3000-3300 mg/L (EAG), inclui as amostras Capote Velho Reserva (E),
3800
3600
3400
3200
2800
2600
2400
2200
2000
En
c
Po
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TM
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Ba
sa
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ç)
Polifenóis totais (mg / L, EAG)
3000
Amostras
Figura 3.1: Representação gráfica da quantificação dos polifenóis totais presentes nas
amostras de vinho (método de Folin-Ciocalteau).
TM - Trás-os-Montes; D - Douro; B - Beiras; E – Estremadura; R – Ribatejo; TS – Terras
do Sado; Ale. - Alentejo; Alg. - Algarve; Aç. - Açores. Método com erro associado de 2%.
Serradayres Reserva e Monte Sacro (R) e Vinha das Garças (TS); o
terceiro grupo, com concentrações entre 2700-3000 mg/L (EAG), inclui as
amostras Entre Serras (B), Periquita (TS), Porche's e Lagoa Reserva (Alg.)
35
Resultados e Discussão
e Basalto (Aç.); por fim, o último grupo, com concentrações de polifenóis
totais de entre 2200-2500 mg/L (EAG), inclui as amostras Encostas do
Rabaçal (TM), Planura e Amoreira (Ale.).
Um dos objectivos deste trabalho foi averiguar se existiria, ou não,
alguma relação entre a área geográfica de produção e as características
polifenólicas dos vinhos. O valor médio da concentração de polifenóis
totais das amostras analisadas foi de 3049 mg/L (EAG), o valor máximo
foi de 3625 mg/L (EAG) e o valor mínimo de 2244 mg/L (EAG). Não se
observou uma relação entre a área geográfica de produção e as
concentrações de polifenóis totais ou seja, pequenos detalhes a nível do
crescimento das uvas podem estar na origem das diferenças existentes.
3.1.1.2.
Análise química das amostras (polifenóis)
A identificação de compostos fenólicos presentes nas amostras de vinho
em estudo foi efectuada por recurso a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC – high performance liquid chromatography) acoplada a um
detector de díodos (DAD – diode array detector), correspondendo a figura
Figura 3.2: Cromatograma obtido por HPLC-DAD para identificação de polifenóis.
3.2 a um dos cromatogramas obtidos. A identificação de trans-piceid e de
trans-resveratrol fez-se por acoplação do sistema HPLC a um detector de
36
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
fluorescência (FD – fluorescence detector) dada a baixa sensibilidade do
detector de díodos a estes dois compostos (fig. 3.3).
Figura 3.3: Cromatograma obtido por HPLC-FD para identificação de trans-resveratrol e
trans-piceid.
Os perfis cromatográficos obtidos, tanto por HPLC-DAD como HPLC-FD,
confirmaram a tendência evidenciada pelos resultados dos polifenóis totais, isto é, embora se tenham registado diferenças pontuais nalguns
perfis, a semelhança entre eles era bastante evidente, comprovando uma
certa homogeneidade dos vinhos nacionais em termos de composição polifenólica.
3.1.1.3.
Quantificação das antocianinas totais
As antocianinas totais foram quantificadas através do método do pH diferencial. Com os resultados obtidos, desenhou-se um gráfico (fig. 3.4)
que permite observar a grande variabilidade entre as diferentes amostras.
O valor máximo foi alcançado com a amostra Porta Velha, com
136 mg de equivalentes de malvidina-3-glucósido por litro (EM3G/L); o
valor mínimo foi alcançado com a amostra Porche's, com 13 mg EM3G/L,
37
Resultados e Discussão
ou seja, cerca de 10% do valor registado para a amostra 1. O valor médio
registado foi de 78 mg EM3G/L.
Tal como se verificou para os polifenóis totais, não é possível determinar
a existência de uma padrão de antocianinas totais de acordo com a região
de produção. Contudo, é curioso notar que os valores de antocianinas
totais nas amostras do Algarve são mais baixos do que os demais; tendo
em consideração que as antocianinas as principais responsáveis pela
coloração dos vinhos, então, estes resultados vão ao encontro da opinião
de Huglin e Schneider [57], que dizem que a experiência prática mostra
que para a obtenção de vinhos tintos de cor óptima as condições muito
quentes são adversas.
140
120
80
60
40
20
Po
rta
os
Ve
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lh
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a(
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TM
ab
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(A
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0
En
c
Antocianinas totais (mg EM3G / L)
100
Amostras
Figura 3.4: Representação gráfica da quantificação das antocianinas totais presentes nas
amostras de vinho (método do pH diferencial).
TM - Trás-os-Montes; D - Douro; B - Beiras; E – Estremadura; R – Ribatejo; TS – Terras
do Sado; Ale. - Alentejo; Alg. - Algarve; Aç. - Açores. Método com erro associado de 4%.
3.1.1.4.
Cor dos vinhos
A cor dos vinho foi determinada por aplicação de modelos de regressão
simples para obtenção dos parâmetros CIELAB, usando os valores de
absorvância a 420 nm (A420), a 520 nm (A520) e a 620 nm (A620) como
38
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
variáveis independentes. Os resultados obtidos estão expressos na quadro
3.1 e estão de acordo com outros previamente estabalecidos [51, 58].
Quadro 3.1: Cor dos vinhos de acordo com o parâmetros CIELAB
N.º
Marca
L*
a*
b*
C*
h*
1
Porta Velha (TM)
68
32
12
34
18
2
Encostas do Rabaçal (TM)
70
32
8
34
11
3
Vega (D)
65
35
15
37
18
4
Vinha do Mazouco (D)
73
28
10
29
18
5
Entre Serras (B)
79
24
7
25
16
6
Quinta da Garrida (B)
60
39
16
41
17
7
Quinta de Pancas (E)
64
35
17
36
21
8
C apote Velho Reserva (E)
68
32
13
34
18
9
Serradayres Reserva (R)
70
31
12
32
18
10
Monte Sacro (R)
70
29
14
31
23
11
Periquita (TS)
55
37
28
39
36
12
Vinha das Garças (TS)
72
28
13
30
21
13
Planura (Ale.)
73
25
14
26
31
14
Boa Memória (Ale.)
64
36
12
38
15
15
Amoreira (Ale.)
72
26
15
28
30
16
Porche's (Alg.)
64
33
18
34
27
17
Lagoa Reserva (Alg.)
80
20
9
22
26
18
Basalto (Aç)
77
22
11
24
27
Contudo, da simples observação da quadro, não é fácil aferir uma
relação entre as cores das várias das amostras. Por esse motivo, foi
desenhada uma representação gráfica a três dimensões (fig. 3.5) dos
Figura 3.5: Distribuição das amostras analisadas de acordo com
o sistema de cores CIELAB.
parâmetros L*, a* e b*. Verifica-se uma distribuição quase linear das
39
Resultados e Discussão
amostras analisadas. As amostras localizadas na parte superior do gráfico
apresentam um valor de L* maior, logo, são amostras mais claras (5, 17 e
18); pelo contrário, a amostra 11, na extremidade inferior é uma amostra
mais escura.
3.1.2.
3.1.2.1.
Avaliação da capacidade antioxidante
Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)
Este ensaio (fig. 3.6), realizado de acordo com o método de ORAC,
apresentou resultados que estão de acordo com outros previamente estabelecidos [59, 60].
46000
44000
40000
38000
36000
34000
32000
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30000
En
c
Resgate de radicais peroxilo (μM CAET)
42000
Amostras
Figura 3.6: Representação gráfica da capacidade de resgate de radicais peroxilo (método
de ORAC) por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras de vinho.
TM – Trás-os-Montes; D – Douro; B – Beiras; E – Estremadura; R – Ribatejo; TS – Terras
do Sado; Ale. – Alentejo; Alg. – Algarve; Aç – Açores. Método com erro associado de 3%.
A observação do gráfico expõe alguma semelhança entre as várias
amostras, sendo possível organizar os resultados em 4 grupos. O primeiro, contendo as amostras Boa Memória (Ale.) e Basalto (Aç.), com valores
compreendidos entre 43000-44000 μM de capacidade antioxidante de
equivalentes de trolox (CAET); o segundo grupo, incluindo as amostras
40
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Porta Velha (TM), Vega e Vinha do Mazouco (D), Quinta da Garrida (B),
Quinta de Pancas e Capote Velho Reserva (E), Monte Sacro (R), Vinha das
Garças (TS) e Planura (Ale.), com valores entre 39000-41000 μM CAET; o
terceiro grupo, contendo as amostras Encostas do Rabaçal (TM), Serradayres (R), Porche's (Alg.) e Basalto (Aç.), com valores entre 3540037900 μM CAET; o quarto e último grupo, contendo as amostras Entre
Serras (B), Periquita (TS) e Amoreira (Ale.).
Dada a homogeneidade dos resultados obtidos, é difícil estabelecer uma
relação entre a capacidade de resgate de radicais peroxilo com a origem
de produção dos vinhos.
3.1.2.2.
Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙)
O gráfico da figura 3.7 representa a capacidade de inibição de radicais
hidroxilo pelas amostras de vinho analisadas, de acordo com o método de
HORAC. A variabilidade de resultados registada para as diferentes amos37500
27500
22500
17500
Po
rta
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12500
En
c
Inibição de radicais hidroxilo (μM CAEAC)
32500
Amostras
Figura 3.7: Representação gráfica da capacidade de inibição de radicais hidroxilo (método
de HORAC) por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras de vinho.
TM – Trás-os-Montes; D – Douro; B – Beiras; E – Estremadura; R – Ribatejo; TS – Terras
do Sado; Ale. – Alentejo; Alg. – Algarve; Aç. – Açores. Método com erro associado de
6%.
41
Resultados e Discussão
tras foi muito grande, havendo uma divergência de 54% entre o maior e o
menor valor obtidos, Quinta de Pancas, com 36287 μM de capacidade antioxidante de equivalentes de ácido cafeico (CAEAC), e Quinta da Garrida,
com 16601 μM CAEAC, respectivamente.
Do ponto de vista da inibição de radicais hidroxilo de acordo com o local
de produção, as amostras que revelaram uma maior proximidade foram as
do Douro (Vega e Vinha do Mazouco) e as da Estremadura (Quinta de
Pancas e Capote Velho); pelos restantes resultados, não é possível
estabelecer uma relação entre a sua origem e a sua capacidade de
inibição de radicais hidroxilo pelo método de HORAC.
3.1.2.3.
Detecção electroquímica (HPLC-ED)
Para cada uma das amostras foi obtido um cromatograma (fig. 3.8) que
traduz a presença de polifenóis com propriedades electroquímicas. A partir
da integração de cada um dos picos foram obtidas as suas áreas que, uma
vez somadas, fornecem a área total dos picos como mostra a figura 3.9.
A amostra que apresentou uma área total maior foi a Boa Memória com
um valor de 252; a que apresentou uma área total menor foi a Porta Velha
Figura 3.8: Representação gráfica dum cromatograma obtido por HPLC-ED.
42
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
com um valor de 139; o valor médio foi de 182.
Dentre os vários resultados apresentados até este ponto, os de
HPLC-ED são aqueles que permitem observar uma maior tendência para a
sua organização de acordo com a área de produção. Exceptuando as
amostras do Alentejo (Boa memória apresentou um valor muito superior
às outras duas amostras – Planura e Amoreira) e da Estremadura (Quinta
de Pancas e Capote Velho Reserva), verifica-se pouca variação entre as
amostras da mesma região.
250
Área total dos picos
200
150
100
50
do
ha
al
(T
M)
Vi
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c
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t
as
Po
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Ve
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(T
M)
0
Am ostras
Figura 3.9: Representação gráfica das áreas totais dos picos obtidos por HPLC-ED para as
diferentes amostras analisadas.
3.1.2.4. Capacidade
de
inibição/retardação
lipoproteína de baixa densidade (LDL)
da
oxidação
da
O ensaio de inibição/retardação da oxidação de LDL foi efectuado com
as amostras que, segundo o método de ORAC, apresentaram a melhor e a
pior capacidade de resgate de radicais peroxilo, ou seja, Boa Memória e
Periquita, respectivamente. A figura 3.10, uma representação gráfica dos
resultados obtidos, permite observar a retardação da fase estacionária da
oxidação de LDL de acordo com as amostras em análise. No caso da
43
Resultados e Discussão
amostra Boa Memória, a fase estacionária foi prolongada em 32%; a
amostra Periquita prolongou a fase estacionária em 25%, estando estes
resultados de acordo com obtidos com o método ORAC.
0,450
0,400
0,350
Abs (234 nm)
0,300
0,250
0,200
0,150
Branco
Boa Memória(Ale.)
Periquita (TS)
0,100
0,050
0,000
0
100
200
300
400
500
600
t (min)
Figura 3.10: Representação gráfica da capacidade inibição/retardação da oxidação de
LDL das amostras Boa Memória e Periquita.
3.1.3.
3.1.3.1.
Estudo do Envelhecimento
Quantificação dos polifenóis totais
A figura 3.11 é uma representação gráfica da evolução da quantidade
de polifenóis totais presentes nas amostras desde a abertura das garrafas
até ao final do período de armazenamento (14 dias), a 4ºC e à temperatura ambiente.
Pelos resultados obtidos verifica-se que houve uma ligeira tendência
para a diminuição dos polifenóis totais durante o armazenamento, sendo
que a amostra Quinta de Pancas contrariou a tendência, pois apresentou
uma variação mínima nos polifenóis totais quando armazenada tanto à
temperatura ambiente como a 4ºC, podendo a pequena variação verificada ser atribuída ao erro do método.
São várias as amostras em que, apesar de não ter havido uma quebra
significativa nos polifenóis totais das alíquotas armazenadas à temperatura ambiente, houve uma redução expressiva nos polifenóis totais das
alíquotas armazenadas a 4ºC; o inverso, no entanto, não se verificou,
44
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
uma vez que nesses casos a diferença foi reduzida.
Em termos da variação dos polifenóis totais ao longo do período de
armazenamento em função da origem das amostras, não é possível
estabelecer um padrão, embora, nalguns casos, seja visível alguma
semelhança no processo de envelhecimento, como no caso das amostras
do Ribatejo, com variações muito semelhantes.
4000
3000
2500
t0
t14 (4ºC)
t14 (Amb.)
2000
1500
En
c
Po
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(A
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Polifenóis totais (mg/L, EAG)
3500
Amostras
Figura 3.11: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da evolução dos polifenóis
totais (método de Folin-Ciocalteau) presentes nas amostras de vinho desde o momento
da abertura até ao final do período de armazenamento (14 dias).
t0 – amostras recolhidas após a abertura das garrafas; t14 (4ºC) – amostras recolhidas
após armazenamento das garrafas abertas a 4ºC; t14 (Amb.) – amostras recolhidas após
armazenamento das garrafas abertas à temperatura ambiente. Método com erro
associado de 2%.
3.1.3.2.
Quantificação das antocianinas totais
O envelhecimento do vinho após abertura das garrafas provocou quebras nos teores em antocianinas totais (fig. 3.12), sendo que, nalguns
casos, essas reduções no teor em antocianinas aconteceram sobretudo
nas amostras armazenadas a 4ºC (Vega, Entre Serras, Quinta de Pancas,
Boa Memória, Porche's e Lagoa Reserva) e noutros nas amostras armazenadas à temperatura ambiente (Quinta da Garrida e, Serradayres
Reserva). Num terceiro caso, a quebra foi semelhante em qualquer das
45
Resultados e Discussão
temperaturas em estudo. À excepção das amostras do Algarve, não é possível apontar uma tendência à degradação das antocianinas de acordo
com a região.
160
140
120
80
60
40
t0
t14 (4ºC)
t14 (Amb.)
20
Po
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0
En
c
Antocianinas totais (mg/L, EM3G)
100
Amostras
Figura 3.12: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da evolução das
antocianinas totais (método do pH diferencial) presentes nas amostras de vinho desde o
momento da abertura até ao final do período de armazenamento (14 dias).
t0 – amostras recolhidas após a abertura das garrafas; t14 (4ºC) – amostras recolhidas
após armazenamento das garrafas abertas a 4ºC; t14 (Amb.) – amostras recolhidas após
armazenamento das garrafas abertas à temperatura ambiente. Método com erro
associado de 4%.
A amostra que em termos da preservação dos teores em antocianinas
totais mais se destaca pela positiva é a Porta Velha, dado que, sendo
aquela que apresentou um valor inicial superior, foi, também, aquela que
apresentou os maiores valores após armazenamento (4ºC e temperatura
ambiente), com uma quebra muito reduzida. Pela negativa sobressaem as
amostras do Algarve: apesar de não terem sofrido um redução na
concentração de antocianinas totais quando armazenadas à temperatura
ambiente, quando armazenadas a 4ºC a quebra foi muito forte, levando à
sua ausência no caso da amostra Porche's.
46
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
3.1.3.3.
Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)
De uma forma geral, não se verificou um grande decaimento na capacidade
de
resgate
de
radicais
peroxilo
durante
o
período
de
armazenamento, como mostra a figura 3.13, sendo que as amostras com
maior redução neste parâmetro foram a Planura, Amoreira, Lagoa Reserva
e Basalto.
50000
40000
35000
30000
t0
t14 (4ºC)
t14 (Amb.)
25000
Po
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sa
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(A
ç)
20000
En
c
Resgate de radicais peroxilo (μM CAET)
45000
Amostras
Figura 3.13: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica evolução da capacidade
de resgate de radicais peroxilo (método de ORAC) por parte dos compostos antioxidantes
presentes nas amostras de vinho desde o momento da abertura até ao final do período
de armazenamento (14 dias).
t0 – amostras recolhidas após a abertura das garrafas; t14 (4ºC) – amostras recolhidas
após armazenamento das garrafas abertas a 4ºC; t14 (Amb.) – amostras recolhidas após
armazenamento das garrafas abertas à temperatura ambiente. Método com erro
associado de 3%.
É importante referir que, ao contrário do que aconteceu com os polifenóis (e também com as antocianinas), o decaimento da capacidade de
resgate foi mais intenso quando as amostras foram conservadas à temperatura ambiente (à excepção da Porche's) pelo que, no que se refere à
capacidade de resgate de radicais peroxilo, é preferível o armazenamento
do vinho a 4ºC.
Não é possível verificar uma tendência para a perda da capacidade de
47
Resultados e Discussão
resgate de radicais ROO˙ de acordo com a região de origem.
3.1.3.4.
Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙)
O estudo do efeito do envelhecimento do vinho na sua capacidade de
resgate de radicais HO˙revelou que, de um modo geral, quando a
conservação é efectuada à temperatura ambiente, esta não sofre uma
perda significativa, como se pode verificar na figura 3.14. Se nalguns
casos essa quebra é maior – Porta Velha (TM), Capote Velho Reserva (E),
Vinha das Garças (TS), Planura (Ale.), Porche's (Alg.) e Lagoa Reserva
(Alg.) –, nas restantes é pequena, podendo mesmo, nalguns vinhos, ser
considerada
inexistente. Já as
amostras conservadas
a 4ºC, pelo
contrário, revelaram sofrer uma perda acentuada da sua capacidade de
inibição
de
radicais
hidroxilo;
exceptuam-se
as
2
amostras
de
40000
30000
25000
20000
t0
t14 (4ºC)
t14 (Amb.)
15000
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(A
Ba
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.)
sa
lto
(A
ç)
10000
En
c
Inibição de radicais hidroxilo (μM CAEAC)
35000
Amostras
Figura 3.14: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da evolução da
capacidade de inibição de radicais hidroxilo (método de HORAC) por parte dos compostos
antioxidantes presentes nas amostras de vinho desde o momento da abertura até ao final
do período de armazenamento (14 dias).
t0 – amostras recolhidas após a abertura das garrafas; t14 (4ºC) – amostras recolhidas
após armazenamento das garrafas abertas a 4ºC; t14 (Amb.) – amostras recolhidas após
armazenamento das garrafas abertas à temperatura ambiente. Método com erro
associado de 6%.
48
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Trás-os-Montes (Porta Velha e Encostas do Rabaçal), Quinta da Garrida
(B), Monte Sacro (R), Periquita (TS) e Amoreira (Ale.); as restantes
perderam muita da sua capacidade, destacando-se, a título de exemplo, a
Capote Velho Reserva (E) e a Porche's (Alg.).
3.1.4.
Capacidade antioxidante
Através de uma simples representação gráfica a três dimensões, é possível visualizar uma inter-relação dos vários métodos utilizados na
determinação da capacidade antioxidante dos vinhos, no caso, ORAC, HORAC e HPLC-ED, avaliando-se a capacidade antioxidante total de cada um
dos vinhos.
Figura 3.15: Representação gráfica da inter-relação de métodos utilizados na
determinação da capacidade antioxidante dos vinhos (ORAC, HORAC e HPLC-ED) com a
presença de polifenóis.
Na análise dos resultados obtidos com as amostras de vinho há um factor importante a ter em consideração: as amostras foram adquiridas em
diferentes fontes. Isto significa que podem ter sido sujeitas a diferentes
condições de acondicionamento durante o transporte, armazenamento ou
49
Resultados e Discussão
exposição nas lojas, podendo essas diferenças influenciar o resultado final
deste trabalho.
Não tendo sido possível verificar qualquer tendência regional nas características dos vinhos (polifenóis totais ou capacidade antioxidante) através
da observação individual dos ensaios, esperava-se que recorrendo à comparação dos métodos fosse possível esboçar um perfil próprio para cada
região. Contudo, tal como mostra a figura 3.15, essa diferença de perfis
não existe.
Entre as 18 amostras analisadas há cinco que se destacam das restantes pelos elevados níveis de capacidade antioxidante. São elas a Boa
Memória (Ale.), a Quinta de Pancas (E), a Vega e a Vinha do Mazouco (D)
e Serradayres (R ), apresentando níveis muito bons nos 3 parâmetros
analisados: capacidade de inibição de radicais hidroxilo, capacidade de
resgate de radicais peroxilo e actividade electroquímica. Com os piores registos surgem Amoreira (Ale.) e Encostas do Rabaçal (TM).
Por fim, é visível que, de uma forma geral, a capacidade antioxidante,
sobretudo a capacidade de resgate de radicais ROO˙, é acompanhada
pelos polifenóis totais, expondo uma associação entre a presença de
polifenóis e a capacidade antioxidante dos vinhos.
3.2.
Cerveja
3.2.1.
3.2.1.1.
Caracterização das amostras
Quantificação dos polifenóis totais
A quantificação do polifenóis totais foi efectuada de acordo com o método de Folin-Ciocalteau.
Os resultados obtidos (fig. 3.16) revelaram a Super Bock Stout como a
cerveja com maior concentração de polifenóis totais, com 1159 mg/L; pelo
contrário, a cerveja que apresentou menor concentração foi a Cheers, com
293 mg/L; o resultado médio obtido entre as 18 analisadas foi de 556 mg/
L.
As cervejas pretas apresentaram tendencialmente mais polifenóis dos
50
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
que as cervejas brancas tipo Pilsner, sendo que dentre as seis primeiras
cinco eram pretas (Super Bock Stout, Cristal Preta, Sagres Preta, Sagres 0
Preta e Super Bock Preta Sem Álcool); a cerveja Super Bock Abadia, a segunda cerveja com mais polifenóis, é uma cerveja com características
intermédias entre as cervejas preta e branca.
É também interessante notar que as cervejas sem álcool apresentaram
1400
1200
1000
600
400
200
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Bo
Polifenóis totais (mg EAG / L)
800
Amostras
Figura 3.16: Representação gráfica da quantificação dos polifenóis totais presentes nas
amostras de cerveja (método de Folin-Ciocalteau).
Método com erro associado de 2%.
menos polifenóis do que as suas congéneres com álcool. No caso da Super
Bock Stout, a quebra foi de 51%, na Sagres de 21%, na Sagres Preta de
6% e na Super Bock de 1%.
A obtenção de cerveja sem álcool pode ser conseguida por duas vias
distintas: por interrupção da fermentação ou por remoção do álcool no
final da produção. No caso das cervejas Sagres 0 e Sagres 0 Preta
(Central de Cervejas) e Cheers (Unicer), o caminho seguido é o da
interrupção da fermentação; no caso das restantes cervejas sem álcool
produzidas na Unicer, a redução do teor alcoólico é conseguida por
remoção do álcool no final. Este dado pode ajudar a explicar o facto de a
Sagres 0 e a Cheers apresentarem o pior teor em polifenóis totais entre
51
Resultados e Discussão
todas
as
amostras
analisadas,
significando,
possivelmente,
que
a
interrupção do processo fermentativo impede que haja migração de parte
dos polifenóis das matérias-primas, nomeadamente do lúpulo, para as
cervejas.
A Super Bock Limão e a Super Bock Pêssego (cervejas sem álcool com
sabor), apresentaram valores de polifenóis totais superiores à Super Bock
Sem Álcool, 12% e 11% acima, respectivamente, sendo que tal se pode
dever a polifenóis presentes nos sumos de limão e de pêssego utilizados
e/ou à presença de ácido ascórbico (vitamina C) nos referidos sumos (o
ácido ascórbico pode incrementar o valor final dos ensaios do método de
Folin-Ciocalteau [61]).
3.2.1.2.
Quantificação das antocianinas totais
As antocianinas totais foram quantificadas através do método do pH diferencial.
Tendo este ensaio sido realizado com todas as amostras de cerveja,
apenas a Super Bock Tango apresentou um resultado positivo com um
valor de 10 mg/L (EM3G). A presença de antocianinas nesta cerveja de
cor avermelhada deve-se à presença de groselha na sua composição.
3.2.2.
3.2.2.1.
Avaliação da capacidade antioxidante
Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)
A Super Bock Stout foi a cerveja que apresentou maior capacidade de
resgate de radicais peroxilo, com um valor de 11411 μM (CAET – capacidade antioxidante de equivalentes trolox); o pior resultado foi registado
para a Cheers com 3161 μM (CAET); o resultado médio foi de 5735 μM
(CAET).
À imagem dos resultados obtidos com o método de Folin-Ciocalteau, as
cervejas pretas mostraram uma maior capacidade de resgate de radicais
peroxilo do que as cervejas brancas tipo Pilsner (fig. 3.17), com três cervejas pretas entre as quatro cervejas com maior capacidade de resgate
(Super Bock Stout, Cristal Preta e Sagres Preta): somente a Super Bock
52
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Abadia, no segundo lugar, contrariou esta tendência. Como já foi referido
anteriormente, a Super Bock Abadia é uma cerveja com características intermédias entre as cervejas preta e branca. Apesar do predomínio das
cervejas pretas (com álcool), as suas congéneres sem álcool (Super Bock
Preta Sem Álcool e Sagres Preta sem Álcool) apresentaram prestações um
pouco inferiores, sendo ultrapassadas por várias cervejas tipo Pilsner, destacando-se a Carlsberg e a Super Bock Sem Álcool Pêssego, com
resultados muito próximos da Sagres Preta.
12000
8000
6000
4000
2000
ad
Cr
ia
i st
al
Pr
et
Sa
Su
a
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0
Ch
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Su
pe
r
Bo
Bo
ck
St
o
ut
0
Su
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r
Resgate de radicais peroxilo (μM CAET)
10000
Amostras
Figura 3.17: Representação gráfica da capacidade de resgate de radicais peroxilo
(método de ORAC) por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras de
cerveja.
Método com erro associado de 3%.
Igualmente em concordância com os resultados dos polifenóis totais, as
cervejas sem álcool (brancas e pretas) apresentaram menos capacidade
de resgate do que as suas congéneres com álcool, com excepção da Super
Bock Sem Álcool, a qual, contrariando a tendência, apresentou uma capacidade de resgate de radicais peroxilo 10% superior à Super Bock. No
caso da Super Bock Stout, a quebra foi de 53%, na Sagres de 34% e na
Sagres Preta de 19%.
53
Resultados e Discussão
3.2.2.2.
Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙)
Super Bock Stout é a cerveja que apresenta maior capacidade de
inibição de radicais HO˙, numa lista onde pontificam as cervejas pretas
(fig. 3.18). No entanto, é curioso notar que a Super Bock Sem Álcool
Pêssego apresenta um registo semelhante à Sagres 0 Preta; por
comparação, a Super Bock Sem Álcool Limão é a cerveja com pior registo
neste ensaio, à imagem das restantes cervejas brancas sem álcool,
verificando-se aqui também que as cervejas sem álcool têm uma pior
prestação antioxidante do que as suas congéneres com álcool.
10000
6000
4000
2000
tra
Cr
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al
Pr
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co
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go
0
er
Inibição de radicais hidroxilo (μM CAEAC)
8000
Amostras
Figura 3.18: Representação gráfica da capacidade de inibição de radicais hidroxilo
(método de HORAC) por parte dos compostos antioxidantes presentes nas amostras de
cerveja.
Método com erro associado de 6%.
3.2.3.
Estudo do envelhecimento
O estudo do envelhecimento das cervejas incidiu nas amostras das duas
cervejas com maior expressão no mercado nacional e com comercialização
de garrafas de 1 litro: Sagres e Super Bock.
3.2.3.1.
Quantificação dos polifenóis totais
Pelos resultados obtidos (fig. 3.19), verifica-se que a variação dos
polifenóis totais presentes nas amostras de cerveja ao longo do período de
54
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
armazenamento é quase inexistente, podendo as pequenas diferenças nos
resultados ser atribuídas ao erro experimental associado ao método, ou
seja, quando armazenadas a 4ºC, as amostras de cerveja depois de
abertas conservaram o seu teor em polifenóis durante, pelo menos, 48
Polifenóis totais (mg EAG / L)
horas.
500
490
480
470
460
450
440
430
420
410
400
0 horas
24 horas
48 horas
Super Bock
Sagres
Amostras
Figura 3.19: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da evolução dos polifenóis
totais (método de Folin-Ciocalteau) presentes nas amostras de cerveja desde o momento
da abertura (0 horas) até ao final do período de armazenamento (48 horas), a 4ºC.
Método com erro associado de 2%.
3.2.3.2.
Capacidade de resgate de radicais peroxilo (ROO˙)
O método ORAC revelou que as amostras de cerveja em análise não
perderam a sua capacidade de resgatar radicais ROO˙ ao longo das 48
horas de armazenamento a 4ºC. A única quebra registada, 7%, ocorreu
com a amostra Sagres ao fim de 48 horas de armazenamento, como se
confirma na figura 3.20; a cerveja Super Bock manteve a capacidade de
Resgate de radicais peroxilo (μM CAET)
resgate até final.
5600
5400
5200
5000
4800
4600
4400
4200
0 horas
24 horas
48 horas
4000
Super Bock
Sagres
Amostra
Figura 3.20: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da evolução da
capacidade de resgate de radicais peroxilo (método de ORAC) por parte dos compostos
antioxidantes presentes nas amostras de cerveja desde o momento da abertura (0 horas)
até ao final do período de armazenamento (48 horas), a 4ºC.
Método com erro associado de 3%.
55
Resultados e Discussão
3.2.3.3.
Capacidade de inibição de radicais hidroxilo (HO˙)
Como é possível observar na figura 3.21, ao contrário do que aconteceu
com a concentração de polifenóis totais e com a capacidade de resgate de
radicais peroxilo, a capacidade de inibição de radicais hidroxilo diminuiu
ligeiramente ao longo das 48 horas de armazenamento a 4ºC, sendo que,
ao fim desse período, se verificou uma quebra de 40% na amostra de
cerveja Sagres, passando de 6710 µM CAEAC para 4006 µM CAEAC e de
11% na amostra de cerveja Super Bock, passando de 5225 µM CAEAC
Inibição de radicais hidroxilo (μM CAEAC)
para 4624 µM CAEAC.
7500
7000
6500
6000
0 horas
24 horas
48 horas
5500
5000
4500
4000
3500
Super Bock
Sagres
Amostras
Figura 3.21: Estudo do envelhecimento. Representação gráfica da evolução da
capacidade de inibição de radicais hidroxilo (método de HORAC) por parte dos compostos
antioxidantes presentes nas amostras de cerveja desde o momento da abertura (0 horas)
até ao final do período de armazenamento (48 horas), a 4ºC.
Método com erro associado de 6%.
3.2.4.
Capacidade antioxidante
Pelo estudo comparativo de métodos avaliadores da capacidade antioxidante
pode-se
aferir
qual(is)
a(s)
amostra(s),
com
maior
maior
capacidade antioxidante total. É isso que se tenta concluir através da
apresentação do gráfico da figura 3.22.
A cerveja Super Bock Stout (cerveja preta) é claramente a cerveja que
apresenta, na globalidade, a melhor capacidade antioxidante; tanto a capacidade de resgate de radicais ROO˙ como a capacidade de inibição de
radicais HO˙ revelam registos muito bons, destacando-se claramente das
demais amostras. Segue-se a Super Bock Abadia (cerveja ruiva), com um
resultado de ORAC semelhante ao da Super Bock Stout mas com um HORAC um pouco inferior. Depois, um grupo de cervejas composto pela
56
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Sagres Preta, Sagres 0 Preta, Sagres, Cintra, Super Bock Sem Álcool Pêssego
e
Cristal
Preta
apresentam
capacidades
antioxidantes
muito
interessantes, com capacidades de inibição de radicais HO˙ boas/muito
boas e capacidades de resgate de radicais ROO˙ razoáveis/boas.
Figura 3.22: Representação gráfica da inter-relação de métodos utilizados na
determinação da capacidade antioxidante das cervejas (ORAC e HORAC) com a presença
de polifenóis.
É curioso comparar o perfil das cervejas Cintra e Sagres; apesar de produzidas em unidades industriais distintas, utilizam o mesmo malte,
apresentando perfis antioxidantes idênticos.
As cervejas brancas sem álcool, à excepção da Super Bock Sem Álcool
Pêssego, apresentam capacidades antioxidantes manifestamente mais fracas do que as cervejas com álcool, deixando transparecer a ideia que
durante o processo de remoção do álcool muitos dos compostos com bioactividade são neutralizados. Esse facto também é notório nas cervejas
pretas; a Super Bock Preta Sem Álcool apresenta uma capacidade antioxidante bastante pior do que a sua congénere com álcool, o mesmo se
passando com a Sagres 0 Preta, embora não de um modo tão evidente. A
Super Bock Sem Álcool e a Super Bock Sem Álcool Limão, apesar de per57
Resultados e Discussão
derem bastante capacidade de inibição de radicais hidroxilo em relação à
Super Bock, reduzindo a sua actividade antioxidante, mantêm um bom nível de capacidade de resgate de radicais peroxilo.
A evolução dos resultados dos polifenóis totais parece uma réplica dos
resultados do ORAC, favorecendo a ideia da íntima relação entre os
polifenóis totais e a capacidade antioxidante, sobretudo ao nível da
capacidade de resgate de radicais ROO˙.
58
4. Conclusão
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
A primeira conclusão a retirar deste trabalho é que não é possível estabelecer uma correlação entre a região de origem dos vinhos e a sua
capacidade antioxidante. Pelo menos a partir das amostras analisadas,
poucas por região. Talvez com um aumento e diversificação das amostras
fosse possível obter resultados que conduzissem ao esboço de perfis de
capacidade antioxidante de acordo com a região de origem dos vinhos.
Outro factor importante que pode ter influenciado o resultado final é o
modo diversificado como foi feita a amostragem
A linearidade da relação entre os polifenóis presentes na cerveja e a sua
capacidade de resgate de radicais peroxilo permite admitir que um simples
ensaio do método de Folin-Ciocalteau, um método simples e de rápida
aplicação, seja um bom indicador do nível de capacidade antioxidante
duma cerveja. No entanto, apresenta a limitação de só indicar a capacidade de resgate de radicais peroxilo, deixando de fora outros radicais como
HO˙ ou ONOO¯.
In vitro, a capacidade antioxidante da cerveja é inferior à do vinho. Com
os dados obtidos, se se beber um copo de 200 mL (imperial ou fino) de
cerveja preta Super Bock Stout obtém-se a mesma capacidade de resgate
de radicais peroxilo conseguida com a ingestão de 59 mL de vinho tinto;
se, em vez de se beber cerveja preta, se beber 200 mL de cerveja branca
(loura) Carlsberg consegue-se o mesmo efeito obtido com a ingestão de
39 mL de vinho tinto. Se o efeito antioxidante se referir à capacidade de
inibição de radicais hidroxilo, então, o consumo de 200 mL de cerveja
preta (Super Bock Stout) equivale a 67 mL de vinho tinto; o consumo de
200 mL de cerveja loura (Sagres) equivale a 52 mL.
61
5. Perspectivas
Futuras
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Tendo os resultados obtidos com os vinhos sido inconclusivos em
termos de estabelecimento de uma relação entre a sua região de
produção e a sua capacidade antioxidante, seria interessante dar
seguimento a este trabalho com condições mais controladas desde a
produção das uvas à análise dos vinhos, reduzindo ao máximo possíveis
interferências que pudessem condicionar os resultados, por um lado, e
com uma amostragem maior, tornando mais significativo o resultado final.
Seria interessante verificar se o tipo de solo ou se as castas são
também fonte de variação.
65
6. Bibliografia
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[56] Majo, D.; La Guardia, M.; Giammanco, S.; La Neve, L.; Giammanco, M. (2008). The
71
Bibliografia
antioxidant capacity of red wine in relationship with its polyphenolic constituents, Food
Chemistry, 111, pág. 45–49.
[57] Huglin, P.; Schneider, C., Biologie et écologie de la vigne, 1998.
[58] Birse, M.; Pollnitz, A. e Herderich, M., CIELab colour values: Enhanced wine colour
measurement for use by the wine industry and in research applications,
http://www.crcv.com.au/resources/Wine%20Colour%20and%20Flavour/Posters/CIE
%20Lab%20Colour%20Values.pdf.
[59] Rivero-Pérez, M. D.; González-Sanjosé, M. L.; Ortega-Herás, M. e Muñiz, P. (2008).
Antioxidant potential of single-variety red wines aged in the barrel and in the bottle, Food
Chemistry, 111, pág. 957-964.
[60] Lee, J. e Rennaker, C. (2007). Antioxidant capacity and stilbene contents of wines
produced in the Snake River Valley of Idaho, Food Chemistry, 105, pág. 195–203.
[61] Georgé, S; Brat, P.; Alter, P.; Amiot, M. J. (2005). Rapid determination of
polyphenols and vitamin C in plant-derived products, Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 53, pág. 1370−1373.
72
ANEXOS
A
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Anexo 1 :
Amostras analisadas (vinhos)
Os vinhos “Vinha do Mazouco”, “Monte Sacro”, “Vinha das Garças” e “Planura” foram gentilmente cedidos pela UNICER; o vinho “Encostas do Rabaçal” foi gentilmente cedido por José & Barreira Alves – Produtos Alimentares, Lda.; os
vinhos, “Vega”, “Entre Serras”, “Quinta da Garrida”, “Quinta de Pancas”, “Capote Velho Reserva”, “Serradayres”, “Periquita”, “Boa Memória”, “Amoreira”, “Porche's” e “Lagoa Reserva” foram adquiridos num hipermercado “Continente”; os
vinhos “Basalto” e “Porta Velha” foram adquiridos nos armazéns “El Corte Inglés”.
Quadro A.1: Amostras de vinho seleccionadas
N.º
1
Marca
Região
Porta Velha
Trás-osMontes
Ano
2005
Álcool
(%)
Produção
Descrição
13
Produzido e engarrafado
no Casal de Valle
Pradinhos
Este vinho é feito a partir das castas Tinta Roriz e Touriga Nacional cultivadas no Casal de
Valle Pradinhos. O nome Porta Velha refere-se ao portão principal da casa, pelo qual têm
passado tantas e tantas garrafas deste vinho. Trata-se de um vinho de cor vibrante, com
aromas de frutos silvestres e um longo final aveludado, para consumo imediato, embora
tenha a ganhar com alguma permanência em cave.
2
Encostas do
Rabaçal
Trás-osMontes
2005
12,5
3
Vega
Douro
2005
13
São as encostas que ladeiam o rio Rabaçal outrora chamado Mente, nasce em Espanha
atravessa e divide o concelho de Valpaços do de Mirandela. Era esta região atravessada pela
Produzido e engarrafado
Via Romana que ligava S. Tiago mais propriamente nas localidades de Vale de Telhas e
por Adega Cooperativa de
Possacos onde ainda existem vestígios. Também na Corografia Portuguesa de Carvalho da
Valpaços – Caves
Costa (1706) faz referência à ponte Romana sobre o rio Mente e à produção de pão e vinho.
Valpaços, CRL
Esta região está enquadrada na Terra Quente Transmontana, dado o seu clima e tipo de solo
produz excelentes vinhos e faz parte do património vitícola desta Cooperativa.
Engarrafado por DFJ
Vinhos, S.A.
De excelente e intensa cor rubi este vinho apresenta-se-nos cheio de personalidade e sabor.
O seu paladar denota simultaneamente uma deliciosa suavidade e uma riqueza de aromas
maduros a amoras silvestres e cerejas. É um vinho bem encorpado com um longo e seco
final de prova.
75
ANEXOS
Quadro A.1: Amostras de vinho seleccionadas (continuação).
N.º
Marca
Região
Ano
Álcool
(%)
Produção
Descrição
Este vinho tem por base uma criteriosa selecção de uvas das castas Touriga Franca, Tinta
Roriz e Tinta Barroca. É produzido recorrendo à mais moderna tecnologia de vinificação e
sob um rigoroso controlo enológico. Vinho de cor rubi profunda com aroma intenso a fruta
madura e ligeiro tostado. A sua estrutura de taninos confere uma prova cheia, frutada e
elegante.
4
Vinha do Mazouco
Douro
2005
13,5
Engarrafado por UNICER
Vinhos, S.A.
5
Entre Serras
Beiras
2005
13,5
Produzido e engarrafado
por SABE – Soc. Agrícola
da Beira, S.A.
Vinho tinto produzido em solos graníticos na Região da Cova da Beira, nas faldas da Serra
da Estrela, a partir das castas Trincadeira, Tinta Roriz e Tinta Barroca. Contém sulfitos. Não
filtrado. Sujeito a depósito
6
Quinta da Garrida
Beiras
2005
14
Produzido na Quinta da
Garrida, Vila Nova de
Tazém
A partir de uvas seleccionadas das castas Tinta Roriz, Jaen e Touriga Nacional. O estágio de
cerca de 12 meses em barricas de carvalho francês e americano permitiu obter este vinho
harmonioso, com carácter e persistência agradável.
7
8
Quinta de Pancas
Capote Velho
Reserva
Estremadura
Estremadura
2005
2005
13,5
Desde 1498 que o majestoso Solar da Quinta de Pancas e um “terroir” de excepção,
conferem a esta emblemática
Engarrafado por
propriedade características únicas. Da combinação das castas Touriga Nacional, Cabernet
Companhia das Quintas – Sauvignon e Alicante Bouschet nasce este vinho de aroma finamente fumado com notas de
Vinhos, S.A.
compota, menta e especiarias vindas da elegante madeira de carvalho francês onde
estagiou durante 9 meses. Na boca mostra-se suave, volumoso e estruturado, com um final
longo. Recomendado para acompanhar carnes e massas.
13,5
Engarrafado por Goanvi,
Lda.
Este vinho foi vinificado com as castas Touriga Nacional, Syrah e Aragonez, provenientes
das nossas melhores vinhas e fermentado em pequenas cubas de inox à temperatura de
28ºC durante 15 dias com maceração prolongada. O estágio em madeira foi apenas de 3
meses por forma a deixar o vinho exprimir todo o potencial das nobres castas que lhe
deram origem.
Engarrafado por Enoport
– DT – Produção de
Bebidas, S.A.
Serradayres, marca centenária (1881) da região do Ribatejo, é exclusivamente produzido
com uvas da Quinta de S. João Batista. De uvas seleccionadas das castas Castelão,
Trincadeira e Touriga Nacional, obteve-se um vinho de cor granada e aroma complexo onde
predominam os frutos vermelhos e secos. O sabor é frutado e os taninos nobres das
barricas de carvalho francês e amBuckwold, V. E.; Wilson, R. J.; Nalca, A.; Beer, B. B.; Voss,
T. G.; Turpin, J. A.; Buckheit, R. W. 3rd; Wei, J.; Wenzel-Mathers, M.; Walton, E. M.; Smith,
R. J.; Pallansch, M.; Ward, P.; Wells, J.; Chuvala, L.; Sloane, S.; Paulman, R.; Russell, J.;
Hartman, T.; Ptak, R.ericano enaltecem a sua elegância e harmonia.
9
Serradayres
Reserva
Ribatejo
2005
13,5
10
Monte Sacro
Ribatejo
2005
13
76
Vinho elaborado a partir de uma criteriosa selecção de uvas de castas produzidas na região
Engarrafado por Eng. 384
(Tinta Roriz, Tinta Miúda, Trincadeira e Castelão), recorrendo à mais moderna tecnologia de
para UNICER Vinhos, S.A.
vinificação e sob um rigoroso controlo enológico.
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Quadro A.1: Amostras de vinho seleccionadas (continuação).
N.º
11
12
13
14
Marca
Periquita
Vinha das Garças
Planura
Boa Memória
Região
Ano
Terras do Sado 2005
Terras do Sado 2005
Alentejo
Alentejo
2005
2005
Álcool
(%)
Produção
Descrição
13
Produzido e engarrafado
por José Maria da Fonseca
Vinhos, S.A.
A José Maria da Fonseca, fundada em 1834, é uma das mais antigas e prestigiadas
empresas produtoras de vinho em Portugal. Está desde sempre ligada à Península de
Setúbal, onde se produz o vinho Periquita, a marca de vinho de mesa mais antiga de
Portugal, lançada em 1850. As castas Castelão, Trincadeira e Aragonês conferem a este
vinho suave e frutado, aromas a frutos vermelhos e especiarias
Engarrafado por UNICER
Vinhos, S.A.
Vinha das Garças tinto é elaborado a partir de uma cuidada combinação de castas oriundas
do Sul de Portugal, predominantemente Castelão (Periquita). Castas: Predominantemente
Castelão (Periquita) » Cor:Granada »Aroma: Sobressaem os aromas a frutos silvestres »
Sabor: Encorpado e aveludado »Vinificação: Vinho produzido e engarrafado na Região de
Origem sob rigoroso controlo enológico. Maceração e fermentação a temperaturas
controladas. »
13
13,5
Este vinho tem por base uma criteriosa selecção de uvas das castas Aragonês, Trincadeira. e
Engarrafado por Eng. 932 Alicante Bouschet. Planura é produzido recorrendo à mais moderna tecnologia de vinificação
para UNICER Vinhos, S.A. e sob um rigoroso controlo enológico. Vinho de cor rubi com aroma a fruta muito madura e
algumas notas tostadas,suportado por uma estrutura de taninos viva e fácil.
13,5
Produzido e engarrafado
por Soc. Agrícola Monte
Seis Rei, Vinhos, Lda.
(Borba)
No Monte Seis Reis promovemos a Tradição e a Arte da nossa região. Produzimos o Boa
Memória em homenagem a D. João I, 10.º rei de Portugal, a partir das castas Aragonês,
Castelão, Trincadeira e Cabernet Sauvignon. Fermentou com controlo de temperatura e com
a maceração prolongada seguido de ligeiro estágio em madeira.
Fruto das Vinhas existentes na Herdade da Amoreira da Torre, em Montemor-o-Novo, este é
um vinho concebido para dar prazer imediato. Apresenta um carácter de fruta bem
marcante, assente nas características das principais castas regionais que lhe dão origem:
Aragonês e Trincadeira. Na boca surge um vinho com notas de juventude ainda bem
evidentes, num conjunto equilibrado e atractivo.
15
Amoreira
Alentejo
2005
13,5
Produzido e engarrafado
pela Soc. Agrícola do
Freixo do Meio, S.A.
16
Porche's
Algarve
2005
13
Produzido e engarrafado
pela Adega Coop. de
Lagoa, CRL
Produzido a partir das castas Trincadeira, Castelão e Negra Mole, Porche's é um vinho do
Algarve com perfil adequado para combinar com a rica e variada gastronomia regional.
17
Lagoa Reserva
Algarve
2005
13
Produzido e engarrafado
pela Adega Coop. de
Lagoa, CRL
Produzido de uvas Negramole (25%) e Trincadeira (75%). As vinhas, implantadas em solos
de areia, são cultivadas em Protecção Integrada. A vinificação é de meia-curtimenta e por
castas.
12
Produzido e engarrafado
por Cooperativa
Vitivinícola da Ilha do Pico
Como resultado de longos trabalhos experimentais, elegeram-se as castas melhor
adaptadas às peculiaridades edafoclimáticas. Assim surgiu um vinho de cor rubi, definida.
Aroma a frutos vermelhos, evidenciando-se ao sabor da sua juventude, macieza e carácter
frutado.
18
Basalto
Açores
2005
77
ANEXOS
Anexo 2 :
Polifenóis (vinhos)
Quadro A.2: Polifenóis totais presentes nas amostras de vinho.
Determinados pelo método de Folin- Ciocalteau. Os resultados estão expressos em mg/L (EAG). t14
(4ºC) e t14 (Tp. Amb) referem- se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras
armazenadas a 4ºC e à temperatura ambiente, respectivamente. Método com erro associado de
2%.
N.º
Marca
t0
t14 (4ºC)
t14 (Tp. Amb.)
1
Porta Velha (TM)
3477
2716
3411
2
Encostas do Rabaçal (TM)
2244
2072
2127
3
Vega (D)
3361
2754
3355
4
Vinha do Mazouco (D)
3446
2927
3057
5
Entre Serras (B)
2923
2905
2767
6
Quinta da Garrida (B)
3519
3079
3441
7
Quinta de Pancas (E)
3615
3584
3581
8
C apote Velho Reserva (E)
3091
2943
2847
9
Serradayres Reserva (R)
3192
2578
3078
10
Monte Sacro (R)
3151
2648
3120
11
Periquita (TS)
2731
2259
2711
12
Vinha das Garças (TS)
3224
2891
3163
13
Planura (Ale.)
2519
2324
2185
14
Boa Memória (Ale.)
3437
3210
2838
15
Amoreira (Ale.)
2342
1893
1952
16
Porche's (Alg.)
2859
2623
2344
17
Lagoa Reserva (Alg.)
2781
2476
2467
18
Basalto (Aç)
2961
2783
2614
Quadro A.3: Área total dos picos obtidos por
HPLC-DAD (280 nm), traduzindo os polifenóis
presentes nas amostras de vinho.
78
N.º
Marca
1
Porta Velha (TM)
Área Total
2
Encostas do Rabaçal (TM)
3
Vega (D)
4
Vinha do Mazouco (D)
103522049
5
Entre Serras (B)
150429777
6
Quinta da Garrida (B)
88287054
7
Quinta de Pancas (E)
109854838
8
C apote Velho Reserva (E)
99157804
9
Serradayres Reserva (R)
134942766
10
Monte Sacro (R)
11
Periquita (TS)
12
Vinha das Garças (TS)
105248913
78144960
94876646
88007069
94086721
108991682
13
Planura (Ale.)
14
Boa Memória (Ale.)
85522131
15
Amoreira (Ale.)
86306953
16
Porche's (Alg.)
77954194
17
Lagoa Reserva (Alg.)
18
Basalto (Aç)
112687959
79279882
115266028
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Anexo 3 :
Antocianinas (vinhos)
Quadro A.4: Antocianinas poliméricas totais presentes nas amostras de vinho.
Determinadas pelo método do pH diferencial. Os resultados estão expressos em mg/L (EM3G). t14
(4ºC) e t14 (Tp. Amb) referem- se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras
armazenadas a 4ºC e à temperatura ambiente, respectivamente. Método com erro associado de
4%.
Marca
t0
t14 (4ºC)
t14 (Tp. Amb.)
1
Porta Velha (TM)
136
130
132
2
Encostas do Rabaçal (TM)
65
53
55
3
Vega (D)
92
54
72
4
Vinha do Mazouco (D)
83
75
69
5
Entre Serras (B)
113
69
87
6
Quinta da Garrida (B)
97
91
68
7
Quinta de Pancas (E)
112
76
88
8
C apote Velho Reserva (E)
103
82
80
9
Serradayres Reserva (R)
98
89
71
10
Monte Sacro (R)
48
45
51
11
Periquita (TS)
80
61
68
12
Vinha das Garças (TS)
61
50
41
13
Planura (Ale.)
49
36
39
14
Boa Memória (Ale.)
117
77
109
15
Amoreira (Ale.)
73
60
54
16
Porche's (Alg.)
13
0
15
17
Lagoa Reserva (Alg.)
19
9
19
18
Basalto (Aç)
42
44
35
N.º
Quadro A.5: Área total dos picos obtidos por
HPLC- DAD (527 nm), traduzindo as antocianinas
presentes nas amostras de vinho.
N.º
Marca
Área Total
1
Porta Velha (TM)
36830378
2
Encostas do Rabaçal (TM)
12835817
3
Vega (D)
16961118
4
Vinha do Mazouco (D)
16905087
5
Entre Serras (B)
28281923
6
Quinta da Garrida (B)
23199662
7
Quinta de Pancas (E)
23739173
8
C apote Velho Reserva (E)
25034121
9
Serradayres Reserva (R)
29292129
10
Monte Sacro (R)
10449319
11
Periquita (TS)
19352496
12
Vinha das Garças (TS)
11640509
13
Planura (Ale.)
14
Boa Memória (Ale.)
33020930
15
Amoreira (Ale.)
14744192
16
Porche's (Alg.)
1083559
17
Lagoa Reserva (Alg.)
1960395
18
Basalto (Aç)
6804537
8936210
79
ANEXOS
Anexo 4 :
Capacidade antioxidante (vinhos)
Quadro A.6: Capacidade de resgate de radicais peroxilo pelas amostras de vinho.
Determinada pelo método de ORAC. Os resultados estão expressos em μM (CAET). t14 (4ºC) e t14
(Tp. Amb) referem-se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras armazenadas a
4ºC e à temperatura ambiente, respectivamente. Método com erro associado de 3%.
Marca
t0
t14 (4ºC)
t14 (Tp. Amb.)
1
Porta Velha (TM)
40112
36394
34508
2
Encostas do Rabaçal (TM)
35440
33572
31851
3
Vega (D)
40917
37991
35491
4
Vinha do Mazouco (D)
40102
38592
37479
5
Entre Serras (B)
33163
32715
29929
6
Quinta da Garrida (B)
38973
37566
35846
7
Quinta de Pancas (E)
40219
39279
38029
8
C apote Velho Reserva (E)
40038
38380
35930
9
Serradayres Reserva (R)
37899
37043
34449
10
Monte Sacro (R)
39150
38254
36649
11
Periquita (TS)
32713
32641
29388
12
Vinha das Garças (TS)
40351
39803
37286
13
Planura (Ale.)
40118
34027
29080
14
Boa Memória (Ale.)
43813
42056
38430
15
Amoreira (Ale.)
33772
28229
26143
16
Porche's (Alg.)
37493
30946
32285
17
Lagoa Reserva (Alg.)
36083
29250
27573
18
Basalto (Aç)
43288
36183
33969
N.º
Quadro A.7: Capacidade de inibição de radicais hidroxilo pelas amostras de vinho.
Determinada pelo método de HORAC. Os resultados estão expressos em μM (CAEAC). t14 (4ºC) e
t14 (Tp. Amb) referem- se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras armazenadas
a 4ºC e à temperatura ambiente, respectivamente. Método com erro associado de 6%.
Marca
t0
t14 (4ºC)
t14 (Tp. Amb.)
1
Porta Velha (TM)
25830
21766
18701
2
Encostas do Rabaçal (TM)
16899
14596
16598
3
Vega (D)
28824
20899
26784
4
Vinha do Mazouco (D)
28265
19098
27186
5
Entre Serras (B)
27357
17976
24214
6
Quinta da Garrida (B)
16601
14325
16371
7
Quinta de Pancas (E)
34513
20147
29802
8
C apote Velho Reserva (E)
33877
15406
25938
9
Serradayres Reserva (R)
27051
17068
24686
10
Monte Sacro (R)
23441
20191
22146
11
Periquita (TS)
23601
19264
22402
12
Vinha das Garças (TS)
26610
19668
21231
13
Planura (Ale.)
27279
19547
18440
14
Boa Memória (Ale.)
32908
23646
23833
15
Amoreira (Ale.)
15961
16806
14015
16
Porche's (Alg.)
31028
17489
14948
17
Lagoa Reserva (Alg.)
22508
14926
15989
18
Basalto (Aç)
22732
15921
19597
N.º
80
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Quadro A.8: Área total dos picos obtidos por HPLC- ED,
traduzindo a actividade electroquimica dos polifenóis presentes
nas amostras de vinho.
N.º
Marca
Área Total
1
Porta Velha (TM)
182
2
Encostas do Rabaçal (TM)
183
3
Vega (D)
245
4
Vinha do Mazouco (D)
238
5
Entre Serras (B)
160
6
Quinta da Garrida (B)
181
7
Quinta de Pancas (E)
260
8
C apote Velho Reserva (E)
205
9
Serradayres Reserva (R)
232
10
Monte Sacro (R)
212
11
Periquita (TS)
244
12
Vinha das Garças (TS)
179
13
Planura (Ale.)
157
14
Boa Memória (Ale.)
283
15
Amoreira (Ale.)
185
16
Porche's (Alg.)
153
17
Lagoa Reserva (Alg.)
162
18
Basalto (Aç)
179
81
ANEXOS
Anexo 5 :
Amostras analisadas (cervejas)
As cervejas “Super Bock”, “Super Bock Stout”, “Super Bock Sem Álcool”
e “Super Bock Sem Álcool Preta” foram gentilmente cedidas pela UNICER;
as cervejas “Super Bock Sem Álcool Pêssego”, “Super Bock Sem Álcool
Limão” “Super Bock Green”, “Super Bock Abadia”, “Super Bock Tango”,
“Cintra”, “Cheers”, “Carlsberg”, “Cristal”, “Cristal Preta”, “Sagres”, “Sagres
Preta”, “Sagres0” e “Sagres0 Preta” foram adquiridas num hipermercado
“Continente”.
Quadro A.9: Amostras de cerveja seleccionadas
Marca
82
Álcool (% vol.)
Super Bock
5,4
Super Bock Stout (preta)
5,6
Super Bock Sem Álcool
< 0,5
Super Bock Preta Sem Álcool
< 0,5
Super Bock Sem Álcool Pêssego
< 0,5
Super Bock Sem Álcool Limão
< 0,5
Super Bock Green
4,0
Super Bock Abadia
6,8
Super Bock Tango
4,0
Cintra
4,8
Cheers
< 0,5
Carlsberg
5,2
Cristal
5,1
Cristal Preta
4,2
Sagres
5,0
Sagres Preta
4,3
Sagres0
< 0,5
Sagres0 Preta
< 0,5
Avaliação da actividade antioxidante em diferentes tipos de bebidas: vinho e cerveja
Anexo 6 :
Polifenóis (cervejas)
Quadro A.10: Polifenóis totais presentes nas amostras de cerveja.
Determinados pelo método de Folin- Ciocalteau. Os resultados estão expressos em mg/L (EAG). t24
e t48 referem-se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras recolhidas ao fim de
24 e 48 horas, respectivamente. Método com erro associado de 2%.
Marca
t0
t24
t48
1
Super Bock
478
480
8
2
Super Bock Sem Álcool
473
-
-
3
Super Bock Stout
1159
-
-
4
Super Bock Preta Sem Álcool
573
-
-
5
Super Bock Tango
442
-
-
6
Super Bock Sem Álcool Pêssego
531
-
-
7
Super Bock Green
563
-
-
8
Super Bock Sem Álcool Limão
536
-
-
9
Super Bock Abadia
898
-
-
10
C heers
293
-
-
11
C ristal Preta
755
-
-
12
C ristal
419
-
-
13
C arlsberg
563
-
-
14
C intra
483
-
-
15
Sagres
466
441
17
16
Sagres 0
340
-
-
17
Sagres Preta
647
-
-
18
Sagres 0 Preta
609
-
-
N.º
83
ANEXOS
Anexo 7 :
Capacidade antioxidante (cervejas)
Quadro A.11: Capacidade de resgate de radicais peroxilo pelas amostras de cerveja.
Determinada pelo método de ORAC. Os resultados estão expressos em μM (CAET). t24 e t48
referem-se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras recolhidas ao fim de 24 e 48
horas, respectivamente. Método com erro associado de 3%.
N.º
Marca
t0
t24
t48
1
Super Bock
5217
5216
5383
2
Super Bock Sem Álcool
5752
-
-
3
Super Bock Stout
11411
-
-
4
Super Bock Preta Sem Álcool
5324
-
-
5
Super Bock Tango
4768
-
-
6
Super Bock Sem Álcool Pêssego
6250
-
-
7
Super Bock Green
3517
-
-
8
Super Bock Sem Álcool Limão
5386
-
-
9
Super Bock Abadia
9138
-
-
10
C heers
3161
-
-
11
C ristal Preta
7031
-
-
12
C ristal
4521
-
-
13
C arlsberg
6340
-
-
14
C intra
5338
-
-
15
Sagres
4955
5122
4600
16
Sagres 0
3291
-
-
17
Sagres Preta
6532
-
-
18
Sagres 0 Preta
5305
-
-
Quadro A.12: Capacidade de inibição de radicais hidroxilo pelas amostras de cerveja.
Determinada pelo método de HORAC. Os resultados estão expressos em μM (CAEAC). t24 e t48
referem- se ao estudo do envelhecimento, correspondendo às amostras recolhidas ao fim de 24 e 48
horas, respectivamente. Método com erro associado de 6%.
Marca
t0
t24
t48
1
Super Bock
5092
5411
4642
2
Super Bock Sem Álcool
2125
-
-
3
Super Bock Stout
8606
-
-
4
Super Bock Preta Sem Álcool
4772
-
-
5
Super Bock Tango
5895
-
-
6
Super Bock Sem Álcool Pêssego
7134
-
-
7
Super Bock Green
2692
-
-
8
Super Bock Sem Álcool Limão
1338
-
-
9
Super Bock Abadia
8206
-
-
10
C heers
1521
-
-
11
C ristal Preta
6099
-
-
12
C ristal
4158
-
-
13
C arlsberg
4264
-
-
14
C intra
6120
-
-
15
Sagres
6710
6525
4006
16
Sagres 0
1841
-
-
17
Sagres Preta
7714
-
-
18
Sagres 0 Preta
7223
-
-
N.º
84