ر-°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ ë TRABAJOS ORIGINALES Problemática del diagnóstico de la infección por retrovirus humanos (HTLV-1/2) productores de leucemias/linfomas T y síndromes neurológicos degenerativos. Propuesta de un algoritmo alternativo. Balangero Marcos (1), Barbás María Gabriela (2), Berini Carolina (3), Gastaldello René (1), Biglione Mirna (3), Gallego Sandra (1) (1) Instituto de Virología Dr. "J M Vanella" Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba. (2) Laboratorio Central, Ministerio de salud de la provincia de Córdoba. (3) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Departamento de Microbiología, Parasitología e Immunología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina Resumen Evaluamos la utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como una prueba confirmatoria adicional para dilucidar el diagnóstico de infección con HTLV-1/2 en individuos con perfiles de serológicos indeterminados por la técnica de Western blot (Wb). Estos perfiles indeterminados son muy prevalentes y generan incertidumbre en el diagnóstico. Fueron estudiadas por IFI y PCR un total de 47 muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb, 71 muestras confirmadas positivas para HTLV-1/2 por Wb y 63 muestras negativas para HTLV-1/2. 12,8% de las muestras indeterminadas por Wb fueron confirmadas positivas por IFI y PCR y el 70% de las muestras fueron concordantemente negativas por IFI y PCR. Además, se encontraron resultados discordantes en el 17% de las muestras, resultando estas positivas por IFI pero negativas por PCR. Basados en los resultados se propone un algoritmo alternativo para el diagnóstico mediante el cual utilizando la IFI se descartaría rápidamente el alto porcentaje (70%) de los resultados indeterminados por Wb que corresponden a los casos en los que no existe infección y evitando, de este modo, la necesidad de recurrir a técnicas moleculares para la definición del diagnóstico y también la ansiedad que genera en el paciente la opción de un seguimiento serológico. Palabras clave: HTLV-1/2 - IFI- Algoritmo. Troublesome diagnosis of human retroviruses causative agents of T leukaemias/lymphomas and degenerative neurological diseases (HTLV-1/2). Proposal of an alternative algorithm for diagnosis. Summary The present study shows the potential usefulness of IFA in elucidating the status of HTLV-1/2 infection in individuals with indeterminate Wb profiles. These indeterminate Wb patterns are prevalent worldwide. 47 blood samples from indeterminate Wb subjects, 71 samples confirmed positive for HTLV-1/2 by Wb and 63 negative samples for HTLV-1/2 by Wb, were studied using IFA and Nested-PCR. 12, 8% of the indeterminate Wb samples were confirmed positive by IFA and PCR and 70% of the samples were concordantly negative by IFA and PCR. Furthermore, discordant results were found in 17% of the samples. These samples were IFA positive but PCR negative. Based on our results we propose an alternative algorithm using IFA to resolve the diagnosis in the high rate (70%) of indeterminate Wb patterns not associated with HTLV-1/2 infection. Thus, it would not be necessary to use molecular assays nor a serological follow-up of the patient. Key Words: HTLV-1/2 - IFA- Algorithm. Experiencia Médica - Vol. 26 - N° 1 - Pág. 7 a 13 - 2008. 7 ر-°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ ê Experiencia Médica - Vol. 26 - Nº 1 - 2008 Introducción de screening requieren la confirmación de la presencia de anticuerpos específicos para HTLV-1/2 por otras metodologías. El Western blot (Wb) es la técnica de referencia para la confirmación de la infección y es la que define un resultado positivo o negativo para los anticuerpos anti-HTLV-1/2. Sin embargo, una proporción importante de ELISAs reactivos para HTLV-1/2 resulta en un patrón de bandas insuficiente por Wb (17, 18, 19). Los individuos que presentan estos resultados son categorizados serológicamente como indeterminados para HTLV-1/2. Estos perfiles indeterminados por Wb han sido descritos en todo el mundo siendo más frecuentes en áreas tropicales (18, 19, 20). El agente o los agentes causales y la trascendencia médica del estado de indeterminado para HTLV-1/2 están en la actualidad poco claros. Varias explicaciones potenciales han sido sugeridas, incluyendo (I) la reactividad cruzada con otros agentes infecciosos (por ejemplo., Plasmodium sp.) (21) (II) infección con partículas de HTLV-1 defectivas (22, 23), (III) infección con retrovirus nuevos que tienen alta homología con HTLV-1 (24), (IV) e infección con HTLV-1 en individuos que presentan cargas virales que están debajo del alcance de los métodos que se utilizan para la detección. Diferentes secuencias de genes de HTLV-1 pueden ser amplificadas por PCR en los linfomonocitos de sangre periférica (PBMCs) de casi todos los individuos infectados con HTLV-1. Se ha publicado que la mayoría de los individuos indeterminados para HTLV-1/2 son negativos por PCR para las secuencias de genes del virus (18, 19, 25). El objetivo de esta investigación es evaluar la utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como una prueba confirmatoria adicional para el diagnóstico rápido de la infección con HTLV-1/2 en individuos con perfiles de Wb indeterminados. El virus HTLV-1 ha sido identificado como el agente causante de la leucemia/linfoma a células T del adulto y de la paraparesia espástica tropical (TSP / HAM) (1, 2). Además, ha sido demostrado que el virus HTLV-1 está relacionado con otras enfermedades inflamatorias incluyendo varias enfermedades autoimmunes, como artropatía inflamatoria crónica y síndrome de Sjögrens. El virus HTLV-1 se asocia también a polimiositis, uveítis, alveolitis y dermatitis infecciosa (3). El virus HTLV- 2 ha sido relacionado con neoplasias de células T y casos de enfermedad neurodegenerativa (4). La transmisión de los virus HTLV-1/2 podría ocurrir por transfusión de sangre, por vía sexual, de la madre infectada al niño por vía vertical y por el uso drogas endovenosas. El contacto de célula-célula es necesario para una transmisión eficiente del virus HTLV-1 (5) y la transmisión requiere contactos frecuentes entre individuos. Fue demostrado que el riesgo de la infección aumenta con los periodos más prolongados de amamantamiento (> 6 meses) (6, 7) y que el riesgo de transmisión sexual se incrementa en relación con un mayor número de parejas sexuales (8, 9). La infección con HTLV-1/2 ha sido ampliamente documentada en el mundo en zonas endémicas en el sur de Japón, el Caribe, África sub- sahariana y países de Sud América incluyendo Brasil, Colombia, Argentina, Perú, Guayana Francesa y Chile (10, 11, 12, 13,14). El HTLV-2 es endémico entre los amerindios de América del norte, centro y sud América y está diseminado entre consumidores de drogas intravenosas (15, 16). El diagnóstico de las infecciones por HTLV-1/2 se realiza por la detección de anticuerpos específicos en suero o plasma usando ensayos de screening: inmunoensayo ligado a enzimas (enzime linked immunoassay, ELISA) o aglutinación de partícula (AP). Todas las muestras repetidamente reactivas por las pruebas Materiales y métodos Fueron analizadas un total de 181 muestras de sangre periférica correspondientes a personas de diferentes regiones de la Argentina (Buenos Aires, Córdoba, Jujuy). Los pacientes firmaron un consentimiento informado previo a la toma de muestra de sangre. Setenta y una muestras eran positivas para anticuerpos contra los virus HTLV 1/2 (66 HTLV-1 y 5 HTLV-2), 63 muestras eran negativas para HTLV 1/2 y 47 eran reactivas por el ensayo de Correspondencia: Dr. Marcos Balangero Juan Ramirez de Velazco 760 Córdoba. Argentina TE: 0351-4732723 E-mail:[email protected] Recibido: 4 de enero de 2008 Aceptado: 14 de febrero de 2008 8 ر-°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ é PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE HTLV-1/2 screening e indeterminadas por Wb para estos virus. Todas las muestras fueron ensayadas por ELISA (Vironostika HTLV1/2 Organon Teknika), Aglutinación de Partículas de Gelatina (Serodia HTLV-1 Fujirebo Inc., Tokio, Japón) y posteriormente confirmadas por Western blot (HTLV Blot 2.4, Genelabs, Singapur). Todos los ensayos fueron realizados siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados de los ensayos de Wb fueron interpretados según los estrictos criterios de Genelabs Diagnostics. El Wb fue considerado positivo para HTLV-1 solo si la banda para las proteínas gag (p19 y/o p24) y dos proteínas env (GD 21 y rgp 46 I) estaban presentes. Una muestra fue considerada positiva para HTLV2 cuando estaban presentes las bandas para las proteínas gag (p24 y/o p19) y dos proteínas env (GD21 y rgp 46 II). El test fue considerado indeterminado si bandas específicas para HTLV estaban presentes pero no cumplían con el criterio suficiente de positividad. Las muestras fueron consideradas negativas cuando no presentaban ninguna banda específica para proteínas de HTLV-1/2. Inmunofluorescencia Indirecta Todas las muestras de suero fueron probadas por medio de una Inmunofluorescencia Indirecta "in house". Los vidrios fueron preparados utilizando linfocitos T humanos trasformados (MT-2 y Mo-T) e infectados con los virus HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente. Estas células expresan antígenos virales en su superficie y en su citoplasma. La línea celular no infectada Molt-3 fue incluida en los vidrios como control de inespecificidad. La IFI fue realizada siguiendo el procedimiento descrito previamente por Gallego et al (26). Brevemente, se colocan 10-20 ul (dilución 1:4) de las muestra de suero y de los sueros control en los pocillos que contienen las células infectadas y las células no infectadas. Las muestras son incubadas por 30 minutos a 37 ºC en cámara húmeda. Luego el vidrio es lavado tres veces con PBS y posteriormente secado, 10ul de una dilución 1:100 de FITC-conjugado anti IgG humana (Kallestad TM fluorescein conjugated antiserum/Sanofi Diagnostics Pasteur) fue posteriormente agregado a cada pocillo e incubado a 37 ºC en cámara húmeda por 30 minutos. Luego del último lavado una solución de buffer glicerol (pH:8) fue utilizada para el montaje de los vidrios. Los sueros fueron considerados positivos para anticuerpos anti HTLV-1/2 cuando presentaban la fluorescencia característica en el citoplasma de las células infectadas y ausencia de fluorescencia en las células no infectadas. 9 Nested-PCR. Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fueron separadas de muestras de sangre entera por Ficoll-Hypaque. Las células de la interfase fueron recolectadas y lavadas con buffer fosfato (PBS). Las alícuotas conteniendo 1x106 células fueron resuspendidas en 100 ul de buffer de lisis conteniendo 5 mM Tris CLH, 0,5% Twen 20, 0,5% Triton y 80 ug/ml de proteinasa K (Fungal 100mg, Gibco). Se hizo la digestión con proteinasa K por 1 h a 60º C y luego la enzima se inactivó por 10 min. a 95º C. Los lisados fueron mantenidos a 20º C hasta ser utilizados. Una secuencia de -actina fue amplificada como control de calidad del DNA extraído en las muestras (27). A partir de los PBMCs de todas las muestras extraídas se realizó una Nested-PCR para la amplificación de secuencias del provirus de HTLV-1 y HTLV-2. Una secuencia de la región tax/rex, una secuencia genérica del gen tax y una secuencia del gen pol fueron amplificadas en ensayos de Nested-PCR diferentes. Una muestra fue considerada positiva para HTLV1 o HTLV-2 cuando se amplificaron al menos dos secuencias de genes. Resultados Fueron estudiadas por IFI y PCR un total de 47 muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb, 71 muestras confirmadas positivas para HTLV-1/2 por Wb y 63 muestras negativas para HTLV-1/2. Las 71 muestras positivas y las 63 negativas fueron positivas y negativas para anticuerpos anti HTLV-1/2 por IFI, respectivamente, existiendo una completa concordancia entre los resultados de la IFI y el Wb. Por IFI fueron negativas 33/47 (70,2%) de las muestras indeterminadas por Wb, y 14/47 (29,8%) de las muestras indeterminadas por Wb pero positivas por IFI presentaron bajos títulos de anticuerpos por esta ultima técnica (rango 1:4 a 1:64). Se obtuvieron los PBMCs a partir de 181 muestras de sangre entera y la presencia del provirus de HTLV 1/2 fue investigada en ellas. Los resultados se muestran en la Tabla 1. Todas las 71 muestras positivas fueron positivas para HTLV-1/2 por PCR. Así, fueron amplificadas en estas muestras secuencias de 128 pb del gen tax/rex, 219 pb del gen tax (secuencia genérica) y 198 pb o 132 pb del gen pol. Las 63 muestras negativas fueron negativas para todas las ر-°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ è Experiencia Médica - Vol. 26 - Nº 1 - 2008 secuencias del virus evaluadas por PCR. De las 47 muestras indeterminadas por Wb, 6 fueron positivas para al menos dos secuencias virales. De estas últimas fueron tipificadas por PCR 5 como HTLV-1 y 1 como HTLV-2. Se realizó el análisis de los patrones por Wb de las 14 muestras positivas por IFI. De ellos 7 fueron gag indeterminados, 4 env indeterminados y 3 gag/env indeterminados. De las 47 muestras indeterminadas por Wb, 14 fueron positivas por IFI y 6 de ellas fueron concordantemente positivas por PCR. Tres de estas 6 muestras mostraron reactividad contra las proteínas gag y env y dos contra proteínas de gag (Tabla II). De las 3 muestras con reactividad contra gag y env, 2 fueron positivas para HTLV-1 (bandas para P21, P24, P28, P32) y (bandas para GD21, P24) y 1 muestra fue positiva para HTLV-2 (bandas para GD21 y P24). Una de las 2 muestras con reactividad para gag fue positiva para HTLV-1 (p19 y p24) y la otra para HTLV-2 (p19) (Tabla II). Todas las muestras con reactividad para las proteínas del gag (p36, p32, p28, p26, p19 o p36, p28, p26, p19 o p24 solamente) o proteínas env (solamente GD21) fueron negativas por PCR. Tabla I: Presencia de anticuerpos para HTLV-1/2 y de secuencias del provirus en las muestras de sangre correspondientes a las diferentes categorías estudiadas. Patrones de Wb Nº PCR a b POL I TAX I POL II c TAX II d Tax generice IFI Muestras + - positivas PCR vs. IFI HTLV-1 positivo 66 66 66 0 0 66 66 0 66/66 HTLV-2 positivo 5 0 0 5 5 5 5 0 5/5 Indeterminado 47 5 5 1 1 6 14 33 6/14 Negativo 63 0 0 0 0 0 0 63 63/63 Total 181 71 71 6 6 77 85 96 a- gen pol 198 pb (HTLV-1) (30). b- 128 pb de la secuencia del gen tax digerida con la enzima Taq I en 122 pb y 6 pb (perfil HTLV-1) (28). c- gen pol 138 pb (HTLV-2) (30). d- 128 pb de la secuencia del gen tax digerida con la enzima Taq I resultando en 69 pb, 53 pb y 6 pb (perfil HTLV-2) (28). e- gen tax 219 pb (genérica, HTLV-BLV) (29). Tabla II: Reactividad por Western Blot y PCR de las muestras positivas por IFI. Nº IFI Patrones de reactividad por Wb PCR a b POL I TAX I POL II c TAX II d 1 1 1 1 2 + + + + + Wb Indeterminado (p36, p32, p28, p26, p19) Wb Indeterminado (P36, P28, P26, P 19) Wb Indeterminado (GD 21, P24, P28, P32) Wb Indeterminado (GD 21, RGP46I, RGP46II ) Wb Indeterminado (GD21 ,P24) 2 3 1 2 + + + + Wb Wb Wb Wb Indeterminado (p19, p24) Indeterminado (GD 21) Indeterminado (P24) Indeterminado P19) + + 1/2 1/2 - + + 1/2 1/2 - - - 1/2 1/2 1/2 1/2 a- gen pol 198 pb (HTLV-1) (30). b-128 pb de la secuencia tax digerida con la enzima Taq I en 122 pb y 6 pb (perfil HTLV-1 ) (28). c- gen pol 138 pb (HTLV-2) (30). d-128 pb de la secuencia tax digerida con la enzima Taq I resultando en 69 pb, 53 pb y 6bp (perfil HTLV-2) (28). e-gen tax 219pb (generica, HTLV-BLV) (29). 10 ر-°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ ç PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE HTLV-1/2 Discusión por Wb no está claro hasta el momento. Algunos autores argumentan que la presencia de dichos perfiles en áreas no endémicas sugiere que los individuos no están infectados con HTLV-1 o HTLV-2 ya que la mayoría no portan el provirus (32, 33, 34, 35). Sin embargo, otros autores sugieren que estos datos pueden indicar que la prevalencia del virus está muy subestimada en ciertos grupos poblacionales (36, 34). Estudios recientes en Buenos Aires, Argentina (25) mostraron que 5/34 individuos indeterminados por Wb estudiados fueron positivos para HTLV-1 por PCR y 4/5 tenían un perfil de Wb con reactividad para proteínas del env (GD21 o rgp 46II), sugiriendo que la reactividad principalmente con la proteína del env GD21 podría ser indicativa de infección por HTLV-1/2. En este estudio hemos encontrado varios diferentes perfiles de Wb indeterminados en el grupo de individuos positivos por PCR. Así, en estas muestras evaluadas no hemos encontrado patrones específicos que puedan ser sugeridos como indicativos de infección por HTLV-1/2. Además, en este estudio el 50% de las muestras positivas por PCR no tenían reactividad contra la proteína GD21 y todas las muestras que solo presentaban reactividad contra la proteína GD21 fueron negativas por PCR (Tabla II). En estudios realizados en otros países tampoco se encontró asociación entre algún perfil de indeterminado por Wb y la infección confirmada con HTLV-1/2 (37). Sin embargo, sería interesante poder realizar en Argentina estudios multicéntricos para seguimiento de cohortes mayores de estos individuos seroindeterminados a fin de clarificar si es posible determinar uno o más patrones de Wb indeterminados que sean útiles como indicativos de infección. Además, en este tipo de estudios prospectivos otros factores deberían ser considerados tales como conductas y factores de riesgo ambientales, tal como fue realizado previamente en otros grupos poblacionales de Brasil. (38) En estudios previos realizados por nuestro grupo demostramos que la IFI tiene sensibilidad y especificidad comparable con el Wb (39) y que puede entonces ser utilizada como una sencilla técnica alternativa para la confirmación de la infección por HTLV-1/2. Los resultados obtenidos en este trabajo corroboran esto último ya que la IFI detectó correctamente las 71 muestras positivas (66 Los patrones indeterminados por Wb para HTLV1/2 son muy frecuentes en todo el mundo con prevalencias que varían considerablemente de acuerdo al país: Francia (0,033 por mil) (25), Estados Unidos (0,035%) (26, 28), Camerún (11% en población rural) (29) y en Congo (3% en población de mujeres embarazadas) (30). Además los patrones de Wb indeterminados persistentes son muy frecuentes en población de bajo riesgo como los donantes de sangre, en los cuales para resolver el diagnóstico debe recurrirse a un seguimiento serológico prolongado o a la definición del diagnóstico por técnicas moleculares. La evaluación de técnicas serológicas alternativas para ser utilizadas en la confirmación de la infección por HTLV-1 y en la resolución de perfiles serológicos indeterminados, adquiere importancia en los países en desarrollo con zonas endémicas para el virus donde los recursos son limitados y, por ello, las técnicas moleculares no pueden ser usadas masivamente en el diagnóstico. Esta última es la situación de la mayoría de los países de América incluyendo Argentina. El presente estudio demuestra la utilidad de la técnica de inmunofluorescencia indirecta (IFI) para resolver el diagnóstico serológico de la infección por HTLV-1/2 en individuos con perfiles indeterminados por Wb. En este trabajo demostramos que 14 (29,8%) y 33 (79,2%) de los 47 individuos con Wb indeterminados fueron positivos y negativos respectivamente por IFI para HTLV 1/2. Seis de las 14 (12,8%) muestras positivas por IFI fueron también positivas por PCR. Estos resultados muestran claramente que la mayoría de los individuos con Wb indeterminados no están infectados con HTLV-1 o HTLV-2. Sin embargo 4/6 (66,7%) y 2/6 (33,3) de estos individuos están infectados con HTLV-1 y HTLV-2 respectivamente (Tabla I y II), siendo la frecuencia global de positividad entre los indeterminados de 12,o % (HTLV-1 (8,5 %) y HTLV-2 (4,3 %). Nuestros hallazgos son concordantes con lo descrito por autores de otros países que encontraron tasas de positividad por PCR de 15 % a 31 % en grupos de individuos con perfiles indeterminados (31). El significado de estos perfiles indeterminados 11 ر-°Ð®·ªïóîððèò¯¨¼ ðîñðéñîððè ïîæëç ÐZ¹·²¿ ïð Experiencia Médica - Vol. 26 - Nº 1 - 2008 HTLV-1 y 5 HTLV-2) y las 63 muestras negativas. Además, la IFI mostró más sensibilidad que el Wb debido a que detectó 6 muestras positivas entre las 47 muestras indeterminadas por Wb. Estas 6 muestras positivas por IFI fueron concordantemente positivas por PCR (Tabla I). Las principales conclusiones se basan en los siguientes resultados: 12,8 % de las muestras indeterminadas por Wb fueron confirmadas positivas por IFI y PCR y el 70 % de las muestras fueron concordantemente negativas por IFI y PCR. Además, se encontraron resultados discordantes en el 17 % de las muestras, resultando estas positivas por IFI pero negativas por PCR. Basados en nuestros resultados proponemos que sean utilizados una combinación de ensayos serológicos para la confirmación de la presencia de anticuerpos contra HTLV-1/2. Básicamente proponemos que todas las muestras indeterminadas por Wb sean probadas por IFI. Todas las muestras que resulten negativas por IFI demostrarían ausencia de anticuerpos contra HTLV-1/2 y todas las muestras que resulten positivas por IFI deberán ser estudiadas por PCR. Así, las muestras concordantemente positivas por IFI y PCR confirman una infección por HTLV-1/2, mientras que el porcentaje muy bajo de los individuos con resultados discordantes (positivos por IFI y negativos por PCR) deberían ser estudiados en un seguimiento serológico. Este esquema propuesto permitiría realizar un diagnóstico confirmatorio rápido de la infección por HTLV-1/2, descartando rápidamente el alto porcentaje (70%) de los resultados indeterminados por Wb que corresponden a los casos en los que no existe infección y evitando, de este modo, la necesidad de recurrir a técnicas moleculares para la definición del diagnóstico y la ansiedad que genera en el paciente la opción de un seguimiento serológico. Bibliografía 7. Wiktor SZ, Pate EJ, Rosenberg PS, Mother-to-child transmission of human T-cell Agradecimientos Las autores agradecen a las Dras. Lisa Sen y Andrea Mangano del laboratorio de Biología Celular y Retrovirus, Hospital Nacional de Pediatría "J. P. 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