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TRABAJOS ORIGINALES
Problemática del diagnóstico de la infección por retrovirus humanos
(HTLV-1/2) productores de leucemias/linfomas T y síndromes
neurológicos degenerativos. Propuesta de un algoritmo alternativo.
Balangero Marcos (1), Barbás María Gabriela (2), Berini Carolina (3), Gastaldello René (1), Biglione Mirna (3), Gallego Sandra (1)
(1) Instituto de Virología Dr. "J M Vanella" Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba.
(2) Laboratorio Central, Ministerio de salud de la provincia de Córdoba.
(3) Centro Nacional de Referencia para el SIDA, Departamento de Microbiología, Parasitología e Immunología, Facultad de Medicina,
Universidad de Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina
Resumen
Evaluamos la utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como una prueba confirmatoria adicional para
dilucidar el diagnóstico de infección con HTLV-1/2 en individuos con perfiles de serológicos indeterminados por la técnica
de Western blot (Wb). Estos perfiles indeterminados son muy prevalentes y generan incertidumbre en el diagnóstico. Fueron
estudiadas por IFI y PCR un total de 47 muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb, 71 muestras confirmadas
positivas para HTLV-1/2 por Wb y 63 muestras negativas para HTLV-1/2. 12,8% de las muestras indeterminadas por Wb
fueron confirmadas positivas por IFI y PCR y el 70% de las muestras fueron concordantemente negativas por IFI y PCR.
Además, se encontraron resultados discordantes en el 17% de las muestras, resultando estas positivas por IFI pero negativas
por PCR. Basados en los resultados se propone un algoritmo alternativo para el diagnóstico mediante el cual utilizando la IFI
se descartaría rápidamente el alto porcentaje (70%) de los resultados indeterminados por Wb que corresponden a los casos en
los que no existe infección y evitando, de este modo, la necesidad de recurrir a técnicas moleculares para la definición del
diagnóstico y también la ansiedad que genera en el paciente la opción de un seguimiento serológico.
Palabras clave: HTLV-1/2 - IFI- Algoritmo.
Troublesome diagnosis of human retroviruses causative agents of T leukaemias/lymphomas and
degenerative neurological diseases (HTLV-1/2). Proposal of an alternative algorithm for diagnosis.
Summary
The present study shows the potential usefulness of IFA in elucidating the status of HTLV-1/2 infection in
individuals with indeterminate Wb profiles. These indeterminate Wb patterns are prevalent worldwide. 47 blood samples from
indeterminate Wb subjects, 71 samples confirmed positive for HTLV-1/2 by Wb and 63 negative samples for HTLV-1/2 by
Wb, were studied using IFA and Nested-PCR. 12, 8% of the indeterminate Wb samples were confirmed positive by IFA and
PCR and 70% of the samples were concordantly negative by IFA and PCR. Furthermore, discordant results were found in
17% of the samples. These samples were IFA positive but PCR negative.
Based on our results we propose an alternative algorithm using IFA to resolve the diagnosis in the high rate (70%)
of indeterminate Wb patterns not associated with HTLV-1/2 infection. Thus, it would not be necessary to use molecular assays
nor a serological follow-up of the patient.
Key Words: HTLV-1/2 - IFA- Algorithm.
Experiencia Médica - Vol. 26 - N° 1 - Pág. 7 a 13 - 2008.
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Experiencia Médica - Vol. 26 - Nº 1 - 2008
Introducción
de screening requieren la confirmación de la presencia de
anticuerpos específicos para HTLV-1/2 por otras
metodologías. El Western blot (Wb) es la técnica de
referencia para la confirmación de la infección y es la que
define un resultado positivo o negativo para los
anticuerpos anti-HTLV-1/2. Sin embargo, una proporción
importante de ELISAs reactivos para HTLV-1/2 resulta en
un patrón de bandas insuficiente por Wb (17, 18, 19). Los
individuos que presentan estos resultados son
categorizados serológicamente como indeterminados para
HTLV-1/2. Estos perfiles indeterminados por Wb han sido
descritos en todo el mundo siendo más frecuentes en áreas
tropicales (18, 19, 20). El agente o los agentes causales y
la trascendencia médica del estado de indeterminado para
HTLV-1/2 están en la actualidad poco claros. Varias
explicaciones potenciales han sido sugeridas, incluyendo
(I) la reactividad cruzada con otros agentes infecciosos
(por ejemplo., Plasmodium sp.) (21) (II) infección con
partículas de HTLV-1 defectivas (22, 23), (III) infección
con retrovirus nuevos que tienen alta homología con
HTLV-1 (24), (IV) e infección con HTLV-1 en individuos
que presentan cargas virales que están debajo del alcance
de los métodos que se utilizan para la detección.
Diferentes secuencias de genes de HTLV-1 pueden
ser amplificadas por PCR en los linfomonocitos de sangre
periférica (PBMCs) de casi todos los individuos infectados
con HTLV-1. Se ha publicado que la mayoría de los
individuos indeterminados para HTLV-1/2 son negativos
por PCR para las secuencias de genes del virus (18, 19, 25).
El objetivo de esta investigación es evaluar la
utilidad de una Inmunofluorescencia indirecta (IFI) como
una prueba confirmatoria adicional para el diagnóstico
rápido de la infección con HTLV-1/2 en individuos con
perfiles de Wb indeterminados.
El virus HTLV-1 ha sido identificado como el
agente causante de la leucemia/linfoma a células T del
adulto y de la paraparesia espástica tropical (TSP / HAM)
(1, 2). Además, ha sido demostrado que el virus HTLV-1
está relacionado con otras enfermedades inflamatorias
incluyendo varias enfermedades autoimmunes, como
artropatía inflamatoria crónica y síndrome de Sjögrens. El
virus HTLV-1 se asocia también a polimiositis, uveítis,
alveolitis y dermatitis infecciosa (3). El virus HTLV- 2 ha
sido relacionado con neoplasias de células T y casos de
enfermedad neurodegenerativa (4).
La transmisión de los virus HTLV-1/2 podría
ocurrir por transfusión de sangre, por vía sexual, de la
madre infectada al niño por vía vertical y por el uso drogas
endovenosas. El contacto de célula-célula es necesario
para una transmisión eficiente del virus HTLV-1 (5) y la
transmisión requiere contactos frecuentes entre
individuos. Fue demostrado que el riesgo de la infección
aumenta con los periodos más prolongados de
amamantamiento (> 6 meses) (6, 7) y que el riesgo de
transmisión sexual se incrementa en relación con un
mayor número de parejas sexuales (8, 9).
La infección con HTLV-1/2 ha sido ampliamente
documentada en el mundo en zonas endémicas en el sur
de Japón, el Caribe, África sub- sahariana y países de Sud
América incluyendo Brasil, Colombia, Argentina, Perú,
Guayana Francesa y Chile (10, 11, 12, 13,14). El HTLV-2
es endémico entre los amerindios de América del norte,
centro y sud América y está diseminado entre
consumidores de drogas intravenosas (15, 16).
El diagnóstico de las infecciones por HTLV-1/2
se realiza por la detección de anticuerpos específicos en
suero o plasma usando ensayos de screening:
inmunoensayo ligado a enzimas (enzime linked
immunoassay, ELISA) o aglutinación de partícula (AP).
Todas las muestras repetidamente reactivas por las pruebas
Materiales y métodos
Fueron analizadas un total de 181 muestras de
sangre periférica correspondientes a personas de diferentes
regiones de la Argentina (Buenos Aires, Córdoba, Jujuy).
Los pacientes firmaron un consentimiento
informado previo a la toma de muestra de sangre. Setenta y
una muestras eran positivas para anticuerpos contra los virus
HTLV 1/2 (66 HTLV-1 y 5 HTLV-2), 63 muestras eran
negativas para HTLV 1/2 y 47 eran reactivas por el ensayo de
Correspondencia:
Dr. Marcos Balangero
Juan Ramirez de Velazco 760
Córdoba. Argentina
TE: 0351-4732723
E-mail:[email protected]
Recibido: 4 de enero de 2008
Aceptado: 14 de febrero de 2008
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PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE HTLV-1/2
screening e indeterminadas por Wb para estos virus. Todas las
muestras fueron ensayadas por ELISA (Vironostika HTLV1/2 Organon Teknika), Aglutinación de Partículas de Gelatina
(Serodia HTLV-1 Fujirebo Inc., Tokio, Japón) y
posteriormente confirmadas por Western blot (HTLV Blot
2.4, Genelabs, Singapur). Todos los ensayos fueron realizados
siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados de
los ensayos de Wb fueron interpretados según los estrictos
criterios de Genelabs Diagnostics. El Wb fue considerado
positivo para HTLV-1 solo si la banda para las proteínas gag
(p19 y/o p24) y dos proteínas env (GD 21 y rgp 46 I) estaban
presentes. Una muestra fue considerada positiva para HTLV2 cuando estaban presentes las bandas para las proteínas gag
(p24 y/o p19) y dos proteínas env (GD21 y rgp 46 II). El test
fue considerado indeterminado si bandas específicas para
HTLV estaban presentes pero no cumplían con el criterio
suficiente de positividad. Las muestras fueron consideradas
negativas cuando no presentaban ninguna banda específica
para proteínas de HTLV-1/2.
Inmunofluorescencia Indirecta
Todas las muestras de suero fueron probadas por
medio de una Inmunofluorescencia Indirecta "in house".
Los vidrios fueron preparados utilizando linfocitos T
humanos trasformados (MT-2 y Mo-T) e infectados con los
virus HTLV-1 y HTLV-2, respectivamente. Estas células
expresan antígenos virales en su superficie y en su
citoplasma. La línea celular no infectada Molt-3 fue incluida
en los vidrios como control de inespecificidad. La IFI fue
realizada siguiendo el procedimiento descrito previamente
por Gallego et al (26). Brevemente, se colocan 10-20 ul
(dilución 1:4) de las muestra de suero y de los sueros control
en los pocillos que contienen las células infectadas y las
células no infectadas. Las muestras son incubadas por 30
minutos a 37 ºC en cámara húmeda. Luego el vidrio es
lavado tres veces con PBS y posteriormente secado, 10ul de
una dilución 1:100 de FITC-conjugado anti IgG humana
(Kallestad TM fluorescein conjugated antiserum/Sanofi
Diagnostics Pasteur) fue posteriormente agregado a cada
pocillo e incubado a 37 ºC en cámara húmeda por 30
minutos. Luego del último lavado una solución de buffer
glicerol (pH:8) fue utilizada para el montaje de los vidrios.
Los sueros fueron considerados positivos para anticuerpos
anti HTLV-1/2 cuando presentaban la fluorescencia
característica en el citoplasma de las células infectadas y
ausencia de fluorescencia en las células no infectadas.
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Nested-PCR.
Las células mononucleares de sangre periférica
(PBMCs) fueron separadas de muestras de sangre entera por
Ficoll-Hypaque. Las células de la interfase fueron recolectadas
y lavadas con buffer fosfato (PBS). Las alícuotas conteniendo
1x106 células fueron resuspendidas en 100 ul de buffer de lisis
conteniendo 5 mM Tris CLH, 0,5% Twen 20, 0,5% Triton y 80
ug/ml de proteinasa K (Fungal 100mg, Gibco).
Se hizo la digestión con proteinasa K por 1 h a 60º
C y luego la enzima se inactivó por 10 min. a 95º C. Los
lisados fueron mantenidos a 20º C hasta ser utilizados.
Una secuencia de -actina fue amplificada como
control de calidad del DNA extraído en las muestras (27).
A partir de los PBMCs de todas las muestras
extraídas se realizó una Nested-PCR para la amplificación
de secuencias del provirus de HTLV-1 y HTLV-2. Una
secuencia de la región tax/rex, una secuencia genérica del
gen tax y una secuencia del gen pol fueron amplificadas en
ensayos de Nested-PCR diferentes.
Una muestra fue considerada positiva para HTLV1 o HTLV-2 cuando se amplificaron al menos dos
secuencias de genes.
Resultados
Fueron estudiadas por IFI y PCR un total de 47
muestras de sangre con patrones indeterminados por Wb,
71 muestras confirmadas positivas para HTLV-1/2 por Wb
y 63 muestras negativas para HTLV-1/2.
Las 71 muestras positivas y las 63 negativas fueron
positivas y negativas para anticuerpos anti HTLV-1/2 por
IFI, respectivamente, existiendo una completa concordancia
entre los resultados de la IFI y el Wb. Por IFI fueron
negativas 33/47 (70,2%) de las muestras indeterminadas por
Wb, y 14/47 (29,8%) de las muestras indeterminadas por
Wb pero positivas por IFI presentaron bajos títulos de
anticuerpos por esta ultima técnica (rango 1:4 a 1:64).
Se obtuvieron los PBMCs a partir de 181 muestras
de sangre entera y la presencia del provirus de HTLV 1/2
fue investigada en ellas. Los resultados se muestran en la
Tabla 1. Todas las 71 muestras positivas fueron positivas
para HTLV-1/2 por PCR. Así, fueron amplificadas en estas
muestras secuencias de 128 pb del gen tax/rex, 219 pb del
gen tax (secuencia genérica) y 198 pb o 132 pb del gen pol.
Las 63 muestras negativas fueron negativas para todas las
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Experiencia Médica - Vol. 26 - Nº 1 - 2008
secuencias del virus evaluadas por PCR. De las 47 muestras
indeterminadas por Wb, 6 fueron positivas para al menos
dos secuencias virales. De estas últimas fueron tipificadas
por PCR 5 como HTLV-1 y 1 como HTLV-2.
Se realizó el análisis de los patrones por Wb de
las 14 muestras positivas por IFI. De ellos 7 fueron gag
indeterminados, 4 env indeterminados y 3 gag/env
indeterminados. De las 47 muestras indeterminadas por
Wb, 14 fueron positivas por IFI y 6 de ellas fueron
concordantemente positivas por PCR. Tres de estas 6
muestras mostraron reactividad contra las proteínas gag y
env y dos contra proteínas de gag (Tabla II). De las 3
muestras con reactividad contra gag y env, 2 fueron
positivas para HTLV-1 (bandas para P21, P24, P28, P32) y
(bandas para GD21, P24) y 1 muestra fue positiva para
HTLV-2 (bandas para GD21 y P24). Una de las 2 muestras
con reactividad para gag fue positiva para HTLV-1 (p19 y
p24) y la otra para HTLV-2 (p19) (Tabla II).
Todas las muestras con reactividad para las
proteínas del gag (p36, p32, p28, p26, p19 o p36, p28, p26,
p19 o p24 solamente) o proteínas env (solamente GD21)
fueron negativas por PCR.
Tabla I: Presencia de anticuerpos para HTLV-1/2 y de secuencias del provirus en las muestras de sangre
correspondientes a las diferentes categorías estudiadas.
Patrones de Wb
Nº
PCR
a
b
POL I TAX I POL II c TAX II d Tax generice
IFI
Muestras
+
-
positivas PCR vs. IFI
HTLV-1 positivo
66
66
66
0
0
66
66
0
66/66
HTLV-2 positivo
5
0
0
5
5
5
5
0
5/5
Indeterminado
47
5
5
1
1
6
14 33
6/14
Negativo
63
0
0
0
0
0
0
63
63/63
Total
181
71
71
6
6
77
85
96
a- gen pol 198 pb (HTLV-1) (30).
b- 128 pb de la secuencia del gen tax digerida con la enzima Taq I en 122 pb y 6 pb (perfil HTLV-1) (28).
c- gen pol 138 pb (HTLV-2) (30).
d- 128 pb de la secuencia del gen tax digerida con la enzima Taq I resultando en 69 pb, 53 pb y 6 pb (perfil HTLV-2) (28).
e- gen tax 219 pb (genérica, HTLV-BLV) (29).
Tabla II: Reactividad por Western Blot y PCR de las muestras positivas por IFI.
Nº
IFI
Patrones de reactividad por Wb
PCR
a
b
POL I TAX I POL II c TAX II d
1
1
1
1
2
+
+
+
+
+
Wb Indeterminado (p36, p32, p28, p26, p19)
Wb Indeterminado (P36, P28, P26, P 19)
Wb Indeterminado (GD 21, P24, P28, P32)
Wb Indeterminado (GD 21, RGP46I, RGP46II )
Wb Indeterminado (GD21 ,P24)
2
3
1
2
+
+
+
+
Wb
Wb
Wb
Wb
Indeterminado (p19, p24)
Indeterminado (GD 21)
Indeterminado (P24)
Indeterminado P19)
+
+
1/2
1/2
-
+
+
1/2
1/2
-
-
-
1/2
1/2
1/2
1/2
a- gen pol 198 pb (HTLV-1) (30).
b-128 pb de la secuencia tax digerida con la enzima Taq I en 122 pb y 6 pb (perfil HTLV-1 ) (28).
c- gen pol 138 pb (HTLV-2) (30).
d-128 pb de la secuencia tax digerida con la enzima Taq I resultando en 69 pb, 53 pb y 6bp (perfil HTLV-2) (28).
e-gen tax 219pb (generica, HTLV-BLV) (29).
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PROPUESTA DE ALGORITMO DIAGNÓSTICO DE HTLV-1/2
Discusión
por Wb no está claro hasta el momento. Algunos autores
argumentan que la presencia de dichos perfiles en áreas no
endémicas sugiere que los individuos no están infectados
con HTLV-1 o HTLV-2 ya que la mayoría no portan el
provirus (32, 33, 34, 35).
Sin embargo, otros autores sugieren que estos
datos pueden indicar que la prevalencia del virus está muy
subestimada en ciertos grupos poblacionales (36, 34).
Estudios recientes en Buenos Aires, Argentina
(25) mostraron que 5/34 individuos indeterminados por
Wb estudiados fueron positivos para HTLV-1 por PCR y
4/5 tenían un perfil de Wb con reactividad para proteínas
del env (GD21 o rgp 46II), sugiriendo que la reactividad
principalmente con la proteína del env GD21 podría ser
indicativa de infección por HTLV-1/2. En este estudio
hemos encontrado varios diferentes perfiles de Wb
indeterminados en el grupo de individuos positivos por
PCR. Así, en estas muestras evaluadas no hemos
encontrado patrones específicos que puedan ser sugeridos
como indicativos de infección por HTLV-1/2. Además, en
este estudio el 50% de las muestras positivas por PCR no
tenían reactividad contra la proteína GD21 y todas las
muestras que solo presentaban reactividad contra la
proteína GD21 fueron negativas por PCR (Tabla II). En
estudios realizados en otros países tampoco se encontró
asociación entre algún perfil de indeterminado por Wb y la
infección confirmada con HTLV-1/2 (37). Sin embargo,
sería interesante poder realizar en Argentina estudios
multicéntricos para seguimiento de cohortes mayores de
estos individuos seroindeterminados a fin de clarificar si es
posible determinar uno o más patrones de Wb
indeterminados que sean útiles como indicativos de
infección. Además, en este tipo de estudios prospectivos
otros factores deberían ser considerados tales como
conductas y factores de riesgo ambientales, tal como fue
realizado previamente en otros grupos poblacionales de
Brasil. (38)
En estudios previos realizados por nuestro grupo
demostramos que la IFI tiene sensibilidad y especificidad
comparable con el Wb (39) y que puede entonces ser
utilizada como una sencilla técnica alternativa para la
confirmación de la infección por HTLV-1/2. Los resultados
obtenidos en este trabajo corroboran esto último ya que la
IFI detectó correctamente las 71 muestras positivas (66
Los patrones indeterminados por Wb para HTLV1/2 son muy frecuentes en todo el mundo con prevalencias
que varían considerablemente de acuerdo al país: Francia
(0,033 por mil) (25), Estados Unidos (0,035%) (26, 28),
Camerún (11% en población rural) (29) y en Congo (3% en
población de mujeres embarazadas) (30). Además los
patrones de Wb indeterminados persistentes son muy
frecuentes en población de bajo riesgo como los donantes
de sangre, en los cuales para resolver el diagnóstico debe
recurrirse a un seguimiento serológico prolongado o a la
definición del diagnóstico por técnicas moleculares.
La evaluación de técnicas serológicas alternativas
para ser utilizadas en la confirmación de la infección por
HTLV-1 y en la resolución de perfiles serológicos
indeterminados, adquiere importancia en los países en
desarrollo con zonas endémicas para el virus donde los
recursos son limitados y, por ello, las técnicas moleculares
no pueden ser usadas masivamente en el diagnóstico. Esta
última es la situación de la mayoría de los países de
América incluyendo Argentina. El presente estudio
demuestra la utilidad de la técnica de inmunofluorescencia
indirecta (IFI) para resolver el diagnóstico serológico de la
infección por HTLV-1/2 en individuos con perfiles
indeterminados por Wb.
En este trabajo demostramos que 14 (29,8%) y 33
(79,2%) de los 47 individuos con Wb indeterminados
fueron positivos y negativos respectivamente por IFI para
HTLV 1/2.
Seis de las 14 (12,8%) muestras positivas por
IFI fueron también positivas por PCR. Estos resultados
muestran claramente que la mayoría de los individuos
con Wb indeterminados no están infectados con HTLV-1
o HTLV-2. Sin embargo 4/6 (66,7%) y 2/6 (33,3) de estos
individuos están infectados con HTLV-1 y HTLV-2
respectivamente (Tabla I y II), siendo la frecuencia global
de positividad entre los indeterminados de 12,o %
(HTLV-1 (8,5 %) y HTLV-2 (4,3 %). Nuestros hallazgos
son concordantes con lo descrito por autores de otros
países que encontraron tasas de positividad por PCR de
15 % a 31 % en grupos de individuos con perfiles
indeterminados (31).
El significado de estos perfiles indeterminados
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HTLV-1 y 5 HTLV-2) y las 63 muestras negativas.
Además, la IFI mostró más sensibilidad que el Wb debido
a que detectó 6 muestras positivas entre las 47 muestras
indeterminadas por Wb. Estas 6 muestras positivas por IFI
fueron concordantemente positivas por PCR (Tabla I).
Las principales conclusiones se basan en los
siguientes resultados: 12,8 % de las muestras
indeterminadas por Wb fueron confirmadas positivas por IFI
y PCR y el 70 % de las muestras fueron concordantemente
negativas por IFI y PCR. Además, se encontraron resultados
discordantes en el 17 % de las muestras, resultando estas
positivas por IFI pero negativas por PCR.
Basados en nuestros resultados proponemos que
sean utilizados una combinación de ensayos serológicos
para la confirmación de la presencia de anticuerpos contra
HTLV-1/2. Básicamente proponemos que todas las
muestras indeterminadas por Wb sean probadas por IFI.
Todas las muestras que resulten negativas por IFI
demostrarían ausencia de anticuerpos contra HTLV-1/2 y
todas las muestras que resulten positivas por IFI deberán
ser estudiadas por PCR.
Así, las muestras concordantemente positivas por
IFI y PCR confirman una infección por HTLV-1/2,
mientras que el porcentaje muy bajo de los individuos con
resultados discordantes (positivos por IFI y negativos por
PCR) deberían ser estudiados en un seguimiento
serológico.
Este esquema propuesto permitiría realizar un
diagnóstico confirmatorio rápido de la infección por
HTLV-1/2, descartando rápidamente el alto porcentaje
(70%) de los resultados indeterminados por Wb que
corresponden a los casos en los que no existe infección y
evitando, de este modo, la necesidad de recurrir a técnicas
moleculares para la definición del diagnóstico y la
ansiedad que genera en el paciente la opción de un
seguimiento serológico.
Bibliografía
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Agradecimientos
Las autores agradecen a las Dras. Lisa Sen y
Andrea Mangano del laboratorio de Biología Celular y
Retrovirus, Hospital Nacional de Pediatría "J. P.
Garrahan", Buenos Aires, Argentina por haber cedido
amablemente muestras con patrones indeterminados por
Wb para la infección con HTLV-1/2, las cuales fueron
utilizadas en este estudio.
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