XII Salão de
Iniciação Científica
PUCRS
Determinação do polimorfismo D/I do gene da enzima conversora
de angiotensina em indivíduos com e sem síndrome metabólica –
estudo piloto
Liana Paula Abreu da Silva1, Patrícia Donini Rodrigues1, Ana Maria Feoli2, Fabrício Edler
Macagnan2, Virgínia Minghelli Schmitt1 (orientador)
1
Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Farmácia, PUCRS, 2 Faculdade de Enfermagem,
Nutrição e Fisioterapia, PUCRS
Introdução
A Síndrome Metabólica (SM) é constituída por um conjunto de achados que
representam um risco aumentado para o desenvolvimento de doenças cardiovasculares e
diabetes melito tipo 2 (Geloneze, 2006). É um transtorno complexo, caracterizado pela
associação de dislipidemia, intolerância à glicose, hipertensão arterial, obesidade abdominal,
hipertrigliceridemia e resistência à insulina, sendo esses parâmetros utilizados para o
diagnóstico desta síndrome, seguindo a I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da
Síndrome Metabólica de 2005 (SBC, 2005).
Diversos polimorfismos têm sido estudados como predisponentes à SM, entre eles, o
polimorfismo D/I do gene da enzima conversora de angiotensina (ECA) que se caracteriza
pela presença de um fragmento com cerca de 287pb na variante de inserção (I) e ausência na
variante de deleção (D), resultando em três possíveis genótipos: DD, DI e II. Estudos
mostraram que este polimorfismo influencia na concentração sérica da ECA, sendo mais
elevada em indivíduos que apresentam o genótipo DD e menores em indivíduos que possuem
genótipo II. Os indivíduos com genótipo DI apresentam níveis intermediários. (Lima, 2007;
Higashimori, 2003). A atividade da ECA consiste em converter a angiotensina I (Ang I) em
angiotensina II (Ang II), proteína que faz parte do sistema Renina-Angiotensina, importante
no controle da pressão arterial (PA). A ação da Ang II está associada à vasoconstrição e ao
aumento da PA. Como foi relatada a produção de Ang II pelos adipócitos viscerais (Jaramillo,
2010), este aumento de produção poderia estar associado à elevação da PA em indivíduos
com maior quantidade de adipócitos, como é o caso de indivíduos com SM, sendo que um dos
critérios de inclusão da SM é a hipertensão.
XII Salão de Iniciação Científica – PUCRS, 03 a 07 de outubro de 2011
O programa MERC (Modificação do Estilo de vida e Risco Cardiovascular),
desenvolvido por um grupo multidisciplinar na PUCRS coordenado pela FAENFI, tem como
objetivo proporcionar uma mudança no estilo de vida de indivíduos com SM, através de
intervenção nutricional associada ou não à prática de atividade física supervisionada.
Parâmetros antropométricos, clínicos e bioquímicos são avaliados ao início e ao final da
participação no estudo, além da análise de polimorfismos genéticos predisponentes.
Este trabalho apresenta resultados de um estudo piloto para estabelecimento da
pesquisa do polimorfismo D/I da ECA utilizando a técnica da reação em cadeia da polimerase
(PCR) para ser realizada nos indivíduos com síndrome metabólica participantes do programa
MERC e em indivíduos sem SM, com a finalidade de investigar a influência deste
polimorfismo no desenvolvimento da síndrome.
Metodologia
Para o teste piloto de determinação do genótipo da ECA utilizando a técnica de PCR,
foram selecionadas de forma aleatória 44 amostras de DNA extraídos de 22 indivíduos com
SM participantes do projeto MERC e 22 controles (sem SM) armazenados no Laboratório de
Biologia Molecular da FFARM-PUCRS. O estudo MERC foi aprovado pelo Comitê de Ética
em Pesquisa da PUCRS (protocolo 06/03024) e todos os participantes assinaram o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido que incluia a análise genética. O DNA foi extraído
utilizando protocolo padrão (Lahiri, 1991) e mantido na temperatura de -20°C. O
polimorfismo da ECA foi determinado através de PCR, utilizando primers que reconhecem
sequências comuns aos dois alelos (D e I) (direto: 5’– CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT
TCT-3’; reverso: 5’-GAG GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGAT-3’), gerando amplicons
de 480pb para a variante alélica I e de 190pb para a variante D. O volume total da reação foi
25µL, contendo 2mM MgCl2, 2mM Tris-HCl pH8,4 , 5mM KCl, 20pmol de cada primer
(IDT), 200µM da mistura de dNTPs (Invitrogen), 1% DMSO (Sigma), 1U Taq DNA
polimerase (EasyTaq, 4G). As condições da reação foram: desnaturação inicial a 94°C por 3
minutos, 30 ciclos com desnaturação a 94°C por 1 minuto, anelamento a 52°C por 1 minuto e
extensão a 72°C por 1 minuto, extensão final a 72°C por 5 minutos (Rigat, 1992). A
visualização dos amplicons foi realizada por meio de eletroforese em gel de agarose 1,5%
contendo 0,5µg/µL de brometo de etídio, seguida de observação em luz ultravioleta.
Resultados e Discussão
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Das 44 amostras testadas para o polimorfismo D/I da ECA, em 5 dos indivíduos com
SM não houve amplificação e em 4 dos controles, totalizando 17 amostras de SM e 18 de
controles para a análise. A não amplificação de algumas amostras de DNA armazenadas
sugere uma provável alteração/degradação do DNA, provavelmente associada a uma
qualidade não adequada do DNA extraído. Entre os indivíduos com SM, a distribuição dos
genótipos foi: DD 3 (17,7%), DI 9 (52,9%), II 5 (29,4%), e para os controles DD 3 (16,7%),
DI 10 (55,5%,; II 5 (27,8%), não apresentando diferença significativa na distribuição
(p<0,05). A frequência alélica observada nos dois grupos foi idêntica: para a variante alélica
D 0,44 e para a variante I 0,56.
Conclusão
Este estudo mostrou que a técnica de PCR para determinação dos genótipos do
polimorfismo D/I da ECA é adequada para investigar os indivíduos participantes do estudo
MERC, porém a qualidade do DNA extraído deve ser aprimorada. Não houve diferença na
distribuição dos genótipos entre indivíduos com ou sem SM, porém este é apenas um estudo
piloto que deverá ser continuado com a totalidade dos participantes do estudo MERC, quando
esta análise deverá ser realizada novamente.
Referências
GELONEZE, B., Síndrome Metabólica: Mito ou Realidade?. Arq Bras Endocrinol Metab. Vol. 50, N° 3
(2006), pp. 0409 – 0411.
HIGASHIMORI, K.; ZHAO, Y.; HIGAKI, J.; KAMITANI, A.; KATSUYA, T.; NAKURA, J.; MIKI,
T.; MIKAMI, H.; OGIHARA, T. Association analysis of a polymorphism of the angiotensin
converting enzyme gene with essencial hypertensin in Japanese population. Biochem Biophys
Res Commun, v. 191, p. 399-404, 1993
LAHIRI, D.K., NURNBERGER, Jr.JI, A rapid non-enzymatic method for the preparation of HMW DNA from
blood for RFLP studies. Nucleic Acids Res. Vol. 19, N° 19 (1991), pp. 5444.
LIMA,S.G, HATAGIMA,A.,SILVA,N.L.C.L.,Sistema Renina-Angiotensina: é Possível Identificar Genes de
Suscetibilidade à Hipertensão?. Arq Bras Cardiol. (2007), pp. 0427 – 0433.
RIGAT B, HUBERT C, CORVOL P, et al. PCR detection of the polymorphism of the human angiotensin
converting enzyme gene (DCP1 (dipeptidyl carboxypeptidase1) Nucl Ac Res. Vol. 20, N° 6(1992), pp. 1343 –
1346.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA. I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da SM de
2005. Arq Bras Card. V.84, supl I, p.1-28. 2005. Disponível em
http://www.scielo.br/pdf/abc/v84s1/a01v84s1.pdf. Acessado em 01 de julho de 2011.
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