MAPA/SDA/CGAL
Código: MET POA/16/02/02
Laboratório Nacional Agropecuário - LANAGRO/RS
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Laboratório de Produtos de Origem Animal
Emissão: 07/08/2014
Método de Ensaio - MET
Pesquisa de Fosfatase Alcalina em Leite Fluido por Colorimetria
1 Escopo
Este método tem como objetivo descrever os procedimentos para o ensaio “Pesquisa de
Fosfatase Alcalina em Leite Fluido por Colorimetria”.
2 Fundamentos
O principal objetivo do ensaio é verificar se o processo de pasteurização do leite foi
eficiente. Também pode ser utilizado para verificação de fraude por adição de leite cru ao
pasteurizado.
A enzima fosfatase alcalina, que está sempre presente no leite cru, é desnaturada em
temperaturas próximas a de pasteurização. O tratamento térmico igual ou mais severo do que
temperaturas de 62,8ºC por 30 minutos ou a 71,8ºC por 15 segundos, aplicados
comercialmente para a pasteurização, elimina todos os microrganismos patogênicos e
também toda a atividade enzimática da fosfatase alcalina. Logo, o leite e seus derivados que
apresentem um teste negativo para fosfatase alcalina são considerados pasteurizados e
próprios para o consumo. Um teste positivo, neste caso, significa que não se alcançou a
temperatura adequada. No leite UHT, o teste não é realizado rotineiramente, pois a
temperatura para a esterilização atinge os 150º C, inativando a enzima.
A atividade ótima da enzima ocorre em pH 9,65 e temperatura de 37-39°C sendo
aparentemente aumentada pelos elementos cálcio, lítio, manganês e, especialmente, o
magnésio. É fortemente inibida pelo zinco, mercúrio e cádmio.
Vários fatores podem interferir na quantidade de fosfatase alcalina no leite, tais como
raça, individualidade, período de lactação, produção (a quantidade de fosfatase, é
inversamente proporcional à produção) e nos casos de mamite em que há grande aumento da
fosfatase.
A verificação da atividade enzimática é feita mediante a adição do substrato específico da
enzima, em condições ideais para sua atuação, à amostra. A fosfatase alcalina hidrolisa
ésteres de monofosfatos à temperatura e pH apropriados liberando compostos que podem ser
detectados por desenvolvimento de cor. O método utiliza como substrato para a enzima o fenil
fosfato dissódico. O fenol liberado reage com 2,6-dicloroquina cloroimida na presença de
sulfato de cobre gerando um indofenol de cor azul. A quantidade de cor desenvolvida é
proporcional à concentração da fosfatase.
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3 Reagentes, padrões e materiais
3.1 Reagentes
a) Catalisador
Preparo: dissolver 0,2 g de sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4.5 H2O) p.a. em 100 mL
de água.
b) Solução reagente
Preparo: pesar 0,150 g de 2,6-dicloroquinona cloroimida (C6H2Cl3NO) p.a. e dissolver em
50 mL de álcool etílico p.a. Transferir para frasco âmbar e estocar em geladeira. A coloração
da solução recentemente preparada é amarelo-citrina, passando a amarelo-ouro e tendendo a
escurecer, adquirindo tons amarronzados com o envelhecimento. Recomenda-se usar a
solução por um período máximo de duas semanas, desde que conservada sob refrigeração e
ao abrigo da luz.
c) Substrato
Preparo: em um béquer, pesar 0,5 g de fenilfosfato dissódico dihidratado (C6H5Na2O4P.2
H2O) p.a. Dissolver com o tampão carbonato diluído e transferir para balão volumétrico de 500
mL. Completar o volume com o mesmo tampão.
Recomenda-se usar esta solução durante um período máximo de duas semanas.
d) Tampão carbonato
(1) Preparo da solução estoque: pesar 46,89 g de carbonato de sódio anidro (Na2CO3) p.a.
e 37,17 g de bicarbonato de sódio (NaHCO3) p.a. Dissolver em água e transferir para balão
volumétrico de 1000 mL, completando o volume.
(2) Preparo da solução de uso: retirar uma alíquota de 25 mL da solução estoque e
transferir para balão volumétrico de 500 mL e completar o volume. O pH deste tampão
diluído situa-se entre 9,5 e 9,7.
3.2 Materiais
a) Tubo de ensaio com tampa rosca;
b) Estante para tubos;
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c) Pipetas graduadas de 2 e 5 mL, ou material volumétrico similar.
4 Equipamentos
a) Banho-maria com temperatura entre 39-41ºC
b) Termômetro calibrado com divisão de pelo menos 1ºC.
5 Precauções analíticas
a)
Ajustar a temperatura do banho-maria para que a mesma fique na faixa entre 40 ± 1º C.
b)
Os tubos de ensaio e suas tampas precisam encontrar-se perfeitamente limpos e sem
qualquer vestígio de detergentes em decorrência do processo de lavagem e livres de
fenol.
c)
As provas positivas são repetidas com reagentes recentemente preparados (usar
somente o regente do substrato até duas semanas do preparo).
d) A amostra sofre cuidadosa agitação antes de ser analisada, visando distribuir a gordura
ou a camada de creme pelo líquido. A retirada de uma alíquota da amostra a partir da sua
camada superior pode levar a resultado positivo ou suspeito, ainda que o leite tenha sido
adequadamente pasteurizado. A fosfatase alcalina encontra-se adsorvida aos glóbulos de
gordura.
e) A fosfatase alcalina pode sofrer reativação após algum tempo de pasteurização do leite.
Esta interferência é rara, porém pode ocorrer principalmente em leites com mais de 24
horas de processamento.
Alguns fatores que podem aumentar a reativação são o
aumento da temperatura de pasteurização com diminuição do tempo de exposição,
aumento da temperatura de estocagem do leite pasteurizado (10 a 34ºC), presença de
certos elementos como cálcio e magnésio. A acidez, ao contrário, age inibindo a ativação
da fosfatase.
6 Procedimentos
1) Transferir 0,5 mL da amostra a analisar para um tubo de ensaio;
2) Adicionar 5 mL do substrato e tampar. Agitar ligeiramente e levar ao banho-maria mantido
a 39-41º C durante 20 minutos.
3) Esfriar o tubo de ensaio em água corrente.
4) Adicionar 6 gotas de solução reagente e 2 gotas do catalisador.
5) Levar o tubo novamente ao banho-maria a 39 – 41º C por 5 minutos.
6) Fazer a leitura do teste.
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A cada novo lote de substrato realizar o ensaio da amostra em paralelo com controle
positivo (leite cru) e negativo (leite cru fervido).
7 Resultados
O resultado do ensaio fosfatase alcalina é registrado no formulário “Dados brutos da
análise de leite” – anexo do POP POA/06 e inserido na planilha eletrônica IT POA/04.
O teste é qualitativo e o resultado é expresso como positivo ou negativo. O resultado é
considerado positivo com aparecimento de coloração azul intensa (quanto mais intensa a
coloração, maior é a deficiência de pasteurização) e negativo com aparecimento de coloração
cinza.
7. 1 Critérios para aceitação do resultado
Para o leite cru, o resultado esperado é positivo, pois ainda não sofreu nenhum tipo de
processamento. Imediatamente após a pasteurização, o leite deve apresentar teste negativo
para fosfatase alcalina. Quando o resultado for discordante, o ensaio é repetido com uso de
controles.
8 Arquivamento dos registros
Não aplicável.
Observação: os formulários utilizados neste método de ensaio são arquivados conforme
procedimento descrito no POP POA/06 – Controle de Itens de ensaio Leite e Derivados
Lácteos e IT POA/04 – Uso de Planilha Eletrônica na Revisão de Cálculos de Dados Brutos nas
Análises de Leite, Derivados Lácteos, Água e Mel.
9 Referências
BRASIL. Ministério da Agricultura. Secretaria de Defesa Agropecuária. Métodos
Analíticos Físico-Químicos para Controle de Leite e Produtos Lácteos. Instrução
Normativa 68, 12/12/06. Brasília: Ministério da Agricultura, 2006.
BRASIL. Ministério da Agricultura. Regulamentos Técnicos de Produção, Identidade e
Qualidade do Leite. Instrução Normativa 51, 18/09/02. Brasília: Ministério da Agricultura,
2002.
CASTRO, Paula Rosa Schetino. Modificação de Método de Scharer para Determinação
da Atividade de Fosfatase Alcalina em Leite. Viçosa, Minas Gerais, 2005. Consultado em
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29/07/2014:http://alexandria.cpd.ufv.br:8000/teses/ciencia%20e%20tecnologia%20de%20aliment
os/2005/190246f.pdf
10 Anexos
Não aplicável.
11 Alterações
Alterado o texto do item 2 Fundamentos visando facilitar o entendimento da reação química
e implicações no resultados do ensaio.
Incluído no item 5 Precauções analíticas, subitem “a” a importância da vidraria estar livre de
fenol (interferente) e no subitem “e” alguns fatores que podem interferir na reativação enzimática.
Incluído uma referência bibliográfica (terceira bibliografia citada).
12 Responsabilidades
É de responsabilidade do RT ou seu substituto do POA assegurar que os analistas que
utilizarem este MET tenham sido treinados e capacitados para sua execução e o mesmo esteja
sendo corretamente seguido.
Elaboração/Revisão:
Rita Beatriz Andrade - POA
Data: 30/07/2014
Aprovação:
Tiago Charão de Oliveira - POA
Data: 06/08/2014
Verificação:
Eliana Menezes - UGQ
Data: 07/08/2014