DITERPENOS DAS ALGAS DA TRIBO
DICTYOTEAE NO SUL CARIBENHO E
SUDESTE ATLÂNTICO
FREDY AUGUSTO ORTIZ RAMÍREZ
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MARINHA
Niterói – RJ, Brasil
Fevereiro de 2012
O77d
Ortiz Ramírez, Fredy Augusto
Diterpenos das algas da tribo dictyoteae no sul caribenho e
sudeste Atlântico/ Fredy Augusto Ortiz Ramírez. – Niterói: [s.n.],
2012.
205f.
Tese – (Doutorado em Biologia Marinha) – Universidade
Federal Fluminense, 2012.
1. Alga parda. 2. Análise química. 3. Dictyota Mestrualis. 4.
Classificação.
5. Quimiotaxonomia. I. Título.
CDD.589.45
UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
INSTITUTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA MARINHA
DITERPENOS DAS ALGAS DA TRIBO DICTYOTEAE NO
SUL CARIBENHO E SUDESTE ATLÂNTICO
FREDY AUGUSTO ORTIZ RAMÍREZ
Tese de Doutorado apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Biologia Marinha do
Departamento de Biologia Marinha, Instituto
de
Biologia,
Universidade
Federal
Fluminense, como requisito parcial para a
obtenção do Título de Doutor em Biologia
Marinha.
Orientadores:
Dra Valéria Laneuville Teixeira
Dra Diana Negrão Cavalcanti
Niterói – RJ, Brasil
Fevereiro de 2012
Al más preciado tesoro que puedo tener, mi amada familia
“Ilsa, Jesus, Marisol y Juanito”
En especial a mis siempre amigos
Siempre tutores
Siempre MADRE y PADRE
AGRADECIMENTOS
Com um sentimento de gratidão ENORME dedico este reconhecimento àqueles
que tornaram possível a realização deste trabalho.
Às minhas queridas orientadoras Dra. VALÉRIA LANEUVILLE TEIXEIRA e Dra.
DIANA NEGRÃO CAVALCANTI, um muito obrigado por estes anos que guardarei
com boas lembranças, por tudo aquilo que aprendi com vocês, pelas sugestões,
orientação e paciência para elucidar o meu “portunhol” e principalmente pelo
carinho e amizade.
“A mi amada madre Ilsa Ramírez de Ortiz (in memoriam 1952 – 2011), no
encuentro palabras para expresarte todo el amor que siento por ti, lamento con
dolor tu ausencia porque este logro es fruto de tu insentivo. A mi padre Jesus
Ortiz, a mi hermana Marisol y a mi querido Juan David por ser lo que son mi
familia y a quienes profeso mi profundo amor e incondicionalidad”
A todos os amigos e colegas do Laboratório, Carlos José Brito, Rainiomar
Fonseca, Nathalia Preciosso, Wilton Ferreira, Kelvin Osako. À amiga Magui Vallim
pela ótima parceria nos testes com os ouriços pela amizade e carinho. À amiga
adorável Thaisa Domingos (a sinistra) pela ótima parceria no trabalho de bancada
pela ajuda incondicional e amizade. Às IC Samara França, Karla Saiukusa e
Mariana Carvalho. Muito obrigado a todos vocês pelo apoio e por tornar agradável
o ambiente de trabalho.
À Laura Moura pela ótima parceria nos testes de hemostasia.
Ao Dr. Joel Campos de Paula (Don Joel) por os apontamentos na descrição
taxonômica da nova espécie, pela parceria, ajuda e pela sua amizade.
Aos meus amigos e irmãos de coração Dr. Alonso Juvinao e Rafael Frenandes
pela sua amizade sincera e apoio nos momentos mais difíceis.
Aos funcionários do Laboratório multiusuário de Resonância Magnética Nuclear
LaREM pela obtenção dos espectros RMN indispensáveis para este trabalho.
Aos integrantes do grupo de pesquisa em produtos naturais marinhos da
Universidade Nacional de Colômbia.
À Helena Laneuville pela ajuda nos textos em inglês.
A todos que contribuíram de alguma maneira e que por imperdoável omissão não
registrei os seus nomes aqui.
A todos,
Muito obrigado.
v
ÍNDICE
RESUMO................................................................................................................ x
ABSTRACT........................................................................................................... xi
LISTA DE TABELAS ........................................................................................... xii
LISTA DE FIGURAS ............................................................................................ xv
PREFÁCIO ............................................................................................................. 1
CAPÍTULO
1.
FERRAMENTA
CROMATOGRAFIA
DE
AUXÍLIO
NA
EM
CAMADA
IDENTIFICAÇÃO
DELGADA:
DE
UMA
ESPÉCIES
E
POPULAÇÕES DE ALGAS MARINHAS............................................................... 6
1.1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 7
1.2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 11
1.2.1. Coleta .................................................................................................. 11
1.2.2. Preparação dos extratos ..................................................................... 11
1.2.3. Identificação do perfil químico ............................................................. 12
1.2.4. Isolamento do padrão de diterpenos ................................................... 12
1.2.5. Cromatografia em camada delgada (CCD) ......................................... 16
1.2.6. Processamento das imagens e calibração .......................................... 16
1.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................. 18
CAPÍTULO 2. ESTUDO QUIMIOTAXONÔMICO DAS ALGAS DA TRIBO
DICTYOTEAE DA REGIÃO DE SANTA MARTA, MAR DO CARIBE, COLÔMBIA
............................................................................................................................. 29
2.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 30
2.2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 33
vi
2.2.1. Coleta do material algáceo .................................................................. 33
2.2.2. Preparação dos extratos ..................................................................... 34
2.2.3. Identificação dos perfis químicos das amostras .................................. 34
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................. 36
2.3.1. Espectros de massas de substâncias identificadas ............................ 40
2.3.2. Dados morfológicos e químicos das algas da tribo Dictyoteae ........... 50
2.4. CONCLUSÃO ............................................................................................ 59
CAPÍTULO 3. UMA NOVA ESPÉCIE DO GENÊRO Dictyota Lamouroux
(DICTYOTACEAE,
PHAEOPHYCEAE)
BASEADA
EM
ASPECTOS
MORFOLÓGICOS E QUÍMICOS. ........................................................................ 60
3.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 61
3.2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 64
3.2.1. Coleta do material ficológico ............................................................... 64
3.2.2. Descrição morfológica ......................................................................... 65
3.2.3. Análise química ................................................................................... 65
3.2.3.1. Preparação e obtenção dos extratos ............................................ 65
3.2.3.2. Obtenção do perfil químico em cromatografia em fase gasosa .... 66
3.2.3.3. Obtenção do perfil químico por cromatografia em camada delgada
(CCD) ........................................................................................................ 66
3.2.3.4. Obtenção dos diterpenos majoritários .......................................... 67
3.2.3.4.1. Isolamento dos diterpenos majoritários .......................................................... 68
3.2.3.5. Transformação (redução) do produto DvM (15) ............................ 69
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................. 71
vii
3.3.1. Descrição taxonômica ......................................................................... 71
3.3.1.1. Dictyota sp. nov. Ortiz-Ramírez, De Paula et Cavalcanti sp. nov. 71
3.3.1.2. Diagnose ...................................................................................... 73
3.3.2. Perfil químico ...................................................................................... 75
3.4. CONCLUSÃO ............................................................................................ 80
CAPÍTULO
cervicornis:
4.
METABOLITOS
UMA
SECUNDÁRIOS
ESTRATÉGIA
QUÍMICA
DE
PARA
Canistrocarpus
O
CONTROLE
POPULACIONAL DOS SEUS CONSUMIDORES? ............................................ 81
4.1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 82
4.2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 85
4.2.1. Coleta do material ficológico ............................................................... 85
4.2.2. Extração e isolamento ......................................................................... 85
4.2.3. Coleta dos ouriços-do-mar, obtenção dos gametas e sua estocagem 86
4.2.4. Preparação das soluções do extrato bruto e produto puro .................. 87
4.2.5. Ensaios Pós-fecundação..................................................................... 87
4.2.6. Ensaios pré-fecundação em óvulos .................................................... 88
4.2.7. Ensaios pré-fecundação nos espermatozóides ................................... 89
4.2.8. Análise estatística ............................................................................... 89
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................. 91
4.4. CONCLUSÃO .......................................................................................... 100
CAPÍTULO
5.
ATIVIDADE
ANTIMITÓTICA
DOS
METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS DAS ALGAS PARDAS MARINHAS Dictyota menstrualis E D.
ciliolata (DICTYOTACEAE, PHAEOPHYCEAE) DO LITORAL BRASILEIRO. 101
viii
5.1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 102
5.2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 105
5.2.1. Coleta do material algáceo ................................................................ 105
5.2.2. Preparação dos extratos ................................................................... 105
5.2.3. Isolamento e purificação dos diterpenos ........................................... 106
5.2.3.1. Isolamento do pachydictyol A ..................................................... 106
5.2.3.2. Isolamento do dictyol E ............................................................... 107
5.2.3.3. Isolamento do dichotomano ........................................................ 109
5.2.4. Ensaio de atividade biológica ............................................................ 110
5.2.4.1. Coleta dos ouriços-do-mar, obtenção dos gametas e estocagem
................................................................................................................ 110
5.2.4.2. Preparação das soluções dos extratos brutos e produtos puros 111
5.2.4.3. Avaliação da atividade em zigotos de Lytechinus variegatus ..... 111
5.2.4.4. Tratamento dos dados e análise estatística ............................... 112
5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 114
5.3.1. Atividade biológica dos extratos brutos ............................................. 114
5.3.2. Atividade biológica dos diterpenos majoritários ................................ 120
5.4. CONCLUSÃO .......................................................................................... 128
CAPÍTULO 6. EFEITOS DOS PRODUTOS NATURAIS DE Dictyota menstrualis
E D. ciliolata SOBRE A AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA E COAGULAÇÃO
SANGUÍNEA ...................................................................................................... 129
6.1. INTRODUÇÃO ......................................................................................... 130
6.2. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................ 133
ix
6.2.1. Coleta do material algáceo e obtenção dos extratos......................... 133
6.2.2. Ensaios em plaquetas ....................................................................... 135
6.2.3. Ensaios na coagulação ..................................................................... 136
6.2.4. Ensaio de recalcificação do plasma .................................................. 137
6.2.5. Ensaio de Tempo de Protrombina (TP) ............................................. 137
6.2.6. Ensaio de Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA) .......... 138
6.2.7. Fibrinocoagulação ............................................................................. 138
6.2.8. Ensaio sobre substratos cromogênicos ............................................. 138
6.2.8. Análise estatística ............................................................................. 139
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................... 140
6.3.1. Efeitos dos extratos sobre a agregação plaquetária ......................... 140
6.3.2. Efeito dos extratos sobre a coagulação sanguínea ........................... 144
6.3.3. Efeitos dos extratos sobre substratos cromogênicos ........................ 145
6.4. CONCLUSÃO .......................................................................................... 154
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 155
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................. 158
APÊNDICE 1. Artigo publicado ....................................................................... 172
APÊNDICE 2. Artigo no prelo .......................................................................... 186
APÊNDICE 3. Apresentações em eventos...................................................... 202
x
RESUMO
Os representantes da tribo Dictyoteae constituem um dos componentes principais
na estrutura de comunidades bentônicas dos mares temperados e tropicais. São
produtoras de moléculas com especial potencial biotecnológico, sendo também
uma útil ferramenta em taxonomia e biogeografia. Foram coletadas amostras de
diferentes espécies em diferentes locais, sendo obtidos os seus extratos em
solventes orgânicos e isolados e purificados alguns diterpenos. Foram realizadas
descrições taxonômicas e a avaliação dos extratos e produtos puros mediante
análises de imagem em cromatografia em camada delgada. Foram apresentados
os seus efeitos sobre os zigotos de Lytechinus variegatus, além da investigação
de sua atividade antimitótica, anticoagulante e antiplaquetária. Os resultados
mostram que o melhor canal de cor na análise de imagens para diferenciar duas
populações é o azul, não revelando discrepâncias com técnicas como a
cromatografia gasosa. Propõe-se a existência de uma nova espécie do gênero
Dictyota baseada em dados morfológicos e químicos. O primeiro estudo sobre os
metabolitos secundários da tribo Dictyoteae no Mar do Caribe da Colômbia
demonstraram que o perfil quantitativo de Canistrocarpus cervicornis é similar ao
das populações brasileiras e que os efeitos dos produtos naturais desta espécie
diminuem as taxas de fecundação de L. variegatus e inibem o seu
desenvolvimento embrionário. Um diterpeno dichotomado mostrou alta atividade
antimitótica em zigotos de L. variegatus. Finalmente, os extratos de D. menstrualis
e D. ciliolata mostraram atividade diferenciada nos processos de hemostasia.
Palavras
chave:
Dictyota,
biológica, bioprospecção.
Canistrocarpus,
taxonomia
química,
atividade
xi
ABSTRACT
The species of the Tribe Dictyoteae are one of the main components of the
structure of benthic communities from temperate and tropical seas. They are also
characterized by producing molecules with a special biotechnological potential and
being an important tool in both taxonomy and biogeography. Samples from various
species were collected in different places so that it would be possible to obtain
their extracts using organic solvents, as well as isolating and purifying several
diterpenes. Then, we conducted taxonomic descriptions and evaluated extracts
and pure products by performing image analysis in thin layer chromatography. In
addition, we presented their effects on the zygotes of Lytechinus variegatus, and
investigated their antimitotic, anticoagulant and antiplatelet activities. The results
have shown that the best color channel for the image analysis to differentiate the
two populations is blue, since it did not present discrepancies when compared to
other techniques, such as the gas chromatography. Hence, the existence of a new
species of the Dictyota genus is being proposed based on morphological and
chemical data. Indeed, the first study on the secondary metabolites of the Tribe
Dictyoteae in the Colombian Caribbean has demonstrated that the quantitative
profile of local Canistrocarpus cervicornis is similar to the Brazilian populations.
Moreover, the effects of the natural products of this species are capable of
reducing the fecundation rates of L. variegatus as well as inhibiting embryonic
development. Also, a dichotomane diterpene has shown intense antimitotic activity
in L. variegatus zygotes. Finally, the extracts of D. menstrualis and D. ciliolata
have presented differentiated activities in the hemostasis processes.
Keywords: Dictyota, Canistrocarpus, chemotaxonomy, biological activity,
bioprospection.
xii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Vantagens e desvantagens das diferentes massas de extrato de D.
ciliolata e D. menstrualis aplicadas nas placas cromatográficas. ............ 19
Tabela 2. Massa calculada pelo método RGB para a amostra desconhecida. .... 23
Tabela 3. Dados quantitativos expressados em abundância relativa (%) de alguns
produtos naturais de Dictyota menstrualis das populações de Búzios e
Arquipélago São Pedro e São Paulo, tomados de Ortiz-Ramírez et al.
2008......................................................................................................... 24
Tabela 4. Valores do canal de cor azul (B) e absorbância calculada das
populações de Dictyota ciliolata (A1 e A2) e de D. menstrualis (BZ e
SPSP) com o seu respectivo valor p do teste t. ....................................... 25
Tabela 5. Ocorrência de espécies da tribo Dictyoteae na região caribenha
colombiana (segundo Díaz-Pulido &Díaz-Ruíz, 2003)............................. 30
Tabela 6. Lista das prováveis espécies que podem ser coletadas na região do
Distrito de Santa Marta, Caribe – Colômbia (Segundo Diaz-Pulido & DíazRuíz 2003). .............................................................................................. 36
Tabela 7. Códigos dos Locais de coleta, Locais de coleta, códigos das amostras,
massas secas das algas (em g), massas dos extratos em acetato de etila
(em MG), rendimentos dos extratos das amostras (em %) e grupo
segundo o perfil cromatográfico das amostras coletadas na região de
Santa Marta, Colômbia. ........................................................................... 38
Tabela 8. Nome dos ácidos graxos ou derivados, estruturas moleculares, tempo
de
retenção
(em
minutos)
e
respectivas
fragmentações
em
Espectrometria de Massas por impacto de elétrons (70eV) (EM-IE) e
intensidades relativas (%) dos picos........................................................ 41
Tabela 9. Nome dos diterpenos identificados, tempo de retenção (em minutos),
respectivas fragmentações em Espectrometria de Massas por impacto de
xiii
elétrons (EM-IE) e intensidades relativas (%) dos picos e principais sinais
em RMN 1H. ............................................................................................ 44
Tabela 10. Produção quantitativa dos diterpenos dos indivíduos da espécie
Canistrocarpus cervicornis coletados na enseada de Taganga, Caribe
colombiano (em porcentagem relativa). ................................................... 55
Tabela 11. Porcentagem dos zigotos segundo o estágio de desenvolvimento
embrionário nas experiências com o extrato bruto (CE) e com o dolastano
16 (D): OF) porcentagem dos ovos fecundados sem clivagem; I – IV)
porcentagem das clivagens e A) porcentagem dos zigotos anômalos. ... 93
Tabela 12. Porcentagem de óvulos não fecundados nas experiências de préfecundação
em
diferentes
concentrações
do
extrato
bruto
de
Canistrocarpus cervicornis. (Media ±SD). ............................................... 94
Tabela 13. Massa seca das algas de cada espécime e população, massa dos
extratos brutos obtidos em n-hexano (Hex) e acetato de etila (AcOEt).
SPSP: Arquipelago São de Pedro e São Paulo; BZ: Praia do Forno,
Búzios; IG: Ilha Grande, Angra dos Reis. .............................................. 106
Tabela 14. Comparação dos dados espectroscópicos do pachydictyol A (1)
obtidos por RMN 1H (300 MHz, CDCl3) com dados apresentados na
literatura................................................................................................. 121
Tabela 15. Comparação dos dados espectroscópicos do dictyol E (16) obtidos por
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) com dados apresentados na literatura. ...... 121
Tabela 16. Comparação dos dados espectroscópicos do dichotomano (17)
obtidos por RMN 1H (300 MHz, CDCl3) com dados apresentados na
literatura................................................................................................. 122
Tabela 17. Relação das espécies estudadas, tipo de solvente utilizado para
extração, local de coleta das algas pardas e sua respectiva codificação.
............................................................................................................... 134
xiv
Tabela 18. Perfil inibitório dos extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata sobre
a agregação plaquetária. ....................................................................... 144
Tabela 19. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata
sobre o tempo de coagulação. .............................................................. 145
Tabela 20. Perfil inibitório dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D.
ciliolata sobre a hidrólise dos substratos cromogênicos. ....................... 149
Tabela 21. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata nos
ensaios biológicos. ................................................................................ 150
xv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Propostas biogenéticas hipotéticas para os diterpenos dos grupos I, II
(A e B) e III (Modificado de Teixeira & Kelecom 1988; De-Paula et al.
2007). ........................................................................................................ 3
Figura 2. Representação do cubo de cores RGB (Godinho et al. 2008). .............. 8
Figura 3. A) Esquema de fracionamentos para obtenção da mistura dos
diterpenos isômeros pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2). B) Placa
cromatográfica em camada delgada revelada em sulfato sérico, onde as
frações F8 e F9 correspondem à mistura dos isômeros usados como
padrão no modelo RGB. .......................................................................... 14
Figura 4. Espectro RMN 1H (300 MHz, em CDCl3, TMS como referência interna)
da mistura dos diterpenos pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2). .... 15
Figura 5. Aba da ferramenta conta gotas do programa Adobe® Photoshop CS5
versão 12.0 que mostra os valores da composição da cor no canal RGB.
................................................................................................................. 17
Figura 6. Placa CCD eluída em hexano e acetato de etila (7:3) dos extratos de
Dictyota ciliolata (morfotipos A1 e A2, Ilha Grande) e D. menstrualis das
populações de Búzios (BZ) e do Arquipélago São Pedro e São Paulo
(SPSP), indicando alguns dos seus produtos naturais reconhecíveis pelo
padrão cromático de revelação. .............................................................. 19
Figura 7. Placa de calibração em cromatografia de camada delgada com a
mistura dos isômeros pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2) com R f =
0,70. A massa de aplicação X corresponde a 50µg, e foi considerada
como a massa desconhecida. Esses dados servirão para a avaliação por
análise univariada de cada canal de cor primária. ................................... 20
Figura 8. Absorbância em placa de CCD para cada cor primária RGB em função
da massa de amostra aplicada na placa (em µg). ................................... 21
xvi
Figura 9. Curva de calibração para cada cor primária, vermelho (R), verde (G) e
azul (B) dos isômeros pachydictyol A e isopachydictyol A. ..................... 22
Figura 10. Comparação do extrato de Dictyota friabilis e do espécime A6 ......... 27
Figura 11. Mapa da região de Santa Marta (Colômbia) indicando os locais de
coleta das algas da tribo Dictyoteae C1: Pozos colorados, C2: El
Rodadero e C3: Taganga. ....................................................................... 33
Figura 12. Exemplos dos perfis cromatográficos dos extratos das amostras de
algas pardas marinhas da tribo Dictyoteae coletadas no Mar do Caribe,
segundo a classificação por grupos taxonômicos (A-D). A) Cromatograma
da amostra da alga R1 pretencente ao grupo A. B) Cromatograma da
amostra da alga R6 pretencente ao grupo B. C) Cromatograma da
amostra da alga R2 pretencente ao grupo C. D) Cromatograma da
amostra da alga T’3 pretencente ao grupo D. As linhas pontilhadas
vermelhas delimitam os cromatogramas nas três regiões previamente
definidas. ................................................................................................. 39
Figura 13. Espectro de massas do éster metílico do ácido mirístico (3) (70eV) .. 42
Figura 14. Espectro de massas do éster metílico do ácido palmítico (4) (70 eV) 42
Figura 15. Espectro de massas do ácido palmítico (5) (70 eV) ........................... 43
Figura 16. Espectro de massas do diterpeno do tipo guaiano prenilado
pachydictyol A (1) (70 eV). ...................................................................... 46
Figura 17. Espectro de massas do diterpeno do tipo guaiano prenilado
isopachydictyol A (2) (70 eV). .................................................................. 46
Figura 18. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4,9,14-triidroxi-1,9dolastano-1,9-dieno (6) (70 eV). .............................................................. 47
Figura 19. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4-acetoxi-9,14-diidroxi1,9-dolastano-1,9-dieno (7) (70 eV). ........................................................ 47
xvii
Figura 20. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4,14-diidroxi-dolastano1(15),7,9-trieno (8) (70 eV). ..................................................................... 48
Figura 21. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4-acetoxi-14-hidroxidolastano-1(15),7,9-trieno (9) (70 eV). .................................................... 48
Figura 22. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4-7diacetoxi-14-hidroxidolastano-1,9-dieno (10) (70 eV). ............................................................ 49
Figura 23. Espectro de massas do diterpeno, o isolinearol (11) (70 eV). ............ 49
Figura 24. Espectro de massas do esterol típico das feofíceas, o fucosterol (12)
(70 eV). .................................................................................................... 50
Figura 25. Placa CCD comparativa dos extratos do grupo D (T’3, T’4, T’7, T1, T’1
e T5) com CC (C. cervicornis), DM (D. menstrualis) e DC (D. ciliolata)
eluida em CH2Cl2 : AcOEt (8:2) e revelada com sulfato cérico a 2% em
ácido sulfúrico. As linhas vermelhas mostram o padrão típico de revelação
dos diterpenos dolastanos e secodolastanos. ......................................... 52
Figura 26. Canistrocarpus cervicornis: Aspecto geral, distribuição e detalhe dos
esporângios. A) Detalhe da distribuição dos esporângios solitários ou em
pequenos grupos. B) Aspecto geral da alga coletada na Enseada de
Taganga, (Santa Marta, Colômbia), C) detalhe dos esporângios
circundados por uma coroa de células corticais (seta) e uma célula no
pedicelo. .................................................................................................. 54
Figura 27. Análise quantitativa dos diterpenos dos tipos dolastano e
secodolastano detectados no extrato bruto de C. cervicornis, coletados na
Enseada de Taganga, no Mar do Caribe colombiano.............................. 56
Figura 28. Mapa do local de coleta, o ponto amarelo indica o local aproximado
(modificado de www.mapasdigitais.uerj.br). ............................................ 64
Figura 29. Esquema de fracionamento para a obtenção dos diterpenos DvD (13),
DvM (14) e DvH (15)................................................................................ 70
xviii
Figura 30. Holotipo de Dictyota sp. nov., Ilha Grande, Angra dos Reis-RJ. a)
aspecto geral do individuo; b) detalhe dos ápices agudos e arredondados;
c) corte transversal da região mediana do talo mostrando a disposição em
uma camada das células medulares; d) vista superficial de um pequeno
grupo de esporângios; e-f) corte transversal dos esporângios exibindo
uma única célula peduncular. .................................................................. 72
Figura 31. Placas cromatográficas em camada delgada (CCD) de Dictyota sp.
nov. a) comparação entre os dois extratos em hexano e em acetato de
etila; b) resultado do primeiro fracionamento do extrato hexânico (EHB),
onde pode ser observado a característica principal da serie de bandas de
cor púrpura (diterpenos) (1 – 31 frações coletadas). ............................... 76
Figura 32. Comparação dos extratos em cromatografia de camada delgada
(CCD) de Dictyota pfaffii (Dp) e Dictyota sp. nov. (Dv). ........................... 77
Figura 33. Placa em cromatografia de camada delgada dos produtos naturais
DvD (13) Rf= 0,59, DvM (14) Rf=0,49 e DvH (15) Rf=0,12....................... 78
Figura 34. Cromatograma (CG/EM) do extrato bruto em hexano de Dictyota sp.
nov. indicando os picos dos diterpenos diacetilado (13) e monoacetilado
(14). ......................................................................................................... 79
Figura 35. Estrutura do diterpeno dolastano (4R,7R,14S)-4α,7α-diacetoxi-14hidroxidolasta-1(15),8-dieno. ................................................................... 86
Figura 36. Esquema ilustrativo dos ensaios realizados de pós-fecundação e préfecundação. ............................................................................................. 90
Figura 37. Primeiros estágios do desenvolvimento embrionário de Lytechinus
variegatus e eventos registrados durante as experiências. A) óvulo sem
fecundar; B) óvulo fecundado sem clivagem; C) zigoto na clivagem I; D)
zigoto na clivagem II; E) zigoto na clivagem III; F) zigoto na clivagem IV;
G) zigoto anômalo e H) lise celular dos blastômeros............................... 91
Figura 38. Porcentagem dos zigotos anômalos nas experiências de pósfecundação com o extrato bruto (CE) e com o dolastano (D) e nas
xix
experiências de pré-fecundação com o extrato bruto. Os códigos das
concentrações 1 a 5 representam as diluições detalhadas em materiais e
métodos da menor a maior das concentrações. ...................................... 98
Figura 39. Esquema ilustrado do isolamento e purificação do pachydictyol A (1).
............................................................................................................... 107
Figura 40. Esquema do isolamento e purificação do dictyol E (16). .................. 108
Figura 41. Esquema ilustrado do isolamento e purificação do diterpeno 9-hidroxidichotoma-2,13-dieno-16,17-dial (dichotomano 17). ............................. 110
Figura 42. Esquema ilustrado do ensaio de atividade biológica dos extratos de
Dictyota menstrualis, Dictyota ciliolata e dos diterpenos pachydictyol A,
dictyol E e dichotomano frente aos zigotos de Lytechinus variegatus. .. 113
Figura 43. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus
variegatus nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF)
ovos não clivados; I-IV) primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A)
zigotos anômalos, nas experiências com o extrato bruto em hexano (0;
12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) de Dictyota ciliolata da população da Ilha
Grande, Angra dos Reis. ....................................................................... 115
Figura 44. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus
variegatus nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF)
ovos não clivados; I-IV) primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A)
zigotos anômalos, nas experiências com o extrato bruto em hexano (0;
12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) de Dictyota menstrualis da população de
Búzios. ................................................................................................... 117
Figura 45. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus
variegatus nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF)
ovos não clivados; I-IV) primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A)
zigotos anômalos, nas experiências com o extrato bruto em hexano (0;
12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) de Dictyota menstrualis da população do
Arquipélago São Pedro e são Paulo. ..................................................... 118
xx
Figura 46. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus
variegatus nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF)
ovos não clivados; I-IV) primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A)
zigotos anômalos, nas experiências com o diterpeno pachydictyol A (0;
6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL)............................................................. 123
Figura 47. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus
variegatus nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF)
ovos não clivados; I-IV) primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A)
zigotos anômalos, nas experiências com o diterpeno dictyol E (0; 6,25;
12,5; 25; 50 e 100 µg/mL)...................................................................... 124
Figura 48. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus
variegatus nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF)
ovos não clivados; I-IV) primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A)
zigotos anômalos, nas experiências com o diterpeno dichotomano (0;
6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL)............................................................. 125
Figura 49. Imagens microscópicas dos zigotos de Lytechinus variegatus. A) ovo
fecundado normal sem tratamento com dichotomano. B) zigoto normal na
clivagem IV sem tratamento com dichotomano. C) zigoto tratado com o
dichotomano. As setas indicam os pontos claros citoplasmáticos
correspondentes ao indicativo da estabilização do aparato mitótico. A
media do diâmetro dos zigotos foi 110 µm. ........................................... 127
Figura 50. Efeito dos extratos de algas sobre a agregação plaquetária em Plasma
Rico em Plaquetas (PRP). ..................................................................... 141
Figura 51. Registros típicos da agregação plaquetária em plaquetas lavadas (WP)
............................................................................................................... 142
Figura 52. Efeitos dos extratos das algas sobre a agregação plaquetária em
Plaquetas lavadas (WP). ....................................................................... 143
Figura 53. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata
sobre a cinética da hidrólise dos substratos cromogênicos. .................. 147
xxi
Figura 54. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata
sobre
a
atividade
catalítica
da
trombina
sobre
os
substratos
cromogênicos. ....................................................................................... 148
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – PREFÁCIO
1
PREFÁCIO
A ordem Dictyotales da classe Phaeophyceae destaca-se por ser um
importante componente na estrutura das comunidades bentônicas dos mares
temperados e tropicais pela sua biomassa e diversidade de espécies (Bittner et al.
2008; Norris 2010; Tronholm et al. 2010). Dentro da ordem Dictyotales encontrase a família Dictyotaceae que atualmente circunscreve de 18 gêneros (Wysor &
De Clerck 2003), por sua vez para a família são reconhecidas duas tribos, a tribo
Dictyoteae e a tribo Zonarieae. Estes táxons são diferenciados pelo crescimento
do seu talo por uma ou várias células apicais, sendo que na tribo Dictyoteae o
crescimento do talo é realizado por uma única célula apical. A tribo Dictyoteae é
composta de três únicos gêneros Dictyota Lamouroux, Canistrocarpus De Paula
et De Clerck e Rugulopteryx De Clerck et Coppejans (De Clerck et al. 2006).
Nas últimas décadas, o aumento significativo de novos epítetos específicos de
macroalgas bentônicas ao redor do mundo (Wynne 2011), está diretamente
relacionado à dificuldade em estabelecer limites de separação entre espécies, em
especial na tribo Dictyoteae pelo seu alto pleomorfismo dos indivíduos e pela
diferenciada interpretação dos caracteres diagnósticos, o que tem levado a
confusões taxonômicas em casos reportados como coespecificidade (Teixeira &
Kelecom 1987, 1988; Bula-Meyer 1994; Solé & Foldats 2003; Wysor & De Clerck
2003).
O avanço em áreas do conhecimento como a química de produtos naturais e
o crescente isolamento de novos e diversos tipos de substâncias, trouxe o avanço
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – PREFÁCIO
2
da taxonomia química, que baseia seu estudo na premissa de que a síntese dos
metabólitos secundários reflete uma condição própria de determinado táxon
(Teixeira 2010).
Desde o ponto de vista químico, uma rota biogenética de síntese dos
diterpenos na tribo Dictyoteae propõe que a partir do geranilgeraniol (precursor
universal de todos os diterpenos), são formados quatro grupos de esqueletos
diterpênicos. O grupo I é formado a partir da primeira ciclização formal entre os
carbonos 1 e 10 e dá origem a uma série de produtos do tipo germacrano
prenilado e derivados, sendo o tipo guaiano prenilado, o mais comum entre as
algas dos gêneros Dictyota. Diterpenos do tipo spatano e secospatano, também
são muito abundantes, mas restritos ao gênero Rugulopterix.
O grupo II é formado pela primeira ciclização formal entre os carbonos 1 e 11,
e podeser dividido em grupos IIa e IIb, de acordo com a ocorrência nas espécies,
ou seja pela origem biossintética de cada tipo. O grupo IIa caracteriza-se pela
produção de dolabellanos e derivados (IIa) e ocorre em algas do gênero Dictyota,
enquanto os diterpenos do tipo dolastanos IIb e secodolastanos (IIb), sem relação
biogenéticas com os dolabellanos, ocorrem nas algas do gênero Canistrocarpus.
Para a formação dos diterpenos do grupo III existem duas propostas
biogenéticas na literatura. A primeira possibilidade seria a partir da primeira
ciclização formal do geranilgeraniol entre os carbonos 2 e 10 e a segunda
envolveria a formação intermediária de um produto do grupo I, seguida da
contração do anel de 10 carbonos em um anel de 9 carbonos, dando origem aos
produtos do grupo III cujo esqueleto mais comum é o xeniano (Teixeira &
Kelecom 1988; Bemfica et al. 1998) (Figura 1).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – PREFÁCIO
3
Figura 1. Propostas biogenéticas hipotéticas para os diterpenos dos grupos I, II (A e B) e
III (Modificado de Teixeira & Kelecom 1988; De-Paula et al. 2007).
Para o caso da tribo Dictyoteae os diterpenos tem sido sugeridos como bons
marcadores taxonômicos. Em decorrência disso, estudos da composição química
dos diterpenos de várias espécies deste táxon têm permitido classificá-las de
acordo com suas características químicas (Figura 1) e inclusive os resultados têm
sido consistentes e, com algumas restrições, concordam com a proposta de De
Clerck et al. (2006) quanto aos três únicos gêneros da tribo Dictyoteae (Kelecom
& Teixeira 1986; Teixeira et al. 1986; Teixeira & Kelecom 1988; Teixeira et al.
1990, 2001; De-Paula et al. 2001, 2008; Teixeira 2002; Barbosa et al. 2003, 2007;
Vallim et al. 2005; Cavalcanti et al. 2006; De-Paula et al. 2007; De-Paula et al.
2007; Oliveira et al. 2008). Estes diterpenos também têm sido apontados como
marcadores biogeográficos para o entendimento da distribuição das espécies e
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – PREFÁCIO
4
para elucidar padrões interpopulaçionais (Teixeira & Kelecom 1987; Vallim et al.
2005; Freitas et al. 2007; Oliveira et al. 2008; Ortiz-Ramírez et al. 2008).
Os diterpenos da tribo Dictyoteae apresentam papéis importantes no âmbito
ecológico, assim experiências em ecologia química tem demonstrado o papel dos
diterpenos na defesa química contra consumidores, anti-incrustação e alelopática
dentre outros (Steinberg 1985; Hay et al. 1987; Hay & Fenical 1988; Bolser & Hay
1996; Cronin et al. 1997; Pereira et al. 2000; Amsler 2001; Lindquist 2002;
Barbosa et al. 2004b; Macaya et al. 2005; Vallim et al. 2007; Soares et al. 2008;
Da Gama et al. 2008; Bianco et al. 2008, 2009).
Por outro lado a mais recente revisão sobre a atividade dos terpenos da
família Dictyotaceae contra diferentes tipos de agentes infecciosos e outros
problemas de saúde publica (De-Paula et al. 2011) revela a importância destes
metabolitos secundários com potencial biotecnológico e estimula em dar
continuidade aos estudos de bioprospecção em aras de contribuir na luta contra
diferentes doenças.
O presente estudo tem como objetivo contribuir ao conhecimento da
ocorrência dos diterpenos da tribo Dictyoteae, avaliar um método de quantificação
de fácil manuseio e baixo custo por análises de cor e realizar experiências in vitro
sobre o potencial biotecnológico dos diterpenos desta tribo.
Em síntese o presente trabalho encontra-se dividido em seis capítulos,
abordando temas inter-relacionados. Assim, o Capítulo 1 apresenta uma visão
biológica no aproveitamento de um dos métodos mais usados nos laboratórios de
química de produtos naturais, a cromatografia em camada delgada (CCD). O
capítulo apresenta como nos dias de hoje, graças ao fácil acesso a dispositivos
digitais de imagens, esta técnica rotineira pode ser uma útil ferramenta para
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – PREFÁCIO
5
biólogos. O Capítulo 2 aborda o primeiro estudo dos diterpenos da tribo
Dictyoteae no Mar do Caribe, da Colômbia, ampliando assim o conhecimento
sobre os diterpenos. Esse estudo estabeleceu o início de uma colaboração
internacional entre o Brasil e a Colômbia, entre dois grupos reconhecidos de
pesquisa na área de produtos naturais marinhos. O Capítulo 3 apresenta uma
nova espécie do gênero Dictyota baseada em dados morfológicos e químicos. Os
três últimos capítulos apresentam novos resultados sobre atividades biológicas de
alguns metabolitos secundários da tribo Dictyoteae e perspectivas de seu
potencial biotecnológico. O Capítulo 4 aborda os efeitos dos produtos naturais na
fertilização e nos primeiros estádios de vida de um dos principais consumidores,
sugerindo ser um tipo de química defensiva indireta. Os Capítulos 5 e 6
apresentam aspectos de bioprospecção e sinalizam o potencial de alguns
diterpenos e extratos brutos como agentes antimitóticos e hemostáticos,
respectivamente.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
6
CAPÍTULO 1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA: UMA
FERRAMENTA DE AUXÍLIO NA IDENTIFICAÇÃO DE ESPÉCIES E
POPULAÇÕES DE ALGAS MARINHAS
Resumo: Este capítulo apresenta o uso da cromatografia em camada delgada
(CCD) como um método de análise quantitativa dos produtos naturais de algas
marinhas por imagens digitais. Nossos resultados indicaram que a quantidade
ideal de aplicação nas placas cromatográficas, para a utilização da técnica, é de
300 µg para os extratos brutos e que o limite de quantificação obtido para os
isômeros pachydictyol A e isopachydictyol A foi de 6,25µg. Para esses diterpenos,
a cor primária azul foi a mais adequada como índice do análogo de absortividade,
pois, ao ser empregado na comparação de diferentes populações de Dictyota
menstrualis, corroboraram os dados obtidos através da quantificação por CG/EM.
Os resultados indicaram que este método pode ser usado como ferramenta
auxiliar em estudos taxonômicos e ecológicos por apresentar baixo custo e rápida
obtenção de resultados.
Publicação produzida a partir deste capítulo:
Perfil químico: uma ferramenta para auxiliar a identificação de populações de algas marinhas
bentônicas?
Ortiz-Ramírez, F.A; Pinto, V.L.M; Cavalcanti, D.N; Villaça, R.C; De Paula, J.C; Teixeira, V.L.
Trabalho apresentado durante o II Congresso Brasileiro de Biologia Marinha – 2009.
Catalogado dentre os cinco trabalhos que concorreram ao premio nível pós-graduação da
Associação Brasileira de Biologia Marina.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
7
1.1. INTRODUÇÃO
A cromatografia em camada delgada (CCD) é um dos métodos mais usados
na rotina de laboratórios de Química Orgânica, sendo a ferramenta que guia o
isolamento e a purificação de muitos produtos naturais. Em alguns casos, pode
ser usada em escala preparativa e ser o método de escolha para o isolamento de
substâncias químicas. Seu baixo custo e tempo de análise fazem deste método o
preferido para muitas aplicações nas áreas biomédicas e farmacêuticas
(Stepanov 2003; Soponar et al. 2008).
O método tradicional para análises quantitativas em CCD é conhecido como
densitometria, baseado nas medidas de fluorescência da placa CCD quando
exposta a uma radiação ou feixe de luz monocromático geralmente na frequência
da radiação ultravioleta (UV). No entanto, esta técnica requer equipamentos de
alto custo e medidas de proteção para o pesquisador-operador contra os raios UV
(Stepanov 2003; Hayakawa & Hirai 2003; Trivedi & Pundarikakshudu 2006;
Lancaster et al. 2008).
Em geral a quantificação de substâncias coloridas é realizada pelo método de
espectrofotometria por detecção da transmitância e absorbância da energia
luminosa, e, em teoria qualquer equipamento capaz de detectar variações da cor
poderia ser utilizado como instrumento de quantificação (Petrović et al. 1997).
Nos dias de hoje, o uso de imagens digitais está muito difundido, porém o seu
uso como ferramenta de quantificação ainda é limitado. Nos últimos anos, no
entanto, o interesse da sua aplicabilidade como técnica quantitativa em setores
industriais vem crescendo (Cserháti & Forgács 2001; Gomes et al. 2008; Godinho
et al. 2008).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
8
A cor pode ser analisada e monitorada por meio de um programa de edição
de imagens como, por exemplo, o Adobe Photoshop®. O sistema de cores mais
usado atualmente é o RGB, que corresponde às siglas em inglês Red (R), Green
(G) e Blue (B). Neste sistema, cada canal de cor primária varia em índices de 0 e
255, permitindo uma combinação por pixel da imagem da ordem de 2563,
resultando em 16.8 milhões de combinações possíveis (Adobe Systems
Incorporated 2010). Assim, cada cor corresponde a um ponto no cubo
tridimensional formado pelos eixos R, G e B (Figura 2).
Figura 2. Representação do cubo de cores RGB (Godinho et al. 2008).
Graças à versatilidade da CCD, biólogos e ecólogos podem fazer uso desta
técnica em diversos propósitos, como na diferenciação de populações pela
produção quantitativa de alguns metabolitos secundários, dentre outros.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
9
Os metabolitos secundários são produto de rotas metabólicas diferenciadas
que refletem características próprias de cada espécie e este é um dos princípios
básicos da taxonomia química.
Seguindo esta linha de pensamento os diterpenos têm sido propostos como
marcadores taxonômicos da tribo Dictyoteae e os resultados obtidos têm
corroborado tal indicação (Pathirana 1984; Teixeira et al. 1985, 1986, 1990, 2001;
Kelecom & Teixeira 1986; Teixeira & Kelecom 1988; Yamase et al. 1999; DePaula et al. 2001; De-Paula et al. 2007; De-Paula et al. 2008; Barbosa et al. 2003;
Cavalcanti et al. 2006; Oliveira et al. 2008)
O presente estudo se propõe a aplicar o uso de imagens digitais de placas
cromatográficas, obtidas através de um digitalizador ou escâner (do inglês
scanner) de mesa, como uma ferramenta de análise quantitativa para determinar
variações populacionais de algas da tribo Dictyoteae. Foram selecionadas duas
espécies para a realização das análises quantitativas: Dictyota. menstrualis (Hoyt)
Schnetter, Hörning & Weber-Peukert 1987 e D. ciliolata Sonder ex Kützing 1859.
Essas espécies foram escolhidas por serem próximas em sua química especial e
em sua morfologia (Cronin et al. 1995; De-Paula et al. 2007; Ortiz-Ramírez et al.
2008; Manzo et al. 2009), tendo sido analisadas por nosso grupo de pesquisa.
Para isso, o presente capítulo tem os seguintes objetivos:

Determinar a concentração do extrato bruto ideal para a obtenção das
imagens das placas cromatográficas das espécies D. menstrualis e D.
ciliolata.

Quantificar os diterpenos pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2) para
avaliar o método proposto de modo experimental por meio de uma curva
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
10
de calibração. Ambas as espécies de Dictyota utilizadas nesse estudo são
produtoras desses diterpenos.

Validar os resultados obtidos com o método proposto através da
comparação dos resultados com aqueles obtidos em cromatografia gasosa
acoplada a espectro de massas.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
11
1.2. MATERIAL E MÉTODOS
1.2.1. Coleta
Os espécimes de Dictyota menstrualis foram coletados mediante mergulho
livre, entre 2 a 5 m de profundidade, no mês de abril de 2003, na praia Rasa, no
município de Armação de Búzios, Rio de Janeiro, Brasil (22°44’49’’ S - 41°52’54’’
W) (BZ). Indivíduos desta mesma espécie foram coletados mediante mergulho
autônomo, entre 3 a 20 m de profundidade, no ano de 2005, pelo Dr Roberto
Campos Villaça no Arquipélago São Pedro e São Paulo (00°55’ N - 29°21’ W)
(SPSP). Exsicatas dos espécimes coletados foram depositadas no Herbário da
Universidade do Estado do Rio de Janeiro (HRJ 10017 - Praia Rasa e HRJ11006
- SPSP).
Espécimes de D. ciliolata (A1 e A2) e um morfotipo desconhecido (A6) foram
coletados na Praia Vermelha, Ilha Grande, Angra dos Reis, Rio de Janeiro (23°00’
S - 44°19’ W), mediante mergulho livre a uma profundidade média de 3 a 5 m no
mês de outubro de 2008.
O material biológico foi triado para a retirada de epífitas e da fauna
acompanhante, posteriormente foi seca a temperatura ambiente no laboratório.
1.2.2. Preparação dos extratos
Após a total secagem das algas, uma alíquota de 10 g de cada amostra foi
submetida à extração sequencial em n-hexano e acetato de etila, durante três
semanas para cada solvente, sendo renovado a cada semana. Os volumes dos
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
12
extratos obtidos foram reduzidos sob pressão reduzida, em evaporador rotativo,
sendo armazenados sob refrigeração.
1.2.3. Identificação do perfil químico
Uma alíquota (de 8 a 10 mg) de cada um dos extratos foi dissolvida em
clorofórmio deuterado (CDCl3) para obtenção do espectro de Ressonância
Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H), em aparelho Varian-Unity Plus, na
frequência de 300,00 ou 500,00 MHz, sendo usado o tetrametilsilano (TMS) como
referência interna.
Uma alíquota (2 mg) de cada extrato foi diluída em 2 mL de acetato de etila
(AcOEt) e 1 μL da solução foi injetada em cromatógrafo em fase gasosa Hewlett
Packard HP 5973, acoplado a espectrômetro de massas (CG/EM), em modo de
impacto de elétrons (70 eV), programado a uma temperatura inicial de 160 ºC e
aumentando 4 ºC/min, até chegar aos 260 ºC. Em seguida, a temperatura foi
elevada até 290 ºC a uma taxa de 10 ºC/min e mantida constante por 10 min.
Foram obtidos os espectros de massas por impacto de elétrons para cada
substância presente no extrato. Estes dados foram obtidos durante as
experiências da dissertação de mestrado do autor (Ortiz-Ramírez 2008).
1.2.4. Isolamento do padrão de diterpenos
Com o objetivo de isolarmos a mistura dos isômeros pachydictyol A (1) e
Isopachydictyol A (2), D. menstrualis foi coletada durante o mês de julho de 2010,
na Praia do Forno, Armação de Búzios (RJ). O material seco (95 g) foi submetido
à extração exaustiva com diclorometano (CH2Cl2). Após a redução do volume do
solvente em evaporador rotativo sob pressão reduzida, duas alíquotas de 2,5 g,
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
13
de cada extrato bruto, foram submetidas à partição em coluna tipo flash em gel de
sílica (0,015 – 0,045 mm) (Ø3 cm, altura da coluna 20 cm), usando como fase
móvel, os solventes ou misturas de solventes CH2Cl2:AcOEt 8:2, 1:1, AcOEt 100%
e Acetona 100%. As frações 2 e 3 das duas colunas foram reunidas (165 mg).
Esta fração foi submetida a um fracionamento em coluna de gel de sílica
preparativa (0,015 – 0,045 mm) (Ø2 cm, altura da coluna 10 cm),
isocrática
usando n-hexano:AcOEt 9:1, onde foram obtidas 24 frações(F1-F24). As frações
F8 a F11 foram reunidas (55 mg), e um novo fracionamento foi realizado em coluna
de gel de sílica (0,015 – 0,045 mm) (Ø1 cm, altura da coluna 15 cm), usando
como fase móvel, o n-hexano. A polaridade foi sendo aumentada pelo acréscimo
progressivo de CH2Cl2. Foram obtidas 24 fracões (F1-F24), sendo reunidas as
frações F8
e
F9 (45 mg), que consistiam num óleo amarelado, que pelos sinais
espectrais de RMN 1H correspondem à mistura dos isômeros pachydictyol A (1) e
Isopachydictyol A (2) (Pathirana & Andersen 1984; Durán et al. 1997; Freitas
2006) (Figura 3, 4).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
14
Extrato em CH2Cl2 5 g
A
Alíquota 2,5 g
Alíquota 2,5 g
1° Fracionamento
CH2Cl2:AcOEt 8:2
Fração 2
Fração 3
165 mg
2° Fracionamento
Hex:AcOEt 9:1
Frações 8 – 11 (55 mg)
3° Fracionamento
Hex:CH2Cl2
Frações 8 e 9 (45 mg)
Diterpenos 1 e 2
B
Figura 3. A) Esquema de fracionamentos para obtenção da mistura dos diterpenos
isômeros pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2). B) Placa cromatográfica em camada
delgada revelada em sulfato sérico, onde as frações F8 e F9 correspondem à mistura dos
isômeros usados como padrão no modelo RGB.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
15
Figura 4. Espectro RMN 1H (300 MHz, em CDCl3, TMS como referência interna) da mistura dos diterpenos pachydictyol A (1) e isopachydictyol
A (2).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
16
1.2.5. Cromatografia em camada delgada (CCD)
Várias soluções de concentração conhecida do extrato hexânico de D.
menstrualis e de D. ciliolata foram usadas para realizar diferentes placas
cromatográficas. A mistura de pachydictyol A e isopachydictyol A foi utilizada
como padrão de calibração do método. Foram utilizadas placas de gel de sílica 60
F254 Merck®, com 2,5 cm x 10 cm, eluídas em n-hexano: acetato de etila (7:3).
Com o auxilio de uma micropipeta automática, foram realizadas aplicações de 3µL
das soluções de extratos, obtendo-se as massas de 100 a 1000 µg por aplicação.
A revelação das bandas cromatográficas foi realizada através do borrifamento
com solução de sulfato cérico (CeSO4) a 2% em ácido sulfúrico (H2SO4), seguido
do aquecimento em placa aquecedora. Imediatamente após a revelação das
bandas cromatográficas, a placa foi digitalizada em escâner de mesa HP Scanjet
2400.
.
1.2.6. Processamento das imagens e calibração
As imagens foram digitalizadas em formato JPEG, cuja sigla em inglês
significa Joint Pictures Expert Group, com uma resolução de 300 dpi, ou seja, 300
micropingos de tinta numa área de uma polegada quadrada, usando o canal RGB,
referente às três cores primárias, vermelho, verde e azul, no formato de imagem
de oito bits. As cores formadas na composição RGB são expressas por valores
proporcionais para cada cor da imagem gerada. A obtenção dos resultados foi
realizada no programa de processamento de imagens Adobe® Photoshop CS5
versão 12.0, usando a ferramenta conta gotas, no tamanho amostral médio de
3x3 píxeis (Figura 5).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
17
Figura 5. Aba da ferramenta conta gotas do programa Adobe® Photoshop CS5 versão
12.0 que mostra os valores da composição da cor no canal RGB.
Os valores decompostos do canal de cores RGB podem ser tratados como um
análogo da energia radiante em espectrofotometria UV/visível, assim os valores
de uma cor primária do branco foram tratados como energia incidente (P 0) e os
valores das aplicações eluídas em CCD foram tratados como energia emergente
(P), resultando no cálculo da absorbância (Abs = -log P/P0) (Gomes et al. 2008).
Para validar este método foi realizada uma calibração quantitativa univariada
da placa cromatográfica em duplicata, utilizando-se a mistura de pachydictyol A
(1) e isopachydictyol A (2) como padrão. O branco é considerado como a média
aritmética de 10 pontos aleatórios na placa CCD em áreas onde não existissem
rastos da eluição da mistura, Os valores para o cálculo da energia emergente
foram obtidos em 10 pontos aleatórios dentro da área da aplicação eluída e
revelada da amostra dos isômeros. A partir desses dados foi realizada uma curva
de calibração Abs. vs [µg]. Os mesmos cálculos foram realizados na placa CCD
comparativa de D. menstrualis e D. ciliolata e a diferença proporcional obtida foi
comparada com os resultados quantitativos obtidos com a análise dos extratos
em CG/EM.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
18
1.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A cromatografia em camada delgada é o método a ser avaliado como uma
ferramenta auxiliar para diferenciar duas populações ou espécies muito próximas
através da expressão cromática dos principais componente químicos após
revelação adequada. Após a revelação, podem-se utilizar as intensidades e a
composição das cores susceptíveis de serem mensuradas por dispositivos digitais
(escâner) para posterior processamento computacional e matemático.
O uso de imagens digitais para análise quantitativa em CCD não é novo (Lin
et al. 1998; López et al. 1999), no entanto não há registro de sua aplicação em
produtos naturais de algas.
Para estudar a factibilidade do uso deste método antes da análise univariada
por
decomposição
das
cores,
tornou-se
necessário
testar
diferentes
concentrações dos extratos das algas, com o intuito de obtermos uma placa
cromatográfica com boa resolução, possibilitando a definição do padrão cromático
(cores) a ser utilizado. Foram realizados também vários testes com diferentes
sistemas de eluentes.
Após realizar as placas cromatográficas com aplicações de diferentes massas
dos extratos de D. ciliolata e D. menstrualis, foi possível determinar que
aplicações entre 250 e 300 µg oferecem uma boa resolução e definição do padrão
cromático das manchas cromatográficas. A Tabela 1 apresenta os principais
resultados obtidos nas placas cromatográficas, com diferentes concentrações
(massas) dos extratos brutos de D. menstrualis e D. ciliolata, e as vantagens e
desvantagens observadas.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
19
Tabela 1. Vantagens e desvantagens das diferentes massas de extrato de D. ciliolata e
D. menstrualis aplicadas nas placas cromatográficas.
Concentração

< 200 µg
250 e 300 µg

Vantagem
Visualização
componentes
majoritários
dos
químicos
Desvantagem
 Baixa
resolução
do
padrão
cromático
Boa resolução com definição
do padrão cromático

Saturação
da
sílica
 Rastro da eluição
>300 µg
muito
forte
prejudicando
a
observação visual
do resultado
Conforme os resultados obtidos nesses testes, foram selecionadas

Visualização
dos
componentes
químicos
majoritários com pouco tempo
de
aquecimento
(alguns
segundos).
aplicações com a massa de 300µg de extrato na placa de CCD, eluída na mistura
de hexano e acetato de etila (7:3) (Figura 6).
Pachy e Isopachydictyol
A
Acetato do dictyol
Dictyol E
B
Acetoxicicloxeniano
Dictyol C
Cicloxenia
no
Esteróis
Figura 6. Placa CCD eluída em hexano e acetato de etila (7:3) dos extratos de Dictyota
ciliolata (morfotipos A1 e A2, Ilha Grande) e D. menstrualis das populações de Búzios
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
20
(BZ) e do Arquipélago São Pedro e São Paulo (SPSP), indicando alguns dos seus
produtos naturais reconhecíveis pelo padrão cromático de revelação.
Para realizar a calibração do método, foi escolhida uma mistura dos isômeros
pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2). Foram aplicados de 0,39 a 200 µg da
mistura para determinação mudança do perfil cromático em função das diferentes
massas. O limite de detecção visual foi de 6,25 µg, quando utilizado o
aquecimento da placa a 80°C por cerca de 1 min. A massa de aplicação X
correspondeu a 50 µg e foi estabelecida como valor de referência para avaliar a
precisão da análise univariada por decomposição das cores primarias R
(vermelho), G (verde) e B (azul) (Figura 7).
Figura 7. Placa de calibração em cromatografia de camada delgada com a mistura dos
isômeros pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2) com Rf = 0,70. A massa de aplicação
X corresponde a 50µg, e foi considerada como a massa desconhecida. Esses dados
servirão para a avaliação por análise univariada de cada canal de cor primária.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
21
O uso da fórmula Abs = -log P/P0 em análises de imagens digitais por
decomposição de cor como um processo análogo ao espectrofotômetro, deve
cumprir a lei de Beer (Gomes et al. 2008). Segundo esta lei, quanto maior o
percurso óptico que a radiação tem que percorrer, em concentração constante,
maior será sua absorção. Do mesmo modo, quando o caminho óptico é fixo, como
no caso da placa CCD, mas com aplicações de massas diferentes deve-se obter
o mesmo efeito mostrando uma correlação positiva.
Após a conversão dos valores RGB em absorbância para cada aplicação da
mistura dos isômeros pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2), a Figura 8
demonstra correlação positiva entre as aplicações em diferentes massas e os
seus valores de absorbância, sendo respeitada, portanto, a lei de Beer.
0,35
0,3
Absorbância
0,25
0,2
R
0,15
G
0,1
B
0,05
0
-0,05
6,25
12,5
25
50
100
200
µg
Figura 8. Absorbância em placa de CCD para cada cor primária RGB em função da
massa de amostra aplicada na placa (em µg).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
22
A partir dos dados de composição RGB e do comportamento observado
(Figura 8), foi possível determinar que a cor vermelha (R) se encontrava saturada
e sofreu pouca variação correlativa com respeito às cores complementares, verde
(G) e azul (B). Isto foi confirmado pelo valor de R2 no modelo linear para esta cor.
A aplicação de 50 µg foi assumida como um analito desconhecido para validar o
método de análise univariada (Figura 9).
0,35
0,3
y = 0,0966x - 0,0943
R² = 0,8451
Absorbância
0,25
R
0,2
0,15
y = 0,2177x - 0,1903
R² = 0,9741
G
y = 0,1027x - 0,0607
R² = 0,9876
B
0,1
0,05
0
-0,05
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Log[µg]
Figura 9. Curva de calibração para cada cor primária, vermelho (R), verde (G) e azul (B)
dos isômeros pachydictyol A e isopachydictyol A.
Utilizando-se cada modelo, a aplicação X correspondeu aos seguintes
valores: 39,56 µg para a cor vermelha; 43,78 µg, para a cor verde e 59,98 µg,
para a cor azul. O modelo com menor robustez foi o da cor vermelha (R), devido à
sua saturação e a baixa correlação linear (R2). As duas outras cores (verde e
azul) apresentaram maior aproximação com aqueles obtidos pelo método
experimental (Tabela 2).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
23
Tabela 2. Massa calculada pelo método RGB para a amostra desconhecida.
Cor
Massa calculada
(µg)
Diferença entre a massa real
Erro (%)
(50µg) e a massa calculada (µg)
R – vermelho
39,56
-10,44
26,4
G – verde
43,78
-6,22
14,2
B – azul
59,98
+9,98
16,6
Embora o modelo para a cor verde (G) mostrou-se com um menor erro e mais
perto da concentração real, o modelo mais apropriado para a quantificação da
mistura de isômeros foi o da cor complementar azul (B), por apresentar uma
maior correlação (R2 = 0,9876), o que significa em outros termos maior precisão.
Os diterpenos guaianos prenilados, como o pachydictyol A e isopachydictyol
A, estão presentes em várias espécies do grupo Dictyota (Pathirana & Andersen
1984; Durán et al. 1997; Teixeira et al. 2001; Cavalcanti 2004; Siamopoulou et al.
2004; Vallim et al. 2005; Cavalcanti et al. 2006; Freitas 2006; Oliveira 2006; De
Paula 2007; Freitas et al. 2007; Oritz-Ramírez 2008; Ortiz-Ramírez et al. 2008;
De-Paula et al. 2008; Manzo et al. 2009) Os diterpenos desse tipo de esqueleto
carbônico apresentam, na maioria dos casos, um padrão de revelação cromático
muito similar, quando utilizamos o sulfato cérico como revelador. Esse padrão
deve-se à funcionalização mais comum desses diterpenos, com uma, duas ou
três hidroxilas.
Após a confirmação da aplicabilidade do uso de imagens digitais para a
quantificação da mistura dos isômeros pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2),
extratos de diferentes populações de D. menstrualis e D. ciliolata foram
submetidos à análise pelo método de quantificação em placas de CCD (Figura 6).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
24
A espécie D. menstrualis foi usada como padrão por ser quimicamente bem
conhecida (Teixeira et al. 2001; Cavalcanti 2004; Cavalcanti et al. 2006; OrtizRamírez 2008; Ortiz-Ramírez et al. 2008; Cavalcanti et al. 2008).
Os dados quantitativos do pachydictyol A (1), Isopachydictyol A (2) e outros
produtos de D. menstrualis coletadas em Búzios e no Arquipélago de São Pedro e
São Paulo foram, anteriormente analisados por CG/EM e refletem uma notável
variação no perfil quantitativo (Tabela 3).
Tabela 3. Dados quantitativos expressados em abundância relativa (%) de alguns
produtos naturais de Dictyota menstrualis das populações de Búzios e Arquipélago São
Pedro e São Paulo, tomados de Ortiz-Ramírez et al. 2008.
Composto/áreas de coleta
Praia Rasa,
Búzios, RJ
Arquipélago
São Pedro
e São Paulo
Abundancia relativa
(%)
DITERPENOS
Guaianos prenilados
Pachydictyol A (1)
1.77
3.91
Isopachydictyol A (2)
1.06
1.22
Dictyotadiol
0.82
1.34
Dictyol C
0.75
1.19
6-Hidroxi-dichotoma-2,13-dieno16,17-dial
8.38
1.75
6-Acetoxi-dichotoma-2,13-dieno16,17-dial
2.64
1.14
5-Hidroxi-1,6-cicloxenia-2,13-dieno16,17-dial
5.02
1.62
5-Acetoxi-1,6-cicloxenia-2,13-dieno16,17-dial
2.68
8.03
Dichotomanos
Cycloxenianos
ESTERÓIS
Colesterol
Fucosterol
2.54
1.80
6.24
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
25
Os dados de absorbância baseados na lei de Beer obtidos pelo método de
quantificação em placa de CCD para os produtos de D. menstrualis foram
comparados com os dados obtidos por CG/EM previamente (Ortiz-Ramírez et al.
2008).
Os resultados demonstram que a analise de imagens dos valores da cor azul
(B) previamente estipulada como a mais apropriada, detectou diferenças
populacionais da espécie D. menstrualis (teste t, p = 0,0001), em termos de
absorbância, onde a maior absorbância corresponde à maior concentração da
mistura de isômeros, respeitando a lei de Beer. No caso de D. ciliolata seus
valores foram similares e o valor p igual a 0,0756 rejeita a hipótese que haja
diferença significativa na produção quantitativa da mistura de isômeros nas
diferentes populações (Tabela 4).
Tabela 4. Valores do canal de cor azul (B) e absorbância calculada das populações de
Dictyota ciliolata (A1 e A2) e de D. menstrualis (BZ e SPSP) com o seu respectivo valor p
do teste t.
A1
Dado da cor azul 163,0 ± 7,02
Absorbância
Teste t (valor p)
0,18 ± 0,02
A2
BZ
SPSP
166,1 ± 4,5
130,4 ± 9,4
94,6 ± 11,4
0,17 ± 0,02
0,28 ± 0,02
0,42 ± 0,05
0,0756
0,0001
Ao comparar os dados da mistura dos isômeros pachydictyol A (1) e
isopachydictyol A (2) em termos de proporção, da porcentagem relativa pelo
CG/EM e da absorbância pelo método de análises de imagens é possível ver que
não existe discrepância e que os dois métodos mostram uma marcada diferença
entre as duas populações (proporção BZ:SPSP pelo método CG/EM 1:1,8;
proporção BZ:SPSP pelo método de análise de imagens do canal azul 1:1,5).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
26
Não foram encontrados estudos do uso da cromatografia em camada delgada
para analises quantitativa ou semiquantitativa de misturas complexas, tais como
extratos de algas. Alguns estudos fazem menção a diferenças populacionais dos
componentes químicos de algas sendo observadas em placas CCD. No entanto,
os resultados obtidos nesses estudos não permitiram o estabelecimento de
conclusões quantitativas confiáveis (Freita 2006; De Oliveira 2006).
No entanto, o uso de imagens digitais e analises por decomposição de cores
vem ganhando reconhecimento na ultima década nas áreas industriais, médicas,
nos processos de controle de qualidade, na educação e na detecção de
contaminantes como metais pesados (Gomes et al. 2008; Soponar et al. 2008;
Godinho et al. 2008). Suas principais vantagens são o baixo custo, a versatilidade
e a rápida obtenção dos resultados.
A CCD é uma técnica muito usada em estudos fitoquímicos e é aplicada como
uma técnica rotineira para guiar processos de fracionamentos para o isolamento e
a purificação de produtos naturais. No entanto, sua versatilidade vai além dos
usos mencionados e pode ser considerada como uma ferramenta auxiliar para
taxonomistas químicos, visto que a produção dos metabólitos secundários reflete
uma condição própria da espécie, o que tem sido confirmado por vários estudos
(Kelecom & Teixeira 1986; Kelecom 1988; Fleury et al. 1994; De-Paula et al.
2001; Barbosa et al. 2004; De-Paula et al. 2011).
De-Paula (2000) no seu estudo sobre uma abordagem química, sistemática e
biogeográfica da tribo Dictyoteae, apresenta um acervo importante de placas
cromatográficas comparativas com diferentes espécies coletadas na costa
brasileira. Nestas placas é possível observar que o uso de solventes de eluição
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
27
adequados, o gênero Canistrocarpus (De Paula et De Clerck) pode ser
reconhecível. Um caso de polimorfismo apresentado neste trabalho demonstrou
que espécimes largos e planos de C. cervicornis podem ser confundidos com um
morfotipo de D. menstrualis de Búzios (RJ). Por outro lado, o perfil químico do
extrato desses espécimes de D. menstrualis, revelado em CCD, auxiliou a
elucidar sua verdadeira identidade taxonômica.
O uso de placas cromatográficas (CDD) pode ser uma importante ferramenta
de auxilio na identificação preliminar das espécies, em particular daquelas
próximas morfologicamente.
Durante o desenvolvimento do presente trabalho foi coletado na Ilha Grande
indivíduos codificados como A6, espécimes de uma alga de pequeno porte e com
características similares a D. friabilis Setchell (= D. pfaffii Schnetter ou D.
humifusa Hörnig, Schnetter & Coppejans), mas o perfil químico dos extratos de A6
e de D. friabilis demonstrou muitas diferenças quanto aos componentes químicos
majoritários (Figura 10).
Figura 10. Comparação do extrato de Dictyota friabilis e do espécime A6
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 1
28
O resultado da placa CCD comparativa dos extratos de A6 (Dictyota sp.) e D.
friabilis resultou ser o primeiro resultado sobre a identidade dessa espécie não
identificada. Discussões taxonômicas mais detalhadas encontram-se no capitulo
3.
1.4. CONCLUSÃO
Determina-se que a concentração do extrato bruto ideal para a obtenção das
imagens das placas cromatográficas das espécies D.menstrualis e D. ciliolata
foi de 300 µg de extrato, pois forneceram uma boa definição e resolução do
padrão cromático.
A análise de imagens digitais por decomposição do canal de cores RGB
demonstra ser uma técnica importante para a quantificação dos diterpenos
pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2). A cor primária azul demonstra ser a
mais apropriada pelos seus valores de composição, que são mais sensíveis a
diferentes concentrações, ajustando-se coerentemente aos princípios da lei de
Beer.
Os resultados não evidenciam discrepância quando comparados com aqueles
obtidos pelas técnicas de CG/EM.
Esta ferramenta é útil como uma técnica auxiliar no estabelecimento da
identidade taxonômica de espécies com morfologias próximas.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
29
CAPÍTULO 2. ESTUDO QUIMIOTAXONÔMICO DAS ALGAS DA TRIBO
DICTYOTEAE DA REGIÃO DE SANTA MARTA, MAR DO CARIBE, COLÔMBIA
Resumo: Este capítulo apresenta a primeira abordagem quimiotaxonômica de
algas marinhas da tribo Dictyoteae oriundos do sul caribenho. Foram analisadas
26 diferentes amostras de algas coletadas na baía de Santa Marta (Magdalena,
Colômbia), pela técnica de CG/EM. A análise dos produtos naturais presentes nos
extratos em acetato de etila obtidos de cada amostra permitiram agrupá-las em
quatro grupos diferentes (A-D). No primeiro grupo (A), não foi possível identificar
diterpenos como compostos majoritários. Nos grupos B e C foram encontrados
diterpenos com padrão de fragmentação similar à dos guaianos prenilados. No
grupo D foram identificados diterpenos do tipo dolastano e secodolastano.
Baseados na proposta do uso dos diterpenos como marcadores taxonômicos da
tribo Dictyoteae, os resultados sugerem que o grupo D corresponde a algas do
gênero Canistrocarpus. Análises morfológicas posteriores confirmaram a
identidade taxonômica dessas amostras como pertencentes à espécie C.
cervicornis.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
30
2.1. INTRODUÇÃO
O inventário mais recente das macroalgas bentônicas do Atlântico tropical e
subtropical ocidental apresenta em torno de 1393 espécies (Wynne, 2011). Para a
região do Mar do Caribe colombiano, incluindo as regiões oceânicas e costeiras, o
inventario mais atual inclui 565 espécies de macroalgas, o que representa em
torno dos 40% do total conhecido para o Atlântico tropical e subtropical ocidental,
sugerindo uma alta diversidade específica de macroalgas para essa região. Se
levarmos em consideração que a sua extensão constitui menos dos 5%, ou seja
1600 Km da linha costeira desde o litoral do estado da Carolina do norte (EUA)
até o extremo sul do Brasil (Díaz-Pulido & Díaz-Ruíz, 2003). Nesta lista de
espécies da região caribenha colombiana estão presentes 18 espécies da tribo
Dictyoteae (Tabela 5).
Tabela 5. Ocorrência de espécies da tribo Dictyoteae na região caribenha colombiana
(segundo Díaz-Pulido &Díaz-Ruíz, 2003)
Espécie da tribo Dictyoteae
Canistrocarpus cervicornis (Kützing) De Paula et De Clerck
Canistrocarpus cervicornis Kützing f. pseudohamata (Cribb)
De Clerck & Coppejans
Canistrocarpus crispatus Lamouroux
Dictyota canaliculata De Clerck & Coppejans
Dictyota caribaea Hörnig & Schnetter
Dictyota bartayresiana J.V. Lamoroux
Dictyota ciliolata Sonder ex Kützing
Dictyota crenulata J. Agardh
Dictyota crispata Lamouroux
Dictyota guajirae Hörnig, Schnetter & J.M. Ove
Dictyota guineensis (Kützing) P. Crouan & H. Crouan
Dictyota hamifera Setchell
Dictyota humifusa Hörnig, Schnetter
& Coppejans in Hörnig et al.
Dictyota menstrualis (Hoyt) Schnetter, Hörnig, & WeberPeukert
Dictyota mertensii (Martius) Kützing
Dictyota pfaffii Schnetter
Dictyota pinnatifida Kützing
Dictyota pulchella Hörnig & Schnetter
Dictyota volubilis Kützing sensu Vickers
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
31
As macroalgas pardas marinhas da família Dictyotaceae, onde estão incluídas
as espécies da tribo Dictyoteae é uma fonte rica em metabolitos secundários, em
especial, diterpenos (Teixeira et al, 1991; Teixeira, 2002). Essas substâncias
apresentam um valor imensurável na luta contra diferentes doenças que atingem
a população humana, uma vez que alguns desses diterpenos mostraram
comprovada atividade in vitro como: antiviral (HIV-1, HSV-1), antileshmaniose,
anticoagulante, antiplaquetária, contra alguns dos efeitos do veneno de serpentes
e atividade anticâncer dentre outros (Barbosa et al. 2004; Pereira. et al. 2004,
2005; Cierne-Santos et al. 2006, 2008; Soares et al. 2007; Abrantes et al. 2010;
Vallim et al. 2010; Moura et al. 2010; Ayyad et al. 2011; Moura et al. 2011;
Domingos et al. 2011; Moura et al. 2011; Santos et al. 2011).
Por outro lado, os metabolitos secundários são produto de rotas metabólicas
que refletem características próprias de cada espécie. Esse é um dos princípios
básicos da taxonomia química. Seguindo esta linha de pensamento, os diterpenos
têm sido propostos como marcadores taxonômicos da tribo Dictyoteae (Pathirana
& Andersen 1984; Teixeira et al. 1985, 1986, 1990, 2001; Kelecom & Teixeira
1986; Teixeira & Kelecom 1988; Yamase et al. 1999; De-Paula et al. 2001; DePaula et al. 2007; De-Paula et al. 2008; Barbosa et al. 2003; Cavalcanti et al.
2006; Oliveira et al. 2008) e serviram como uma ferramenta útil para o
estabelecimento da nova espécie Dictyota dolabellana na costa brasileira (DePaula et al. 2007).
Outra abordagem importante é o uso de metabolitos secundários, no caso das
algas da família Dictyotaceae, os diterpenos, como marcadores biogeográficos, o
que pode auxiliar a compreensão da distribuição das espécies e na
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
32
caracterização das variações geográficas das populacionais pela sua produção
diferenciada (Teixeira & Kelecom 1987; Teixeira et al. 1990; Vallim et al. 2005;
Freitas et al. 2007; Oliveira et al. 2008; Ortiz-Ramírez et al. 2008; De-Paula et al.
2008, 2011; Vasconcelos et al. 2010). No entanto, apesar da região caribenha
colombiana ser considerada uma de alta diversidade de macroalgas bentônicas e,
portanto, com grande potencial do uso dos metabolitos secundários em diferentes
áreas da Ciência, como a biotecnologia, a taxonomia e a biogeografia, existe
pouca informação sobre os diterpenos das populações da tribo Dictyoteae desta
região. Apenas dois trabalhos testaram extratos brutos de diferentes algas e, de
acordo com os resultados obtidos, sugeriram que os componentes químicos de
Dictyota pulchella apresentam atividade antimitótica (Díaz et al. 2006) e que D.
bartayresiana e D. pulchella apresentam atividade antimicrobiana (Matínez et al.
2002).
Buscando ampliar o conhecimento sobre os diterpenos presentes na tribo
Dictyoteae das populações coletadas no Caribe colombiano o presente capitulo
tem como objetivos:

Identificar o perfil químico e os produtos majoritários das algas coletadas
na região de Santa Marta Colômbia pela técnica de cromatografia gasosa
acoplada a espectro de massas.

Agrupar as espécies de algas, segundo a natureza de seus extratos
através de seu perfil cromatográfico.

Comparar o perfil químico das espécies com outras populações da região
Atlântica tropical e subtropical ocidental.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
33
2.2. MATERIAL E MÉTODOS
2.2.1. Coleta do material algáceo
Vinte e oito amostras de algas marinhas da tribo Dictyoteae foram coletadas
na região caribenha de Santa Marta, Magdalena, Colômbia, em Pozos Colorados
(11°09’53’’N, 74°13’50’’W, código C1), El Rodadero (11°13’00’’N, 74°13’00’’W,
código C2) e Taganga (11°15’37’’N, 74°11’00’’W, código C3) (Figura 11). As
coletas foram realizadas durante o mês de maio de 2008, a uma profundidade de
1-5 m, através de mergulho livre. As exsicatas de cada amostra foram
depositadas no herbário do Museo de Historia Natural Marina de Colombia”, do
“Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras INVEMAR” (MHNMC 133-160 de
2008).
Figura 11. Mapa da região de Santa Marta (Colômbia) indicando os locais de coleta das
algas da tribo Dictyoteae C1: Pozos colorados, C2: El Rodadero e C3: Taganga.
As algas coletas foram lavadas em água do mar no local de coleta, triadas em
campo
para
a
retirada
de
epibiontes,
areia
e
fauna
acompanhante.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
34
Posteriormente, as algas foram secas a temperatura ambiente, na sombra e, a
seguir, mantidas sob refrigeração.
2.2.2. Preparação dos extratos
O material seco e limpo de cada amostra de algas foi submetido à extração
com Acetato de etila (AcOEt) durante 24 h, por três vezes consecutivas.
Posteriormente, o solvente foi retirado, sob pressão reduzida, em evaporador
rotativo. As massas de todas as amostras foram obtidas e mantidas sob
refrigeração até o fracionamento.
Com o objetivo de reduzir a quantidade de pigmentos para as análises em
CG/EM de cada amostra de alga, cada extrato foi submetido à uma filtração em
coluna com gel de sílica (60 Mesh) acrescido de uma camada de carvão ativado,
depositado sobre a superfície da coluna (2 g de sílica gel e 30 mg de carvão
ativado por cada 100 mg do extrato). A eluição foi realizada com hexano e AcOEt
(1:1) e AcOEt 100%. A seguir, as frações foram reunidas, sendo os solventes
retirados, sob pressão reduzida, em evaporador rotativo (Cavalcanti et al. 2008).
2.2.3. Identificação dos perfis químicos das amostras
Uma alíquota de 10 µg de cada extrato limpo dissolvida em 1µL de acetato de
etila foi injetada no cromatógrafo em fase gasosa Agilent Technologies®
GC7890A acoplado ao espectro de massas MSD-5975C Agilent Tecnologies®
com auto-injetor em modo de impacto de elétrons (70 eV) equipado com coluna
HP-5MS (5% PhenylMethylSilox) de 60 m x 250 µm x 0,25 µm no modo Split 1:20
e empregando o hélio como gás de arraste grado 5,0 a um fluxo de 1 mL/min,
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
35
programado a uma temperatura inicial 100 °C aumentando 4 °C/min. até chegar
aos 260 °C mantendo-se por 15 min, em seguida a uma taxa de 10 °C/min. a
temperatura foi elevada aos 290 °C mantendo se por 15 min (tempo total 73 min).
Foram obtidos os espectros de massas por impacto de elétrons para cada
substancia susceptível de identificação.
Adicionalmente, nas mesmas condições cromatográficas, uma mistura padrão
de parafinas (C14-C26) foi injetada para calcular os índices de kovats (IK), os
dados foram processados no programa MSD ChemStation E.01.00.237, os
espectros de massas dos metabolitos susceptíveis de identificação foram
comparados com os dados de literatura, assim como com a base de dados de
espectros de massas de diterpenos da Dra. Diana Negrão Cavalcanti.
Para os dolastanos e secodolastanos, as identidades dos diterpenos foram
confirmadas pela análise de RMN 1H (300 MHz), de misturas ou de amostras
semipuras, pela Dra. Valéria Laneuville Teixeira e pela comparação com os dados
espectrais do catálogo desses diterpenos.
Este estudo foi realizado em conjunto com o aluno Alonso Pardo Vargas em
sua monografia final do curso de Química do grupo de pesquisa “Estudio y
Aprovechamiento de Productos Naturales Marinos y Frutas de Colombia da
Universidade Nacional de Colômbia, coordenado pelo Dr. Leonardo Castellanos
através do projeto de convênio internacional Brasil-Colômbia ([490425/2010-0]
CNPq), aprovado pelas entidades de fomento COLCIENCIAS (Colômbia) e CNPq
(Brasil) no ano de 2011 entre o grupo colombiano e o nosso grupo de pesquisa.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
36
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Levando em consideração o mais recente inventario das macroalgas
bentônicas do Caribe colombiano, até o ano 2003, 19 das 20 espécies do gênero
Dictyota com registro para o Atlântico ocidental e subtropical, estão presentes no
litoral caribenho colombiano (Diaz-Pulido & Díaz-Ruíz, 2003). Dentre essas, 19
espécies e segundo a distribuição local, na região litorânea do distrito de Santa
Marta existia alta probabilidade de se coletar material de 18 espécies listadas na
tabela (6).
Tabela 6. Lista das prováveis espécies que podem ser coletadas na região do Distrito de
Santa Marta, Caribe – Colômbia (Segundo Diaz-Pulido & Díaz-Ruíz 2003).
Espécie
Dictyota bartayresiana
Dictyota canaliculata
Dictyota caribea
Distribuição no Mar do Caribe da Colômbia
Tayrona, San Andres e Providencia Velha
Tayrona
San Andres e Providencia Velha
Guajira, Tayrona, Magdalena, Morrosquillo, Ilhas de
Dictyota cervicornis
Rosario, Darien, San Andres e Providencia Velha
Dictyota cervicornis f. Guajira, Tayrona,
pseudohamata
Dictyota ciliolata
Guajira, Tayrona, Magdalena, Morrosquillo
Guajira, Tayrona, Magdalena, Ilhas de Rosario
Dictyota crenulata
Guajira, Tayrona, Magdalena, Ilhas de Rosario, sem local
Dictyota crispata
Dictyota guajirae
Guajira
Dictyota guineensis
Darien, San Andres e Providencia Velha
Dictyota hamifera
Tayrona, San Andres e Providencia Velha
Dictyota humifusa
Tayrona
Dictyota menstrualis
Guajira, Tayrona, Magdalena, Morrosquillo
Ilhas de Rosario, Darien, San Andres e Providencia Velha
Dictyota mertensii
Ilhas de Rosario, Darien, San Andres e Providencia Velha
Dictyota pfaffii
Dictyota pinnatifida
Guajira, Tayrona,
Guajira, Tayrona, Magdalena, Ilhas de Rosario
Dictyota pulchella
Dictyota volubilis
Tayrona
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
37
Após obter os cromatogramas de cada lote de algas uma inspeção preliminar
permitiu definir três regiões características nos cromatogramas: A primeira
encontra se dentre 0 e 2000 IK, a segunda desde 2000 até 2750 IK e a terceira
região desde 2750 IK em diante.
A primeira região (0 – 2000 IK) caracteriza se por apresentar as substâncias
de menor polaridade onde os picos majoritários são atribuídos aos ácidos graxos
e seus ésteres metílicos.
A segunda região (2000 – 2750 IK) foi a que apresentou maiores variações
dentre os espécimes e ofereceu um critério valido para classificar os lotes das
algas, visto que esta região caracteriza se pela presencia dos diterpenos
marcadores taxonômicos deste grupo de algas (Kelecom & Teixeira 1986; 1988;
Fleury et al. 1994; De-Paula et al. 2001; Barbosa et al. 2004; De-Paula et al.
2011). Essas informações foram usadas na tentativa de identificar as espécies em
quatro grupos taxonômicos (A – D).
A terceira região (<2750 IK) caracteriza se pelas substancias de maior tempo
de retenção e maior peso molecular onde predominam diferentes tipos de
esteróis.
As informações gerais de cada amostra e sua classificação nos grupos
taxonômicos são apresentadas na Tabela 7 um exemplo do cromatograma típico
de cada grupo pode ser observado na Figura 12.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
38
Tabela 7. Códigos dos Locais de coleta, Locais de coleta, códigos das amostras, massas
secas das algas (em g), massas dos extratos em acetato de etila (em MG), rendimentos
dos extratos das amostras (em %) e grupo segundo o perfil cromatográfico das amostras
coletadas na região de Santa Marta, Colômbia.
Local
Nome do local
Código
Massa
(g)
Extrato
(mg)
Rendimento
(%)
Grupo
segundo o
perfil
C1
Pozos colorados
PC1
3,78
82,3
2,2
A
C1
Pozos colorados
PC2
4,18
201,7
4,8
A
C2
El Rodadero
R1
5,04
35,7
0,7
A
C2
El Rodadero
R2
5,03
115,0
2,3
C
C2
El Rodadero
R3
4,73
70,8
1,5
B
C2
El Rodadero
R4
5,02
240,8
4,8
C
C2
El Rodadero
R5
4,98
196,1
3,9
B
C2
El Rodadero
R6
5,25
52,7
1,0
B
C2
El Rodadero
R7
5,22
125,6
2,4
B
C2
El Rodadero
R’1
5,01
85,8
1,7
A
C2
El Rodadero
R’2
5,00
43,9
0,9
A
C2
El Rodadero
R’3
3,34
400,6
12,0
A
C2
El Rodadero
R’4
1,18
55,0
4,6
A
C2
El Rodadero
R’5
0,97
29,3
3,0
A
C2
Taganga norte
T1
5,02
59,9
1,2
D
C2
Taganga norte
T2
2,56
84,3
3,3
C
C3
Taganga norte
T3
5,03
291,9
5,8
A
C3
Taganga norte
T4
5,32
66,3
1,2
B
C3
Taganga norte
T5
4,67
135,3
2,9
D
C3
Taganga sul
T’1
5,65
181,2
3,2
D
C3
Taganga sul
T’2
4,35
148,3
3,4
B
C3
Taganga sul
T’3
7,87
440,0
5,6
D
C3
Taganga sul
T’4
2,77
83,9
3,0
D
C3
Taganga sul
T’5
2,54
35,1
1,4
B
C3
Taganga sul
T’6
2,34
36,5
1,6
C
C3
Taganga sul
T’7
1,33
51,4
3,9
D
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
39
Figura 12. Exemplos dos perfis cromatográficos dos extratos das amostras de algas
pardas marinhas da tribo Dictyoteae coletadas no Mar do Caribe, segundo a classificação
por grupos taxonômicos (A-D). A) Cromatograma da amostra da alga R1 pretencente ao
grupo A. B) Cromatograma da amostra da alga R6 pretencente ao grupo B. C)
Cromatograma da amostra da alga R2 pretencente ao grupo C. D) Cromatograma da
amostra da alga T’3 pretencente ao grupo D. As linhas pontilhadas vermelhas delimitam
os cromatogramas nas três regiões previamente definidas.
No grupo A, foram reunidas as amostras que apresentaram apenas um
componente ou não apresentaram componentes com espectro de massas
atribuíveis
aos
apresentaram
diterpenos.
espectros
de
Os
componentes
massas
majoritários
característicos
de
deste
ácidos
grupo
graxos
monoinsaturados.
O grupo B caracterizou-se por apresentar de cinco a nove componentes cujos
espectros de massas revelaram fragmentações típicas dos diterpenos. Os seus
padrões de fragmentação foram atribuíveis aos guaianos prenilados, onde se
destacaram o pachydictyol A (1) e isopachydictyol A (2) (Cavalcanti 2004;
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
40
Cavalcanti et al. 2006; Freitas et al. 2007). Outra característica deste grupo é uma
menor presença dos ácidos graxos monoinsaturados que a encontrada no grupo
A.
O grupo C é similar ao grupo B. No entanto, os espectros de massas
apresentaram fragmentações típicas dos guaianos prenilados com menores
quantidades e variedades. Alguns dos cromatogramas das amostras desse grupo
revelaram picos de diterpenos minoritários, com fragmentações típicas dos
diterpenos do tipo dolastano.
O grupo D caracteriza-se por apresentar espectros de massas com
fragmentações típicas dos diterpenos dos tipos dolastano e secodolastano (De
Oliveira et al. 2008), assim como uma menor proporção dos ácidos graxos
monoinsaturados em relação às amostras de algas dos grupos A, B e C.
As substâncias presentes nos extratos das amostras de algas que foram
identificadas pelos seus tempos de retenção, índice de Kovatz, espectros de
massas e comparação com os dados de literatura com o catálogo do nosso
grupo, são descritas a seguir.
2.3.1. Espectros de massas de substâncias identificadas
A seguir, serão apresentadas as substâncias identificadas pela técnica de
CG/EM por classe de produto natural (ácidos graxos e ésteres derivados,
diterpenos e esteróis). A Tabela 8 apresenta os dados dos ácidos graxos
identificados nas amostras de algas.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
41
Ácidos graxos
Tabela 8. Nome dos ácidos graxos ou derivados, estruturas moleculares, tempo de
retenção (em minutos) e respectivas fragmentações em Espectrometria de Massas por
impacto de elétrons (70eV) (EM-IE) e intensidades relativas (%) dos picos.
EM-IE m/z
Nome das
substâncias
Ester
metílico do
ácido
mirístico
Ester
metílico do
ácido
palmítico
Ácido
palmítico
Estruturas Moleculares
TR
18,75
(3)
23,79
(4)
24,59
(5)
(intensidade
relativa)
242 (14) [M]+, 185
(32), 129 (57), 97
(13), 83 (22), 73 (94),
60 (68), 43 (100).
270 (10) [M]+, 227
(12), 199 (5), 171 (7),
143 (18), 97 (7), 87
(70), 74 (100), 55
(21), 43 (25).
256 (24) [M]+,
(21), 185 (16),
(25), 129 (46),
(20), 83 (26),
(100), 60 (77),
(74).
213
157
97
73
43
As Figuras 13, 14 e 15 apresentam os espectros de massas de cada ácido
graxo identificado nas amostras das algas colombianas.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
42
Abundance
S c a n 2 0 8 8 ( 1 8 . 7 5 7 m in ) : D T ' 3 . D \ d a t a . m s ( + )
7 4 .0
26000
24000
22000
20000
18000
16000
14000
12000
10000
8000
4 3 .1
6000
1 4 3 .1
1 9 9 .1
4000
5 9 .0
2000
1 0 1 .0
2 4 2 .2
1 7 1 .0
0
4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 1 0 01 1 01 2 01 3 01 4 01 5 01 6 01 7 01 8 01 9 02 0 02 1 02 2 02 3 02 4 0
m / z -->
Figura 13. Espectro de massas do éster metílico do ácido mirístico (3) (70eV)
A b u n d a n c e
S c a n
2 9 5 2
(2 3 .7 9 3
m in ) : D T '3 . D \ d a t a . m s
7 4 .0
4 5 0 0 0
4 0 0 0 0
3 5 0 0 0
3 0 0 0 0
2 5 0 0 0
2 0 0 0 0
1 5 0 0 0
4 3 .1
1 0 0 0 0
1 4 3 .1
2 2 7 .2
5 0 0 0
2 7 0 .1
9 7 .1
1 8 5 .1
1 1 5 .1
0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
m / z -->
Figura 14. Espectro de massas do éster metílico do ácido palmítico (4) (70 eV)
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
43
A b u n d a n c e
S c a n
9 5 0 0
3 0 9 0
(2 4 .5 9 7
m in ) : D T '3 . D \ d a t a . m s
7 3 .0
9 0 0 0
8 5 0 0
8 0 0 0
7 5 0 0
7 0 0 0
4 3 .1
6 5 0 0
6 0 0 0
5 5 0 0
5 0 0 0
1 2 9 .1
4 5 0 0
4 0 0 0
3 5 0 0
3 0 0 0
2 5 0 0
2 5 6 .1
2 1 3 .1
9 7 .1
2 0 0 0
1 5 7 .1
1 5 0 0
1 8 5 .1
1 0 0 0
1 1 3 .0
5 0 0
0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
m / z -->
Figura 15. Espectro de massas do ácido palmítico (5) (70 eV)
Diterpenos
A seguir, serão apresentados os diterpenos identificados nas amostras das
algas coletadas na Colômbia, pela técnica de CG/EM. A Tabela 9 apresenta os
dados dos diterpenos identificados nas amostras de algas. As Figuras 16 – 23
apresentam os cromatogramas dos diterpenos que foram identificados nesse
estudo através das técnicas de CG/EM ou CG/EM e RMN 1H.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
44
Tabela 9. Nome dos diterpenos identificados, tempo de retenção (em minutos),
respectivas fragmentações em Espectrometria de Massas por impacto de elétrons (EMIE) e intensidades relativas (%) dos picos e principais sinais em RMN 1H.
1
6 R = OH
2
7 R = OAc
8 R = OH
11
10
9 R = Oac
TR
Pachydictyol A
31,31
288 (36) [M]+, 270 (12), 255
(27), 227 (7), 188 (26), 173 (18),
159 (100), 145 (33), 119 (86),
107 (74), 91 (52), 69 (93), 55
(63), 41 (94)
-
31,30
288 (31) [M]+, 270 (12), 255
(25), 203 (25), 175 (15), 159
(82), 105 (54), 91 (70), 69 (97),
55 (73), 41 (100)
-
35,40
302 (13) [M]+, 284 (30), 277
(20), 266 (13), 259 (78), 241
(100), 223 (37), 199 (39), 183
(30), 171 (29), 157 (25), 149
(40), 133 (43), 123 (60), 105
(52), 91 (65), 79 (42), 55 (42),
0,90 e 1,03 (d,
Me-18 e 19),
0,69 (s, Me16), 1,47 (s,
Me-20),
3,45
(H-4), 4,63 (dd,
(intensidade relativa)
(1)
Isopachydictyol A
(2)
4,9,14-triidroxi-1,9dolastano-1,7-dieno
(6)
EM-IE m/z
Dados
selecionados
de RMN 1H
Nome das
substâncias
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
4-acetoxi-9,14diidroxi-1(15),9dolastano-1,7-dieno
43 (73)
H-7), 4,78 e
4,87 (s, H-15)
35,85
344 (10) [M]+, 316 (10), 319
(23), 301 (38), 284 (12), 259
(23), 241 (95), 223 (38), 209
(10), 199 (57), 183 (20), 157
(30), 133 (40), 119(55), 105
(45), 91 (50), 79 (35), 67 (25),
55 (30), 43 (100)
0,83 e 1.03(d,
Me-18 e 19),
0,89 (s, Me16), 1,24 (s,
Me-20),
2,16
(s, Me), 4,82 e
4,93 (ls, H-15),
5.54 (dd, H-4)
31,98
302 (14) [M]+, 284 (82), 269
(25), 251 (25), 241 (52), 225
(37), 197 (29), 183 (24), 171
(24), 157 (30), 133 (90), 119
(67), 105 (80), 91 (100), 77 (48),
69 (30), 55 (57), 43 (95)
0,80 (s, Me16), 1,07 e
1,09 (Me-18 e
19), 1,40 (Me20), 3,87 (H-4),
4,77 e 4,91 (s,
H-15),
5,45
(dd,
H-7
e
5,57(s, H-10)
32,74
362(5) [M]+, 344 (10), 326 (15),
301 (5), 283 (8), 266 (18), 251
(20), 241 (9) 223 (25), 209 (10),
195 (10), 181 (12), 165 (8), 157
(15), 133 (30), 119 (27), 105
(27), 91 (30), 81 (20), 72 (75),
59 (100), 55 (50), 60 (43)
1,00 (s, Me16), 1,1 e 1,4
(d< Me-18 e
19), 2,20 (s),
4,90 (m, 3H),
5,65 (H-10)
35,67
362 (5) [M]+, 344 (10), 326 (12),
302 (6), 284 (16), 266 (25), 241
(46), 223 (40), 209 (15), 199
(20), 181 (15), 165 (20), 157
(25), 149 (45), 121 (50), 105
(50), 91 (55), 79 (30), 55 (30),
43 (100)
0.88 (s, Me16), 0.94 e
0.91 (d, Me-18
e 19), 1.47 (s,
Me-20), 2.02 e
2.15 (s, 2Me),
4.86 e 4.91 (ls,
H-15),
4.77
(bt,H-4) e 5.88
(dd, H-7)
34,74m 318 (5) [M]+, 300 (5), 285 (3),
in
275 (7), 257 (7), 251 (14), 245
(7), 233 (12), 219 (55), 206 (7),
201 (13), 193 (50), 173 (30),
159 (57), 143 (30), 133 (33),
125 (48), 119 (30), 105 (30), 91
(31), 79 (25), 17 (46), 55 (45),
43 (100)
3.57 (t, H-4),
4.82 (ls, H15a), 4.97 (ls,
H-15b), 0,66 (s,
Me-16, 1.12 (d,
Me-18 e 19) e
1.02 (s, Me-20)
(7)
4,14-diidroxi-dolastano1(15),7,9-trieno
(8)
4-acetoxi-14hidroxi-dolastano1(15),7,9-trieno
(9)
4-7-diacetoxi-14hidroxi-1,9dolastano-1,9-dieno
(10)
isolinearol
(11)
45
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
46
A b u n d a n c e
S c a n
3 2 0 0
4 1 .1
4 2 4 0
( 3 1 . 3 0 0 m in ) : D
1 5 9 .1
R
3 .D
\ d a ta .m s
6 9 .1
3 0 0 0
1 1 9 .0
2 8 0 0
2 6 0 0
2 4 0 0
2 2 0 0
2 0 0 0
1 8 0 0
9 1 .0
1 6 0 0
1 7 7 .1
1 4 0 0
2 8 8 .1
1 2 0 0
1 0 0 0
2 0 3 .1
2 5 5 .1
8 0 0
6 0 0
4 0 0
1 3 7 .0
2 2 7 .0
2 0 0
0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
m / z -->
Figura 16. Espectro de massas do diterpeno do tipo guaiano prenilado pachydictyol A (1)
(70 eV).
A bundanc e
S c a n 4 2 4 2 ( 3 1 . 3 1 2 m in ) : D N 3 . D \ d a t a . m s
4 1 .0
6 9 .0
2000
1 5 9 .1
1 1 9 .0
1800
1600
9 1 .0
1400
1200
1000
1 7 7 .0
800
2 8 8 .0
600
2 0 3 .1
400
2 5 5 .0
1 3 7 .0
200
0
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
240
260
280
m / z -->
Figura 17. Espectro de massas do diterpeno do tipo guaiano prenilado isopachydictyol A
(2) (70 eV).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
47
A b u n d a n c e
S c a n
2 4 0 0 0
4 9 4 5
(3 5 .4 0 9
m in ) : D T '3 . D \ d a t a . m s
2 4 1 .1
2 2 0 0 0
2 0 0 0 0
1 8 0 0 0
4 3 .1
1 6 0 0 0
9 1 .1
1 4 0 0 0
1 2 3 .1
1 2 0 0 0
1 0 0 0 0
1 4 9 .1
1 9 9 .1
2 8 4 .1
8 0 0 0
6 7 .1
6 0 0 0
1 7 1 .1
4 0 0 0
2 6 0 .1
2 0 0 0
3 0 3 .1
2 2 1 .1
0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
3 0 0
m / z -->
Figura 18. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4,9,14-triidroxi-1,9-dolastano1,9-dieno (6) (70 eV).
Abundance
S c a n 5 0 2 3 (3 5 . 8 6 4 m in ): D T '3 . D \ d a t a . m s
2 4 1 .1
7 0 0 0 0 4 3 .1
65000
60000
55000
50000
45000
1 9 9 .1
40000
1 1 9 .1
9 1 .1
35000
3 0 1 .1
30000
25000
1 5 7 .1
20000
6 7 .1
15000
2 6 6 .1
10000
3 4 4 .2
5000
0
40
60
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
m / z -->
Figura 19. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4-acetoxi-9,14-diidroxi-1,9dolastano-1,9-dieno (7) (70 eV).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
48
Abundance
S c a n 4 3 5 5 (3 1 . 9 7 1 m in ): D T '3 . D \ d a t a . m s
9 1 .0
1 3 3 .1
4 3 .1
1600
1400
2 8 4 .1
1200
2 4 1 .1
1000
800
1 5 7 .0
6 9 .0
600
2 6 1 .1
1 9 9 .1
400
1 1 1 .0
1 7 9 .0
200
0
40
60
80
100 120 140
160 180 200 220 240 260
280 300
m / z -->
Figura 20. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4,14-diidroxi-dolastano1(15),7,9-trieno (8) (70 eV).
Abundance
S c a n 4 4 8 7 (3 2 . 7 4 0 m in ): D T '3 . D \ d a t a . m s
9000
5 9 .1
8000
7000
6000
5000
4000
9 1 .1
1 3 3 .1
3000
2 2 3 .1
2 5 1 .2
2000
1 5 7 .0
3 2 6 .2
1 9 5 .0
1000
2 8 3 .1
0
40
60
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
m / z -->
Figura 21. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4-acetoxi-14-hidroxi-dolastano1(15),7,9-trieno (9) (70 eV).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
49
A b u n d a n c e
S c a n
4 9 9 1
(3 5 .6 7 8
m in ) : D T '3 . D \ d a t a . m s
4 3 .1
1 7 0 0 0
1 6 0 0 0
1 5 0 0 0
1 4 0 0 0
1 3 0 0 0
1 2 0 0 0
1 1 0 0 0
1 0 0 0 0
9 1 .1
1 3 3 .1
9 0 0 0
2 4 1 .1
8 0 0 0
7 0 0 0
6 0 0 0
5 0 0 0
2 6 6 .1
1 5 7 .1
4 0 0 0
1 9 9 .1
6 7 .0
3 0 1 .1
3 0 0 0
3 2 6 .2
2 0 0 0
1 0 0 0
3 6 2 .2
0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
3 0 0
3 2 0
3 4 0
3 6 0
m / z -->
Figura 22. Espectro de massas do diterpeno dolastano, o 4-7diacetoxi-14-hidroxidolastano-1,9-dieno (10) (70 eV).
Abundance
S c a n 4 8 3 1 (3 4 .7 4 5 m in ): D T '3 .D \ d a ta .m s
1 4 0 0 0 4 3 .1
12000
10000
1 5 9 .1
8000
1 2 5 .1
7 1 .1
2 1 9 .1
1 9 3 .1
6000
9 1 .1
4000
2 5 1 .1
2000
2 7 5 .1
3 1 8 .1
0
40
60
80
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
m / z -->
Figura 23. Espectro de massas do diterpeno, o isolinearol (11) (70 eV).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
50
A b u n d a n c e
S c a n
8 6 6 1
(5 7 .0 6 9
1 5 0 0
m in ) : D T '3 . D \ d a t a . m s
2 0 7 .0
1 4 0 0
1 3 0 0
1 2 0 0
4 4 .0
1 1 0 0
1 0 0 0
3 1 4 .2
9 0 0
8 0 0
2 8 1 .1
7 0 0
6 0 0
5 0 0
4 0 0
6 9 .0
1 0 5 .0
1 3 3 .0
2 2 9 .1
3 0 0
2 0 0
1 6 1 .1
1 0 0
0
4 0
6 0
8 0
1 0 0
1 2 0
1 4 0
1 6 0
1 8 0
2 0 0
2 2 0
2 4 0
2 6 0
2 8 0
3 0 0
m / z -->
Figura 24. Espectro de massas do esterol típico das feofíceas, o fucosterol (12) (70 eV).
2.3.2. Dados morfológicos e químicos das algas da tribo Dictyoteae
De Clerck et al. (2006), argumentam que, pelas analises de DNA (rbcL e 26S),
a tribo Dictyoteae deve estar dividida em três gêneros: Dictyota Lamouroux,
Canistrocarpus De Paula et De Clerck e Rugulopteryx De Clerck et Coppejans.
Segundo De Paula (2007), em sua tese de doutoramento, argumentou que os
resultados observados utilizando-se os diterpenos como marcadores taxonômicos
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
51
das algas da tribo Dictyoteae, são compatíveis com aqueles resultados
filogenéticos que dividem a tribo em três gêneros.
De acordo com várias propostas taxonômicas anteriores (e.g.Teixeira &
Kelecom 1988, 1987), baseadas nos diterpenos como marcadores taxonômicos,
as espécies dos antigos gêneros Dilophus J. Agardh, Glossophora J. Agardh e
Pachydictyon J. Agardh foram finalmente incorporadas ao gênero Dictyota. As
algas da espécie Dictyota cervicornis Kűtzing, considerada como um grupo
diferenciado entre as demais espécies, por produzir diterpenos dos tipos
dolastanos e secodolastanos, foi reconhecida como parte do gênero novo
Canistrocarpus, enquanto as algas produtoras de spatanos e secospatanos foram
reconhecidas como representantes do novo gênero Rugulopteryx (Teixeira &
Kelecom 1988).
Baseados nestas observações, nossos resultados sugerem a classificação
das algas dos agrupamentos A-D conforme descrito a seguir.
Pelos resultados obtidos das amostras das algas caribenhas da Colômbia,
para o agrupamento A não foi possível reconhecer claramente padrões de típicos
de diterpenos, sendo caracterizado apenas pelos ácidos graxos e esteróis.
Nos extratos alocados nos grupos B e C, foram reconhecidos diterpenos do
tipo guaiano prenilado, especificamente o pachydictyol A (1) e isopachydictyol A
(2). Este fato sugere que as algas pertencem ao gênero Dictyota, com produção
de diterpenos do grupo I (guaianos prenilados), podendo ou não ter diterpenos do
grupo III (xenianos), como D. menstrualis, D. ciliolata, D. mertensii, entre outras.
É importante ressaltar que alguns dos indivíduos do grupo C mostraram espectros
de massas com fragmentações típicas dos diterpenos do grupo IIb (dolastanos).
Isto pode ser devido a mistura de indivíduos na hora da coleta, pois a ocorrência
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
52
de diterpenos do tipo guaiano prenilado (grupo I) e dolastanos (grupo IIb) num
mesmo individuo, do ponto de vista quimiotaxônomico, deve ser visto com
ressalvas e ser melhor investigada.
O grupo dos indivíduos D apresentou diterpenos exclusivamente do tipo
dolastanos e secodolastanos. Esta informação sugere que estes indivíduos
pertencem ao gênero Canistrocarpus, táxon composto pelas espécies C.
cervicornis, C. crispatus e C. magneana (De Clerck et al. 2006; De Paula 2007).
A confecção de uma placa cromatográfica comparativa CCD das amostras do
grupo D com as de C. cervicornis, D. menstrualis e D. ciliolata da costa brasileira
foi possível ver as semelhanças deste grupo com o padrão cromático de C.
cervicornis (Figura 25).
Figura 25. Placa CCD comparativa dos extratos do grupo D (T’3, T’4, T’7, T1, T’1 e T5)
com CC (C. cervicornis), DM (D. menstrualis) e DC (D. ciliolata) eluida em CH2Cl2 : AcOEt
(8:2) e revelada com sulfato cérico a 2% em ácido sulfúrico. As linhas vermelhas mostram
o padrão típico de revelação dos diterpenos dolastanos e secodolastanos.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
53
Os diterpenos identificados neste estudo são característicos das espécies
Canistrocarpus, Quimicamente não tem sido possível separar as espécies desse
gênero, o que sugere uma linhagem evolutiva muito próxima entre elas (Teixeira
et al. 1986; De-Paula et al. 2001; 2007; Oliveira et al. 2008).
Morfologicamente um dos principais caracteres para o gênero Canistrocarpus
é a coroa de células corticais circundando os esporângios, essa característica faz
referencia ao nome do gênero que vem das palavras gregas “canistros” que
significa cesta e “carpus” que significa fruto ou semente (De Clerck et al. 2006) o
material estudado do grupo D do Caribe colombiano mostrou concordância com
essa característica (Figura 26C).
Além disso, os indivíduos do grupo D foram identificados como C. cervicornis,
por possuírem um ângulo maior entre as dicotomias subapicais e esporângios
ausentes na região apical sem formação de linhas transversais, características
diferenciais entre C. cervicornis e C. crispatus (De Clerck & Coppejans (1997). As
plantas estudadas concordam com a descrição de De Paula (2007), que aponta
que para algumas populações da costa brasileira, podemos encontrar ápices
agudos nestes indivíduos, característica que é mais relacionada à C. crispatus
(Figura 26A,B).
Por outro lado, a coroa de células corticais circundando o esporângio das
algas estudadas difere daquelas ilustrações apresentadas por De Paula (2007).
Nas populações de C. cervicornis da costa brasileira, a coroa de células corticais
é bem notória, podendo chegar quase até a região mediana do esporângio. No
entanto, os indivíduos coletados na região do Caribe colombiano esta estrutura
apresenta-se num nível mais basal do esporângio. Essa característica pode ser
apontada como uma variação morfológica entre essas amostras (Figura 26C).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
54
Figura 26. Canistrocarpus cervicornis: Aspecto geral, distribuição e detalhe dos
esporângios. A) Detalhe da distribuição dos esporângios solitários ou em pequenos
grupos. B) Aspecto geral da alga coletada na Enseada de Taganga, (Santa Marta,
Colômbia), C) detalhe dos esporângios circundados por uma coroa de células corticais
(seta) e uma célula no pedicelo.
A quantificação dos diterpenos de C. cervicornis (Enseada de Taganga) foi
realizada pela ferramenta de auto-integração como os valores de programação
originais do programa MSD ChemStation E.01.00.237, no qual são computados
os picos do cromatograma que apresentem no mínimo, 5% da área do maior
pico.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
55
Os resultados da Tabela 10 revelam que os indivíduos coletados na Enseada
de Taganga (Caribe colombiano) mantêm como padrão preferencial, a produção
do dolastano 4-acetoxi-9,14-diidroxi-1,9-dolastadieno (7), como componente
majoritário em todos os casos, variando de 10,78 a 43,90% do total de diterpenos,
o que é típico dessa espécie (Teixeira et al. 1986). O segundo diterpeno mais
abundante, em todos os indivíduos, exceto T’4 e T’7, foi o 4,9,14-triidroxidolastano-1,9-dieno (6). Em T’4 e T’7, o segundo diterpeno majoritário foi o
Isolinearol (11). Para todas os amostras, o diterpeno minoritário foi o 4,14-diidroxidolastano-1(15),7,9-trieno (8) (Figura 27).
Tabela 10. Produção quantitativa dos diterpenos dos indivíduos da espécie
Canistrocarpus cervicornis coletados na enseada de Taganga, Caribe colombiano (em
porcentagem relativa).
Indivíduo
T’4
Diterpenoa
T’7
T1
T5
T’1
T’3
Porcentagem relativa (%)
(6)
3,08
7,75
5,04
3,24
13,04
12,71
(7)
17,49 43,90
10,78
10,83
37,65
34,86
(8)
tr
tr
2,32
tr
1,96
tr
(9)
4,93
2,16
2,14
tr
2,21
3,83
(10)
3,79
6,36
2,41
2,00
8,45
8,43
(11)
5,65
9,46
1,89
tr
7,05
6,81
a
Códigos dos diterpenos segundo são referenciados no texto: 4,9,14-triidroxidolastano-1,9-dieno (6), 4-acetoxi-9,14-diidroxi-dolastano-1,9-dieno (7), 4,14diidroxi-dolastano-1,7,9-trieno (8), 4-acetoxi-14-diidroxi-dolastano-1,7,9-trieno (9),
4,7-diacetoxi-14-hidroxi-dolastano-1,9-dieno (10) e isolinearol (11).
tr = traços ou quantidade traço
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
56
Figura 27. Análise quantitativa dos diterpenos dos tipos dolastano e secodolastano detectados no extrato bruto de C. cervicornis, coletados na
Enseada de Taganga, no Mar do Caribe colombiano.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
57
O estudo dos produtos naturais das espécies produtoras de dolastanos no
Atlântico tropical e subtropical teve inicio da década dos anos 80, em Honduras
(Crews et al. 1982), onde sete dolastanos foram identificados em amostras
identificadas como D. divaricata e D. linearis. No entanto, estudos de taxonomia
química apontam a identidade desse material com D. cervicornis (Teixeira et al.
1986; Teixeira & Kelecom 1987, 1988; De-Paula et al. 2001; Vallim et al. 2005;
De-Paula et al. 2007).
As populações mais estudadas de C. cervicornis, no âmbito dos produtos
naturais, no Atlântico tropical e subtropical são as do litoral brasileiro, onde é
mencionada a ocorrência de 13 dolastanos e quatro secodolastanos (Teixeira et
al. 1986a; Teixeira et al. 1986b; Kelecom & Teixeira 1988).
Bianco (2008), em sua tese de doutoramento, apresenta a ocorrência de
quatro novas substâncias para esta espécie e alguns compostos inéditos. Outros
estudos recentes confirmam esta espécie como produtora de dolastanos e
secodolastanos (De-Paula et al. 2001; Oliveira et al. 2008).
Por outro lado são poucos os estudos que mencionam características
quantitativas destes diterpenos, Bianco (2008) aponta que os diterpenos
majoritários encontrados na população da Baía da Ribeira (Angra dos Reis, RJ)
foram o 4-acetoxi-9,14-diidroxi-dolastano-1,9-dieno (7) e o 4-7diacetoxi-14-hidroxidolastano-1,9-dieno (10). Populações da Bahia e Ilha Grande (Rio de Janeiro)
apresentam em comum o diterpeno dolastano majoritário 4,7-diacetoxi-14hidroxi-dolastano-1(15),8-dieno (não detectado no presente estudo), e a
composição dos outros diterpenos majoritários parece manter um padrão similar
(Oliveira et al. 2008).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
58
No presente estudo, os resultados revelaram que as algas C. cervicornis do
Caribe colombiano apresentaram o diterpeno dolastano 4-acetoxi-9,14-diidroxidolastano-1,9-dieno (7), embora o padrão geral dos diterpenos seja semelhante
às populações brasileiras. Estes resultados confirmam a importância dos
diterpenos como marcadores biogeográficos.
Finalmente, este estudo é o primeiro sobre os diterpenos de C. cervicornis na
região do Caribe colombiano e abre o cenário para encorajar os pesquisadores
locais e entidades governamentais em fomentar pesquisas nessa área do
conhecimento, tendo em vista os seus diferentes potenciais biotecnológicos
(Bianco et al. 2008; Domingos et al. 2009; Garcia et al. 2009; Vallim et al. 2010;
Moura et al. 2010; Domingos et al. 2011; De-Paula et al. 2011; Moura et al. 2011;
Santos et al. 2011).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 2
59
2.4. CONCLUSÃO
Das vinte e oito amostras de algas da tribo Dictyoteae do Caribe colombiano
vinte e seis foram agrupados em quatro grupos (A-D), segundo o seu perfil
químico de diterpenos. As análises de espectrometria de massas em
cromatografia em fase gasosa (CG/EM) e ressonância magnética nuclear de
hidrogênio (RMN 1H) permitiram identificar oito diterpenos, dois do tipo guaiano
prenilado, cinco dolastanos e um secodolastano.
Os indivíduos do grupo D apresentam maiores informações químicas e
revelam
serem
produtores
exclusivos
dos
diterpenos
dolastanos
e
secodolastanos. Pela taxonomia química estes indivíduos são agrupados como
espécies do gênero Cansitrocarpus e as análises morfológicas confirmam que a
identidade taxonômica destes indivíduos é de Canistrocarpus cervicornis, apesar
da coroa de células corticais dos esporângios diferir em formato e tamanho
daquelas presentes nas populações brasileiras.
A comparação do padrão quantitativo de C. cervicornis do Caribe colombiano
é semelhante às populações do litoral brasileiro, embora tenha como diterpeno
majoritário o diterpeno dolastano, o 4-acetoxi-9,14-diidroxi-1,9- dolastano-1,9dieno (7).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
60
CAPÍTULO 3. UMA NOVA ESPÉCIE DO GENÊRO DICTYOTA LAMOUROUX
(DICTYOTACEAE, PHAEOPHYCEAE) BASEADA EM ASPECTOS
MORFOLÓGICOS E QUÍMICOS.
Resumo: Dictyota sp. nov. Ortiz-Ramírez, De Paula et Cavalcanti é uma nova
espécie da família Dictyotaceae do Oceano Atlântico tropical ocidental, organismo
de hábito parcialmente decumbente produtor de diterpenos tricíclicos derivados
dos dolabellanos, que representam cerca de 50% do extrato hexânico. Por outro
lado, Dictyota sp. nov. difere de outras espécies de Dictyota de pequeno porte,
por não formar tapetes imbricados, possuir o talo mais estreito, células menores e
mais estreitas e pela disposição dos esporângios. Os dados morfológicos e
químicos junto com a comparação de informações de espécies mais relacionadas
na literatura levaram à proposta de uma nova espécie.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
61
3.1. INTRODUÇÃO
Nos últimos anos têm surgido grandes mudanças nos métodos de
classificação taxonômica e no tratamento de diferentes táxons (Wynne 2011), e a
família Dictyotaceae, uma das mais importantes dentre as algas pardas, não está
alheia a estas mudanças.
A família Dictyotaceae é composta pelas tribos Dictyoteae e Zonarieae,
caracterizadas pelo crescimento do talo por uma ou varias células apicais,
respectivamente (De Clerck et al. 2001, 2006; De-Paula et al. 2007). Nos últimos
anos, uma
nova
proposta,
baseada em
características morfológicas
e
agrupamentos filogeneticamente compatíveis ou afins, circunscrevem três únicos
gêneros para a tribo Dictyoteae, os gêneros Dictyota Lamouroux, Canistrocarpus
De Paula et De Clerck e Rugulopteryx De Clarck et Coppejans (De Clerck et al.
2006).
Para o gênero Dictyota 316 espécies são citadas na literatura, mas somente
76 têm sido reconhecidas como espécies taxonomicamente válidas (Guiry & Guiry
2012).
São desafios para o estabelecimento dos limites de separação das espécies
de Dictyota, a presença de alto pleomorfismo, além da dificuldade na observação,
na avaliação e na interpretação dos caracteres diagnósticos (Teixeira & Kelecom
1987, 1988), e podem levar a identificações diferenciadas, com vários casos de
coespecificidade (Bula-Meyer 1994; Solé & Foldats 2003; Wysor & De Clerck
2003). Cenários deste tipo tornam necessário o uso de outras ferramentas
auxiliares além das analises morfológicas, para estabelecer
taxonômicos entre as espécies.
os limites
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
62
Neste contexto, os metabolitos secundários, especialmente os diterpenos,
majoritários das algas da tribo Dictyoteae, têm mostrado ser uma ferramenta útil
que auxilia na elucidação dos limites taxonômicos das espécies. Desse modo, os
resultados obtidos em estudos de taxonomia química corroboram, em muitos
pontos, a proposta de De Clerck et al. (2006) sobre a existência de três únicos
gêneros para a tribo Dictyoteae (De Paula 2007). Nesse contexto, o gênero
Dictyota caracteriza-se pela produção de diterpenos dos grupos I (derivados do
germacrano prenilado), IIA (derivados dos dolabellanos) e III (derivados do
xeniano), como principais metabolitos secundários (De Paula 2000, 2007; Teixeira
2002, 2010; Vallim et al. 2005).
Em relacao ao uso dos diterpenos como ferramenta para elucidar os limites
das espécies desse grupo, um estudo quimiotaxonômico de 1990, avaliou os
diterpenos isolados de D. dichotoma (Hudson) J.V. Lamouroux de diferentes
populações ao redor do mundo, questionou o status cosmopolita desta espécie,
sugerindo que D. dichotoma era, na verdade, um complexo de espécies (Teixeira
et al. 1990).
Um posterior estudo taxonômico com algas coletadas na costa fluminense
sugeriu que D. pardalis Kűtzing deveria ser considerado um sinônimo de
Canistrocarpus cervicornis, baseado na similaridade química entre as duas
espécies (De-Paula et al. 2001).
O uso de diterpenos como marcadores taxonômicos auxiliaram no
estabelecimento de uma nova espécie, Dictyota dolabellana De Paula,
Yoneshigue-Valentin
et
Teixeira,
produtora
de
diterpenos
derivados
do
dolabellano (grupo IIA), sendo a primeira espécie com margem denticulada do
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
63
talo produtora de diterpenos do tipo dolabellano, característica que deu nome à
espécie (De-Paula et al. 2007).
O capitulo 3 propõe o estabelecimento de uma nova espécie do gênero
Dictyota para a costa fluminense, baseado em informações morfológicas e
químicas. Para essa proposta, o presente capítulo tem como objetivos:

Descrever a morfologia externa e interna dos espécimes coletados,
comparando-os com as demais espécies do gênero.

Definir o perfil químico dessa alga, através do estabelecimento do grupo
químico (I, II ou III) dos diterpenos produzidos por essa espécie.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
64
3.2. MATERIAL E MÉTODOS
3.2.1. Coleta do material ficológico
O material analisado neste capitulo foi coletado na praia Vermelha da Ilha
Grande, Angra dos Reis – RJ (23°09’32’’S - 44°21’08’’W) no mês de outubro de
2008 a uma profundidade aproximada de 3 a 8 m mediante mergulho livre e
autônomo (SCUBA) (Figura 28). O material foi triado ainda em campo e
posteriormente no laboratório separando as espécies e retirando os organismos
epífitos. Uma parte do material foi conservada em formaldeído 4% para analise
morfológica o restante do material foi destinado para o estudo químico e seco em
temperatura ambiente no laboratório.
Figura 28. Mapa do local de coleta, o ponto amarelo indica o local aproximado
(modificado de www.mapasdigitais.uerj.br).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
65
3.2.2. Descrição morfológica
São descritas as características externas, como o tipo de ramificação do talo,
a estrutura de fixação da alga ao substrato, a coloração do talo no meio ambiente,
a presença ou não de iridescência do talo, a coloração da alga após secagem, o
tipo de margem do talo, a forma do ápice, a presença de proliferações e a
disposição dos esporângios e etc.
Aspectos da morfologia interna foram registrados com o auxílio de um
microscópio estereoscópico binocular Olympus® CX 31. A morfometria das
células foi realizada com o auxílio de cortes transversais a mão livre na região
basal, mediana e apical do talo e com o auxílio de uma lâmina de aço, obtendo-se
cortes das diferentes regiões. Foram obtidas as medidas de altura e de largura
das células corticais e medulares, com 10 repetições para cada medida. Alguns
cortes foram corados com azul de anilina.
As laminas contendo os cortes foram fixadas através do uso do meio
Entellan Merck® e observadas em microscópio ótico, para permitir uma descrição
detalhada dos esporângios. As características mais relevantes foram registradas
através do uso de câmera fotográfica digital.
3.2.3. Análise química
3.2.3.1. Preparação e obtenção dos extratos
O material seco (9,9 g) foi submetido à extração seqüencial e exaustiva com
os solvente orgânicos n-hexano (Hex) e acetato de etila (AcOEt) por três semanas
cada solvente, sendo renovado a cada semana. A seguir, o solvente foi retirado,
sob pressão reduzida, em evaporador rotativo para obtenção dos extratos brutos.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
66
Foram obtidas as massas dos extratos hexânico e em acetato de etila, que foram
mantidos sob refrigeração. Foram obtidos 688 mg do extrato hexânico e 119 mg
do extrato em AcOEt, com um rendimento do 6,9% e 1,2%, respectivamente.
Ambos os extratos são oleosos e coloração verde oliva.
3.2.3.2. Obtenção do perfil químico em cromatografia em fase gasosa
Uma alíquota (2 mg) de cada extrato foi diluída em acetato de etila (AcOEt) e
1 μL da solução foi injetada em cromatógrafo em fase gasosa Hewlett Packard HP
5973, acoplado a espectrômetro de massas (CG/EM), em modo de impacto de
elétrons (70 eV), programado a uma temperatura inicial de 160 ºC aumentando 4
ºC/min até chegar aos 260 ºC, em seguida a temperatura foi elevada até 290 ºC a
uma taxa de 10 ºC/min e mantido por 10 min. Foram obtidos os espectros de
massas por impacto de elétrons para as substancias de interesse presente no
extrato. O perfil químico quantitativo foi realizado pela ferramenta de autointegração como os valores de programação originais do programa MSD
ChemStation E.01.00.237 no qual são computados os picos do cromatograma
que apresentem no mínimo 5% da área do maior pico.
3.2.3.3. Obtenção do perfil químico por cromatografia em camada
delgada (CCD)
Pequenas alíquotas de soluções em CH2Cl2 dos extratos hexânico e em
acetato de etila foram aplicadas sobre placas de 2,5 cm x 10 cm, de gel de sílica
60 F254 Merck®, com o auxilio de um capilar de vidro, utilizando uma mistura de
hexano: acetato de etila (7:3) como eluente.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
67
A revelação das bandas cromatográficas foi realizada através do seu
borrifamento com solução de sulfato cérico (CeSO 4), a 2% em ácido sulfúrico
(H2SO4), seguido de aquecimento em placa aquecedora.
3.2.3.4. Obtenção dos diterpenos majoritários
Os diterpenos majoritários foram isolados e purificados a partir do extrato
hexânico, através de técnicas convencionais de cromatografia em coluna em gel
de sílica, utilizando solventes ou mistura de solventes de grau PA (Para Análise)
de diferentes polaridades. O extrato hexânico foi selecionado para fracionamento
por possuir maior massa e apresentar duas bandas cromatográficas com produtos
majoritários.
As análises por cromatografia em camada delgada (CCD) foram realizadas
conforme descrição no item anterior.
Uma alíquota (8-10 mg) do extrato, de frações enriquecidas e dos diterpenos
purificados foram dissolvidos em CDCl3 para obtenção dos espectros de
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H), em aparelho VarianUnity Plus, na frequência de 300,00 ou 500,00 MHz, sendo usado o
tetrametilsilano (TMS) como referência interna.
Para a elucidação dos diterpenos foram obtidos os espectros mono e
bidimensionais de RMN
13
C, COSY, ATP, HMQC, HSQC, além dos espectros de
UV, IV e dados de rotação ótica (αD).
Os espectros de RMN foram realizados pelo Laboratório Multiusuário de
RMN da UFF (http://www.uff.br/laremn/). Os espectros de UV, IV e αD foram
realizados no IQ/UFF.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
68
A elucidação estrutural dos diterpenos está sendo realizada pelas Profas
Valéria Laneuville Teixeira e Diana Negrão Cavalcanti.
3.2.3.4.1. Isolamento dos diterpenos majoritários
Foi realizada com 650 mg de extrato hexânico, uma partição rápida tipo flash
em coluna (Ø 2,5 cm, altura de 20 cm) em gel de sílica 60 (0,015 – 0,045 mm),
isocrática, usando como fase móvel a mistura CH2Cl2: AcOEt (9:1).
Foram obtidas 31 frações (F1 a F31), de volume variável, que foram analisadas por
CCD. As frações semelhantes em CCD e pelos espectros de RMN 1H, foram
reunidas, mantidas sob pressão reduzida até a retirada total dos solventes, e
posteriormente submetida a um contínuo processo de fracionamento até a
separação dos produtos puros.
A partir do fracionamento das 31 frações obtidas do extrato hexânico foram
isolados dois diterpenos, denominados DvD (13) e DvM (14).
Purificação do diterpeno DvD (13): foram reunidas as frações F12-F15 do
primeiro fracionamento. Essas frações apresentaram uma serie de bandas
cromatográficas em CCD, de cor púrpura escura, após revelação, com massa de
119mg. Esse material foi submetido a novo fracionamento em coluna (Ø 1,5 cm e
altura de 20 cm), em gel sílica (0,015 – 0,040 mm), usando como fase móvel
CH2Cl2, com acréscimos graduais de AcOEt, obtendo-se 29 frações (F1-F29).
Foram reunidas as frações F15-F24 (51 mg), que foi submetida a novo
fracionamento em coluna (Ø 1 cm e altura de 15 cm), em gel de sílica (0,015 –
0,040 mm), isocrática, sendo a fase móvel CH2Cl2:AcOEt (9:1) obtendo-se 20
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
69
frações, das quais as F6-F11, continham o diterpeno DvD como um cristal amorfo
incolor (20 mg). A Figura 29 apresenta um esquema dos procedimentos de
isolamento do DvD.
Purificação do diterpeno DvM (14): Foram reunidas as frações F21-F29 do
primeiro fracionamento do extrato hexânico. Essa frações reunidas (121 mg),
foram submetidas a um novo fracionamento em coluna (Ø 1,5 cm e altura de 15
cm) com gel de sílica (0,015 – 0,040 mm), isocrática, usando como fase móvel
CH2Cl2:AcOEt (9:1), obtendo se 20 frações (F1-F20), das quais F13-F17 continham o
diterpeno DVM (42 mg) (Figura 29).
3.2.3.5. Transformação (redução) do produto DvM (15)
A partir do diterpeno DvM foi realizada uma reação de redução do grupamento
acetato (-OAc) a álcool (-OH). Para essa transformação foi escolhido o método de
hidrólise alcalina. Foi utilizada uma massa de 35 mg do diterpeno DvM, que foi
dissolvida em 3 mL de uma solução metanólica saturada de carbonato de
potássio (K2CO3), a temperatura ambiente, por 24h, sob agitação constante.
Após 24 horas foram acrescentados à mistura, 12 mL de água destilada,
sendo a solução transferida para um funil de separação. O produto reduzido pela
transformação lavado e extraído em AcOEt (4 x 6 mL).
As frações foram reunidas e tratadas com sulfato de magnésio anidro, para a
retirada da água. Após filtração, o solvente foi evaporado sob pressão reduzida.
Os sólidos foram recristalizados em CH2Cl2, obtendo-se 30 mg de um cristal
amorfo incolor. Para o produto resultante da reação de hidrolise, sob registro de
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
70
DvH foram realizadas as mesmas técnicas de elucidação estrutural e descritas no
item 3.2.3.4.
650 mg EBH
1° Fracionamento
31 frações
Frações 12-15
(119 mg)
2° Fracionamento
29 frações
CH2Cl2
AcOEt
Frações 15-24
(51 mg)
3° Fracionamento
DCM:AcOEt 9:1
Frações 21-29
(121 mg)
CH2Cl2:AcOEt 9:1
2° Fracionamento
20 frações
Frações 13-17
Diterpeno DvM (14)
(42 mg)
CH2Cl2:AcOEt 9:1
20 frações
Frações 6-11
Diterpeno DvD (13)
(20 mg)
Reação de hidrolise
24h
Alíquota
35mg
Diterpeno DvH (15)
(30 mg)
Figura 29. Esquema de fracionamento para a obtenção dos diterpenos DvD (13), DvM
(14) e DvH (15).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
71
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Seis amostras contendo diferentes morfotipos de algas do gênero Dictyota
foram coletadas nas cercanias da Praia Vermelha, na Ilha Grande, em Angra dos
Reis, RJ. Cinco amostras revelaram-se idênticas dos pontos de vista químico e
morfológico. Essas amostras foram identificadas como D. ciliolata. A sexta
amostra correspondeu à proposta de uma nova espécie.
Sua identidade taxonômica foi baseada na morfologia e na química dos
diterpenos, que são inéditos para as algas do grupo Dictyota.
3.3.1. Descrição taxonômica
3.3.1.1. Dictyota sp. nov. Ortiz-Ramírez, De Paula et Cavalcanti sp. nov.
Plantas pequenas com iridescência azul-esverdeada quando imersas e de cor
verde-oliva quando secas, medindo até 4 cm de altura, de hábito decumbente,
com poucos pontos de fixação ao substrato. Talo com proliferações marginais
raras ou ausentes, com ramificações a princípio alternas, sendo dicotômicas
próximas ao ápice (Figura 30a). Apresenta ramificação dicotômica anisotômica.
Pode haver anastomose entre os ramos. Os ramos da base têm largura de 1 mm,
os da porção mediana, de 2 a 3 mm no meio, e os do ápice, de 1 a 2 mm. Os
ápices dos ramos dicotômicos são agudos ou arredondados (Figura 30b). As
células medulares formam uma camada com 25 a 42,5 µm de altura e 25 a 47,5
µm de largura. As células corticais formam uma camada com 7,5 a 17,5 µm de
altura e 12,5 a 27,5 µm de largura (Figura 30c). Os esporângios encontram-se
espalhados da superfície ao meio do talo, isolados ou em pequenos grupos,
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
72
espalhados preferencialmente pela superfície livres, ausentes ou raros na
superfície voltada para o substrato, com 60 a 90 µm de diâmetro, apresentando
uma única célula peduncular (Figura 30d, 30e, 30f).
Figura 30. Holotipo de Dictyota sp. nov., Ilha Grande, Angra dos Reis-RJ. a) aspecto
geral do individuo; b) detalhe dos ápices agudos e arredondados; c) corte transversal da
região mediana do talo mostrando a disposição em uma camada das células medulares;
d) vista superficial de um pequeno grupo de esporângios; e-f) corte transversal dos
esporângios exibindo uma única célula peduncular.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
73
3.3.1.2. Diagnose
“Planta ut 4 cm longa, prostratus habitus, ramificatio alterna et dichotoma,
margine laevigato, apicibus rotundatis et acuti, cortex et medulla cellulis uno
strato dispositis pro parte maxima, prolificationes superficiales absunt,
esporangia solitaria vel aggregata, cellula basali singulari”.
Etimologia: o epíteto específico será uma homenagem dos autores à
Profa Valéria Laneuville Teixeira, pesquisadora que, desde a década dos anos
1980, tem contribuído para o conhecimento dos produtos naturais de algas
marinhas da tribo Dictyoteae e na formação de recursos humanos.
Habitat: substrato rochoso a uma profundidade média de 5 m em águas de
baías protegidas, de modo calmo.
Distribuição geográfica: Dictyota sp. nov. é conhecida até a presente data
na localidade-tipo, na Praia Vermelha, Ilha Grande, Município de Angra dos Reis,
Estado do Rio de Janeiro, Brasil (23°09’32’’S - 44°21’08’’W).
As espécies do gênero Dictyota tem sido objeto de diversas controvérsias na
identidade taxonômica, em especial, as algas de pequeno porte. No presente
estudo foram analisadas e confrontadas as argumentações de diferentes ficólogos
quanto à identidade taxonômica das espécies mais próximas a Dictyota sp. nov.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
74
Dictyota sp. nov. assemelha-se a outras espécies de Dictyota de pequeno
porte. Diferencia-se de D. bartayresiana por ser menor mais estreita e por ter
habito decumbente.
Dictyota canaliculata De Clerck & Coppejans é um alga de mediano porte,
descrita originalmente para águas do Pacífico (De Clerck & Coppejans 1997). Sua
distribuição foi ampliada para o Atlântico tropical ocidental, com o registro de sua
ocorrência no Mar do Caribe da Venezuela (Solé et al. 1999). O aspecto geral de
D. canaliculata é similar a D. sp. nov., em especial pela sua morfologia de habito
parcialmente decumbente e assemelha-se aos indivíduos de pequeno porte
descritos para o Caribe. No entanto, D. sp. nov. diferencia-se de D. canaliculata
pela ausência de um aspecto conspícuo canaliculado do seu talo, sendo este um
dos caracteres diagnósticos mais importantes para a identificação de D.
canaliculata.
A espécie Dictyota pfaffii Schnetter foi originalmente descrita no Caribe
colombiano, com características que permitiam distingui-la de outras espécies,
por apresentar talos pequenos com interdicotomias curtas, hábito decumbente
formando tapetes imbricados e esporângios dispostos no meio da fita na região
superior e nunca marginalmente (Schnetter 1972). Essa espécie tem sido foco de
diversas controvérsias entre ficólogos, devido à similaridade com Dictyota
humifusa Hörnig, Schnetter et Coppejans que foi descrita baseada nas diferenças
encontradas entre D. adnata sensu Jaasund e a D. adnata originalmente descrita
por Zanardini.
No entanto, Bula-Meyer (1994) sugere que D. humifusa é uma sinonímia de D.
pfaffii, argumentando que a iridescência do talo não pode ser considerada um
caráter diagnostico, assim como o tamanho das células, pois são características
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
75
muito variáveis. O autor considerou que não existem caracteres diagnósticos
formais que permitam separar essas duas espécies. No entanto, De Clerck &
Coppejans (1997) indicam que é possível separar a identidade taxonômica destes
indivíduos pelo tamanho das células e a textura do talo. Posteriormente, Wysor &
De Clerck (2003) propõem que D. pfaffii é uma sinonímia de D. friabilis Setchell
1926.
Diante do cenário controverso dos epítetos D. humifusa, D. pfaffii e D. friabilis
é possível indicar que D. sp. nov. diferencia-se por não ser completamente
decumbente, não formar tapetes imbricados, tendo um talo formado de uma fita
mais estreita principalmente na região basal, por apresentar células medulares
menores e mais estreitas e pela posição dos esporângios espalhados na
superfície do talo na região mediana e não nas porções superiores.
Outra espécie do gênero Dictyota de pequeno porte é Dictyota hamifera
Setchell. No entanto, D. sp. nov. separa-se facilmente pela ausência de ramos
com forma de gancho, como pode ser observado nas ilustrações de Solé (2003).
3.3.2. Perfil químico
Ao comparar os extratos hexânico e em AcOEt de Dictyota sp. nov. por CCD
foi possível perceber que não existem grandes diferenças no perfil cromático
entre os dois extratos, sendo os diterpenos mais abundantes no extrato em
hexano. A Figura 31 apresenta uma comparação entre os dois extratos (Figura
31a) e uma placa com o resultado do primeiro fracionamento do extrato hexânico
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
76
(Figura 31b). Em ambas as placas, os produtos majoritários (diterpenos)
apresentaram-se, após revelação, como bandas de cor púrpura.
a
b
Figura 31. Placas cromatográficas em camada delgada (CCD) de Dictyota sp. nov. a)
comparação entre os dois extratos em hexano e em acetato de etila; b) resultado do
primeiro fracionamento do extrato hexânico (EHB), onde pode ser observado a
característica principal da serie de bandas de cor púrpura (diterpenos) (1 – 31 frações
coletadas).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
77
Das espécies morfologicamente mais próximas a D. sp. nov. e conhecida
quimicamente pelo nosso grupo de pesquisa é a D. pfaffii (=D. friabilis) alga
produtora de diterpenos do tipo dolabellano, do grupo IIa. (Barbosa et al. 2003).
Estes organismos além de possuírem semelhança morfológica, também
apresentam a mesma característica na produção de poucos diterpenos de forma
bastante abundante. No entanto, os diterpenos de D. pfaffii (=D. friabilis) são
diferentes, o que pode ser demonstrado pela revelação das placas em CCD, onde
os diterpenos de D. pfaffii aparecem como uma banda de cor parda (diterpeno
majoritário), enquanto os diterpenos de D. sp. nov. são dois diterpenos
majoritários de cor púrpura (Figura 32).
Figura 32. Comparação dos extratos em cromatografia de camada delgada (CCD) de
Dictyota pfaffii (Dp) e Dictyota sp. nov. (Dv).
Dictyota sp. nov. caracteriza-se por produzir dois produtos naturais
majoritários, dois diterpenos, confirmados pela análise de RMN
13
C (75 MHz), um
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
78
deles com dois grupamentos acetato (24 carbonos), o DvD (13) e o segundo com
apenas um acetato (22 carbonos), o DvM (14).
Os diterpenos (13 e 14) e o produto de transformação (15) são cristais
amorfos e incolores, e em CCD, eluídos em fase móvel CH2Cl2:AcOEt (9:1), após
revelação, caracterizam-se por serem de cor púrpura e apresentar valores Rf igual
a 0,59; 0,49 e 0,12 respectivamente (Figura 33).
Figura 33. Placa em cromatografia de camada delgada dos produtos naturais DvD (13)
Rf= 0,59, DvM (14) Rf=0,49 e DvH (15) Rf=0,12.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
79
O perfil quantitativo calculado em porcentagem relativa indica que estas duas
substancias ocorrem em cerca do 50% do extrato em hexano, sendo que 29%
corresponde ao diterpeno diacetilado - DvD (13) e 23,7% ao diterpeno
monoacetilado - DvM (14) (Figura 34).
Figura 34. Cromatograma (CG/EM) do extrato bruto em hexano de Dictyota sp. nov.
indicando os picos dos diterpenos diacetilado (13) e monoacetilado (14).
As análises de elucidação estrutural demonstraram que os diterpenos isolados
de Dictyota sp. nov. são inéditos, possivelmente com esqueletos novos para a
ciência. A elucidação desses diterpenos está em curso, mas devido ao ineditismo
das moléculas, ainda não foi totalmente concluída.
No momento, podemos afirmar que os diterpenos de Dictyota sp. nov.
apresentam características similares aos dolabellanos (IIa).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 3
80
3.4. CONCLUSÃO
O presente estudo propõe uma nova espécie de Dictyota para a região do
Atlântico tropical e subtropical, Dictyota sp. nov. Ortiz-Ramírez, De-Paula et
Cavalcanti.
Dictyota sp. nov apresenta características morfológicas e químicas únicas,
sendo produtora de diterpenos inéditos com esqueleto carbônico ainda não
descrito para as algas da tribo Dictyoteae.
Suas características morfológicas e químicas aproximam essas algas do
grupo taxonômico B, que reúne as populações brasileiras de Dictyota pfaffii (=
Dictyota friabilis) e da nova espécie Dictyota dolabellana De-Paula, YoneshigueValentin et Teixeira, ambas caracterizadas como produtoras de diterpenos
exclusivos do tipo dolabellano ou derivados. Embora os dolabellanos observados
nestas duas espécies coletadas na costa brasileira sejam exclusivos de algas do
Atlântico, este tipo de esqueleto é o mais representativo das populações
estudadas na região do Indo-Pacífico e do Mar Mediterrâneo.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
81
CAPÍTULO 4. METABOLITOS SECUNDÁRIOS DE Canistrocarpus
cervicornis: UMA ESTRATÉGIA QUÍMICA PARA O CONTROLE
POPULACIONAL DOS SEUS CONSUMIDORES?
Resumo: Este capítulo apresenta a primeira abordagem do estudo sobre os
efeitos dos produtos naturais de Canistrocarpus cervicornis nos primeiros estágios
do desenvolvimento embrionário e na fertilização do ouriço-do-mar Lytechinus
variegatus. Os resultados indicam que a exposição dos zigotos de L. variegatus
ao extrato bruto de C. cervicornis em diferentes concentrações afetou o
desenvolvimento dos zigotos de duas formas: inibindo o desenvolvimento e
gerando anomalias. Quando os gametas foram expostos ao extrato bruto antes da
fecundação, os espermatozóides tornaram-se inviáveis, causando a diminuição
das taxas de fecundação entre 10 – 30%. Os gametas femininos foram menos
susceptíveis à ação do extrato, com proporções de fecundação até 70%. O
diterpeno dolastano (4R,7R,14S)-4α,7α-diacetoxi-14-hidroxidolasta-1(15),8-dieno
não mostrou ser um agente inibidor dos primeiros estágios de desenvolvimento,
entretanto foi constatado que é um agente que induz anomalias nos zigotos e nas
concentrações de 25 e 50 µg/mL pode causar lise celular. Os resultados in vitro
sugerem que este fenômeno possa atuar como estratégia química das algas para
o controle populacional dos seus consumidores, inibindo e/ou impedindo o
desenvolvimento normal dos seus zigotos.
Publicação produzida a partir deste capítulo:
Metabolitos secundários de Canistrocarpus cervicornis: uma estratégia química para o controle
populacional dos seus consumidores?
Ortiz-Ramírez, F.A; Vallim, MA; Cavalcanti, D.N; Teixeira, V.L.
Trabalho apresentado durante o III Congresso Brasileiro de Biologia Marinha – 2011.
Recebeu o “Prêmio ABBM para Estudantes, nível Pós-graduação” da Associação Brasileira de
Biologia Marinha.
Ortiz-Ramírez, FA; Vallim, MA; Cavalcanti, DN; Teixeira, VL. (2012). Secondary Metabolites from
the marine brown alga Canistrocarpus cervicornis (Dictyotales,Phaeophyceae): A strategy for the
population control of the consumers?. Latin American Journal of Aquatic Research. “Artigo no
prelo”
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
82
4.1. INTRODUÇÃO
Os organismos marinhos desenvolveram ao longo da evolução diversos
mecanismos de defesa, que incluem estratégias físicas e químicas para garantir a
sua sobrevivência. Ao longo desse processo evolutivo, os organismos vivos
desenvolveram uma capacidade de síntese de metabólitos secundários ou
produtos naturais que, dentre outras atividades, também ajudam a manter o
equilíbrio entre as espécies (Harper et al. 2001). Essas substâncias especiais
apresentam um grande potencial biotecnológico como antibióticos, antivirais,
antitumorais, dentre outras atividades biológicas (Blunt et al. 2010).
Dentre as algas pardas, mais de 1.140 metabólitos secundários foram
isolados, sendo os representantes da ordem Dictyotales, uma rica fonte em
terpenos (Maschek & Baker 2008). Hoje em dia, são conhecidos mais de 300
diterpenos, isolados a partir de pelo menos 35 espécies, coletadas no litoral
tropical, subtropical e temperado-quente de todo o mundo (Vallim et al. 2005).
Canistrocarpus cervicornis é uma alga parda da ordem Dictyotales, conhecida
por sintetizar diterpenos do tipo dolastanos e secodolastanos (Teixeira et al.
1986a, 1986b; Teixeira & Kelecom 1988; Oliveria et al. 2008), Por ser uma alga
de química bem conhecida, há diversos estudos sobre a atividade biológica e/ou
ecológica destes diterpenos.
Os estudos mostram que vários de seus diterpenos apresentam atividade
inibidora da enzima sódio-potássio ATPase (Garcia et al. 2009), atividade antiviral
contra o vírus da herpes humana (HSV-1) e contra o vírus da AIDS (HIV-1) (Vallim
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
83
et al. 2010), anti-leishmaniose (Santos et al. 2011), contra os efeitos de veneno de
cobra (Moura et al. 2010; Domingos et al. 2011), anticoagulante e antiplaquetária
(Moura et al. 2011), anti-incrustante (Bianco et al. 2009) e atividade anti-herbivoria
(Pereira et al. 2002).
Nas regiões tropicais e subtropicais, a pressão por herbivoria é um forte fator
regulador das populações de algas marinhas bentônicas e os ouriços-do-mar são
um dos seus principais consumidores (Hopp & Herding 1996). Os mecanismos de
controle de populações de consumidores são exercidos por complexas interações
envolvendo os demais consumidores, o alimento em si e o meio ambiente.
Diversos estudos têm demonstrado que moluscos e ouriços de mar, em
ambientes rochosos, (Paine 1992; Hill et al. 2003) e peixes e ouriços do mar, em
ambientes recifais (Hay et al. 1987; Hay 1991; Tittensor et al. 2009),
desempenham um papel fundamental no funcionamento e organização das
comunidades marinhas bentônicas. De forma geral, o grupo dos equinodermos é
apontado como os principais consumidores de algas nas regiões tropicais (Hopp
& Herding 1996).
O avanço dos estudos interdisciplinares tem mostrado que as algas não são
participantes passivas nas interações biológicas produtor/consumidor. Devido ao
desenvolvimento de novos métodos de análises químicas e desenhos
experimentais adequados, tornou-se claro que as algas apresentam mecanismos
de defesa química frente aos seus consumidores e nas suas relações intraespecíficas, tornando-as agentes importantes na estrutura das comunidades
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
84
marinhas (Potin et al. 2002). Assim demonstrou-se a capacidade de defesa
química de algumas algas marinhas bentônicas frente a herbívoros (e.g.,
Steinberg 1985; Hay & Fenical 1988; Pereira et al. 2003).
Neste contexto a alga objeto de estudo, Canistrocarpus cervicornis, também
mostrou estratégias de defesa química contra o gastrópodo Astraea latispina
(Pereira et al., 2002) igualmente para o ouriço do mar Lytechinus variegatus
(Bianco et al., 2010) No entanto, não existiam estudos ecológicos sobre o efeito
dos diterpenos sobre os gametas e primeiros estágios de vida L. variegatus.
Visando ampliar o conhecimento sobre a atividade biológica dos produtos
naturais de Canistrocarpus cervicornis e seu possível papel ecológico o presente
capitulo tem como objetivo:

Avaliar o efeito do extrato bruto e do diterpeno majoritário (4R,7R,14S)4α,7α-diacetoxi-14-hidroxi-dolastano-1(15),8-dieno da alga parda marinha
C. cervicornis nos gametas e primeiros estágios de vida do ouriço-do-mar
Lytechinus variegatus.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
85
4.2. MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1. Coleta do material ficológico
Canistrocarpus cervicornis foi coletada no mês de Junho de 2006 na Praia do
Forno, Armação de Búzios, Rio de Janeiro (22º45’42” S e 41º52’27” W) mediante
mergulho livre. O material foi lavado e triado ainda em campo retirando os
organismos epífitos. Exicatas da espécie foi depositado no Herbário da
Universidade do Rio de Janeiro (HRJ10754).
4.2.2. Extração e isolamento
O material algáceo seco foi submetido a extração exaustiva com o solvente
orgânico diclorometano (DCM) cinco vezes durante 24h. O solvente foi retirado
sob pressão reduzida em evaporador rotativo. 5 g do extrato bruto foram
submetidos a fracionamento em cromatografia de coluna em sílica gel 60 (70-230
Mesh) (Ø4 cm x 40 cm) e eluída com gradiente de polaridade crescente de
hexano a metanol, foram obtidas 228 frações de volumes variáveis. As frações 97
a 99 foram reunidas (771 mg) e submetidas a um novo processo de
fracionamento em cromatografia de coluna em sílica gel 60 (230-400 Mesh) eluída
com os solventes Hex e AcOEt (4:6) obtendo se em estado puro o diterpeno
dolastano
(4R,7R,14S)-4α,7α-diacetoxi-14-hidroxidolasta-1(15),8-dieno
(Figura
35) o diterpeno foi identificado por comparação dos dados espectroscópicos
(RMN 13C e 1H) reportados na literatura (Garcia et al. 2009).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
86
OH
OAc
Figura 35. Estrutura do
hidroxidolasta-1(15),8-dieno.
OAc
diterpeno
dolastano
(4R,7R,14S)-4α,7α-diacetoxi-14-
4.2.3. Coleta dos ouriços-do-mar, obtenção dos gametas e sua
estocagem
Indivíduos adultos de Lytechinus variegatus foram coletados na Praia de
Itaipu, Niterói, Rio de Janeiro, Brasil (23°00’34’’S; 44°26’10’’W). No campo, cada
ouriço foi induzido a liberar os gametas mediante uma injeção de 1 a 3 mL de
solução 0,5M de cloreto de potássio (KCl) na região oral intracelômica. Os
gametas foram coletados e acondicionados cuidadosamente em tubos separados.
Os óvulos foram depositados em tubos FALCON com capacidade para 50 mL
contendo água do mar artificial (AMA) Sea Red® preparada com água ultra pura
(Milli‐Q) e ajustada a 32 UPS de salinidade. Os espermatozóides foram coletados
diretamente da região aboral, a seco, com auxílio de pipetas Pasteur e depositado
em tubos Eppendorf® de 2 mL. Os gametas foram transportados ao laboratório
em isopores com gelo. No laboratório, os gametas foram mantidos em constante
refrigeração até o início da experiência. Foram preparadas soluções estoque de
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
87
óvulos de 100 mL (16.000 óvulos/mL) e uma solução de espermatozóides (1 mL
de espermatozóides concentrado diluído em 9 mL de AMA).
4.2.4. Preparação das soluções do extrato bruto e produto puro
A partir do estoque padrão de 500 µg/mL do extrato bruto (5 mg do extrato foi
dissolvido em 500 µL do solvente DMSO e completado com AMA ate 10 mL em
balão volumétrico) foram preparadas as soluções de 250, 125, 62.5 e 31.25
µg/mL, a partir do estoque padrão do dolastano 100 µg/mL (1 mg do dolastano
(16) dissolvido em 150 µL e completado com AMA ate 10 mL em balão
volumétrico) foram preparadas as soluções de 50, 25, 12.5 e 6.25 µg/mL. A
quantidade do solvente DMSO (dimetil-sulfóxido) foi corrigida para cada solução.
4.2.5. Ensaios Pós-fecundação
Um mL da solução estoque de espermatozóides foi adicionado ao estoque de
óvulos, agitando cuidadosamente durante 30s com o objetivo de facilitar a
fecundação, passados 5 min a fecundação foi confirmada pela elevação da
membrana vitelínica em torno de 80% dos óvulos fecundados. Para cada
tratamento e controle foi depositado 1 mL de ovos fecundados em placas de
cultura (TTP®) com 24 poços com capacidade para 3 mL, em triplicata. Em
seguida foi adicionado 1 mL das soluções do extrato bruto e do dolastano, no
controle foi adicionado 1 mL de AMA e no controle branco 1mL de AMA com a
concentração ajustada de DMSO. As placas de cultura foram mantidas a
temperatura ambiente durante 2 h passado este tempo foram adicionadas 2 gotas
de formaldeído a 10%.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
88
De cada amostra experimental, uma alíquota de 1 mL foi depositada numa
câmara Sedgwick‐Rafter, sendo realizadas as contagens dos ovos em 10 pontos
aleatórios da câmara.
Os ovos foram classificados segundo sua etapa de divisão celular da seguinte
forma:

ovos não fecundados (ONF), nos quais a membrana de fecundação
não foi visualizada;

ovos fecundados porém não divididos (OF), nos quais a membrana foi
visualizada porém não sofreram mitose;

e clivagens I, II, III, IV.
Este método foi adaptado dos testes empregados para determinação da
citotoxicidade,
ecotoxicidade
e
em
estudos
preliminares
de
atividade
farmacológica (Lera et al. 2006; Semenova et al. 2006; Kiselyov et al. 2010;
Magalhães et al. 2010).
4.2.6. Ensaios pré-fecundação em óvulos
Um mL do estoque de óvulos e posteriormente 1 mL de cada solução do
extrato foi adicionado e no controle 1 mL de AMA. Após 10 min. foram
adicionados 20 µL da solução de espermatozóides com agitação leve por 30
segundos. A incubação, fixação e contagem seguiram o mesmo procedimento da
experiência anteriormente descrito.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
89
4.2.7. Ensaios pré-fecundação nos espermatozóides
Vinte µL da solução de espermatozóides e 1 mL de cada solução do extrato
bruto foram depositados nas placas de cultura. Após 10 min. 1mL da solução de
óvulos foi adicionado em cada unidade experimental. A incubação, fixação e
contagem seguiram o mesmo procedimento da experiência anteriormente descrito
(Figura 36).
4.2.8. Análise estatística
Os resultados das experiencias foram analisados pelo teste não paramétrico
Kruskal-Wallis.
Nos
casos
onde
ocorreram
diferenças foram
realizadas
comparações múltiplas, Os testes pré-fecundação foram analisados pelo teste
Wilcoxon-Mann-Whitney U. Este procedimento foi realizado usando o programa
computacional de análise estatística Infostat 2009 (Di Rienzo et al., 2009). Todos
os testes estatísticos foram conduzidos Segundo Zar (1996), adotando como nível
de significância α < 0.05.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
90
Injeção de KCl
Estoque de óvulos
16,000/mL
Solução de
espermatozóides
Fecundação in vitro
20µL
espermatozóides
+
1mL do tratamento
Extrato bruto
1mL óvulos
+
1mL do tratamento
Extrato bruto
5 min.
10 min.
+
1mL óvulos
+
1mL dos
tratamentos
10 min.
+
1 mL zigotos
20 µL
espermatozóides
Figura 36. Esquema ilustrativo dos ensaios realizados de pós-fecundação e préfecundação.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
91
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Pós-fecundação
As experiências de desenvolvimento embrionário foram iniciadas após a
confirmação da elevação da membrana de fecundação em pelo menos 80% dos
óvulos (Figura 37B). Os óvulos não fecundados, fecundados sem clivagem,
zigotos nas clivagens I – IV e anômalos foram avaliados em cada experiência e
exemplos típicos de cada categoria encontram-se na Figura 37.
Figura 37. Primeiros estágios do desenvolvimento embrionário de Lytechinus variegatus
e eventos registrados durante as experiências. A) óvulo sem fecundar; B) óvulo
fecundado sem clivagem; C) zigoto na clivagem I; D) zigoto na clivagem II; E) zigoto na
clivagem III; F) zigoto na clivagem IV; G) zigoto anômalo e H) lise celular dos
blastômeros.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
92
Os resultados demonstraram que, em todas as concentrações testadas, o
número de ovos fecundados não clivados aumentou proporcionalmente a
concentração do extrato bruto adicionada.
Poucos ovos que chegaram a clivar, a maioria gerou anomalias, sugerindo a
inviabilização do desenvolvimento do zigoto até a clivagem IV. As clivagens III e
IV apresentaram diferenças significativas em relação ao controle (p < 0,0001),
onde foi observado apenas de zero a 1% dos indivíduos na clivagem III. Não
foram detectados ovos na clivagem IV.
O efeito gerado pela adição do extrato bruto nas menores concentrações
provocou os maiores percentuais de anômalos. Por outro lado, as maiores
concentrações provocaram um forte efeito inibidor das clivagens, que não foi
acompanhado pelo aumento do percentual de anômalos.
Os resultados nos testes com o dolastano mostraram que não houve
diferenças significativas (p> 0,05) frente ao controle, exceto nas variáveis III, IV e
A. As diferenças encontradas nas clivagens III e IV correspondem às maiores
concentrações (25 e 50µg/mL). No entanto, o valor das proporções nestas
concentrações foi superestimado, tendo em vista a ocorrência de lise dos zigotos.
Assim, na concentração 25 µg/mL do dolastano, foi registrada a proporção de
9,85% ± 8,8 na clivagem IV, e em 50 µg/mL, 0,8% ± 1,4 (Tabela 11).
No caso dos zigotos anômalos, foi observado, de forma geral, que o extrato
bruto provocou uma resposta inversamente proporcional à sua concentração,
onde as menores concentrações provocaram mais anomalias. No caso das
experiências com o dolastano, não foram registradas diferenças significativas (p>
0.05) de anômalos entre as concentrações do diterpeno, mas frente ao controle,
indicando que o diterpeno é um dos responsáveis pelas anomalias observadas
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
93
nas experiências com extrato bruto. De forma geral, nas menores concentrações
(3,125 – 12,5µg/mL) os resultados com o dolastano foram muito similares ao
controle, exceto pela presença de anômalos (Tabela 11).
Tabela 11. Porcentagem dos zigotos segundo o estágio de desenvolvimento embrionário
nas experiências com o extrato bruto (CE) e com o dolastano 16 (D): OF) porcentagem
dos ovos fecundados sem clivagem; I – IV) porcentagem das clivagens e A) porcentagem
dos zigotos anômalos.
CE
(µg/mL)
OF (%)
I (%)
II (%)
III (%)
IV (%)
A (%)
250,0
86,7 ± 5,1
1,0 ± 0,9
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
12,3 ± 5,8
125,0
59,7 ± 4,8
0,47 ± 0,8
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
39,8 ± 4,3
62,5
52,3 ± 7,7
1,7 ± 0,6
1,3 ± 1,2
0,4 ± 0,6
0,0 ± 0,0
44,3 ± 7,7
31,3
46,9 ± 6,2
0,3 ± 0,5
0,7 ± 0,6
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
52,1 ± 6,1
15,62
44,9 ± 2,6
1,3 ± 0,4
2,1 ± 1,1
0,6 ± 1,1
0,0 v 0,0
51,0 ± 4,1
Controle
27,9 ± 11,1
0,8 ± 1,4
2,1 ± 2,0
10,3 ± 6,4
59,8 ± 5,9
0,0 ± 0,0
D
OF
I
II
III
IV
A
50
6,0 ± 3,5
2,6 ± 2,9
5,8 ± 1,7
75,6 v 12,6*
0,8 ± 1,4*
9,1 ± 7,8
25
4,7 ± 4,3
0,0 ± 0,0
0,5 ± 1,0
71,4 ± 7,9*
9,8 ± 8,8*
12,9 ± 1,5
12.5
6,2 ± 2,2
0,0 ± 0,0
1,8 ± 3,1
32,2 ± 12,7
38,7 ± 6,5
21,0 ± 9,1
6.25
2,1 ± 1,9
0,0 ± 0,0
0,41 ± 0,72
23,4 ± 3,3
61,8 ± 6,7
11,4 ± 6,4
3.125
6,5 ± 5,4
0,7 ± 0,6
1,15 ± 0,18
30,1 ± 3,8
48,9 ± 7,4
12,6 ± 9,9
Controle
6,5 ± 4,6
0,4 ± 0,6
3,7 ± 1,9
36,1 ± 7,4
53,2 ± 4,2
0,0 ± 0,0
*proporção superestimada devido à lise nos zigotos.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
94
Pré-fecundação
De forma geral, o aumento da concentração do extrato bruto no tratamento
dos gametas antes da fecundação promoveu um aumento na quantidade de
óvulos não fecundados. Os espermatozóides foram suscetíveis à exposição do
extrato bruto, onde foi verificado que o percentual de óvulos não fecundados foi
superior a 70% em todas as concentrações, não havendo diferenças significativas
entre estas concentrações (p> 0,05). Já quando os gametas femininos foram
submetidos às diferentes concentrações do extrato bruto, o percentual de óvulos
não fecundados foi significativamente maior (p< 0,05) que o controle, variando
entre 30 – 86%, exceto, na menor concentração (15,62 µg/mL) onde o percentual
de ovos não fecundados foi similar às encontradas no controle (Tabela 12).
Tabela 12. Porcentagem de óvulos não fecundados nas experiências de pré-fecundação
em diferentes concentrações do extrato bruto de Canistrocarpus cervicornis. (Media
±SD).
Experiência pré-fecundação
Tratamento (µg/ml)
Espermatozoides (%)
Óvulo (%)
0,00
14,9 ± 9,0
29,3 ± 21,6
15,62
87,2 ± 3,7
30,3 ± 18,8
31,30
83,0 ± 8,5
57,8 ± 19,3
62,50
71,3 ± 0,6
82,4 ± 6,2
125,00
73,7 ± 7,8
68,9 ± 4,6
250,00
90,3 ± 3,6
85,9 ± 2,2
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
95
Os resultados indicaram que nas experiências de pré-fecundação os gametas
tornaram-se inviáveis para o processo de singamia, diminuindo as taxas de
fecundação de 10 a 30% e de 20 a 70% nos testes com espermatozóides e
óvulos, respectivamente.
Algumas substâncias extraídas de algas marinhas tiveram efeitos sobre a
fecundação animal. Dentre as substâncias testadas, as fucoidanas inibiram a
penetração do espermatozóide em óvulos humanos (Oehninger et al. 1991;
Patankar et al. 1993). Por outro lado, um acido graxo poliinsaturado pouco comum
em algas, o ácido octadecapentenóico não mostrou a capacidade de inviabilizar
os gametas do ouriço Paracentrotus lividus nos processos de fecundação, mas
inibiu o desenvolvimento embrionário na primeira clivagem dos zigotos (Fériel et
al. 2000).
Nas experiências, os gametas masculinos mostraram menor resistência aos
componentes lipofílicos de C. cervicornis do que os femininos na mais baixa das
concentrações (15.62 µg/mL) (Tabela 12). Os espermatozóides de ouriço do mar
são imóveis enquanto estão dentro das gônadas e a ativação da mobilidade
acontece quando entram em contato com o meio salino, alcalinizando o pH
intracelular e ativando a enzima ATPase que promove a mobilidade dos flagelos
em resposta a respiração mitocondrial (Christen et al. 1982). A espécie C.
cervicornis é prolifera em diterpenos do tipo dolastanos, sendo conhecido que
dois dolastanos isolados desta espécie inibiram a atividade da enzima Na+K+ATPase (Garcia et al. 2009), podendo explicar a inviabilidade dos gametas em
realizar os processos de fecundação (Tabela 12).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
96
Nas experiências de avaliação dos efeitos do extrato bruto e do dolastano no
desenvolvimento embrionário, o extrato bruto inibiu os ciclos mitóticos dos zigotos
de L. variegatus desde as mais baixas concentrações, ao contrário do dolastano,
que não mostrou evidências claras de inibição dos ciclos mitóticos. Alguns
estudos com extratos em acetona das algas marinhas Botryocladia occidentalis
(Børgesen) Kylin, Ulva fasciata Delile, Gracilaria lemaneiformis (Bory de SaintVincent) Greville e Hypnea musciformis (Wulfen) J.V. Lamouroux inibiram em
mais de 50% o desenvolvimento embrionário de L. variegatus na concentração de
100 µg/mL (Torres et al. 2005). Estes resultados indicam que C. cervicornis
apresentam maior potencial de inibição do que outras algas, em mais baixas
concentrações.
Graças às divisões sincrônicas e uniformidade nas primeiras clivagens, os
testes com zigotos de ouriço do mar são suficientemente sensíveis para identificar
e diferenciar os efeitos tóxicos dos antimitóticos, (Jacobs et al. 1981). Apesar do
efeito de inibição dos ciclos mitóticos causados pelo extrato bruto, os zigotos não
apresentaram pontos claros citoplasmáticos, revelando aspecto homogêneo. A
presença de pontos claros citoplasmáticos é atribuída ao bloqueio do
acoplamento dos microtúbulos (Jacobs & Wilson 1986), assim nossos resultados
indicam que o processo de inibição mitótica induzido pelos componentes
lipofílicos do extrato bruto está relacionado com outros mecanismos diferentes do
acoplamento dos microtúbulos.
Por outro lado, tanto o extrato bruto quanto o dolastano induziram o
aparecimento de zigotos anômalos, caracterizados por planos de clivagem
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
97
assimétricos e proliferações atípicas mesmo em baixas concentrações (Figura
37G e Figura 38). Quando os gametas foram expostos as maiores concentrações
de extrato bruto, a inibição das clivagens provocou um aumento do número de
ovos fecundados não clivados (Figura 37B), dando uma falsa impressão de
diminuição das anomalias. Nesta concentração (250 µg/mL), ocorre a maior
inibição mitótica, onde mais de 80% dos ovos fecundados não chegam a clivar e
os poucos ovos que o fazem, tornam-se anômalos. Já nos testes com o
dolastano,
há
uma formação
de
anômalos
similar em quaisquer
das
concentrações testadas. Contudo, as maiores taxas de anômalos foram
encontradas nas experiências onde os gametas foram pré-tratados com o extrato
bruto (Figura 38). Embriões e larvas de invertebrados marinhos apresentam altas
taxas metabólicas em relação aos adultos durante o seu desenvolvimento e as
taxas metabólicas podem aumentar em uma ordem de magnitude antes da
metamorfose ou assentamento (Hoegh-Guldberg & Manahan 1995).
Experiências in vitro com Lytechinus pictus mostraram que a atividade da
enzima Na+/K+-ATPase aumenta gradualmente nos primeiros estádios de vida
deste organismo,
chegando a um pico de 80% (estádio prisma) (Leong &
Mahanan 1999). Se os dolastanos de C. cervicornis atuam sobre a atividade da
Na+/K+-ATPase, a inibição desta enzima pode afetar o transporte de íons,
promovendo desajustes no gradiente eletroquímico e comprometendo todos os
processos celulares íon-dependentes.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
98
100
Zygote (D)
zygote (CE)
sperm (CE)
ovule (CE)
Abnormal zygotes (%)
80
60
40
20
0
Control
1
2
3
4
5
Code of the concentration
Figura 38. Porcentagem dos zigotos anômalos nas experiências de pós-fecundação com
o extrato bruto (CE) e com o dolastano (D) e nas experiências de pré-fecundação com o
extrato bruto. Os códigos das concentrações 1 a 5 representam as diluições detalhadas
em materiais e métodos da menor a maior das concentrações.
Considerando que um agente antimitótico atua bloqueando a mitose enquanto
há exposição às substâncias e que um agente citotóxico causa danos às células a
ele expostas, os nossos resultados indicam que o extrato bruto de C. cervicornis
apresenta efeitos antimitóticos e citotóxicos. Este último evento foi mais evidente
nos testes com o dolastano ao exibir lise celular nas maiores concentrações
(Tabela 11).
As alterações no funcionamento da bomba Na +K+ podem explicar a lise dos
embriões
verificada
quando
os
zigotos
foram
submetidos
às
maiores
concentrações do dolastano. A bomba Na+K+ é o principal sistema de transporte
ativo na maioria das células animais, assim, a inibição da Na +/K+-ATPase gera
condições que favorecem o acúmulo intracelular de Na + (Aizman et al. 2001). Este
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
99
fato pode criar um ambiente de hipertonicidade celular que conduz à lise.
Entretanto, outras experiências são necessárias para maior compreensão destes
eventos.
Uma das questões fundamentais em biologia marinha e ecologia é o
entendimento demográfico de organismos que apresentam estágios planctônicos
e bentônicos (Pechenik 1999), e como as interações biológicas determinam o
tamanho populacional. Recentemente foi demonstrada a indução da metamorfose
e recrutamento de larvas de invertebrados por sinais químicas da alga Delisea
pulcra (Williamson et al. 2000), por outro lado foi demonstrado que algumas
espécies do gênero Dictyota apresentam defesas químicas que facilitam sua
permanência nos ambientes recifais por competição de espaço, mostrando efeitos
alelopáticos nos primeiros estágios de vida de alguns corais (Paul et al. 2011).
Sem dúvidas, a questão que permanece é: terão as algas a capacidade de
evitar ou se defender dos novos juvenis recrutas de seus consumidores? Nosso
estudo in vitro indica que os componentes lipofílicos de C. cervicornis podem
inviabilizar os gametas de L. variegatus diminuindo as taxas de fecundação,
impedindo a clivagem dos zigotos e promovendo anomalias, talvez na tentativa de
controlar a futura geração dos seus consumidores.
Entretanto, estudos complementares devem ser realizados para que essa
afirmação seja confirmada.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 4
100
4.4. CONCLUSÃO
Os componentes lipofílicos do extrato bruto de C. cervicornis podem atuar em
duas vias sobre um dos seus principais consumidores, o ouriço-do-mar
Lytechinus variegatus: na fecundação e no desenvolvimento embrionário.
O extrato bruto reduz as taxas de fertilização in vitro de L. variegatus,
evidenciando que os espermatozóides, quando expostos a esse extrato, são mais
sensíveis que os óvulos. Por outro lado o extrato bruto mostra efeitos de inibição
nas clivagens dos zigotos e na geração de anomalias.
O dolastano (4R,7R,14S)-4α,7α-diacetoxi-14-hidroxi-dolastano-1(15),8-dieno
revela ser um dos componentes responsáveis pela geração de anomalias nos
zigotos, mas não mostra um efeito de inibição nas clivagens e nas maiores
concentrações induz a lise celular dos blastômeros
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
101
CAPÍTULO 5. ATIVIDADE ANTIMITÓTICA DOS METABÓLITOS
SECUNDÁRIOS DAS ALGAS PARDAS MARINHAS Dictyota menstrualis E D.
ciliolata (DICTYOTACEAE, PHAEOPHYCEAE) DO LITORAL BRASILEIRO.
Resumo: O capítulo 5 apresenta as experiências sobre a bioprospecção da
atividade antimitótica dos extratos brutos de duas populações de D. menstrualis e
uma população de D. ciliolata, os resultados mostraram que o extrato de D.
ciliolata não atuou significativamente como um agente antimitótico, Entanto que
os extratos de D. menstrualis mostraram ser ativos com uma diferença
significativa entre as populações. Estes fatos conduziram ao isolamento dos
diterpenos majoritários pachydictyol A, dictyol E e o dichotomano 9-hidroxidichotoma-2,13-dieno-16,17-dial. Os resultados das experiências mostraram que
o diterpeno dichotomano apresentou uma alta atividade antimitótica impedindo em
todas as concentrações testadas o sucesso do desenvolvimento embrionário dos
zigotos de Lytechinus variegatus até a clivagem IV (16 blastômeros).
Comparações com dados na literatura sugerem que este diterpeno na tribo
Dictyoteae pode ser um bom candidato antitumoral.
Publicação produzida a partir deste capítulo:
Atividade antimitótica dos metabólitos secundários das algas pardas marinhas Dictyota
menstrualis e D. ciliolata (Dictyotaceae, Phaeophyceae) do litoral brasileiro.
Ortiz-Ramírez, F.A; Osako, K; Cavalcanti, D.N; Teixeira, V.L.
Trabalho apresentado durante o III Workshop da REDEALGAS – 2011.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
102
5.1. INTRODUÇÃO
Na diversidade funcional dos organismos marinhos expressada na produção
de diferentes tipos de metabolitos secundários, encontram-se moléculas ainda
pouco conhecidas e que atuam como sinalizador químico entre as espécies, como
na defesa contra consumidores ou predadores, competição por espaço, na
reprodução etc. Uma substância que atua como mediador químico de um
organismo pode ser a esperança no tratamento ou cura de doenças (Teixeira
2009) e o potencial biotecnológico destas moléculas tem sido demonstrado em
diferentes atividades in vitro como antibiótica, antiviral, citotóxica e antitumoral
(Blunt et al. 2010).
Para avaliar o potencial de um produto natural como candidato antitumoral
pode-se constatar sua atividade citostática. Assim, um agente antimitótico é um
tipo de substancia que bloqueia a proliferação celular interrompendo o processo
da mitose e são usados para o tratamento do câncer, também chamados de
inibidores mitóticos (National Cancer Institute, 2011).
Hoje, vários dos produtos de origem marinha em análise pela indústria
farmacêutica têm como objetivo combater diferentes tipos de câncer, estando
alguns deles em fases clínicas I, II ou III ou em uso comercial, como é o caso do
Yondelis® (trabectedina, ecteinascidina-743, ET-743,), da Pharmamar, isolado da
ascídia caribenha Ecteinascidia turbinata Herdman 1880, e que foi aprovado para
uso clínico no tratamento de sarcoma de tecidos moles. Atualmente, o produto é
obtido a partir da síntese da cianosafracina B, obtido de cultura da bactéria
Pseudomonas fluorescens (Schröter 1872) (Pomponi 2001; Haefner 2003; CostaLotufo et al. 2009).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
103
Um dos primeiros relatos de atividade antimitótica de produtos naturais de
algas da família Dictyotaceae foi descrito para extratos orgânicos de Dictyopteris
membranacea (Stackhouse) Batters, onde foram constatadas propriedades
citostáticas in vitro em culturas celulares da linhagem KB (carcinoma oral
humano) (Kosovel et al. 1988).
Uma recente revisão do potencial biotecnológico dos produtos naturais de
algas
marinhas
bentônicas
revelou
que
a
atividade
antimitótica
nos
representantes da tribo Dictyoteae tem sido pouco estudada. No entanto,
diterpenos como as dictyotinas A, B e C, alguns xenianos e norxenianos, todos
isolados de D. dichotoma, e um diterpeno dolabellano, isolado de uma espécie
não identificada de Dictyota apresentaram significativa atividade antimitótica (El
Gamal 2010).
Um dos métodos considerado rápido e de baixo custo para avaliar o potencial
antitumoral de uma substância é o modelo com embriões de ouriço-do-mar,
especialmente Lytechinus variegatus, por fornecer dados tanto citotóxicos como
antimitóticos (Kiselyov et al. 2010). Este modelo permite detectar efeitos
antimitóticos específicos sobre a polimerização da tubulina (Semenova. et al.
2006). As principais características que fazem de este método continuar vigente
nos estudos de bioprospecção são às divisões sincrônicas e uniformes das
primeiras clivagens dos zigotos e seu fácil manuseio (Jacobs et al. 1981; Jacobs
& Wilson 1986).
Visando ampliar o estudo em bioprospecção do potencial biotecnológico da
tribo Dictyoteae, o presente capítulo tem como objetivo:
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5

104
Avaliar o efeito antimitótico dos extratos brutos de diferentes populações de
Dictyota menstrualis e D. ciliolata e dos diterpenos pachydictyol A (1),
dictyol E (16) e dichotomano (17) frente aos zigotos de Lytechinus
variegatus.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
105
5.2. MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1. Coleta do material algáceo
Os espécimes de Dictyota menstrualis foram coletados mediante mergulho
livre, a 2m de profundidade, no mês de julho de 2008, na Praia do Forno no
município de Armação de Búzios, Rio de Janeiro, Brasil (22°44’S - 41°52’W).
Indivíduos desta mesma espécie foram coletados mediante mergulho autônomo,
a 20m de profundidade, no mês de abril de 2008, pelo Dr. Roberto Campos
Villaça na Ilha Barão de Tefé do Arquipelago de São Pedro e São Paulo (00°55’ N
- 29°21’ W).
Amostras de D. ciliolata foram coletados na Praia Vermelha, Ilha Grande,
Angra dos Reis, estado do Rio de Janeiro (23°00’S - 44°19’W), mediante
mergulho livre a uma profundidade média de 3 a 5 m no mês de outubro de 2008.
O material biológico foi triado para a retirada de epibiontes e fauna
acompanhante, posteriormente foi seco a temperatura ambiente no laboratório.
5.2.2. Preparação dos extratos
Após a total secagem das algas, cada amostra foi submetida à extração
seqüencial em n-hexano e acetato de etila, durante três semanas para cada
solvente, sendo renovado a cada semana. Os volumes dos extratos obtidos foram
reduzidos sob pressão reduzida, em evaporador rotativo, sendo armazenados sob
refrigeração (Tabela 13).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
106
Tabela 13. Massa seca das algas de cada espécime e população, massa dos extratos
brutos obtidos em n-hexano (Hex) e acetato de etila (AcOEt). SPSP: Arquipelago São de
Pedro e São Paulo; BZ: Praia do Forno, Búzios; IG: Ilha Grande, Angra dos Reis.
Espécime
População
Extrato
bruto
(g)
Extrato
bruto Hex
(g)
AcOEt (g)
Massa seca
Dictyota
menstrualis
SPSP
115,00
1,75
1,50
Dictyota
menstrualis
BZ
26,70
2,01
1,30
Dictyota ciliolata
IG
87,90
3,02
1,95
5.2.3. Isolamento e purificação dos diterpenos
Os diterpenos foram isolados e purificados através de técnicas convencionais
de cromatografia em coluna em gel de sílica, utilizando solventes ou mistura de
solventes de grau PA (Para Análise) de diferentes polaridades. A identificação das
substâncias foi realizada por análise espectroscópica monodimensional de
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H).
Uma alíquota (de 8 a 10 mg) de cada um dos extratos foi dissolvida em
clorofórmio deuterado (CDCl3) para obtenção do espectro de Ressonância
Magnética Nuclear de Hidrogênio (RMN 1H), em aparelho Varian-Unity Plus, na
freqüência de 300,00 ou 500,00 MHz, sendo usado o tetrametilsilano (TMS) como
referência interna. Os espectros de RMN foram realizados pelo Laboratório
Multiusuário de RMN da UFF (http://www.uff.br/laremn/).
5.2.3.1. Isolamento do pachydictyol A
O pachydictyol A (1), foi obtido segundo o método descrito no capitulo 1
(1.2.4.), a partir do terceiro fracionamento onde foram obtidas 24 fracões (F1-F24),
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
107
a F10 (4 mg) consistia num óleo amarelado, que pelos sinais espectrais de RMN 1H
correspondem a o pachydictyol A (1) (Figura 39).
Extrato em CH2Cl2 5 g
Alíquota 2,5g
Alíquota 2,5g
1° Fracionamento
CH2Cl2:AcOEt 8:2
Fração 2
Fração 3
165mg
2° Fracionamento
Hex:AcOEt 9:1
Frações 8 – 11 (55 mg)
Hex: CH2Cl2
3° Fracionamento
Fração 10 (4 mg)
pachydictyol A (1)
Figura 39. Esquema ilustrado do isolamento e purificação do pachydictyol A (1).
5.2.3.2. Isolamento do dictyol E
Uma alíquota de 1000 mg do extrato hexanico de D. menstrualis da população
do Arquipélago São Pedro e São Paulo foram submetidas à partição em coluna
flash em gel de sílica 60 (0,04 – 0,063 mm) (Ø3 cm, altura da coluna 20 cm),
isocrática usando CH2Cl2:AcOEt 9,5:0,5 onde foram obtidas 47 frações (F1 – F47).
As frações F11 a F17 foram reunidas (174 mg), e um novo fracionamento foi
realizado em coluna de gel de sílica 60 (230-430 Mesh) (Ø1 cm, altura da coluna
30 cm) usando como fase móvel CH2Cl2. A polaridade foi aumentada com
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
108
acréscimo progressivo de AcOEt ate a proporção 9:1. Foram obtidas 25 frações
(F1 – F25), as frações F13 a F19 foram reunidas (43 mg) e um terceiro
fracionamento foi realizado em coluna de gel de sílica 60 (230-430 Mesh) (Ø1 cm,
altura da coluna 15 cm), isocrática usando como fase móvel CH2Cl2:AcOEt
(9,5:0,5) onde foram obtidas 20 frações (F1 – F20), as frações F9 a F12 foram
reunidas (22 mg) e submetidas a um quarto e último fracionamento em coluna de
gel de sílica 60 (230-430 Mesh) (Ø1 cm, altura da coluna 15 cm), isocrática
usando como fase móvel CH2Cl2:AcOEt 9,5:0,5 onde foram obtidas 20 frações (F1
– F20) sendo reunidas as frações F6 a F8 (7 mg), que consistia num óleo
amarelado, que pelos sinais de RMN 1H correspondem ao diterpeno dictyol E (16)
(Figura 40)
.
Extrato em n-hexano 1 g
1° Fracionamento
CH2Cl2:AcOEt 9,5:0,5
Frações 11 – 17 (174 mg)
CH2Cl2
CH2Cl2:AcOEt 9:1
2° Fracionamento
Frações 13 – 19 (43 mg)
3° Fracionamento
CH2Cl2:AcOEt 9,5:0,5
Frações 9 – 12 (22 mg)
4° Fracionamento
CH2Cl2:AcOEt 9,5:0,5
Fração 6 – 8 (7 mg)
dictyol E (16)
Figura 40. Esquema do isolamento e purificação do dictyol E (16).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
109
5.2.3.3. Isolamento do dichotomano
Com o objetivo de isolar o diterpeno dichotomano (17), outra coleta de D.
menstrualis foi realizada durante o mês de julho de 2010, na Praia do Forno,
Armação de Búzios (RJ). O material seco (95 g) foi submetido à extração
exaustiva com diclorometano (CH2Cl2). Após a redução do volume do solvente em
evaporador rotativo sob pressão reduzida, duas alíquotas de 2,5 g, de cada
extrato bruto, foram submetidas à partição em coluna tipo flash em gel de sílica
(0,015 – 0,045 mm) (Ø3 cm, altura da coluna 20 cm), usando como fase móvel, os
solventes ou misturas de solventes CH2Cl2:AcOEt (8:2), (1:1), AcOEt 100% e
Acetona 100%.
A fração 4 das duas colunas foram reunidas (300 mg). Esta
fração foi submetida a um fracionamento em coluna de sílica gel 60 RP18
preparativa (0,015 – 0,045 mm) (Ø2 cm, altura da coluna 30 cm),
isocrática
usando CH3CN, onde foram obtidas 50 frações (F1-F50). As frações 28 a 45 (147
mg) foram reunidas e um novo fracionamento em coluna de sílica gel 60 RP18
preparativa (0,015 – 0,045 mm) (Ø1 cm, altura da coluna 15 cm),
isocrática
usando CH3CN, onde foram obtidas 45 frações (F1-F45). As frações 28 a 35 foram
reunidas (41mg) este resíduo foi submetido a lavagens sucessivas com éter de
petróleo em frio obtendo-se 21mg de um cristal icolor que pelos sinais de RMN 1H
correspondem ao diterpeno dichotomano (17) (Figura 41).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
110
Extrato em CH2Cl2 5 g
Alíquota 2,5 g
Alíquota 2,5 g
1° Fracionamento
CH2Cl2:AcOEt 8:2
Fração 4
Fração 4
300 mg
2° Fracionamento
CH3CN
Frações 28 – 45 (147 mg)
3° Fracionamento
CH3CN
Frações 28 – 35 (41 mg)
Lavagem
Éter de petróleo
Dichotomano (17)
(21 mg)
Figura 41. Esquema ilustrado do isolamento e purificação do diterpeno 9-hidroxidichotoma-2,13-dieno-16,17-dial (dichotomano 17).
5.2.4. Ensaio de atividade biológica
5.2.4.1. Coleta dos ouriços-do-mar, obtenção dos gametas e estocagem
Indivíduos adultos de Lytechinus variegatus foram coletados na Praia de
Itaipu, Niterói, Rio de Janeiro, Brasil (23° 00’34’’ S; 44°26’10’’ W). No laboratório
foram mantidos em aquários, posteriormente cada ouriço foi induzido a liberar os
gametas mediante uma injeção de 1 a 3 mL de solução 0,5M de cloreto de
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
111
potássio (KCl) na região oral intracelômica. Os gametas foram coletados e
acondicionados cuidadosamente em tubos separados.
Os óvulos foram depositados em tubos FALCON com capacidade para 50 mL
contendo água do mar artificial (AMA) Sea Red® preparada com água ultra pura
(Milli‐Q) e ajustada a 32 UPS de salinidade. Os espermatozóides foram coletados
diretamente da região aboral, a seco, com auxílio de pipetas Pasteur e depositado
em tubos Eppendorf® de 2 mL e mantidos em refrigeração. Foram preparadas
soluções estoque de óvulos de 100 mL (10.000 óvulos/mL) e uma solução de
espermatozóides (1 mL de espermatozóides concentrado diluído em 9 mL de
AMA).
5.2.4.2. Preparação das soluções dos extratos brutos e produtos puros
A partir do estoque padrão de 200 µg/mL dos extratos brutos em n-hexano (2
mg do extrato foi dissolvido em 150 µL do solvente DMSO e completado com
AMA ate 10 mL em balão volumétrico) foram preparadas as soluções de 100, 50,
25 e 12.5 µg/mL. De modo similar, a partir do estoque padrão dos produtos puros
100 µg/mL (1mg do produto dissolvido em 150 µL e completado com AMA ate 10
mL em balão volumétrico) foram preparadas as soluções de 50, 25, 12.5 e 6.25
µg/mL. A concentração de DMSO foi corrigida para cada solução.
5.2.4.3. Avaliação da atividade em zigotos de Lytechinus variegatus
1 mL da solução estoque de espermatozóides foi adicionado ao estoque de
óvulos, agitando cuidadosamente durante 30s com o objetivo de facilitar a
fecundação, passados 5min a fecundação foi confirmada pela elevação da
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
membrana
112
vitelínica em torno de 80% dos óvulos fecundados. Para cada
tratamento e controle foi depositado 1 mL de ovos fecundados em placas de
cultura (TTP®) com 24 poços com capacidade para 3 mL, em triplicata. Em
seguida foi adicionado 1 mL das soluções dos extratos brutos e dos produtos
puros, no controle foi adicionado 1 mL de AMA e no controle branco 1 mL de AMA
com a concentração ajustada de DMSO. As placas de cultura foram mantidas a
temperatura ambiente durante 2h passado este tempo foram adicionadas 2 gotas
de formaldeído a 10%.
De cada amostra experimental, uma alíquota de 1 mL foi depositado em uma
câmara Sedgwick‐Rafter e realizadas as contagens dos ovos em 10 pontos
aleatórios da câmara. Os ovos foram classificados segundo sua etapa de divisão
celular da seguinte forma: ovos não fecundados (ONF), nos quais a membrana de
fecundação não foi visualizada; ovos fecundados porém não divididos (OF), nos
quais a membrana foi visualizada porém não sofreram mitose; e clivagens I, II, III,
IV. Este método foi adaptado a partir dos testes empregados em citotoxicidade,
ecotoxicidade e estudos preliminares de atividade farmacológica (Lera et al. 2006;
Semenova et al. 2006; Kiselyov et al. 2010; Magalhães et al. 2010) (Figura 42).
5.2.4.4. Tratamento dos dados e análise estatística
Os resultados das experiências foram analisados pelo teste não paramétrico
Kruskal-Wallis nos casos que se apresentaram diferenças foram realizadas
comparações múltiplas, as comparações dos testes entre populações e
espécimes foram analisados pelo teste de U Mann-Whitney. Este procedimento
foi realizado usando o programa computacional de análise estatística Infostat
2009 (Di Rienzo et al., 2009). Todos os testes estatísticos foram conduzidos
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
113
segundo Zar (1996), adotou-se como nível de significância α < 0,05. Para tornar
comparáveis os dados de atividade antimitótica de cada experiência foi
determinado o sucesso de desenvolvimento embrionário ate a clivagem IV e
aplicou-se o princípio estatístico de relativização dos dados frente ao controle
segundo a fórmula de Abott (Revilla 2009) a partir da qual foi realizado o cálculo
do EC50 usando o programa computacional GraphPad Prism v5.0.
Injeção de KCl
Solução de
espermatozóides
Estoque de óvulos
10,000/mL
Fecundação in vitro
20 µL de
espermatozóides
1 mL de óvulos
Stock
tratamentos
5 min.
1 mL
tratamento
1 mL zigotos
Figura 42. Esquema ilustrado do ensaio de atividade biológica dos extratos de Dictyota
menstrualis, Dictyota ciliolata e dos diterpenos pachydictyol A, dictyol E e dichotomano
frente aos zigotos de Lytechinus variegatus.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
114
5.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.3.1. Atividade biológica dos extratos brutos
As experiências dos efeitos dos extratos brutos hexânicos das populações de
D. menstrualis (Praia do Forno, Búzios e Arquipélago de São Pedro e São Paulo)
e D. ciliolata (Ilha Grande, Angra dos Reis), frente aos primeiros estágios do
desenvolvimento embrionário de L. variegatus, em geral mostraram um efeito de
retardo nas divisões celulares, para todos os extratos, em diferente grau de
intensidade. Deve ser ressaltado que as experiências com os extratos das
populações de D. menstrualis evidenciaram claros sinais de atividade antimitótica.
Os resultados dos ensaios com o extrato de D. ciliolata demonstrou que
existem diferenças significativas (p<0,05) dos zigotos não clivados (OF) e dos
zigotos nas clivagens I, III e IV, frente aos resultados do controle, sendo as
principais diferenças encontradas nas maiores concentrações (100 e 200 µg/mL).
Ao assumir o sucesso do desenvolvimento embrionário ate a clivagem IV, a
concentração de 200 µg/mL apresentou um efeito antimitótico de 28,5 ± 4,6 % de
zigotos nesta clivagem, em comparação com a de 66,4 ± 5,5% do controle.
Por outro lado, a exposição dos zigotos de L. variegatus ao extrato bruto de D.
ciliolata mostrou um aumento dos zigotos anômalos de modo proporcional à
concentração do extrato adicionada, entre 1,9 ± 1,4% (12,5 µg/mL) a 22,3 ±
15,3% (200 µg/mL), caracterizados por clivagens assimétricas e pela ausência de
tubérculos (Figura 43).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
115
Figura 43. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus variegatus
nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF) ovos não clivados; I-IV)
primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A) zigotos anômalos, nas experiências
com o extrato bruto em hexano (0; 12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) de Dictyota ciliolata da
população da Ilha Grande, Angra dos Reis.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
116
Os resultados das experiências com os extratos brutos em hexano das
populações de Dictyota menstrualis mostraram que houve efeito do extrato no
desenvolvimento do ouriço, em qualquer das categorias analisadas (p< 0,05).
Os efeitos dos extratos da população de Búzios e do Arquipélago São Pedro e
São Paulo sobre os zigotos de Lytechinus variegatus mantiveram um padrão em
comum, que consistiu em um aumento proporcional de zigotos não clivados (OF)
com respeito à concentração testada. Esta situação foi mais evidente na
experiência com o extrato da população de Búzios que mostrou 61,1 ± 16,9% de
zigotos não clivados, quando utilizado 50 µg/mL de extrato, 77,2 ± 12,2%, quando
utilizado 100 µg/mL de extrato e 100,0 ± 0,0%, quando utilizado o extrato na
concentração de 200 µg/mL, enquanto o controle manteve-se com 13,5 ± 2,1% de
zigotos não clivados. No caso da população de São Pedro e São Paulo este
comportamento
foi
verificado
nas
maiores
concentrações,
onde
foram
encontrados 50,1 ± 12,9% de zigotos não clivados, quando utilizado o extrato na
concentração de 100 µg/mL e 80,9 ± 4,9% de zigotos não clivados, quando
utilizados 200 µg/mL. Nesta experiência, o valor de zigotos não clivados obtido no
controle foi de 30,8 ± 2,9%.
Consequentemente este fenômeno foi refletido na contagem dos zigotos que
atingiram a clivagem IV, evidenciando um padrão inversamente proporcional à
concentração testada. Assim, para o extrato da população de Búzios, enquanto o
controle apresentou 55,3 ± 11,4% de zigotos na clivagem IV, foram encontrados
30,3 ± 6,0% de zigotos nesta clivagem, quando usado o extrato na concentração
de 12,5 µg/mL, 19,9 ± 5,5%, quando utilizado 25 µg/mL de extrato e quando foram
utilizadas as concentrações de 50, 100 e 200 µg/mL, não foram encontrados
zigotos nesta clivagem (0,0%). No caso da população do Arquipélago São Pedro
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
117
e São Paulo, o controle apresentou 56,9 ± 6,1% de zigotos na clivagem IV,
enquanto foram registrados 33,7 ± 4,4% de zigotos nesta clivagem, quando
utilizados 25 µg/mL de extrato, 22,4 ± 4,7% quando utilizados 50 µg/mL, 8,0 ±
3,1%, quando usados 100 µg/mL e 0,3 ± 0,6%, quando utilizados 200 µg/mL do
extrato (Figura 44 e 45).
Figura 44. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus variegatus
nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF) ovos não clivados; I-IV)
primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A) zigotos anômalos, nas experiências
com o extrato bruto em hexano (0; 12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) de Dictyota menstrualis
da população de Búzios.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
118
Figura 45. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus variegatus
nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF) ovos não clivados; I-IV)
primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A) zigotos anômalos, nas experiências
com o extrato bruto em hexano (0; 12,5; 25; 50; 100 e 200 µg/mL) de Dictyota menstrualis
da população do Arquipélago São Pedro e são Paulo.
Os resultados demostram que independentemente da população, os
componentes lipofílicos do extrato de D. menstrualis atuaram como um agente
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
119
citostático do tipo antimitótico, avaliado segundo o sucesso do desenvolvimento
embrionário de L. variegatus ate a clivagem IV. Para comparação com os
resultados de cada experiência em termos de inibição mitótica, foi aplicada a
formula de Abbott (Revilla 2009) e realizado o cálculo de EC50.
Os resultados demostram que o potencial antimitótico de D. ciliolata atua
como um EC50 = ~ 99,9 µg/mL, enquanto o de D. menstrualis do Arquipélago de
São Pedro e São Paulo apresentou um EC50 = 60,24 µg/mL, e a população de
Búzios de D. menstrualis, como um EC50 = 25,45 µg/mL. Estes resultados
mostram que o extrato bruto de D. menstrualis de Búzios é 2,4 vezes mais ativo
que o extrato de São Pedro e São Paulo e quatro vezes mais ativo que o extrato
de D. ciliolata.
São poucos os estudos da atividade citotóxica antimitótica de extratos de
algas pertencentes à tribo Dictyoteae. Ballesteros et al. (1992) testaram o extrato
metanólico de 71 espécies de macroalgas do Mar Mediterrâneo e seus resultados
mostraram que 50% dos extratos apresentaram atividade antimitótica, sendo o de
D. dichotoma um dos extratos mais ativos. No entanto, sua atividade foi
considerada baixa, de 1 a 25% na atividade inibitória das células de leucemia
(L1210). Por outro lado, um estudo com zigotos de L. variegatus frente ao extrato
metanólico de D. pulchella, mostrou diferenças significativas nos estágios II, IV e
OF em comparação com o controle. Sem dúvidas, os autores não consideraram
este efeito como antimitótico, pois não foram encontradas claras diferenças entre
as experiências dos zigotos OF frente aos outros estágios de desenvolvimento
(Díaz et al. 2006).
O estudo com extratos em acetona das algas marinhas Botryocladia
occidentalis, Ulva fasciata, Gracilaria lemaneiformis e Hypnea musciformis
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
120
inibiram em mais de 50% o desenvolvimento embrionário de L. variegatus na
concentração de 100 µg/mL (Torres et al. 2005). Os nossos resultados mostraram
que os extratos brutos de D. menstrualis são mais ativos que todos esses
exemplos.
D. menstrualis e D. ciliolata caracterizam-se por sintetizar diterpenos do grupo
I (esqueletos do tipo guaiano prenilado) e do grupo III (esqueletos do tipo xeniano)
(Cronin et al. 1995; Schmitt et al. 1998; Teixeira et al. 2001; Cavalcanti et al. 2006,
2008; Manzo et al. 2009). As diferenças encontradas na atividade das duas
populações de D. menstrualis (Arquipelago São Pedro e São Paulo e Búzios)
podem estar diretamente relacionadas com as diferenças na composição dos
produtos naturais. Recentemente, o nosso grupo de pesquisa relatou diferenças
quantitativas no perfil químico de extratos de D. menstrualis desses locais, onde
os diterpenos majoritários foram o dictyol E (16) e o dichotomano (17),
respectivamente (Ortiz-Ramírez et al. 2008).
Para testar esta hipótese, o diterpeno pachydictyol A (1), abundante nas duas
populações de D. menstrualis e em D. ciliolata, o dictyol E (16), diterpeno
majoritário na população do Arquipélago São Pedro e São Paulo de D.
menstrualis, e o dichotomano (17), diterpeno majoritário na população de Búzios,
tiveram avaliados os seus efeitos sobre os zigotos de L. variegatus.
5.3.2. Atividade biológica dos diterpenos majoritários
Depois de isolar os diferentes metabolitos secundários do tipo diterpeno e
obter os correspondentes espectros RMN
1
H os dados espectrais foram
comparados com dados descritos na literatura e mostraram ser compatíveis para
cada um dos compostos: pachydictyol A (Tabela 14), dictyol E (Tabela 15) e
dichotomano (Tabela 16).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
121
Tabela 14. Comparação dos dados espectroscópicos do pachydictyol A (1) obtidos por
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) com dados apresentados na literatura.
n°
Carbono
Pachydictyol A
(presente estudo)
Pachydictyol A
(Gedara et al. 2003)
Pachydictyol A
(Ayyad et al. 2011)
δ 1H (n° de hidrogênios, multiplicidade, J em Hz)
1
2
3
6
14
16
2,6 (1H, m)
2,2 – 2,3 (2H, m)
5,31-5,34 (1H, m)
3,92 (1H, d, 7,41)
5,09-5,15 (1H, m)
1,68 (3H, d, 1,1)
1,8 (3H, qt, 1,47;
1,47; 1,47; 2,8)
2,6 (1H, m)
2,2-2,4 (2H, m)
5,2 (1H, sl)
3,8 (1H, d, 7)
5,02 (1H, br.t, 7)
1,61 (3H, s)
18
4,73-4,75 (2H, m)
4,6 (2H, br)
19
20
0,99 (3H, d, 6,12)
1,61 (3H, d, 0,7)
0,94 (3H, d, 6,0)
1,54 (3H, s)
17
1,75 (3H, sl)
5,33 (1H, sl)
3,92 (1H, m)
5,12 (1H, tl, 7,1)
1,68 (3H, d, 0,9)
1,80 (3H, td, 2,0 e
1,2)
4,74 (1H, sl)
4,75 (1H, sl)
0,96 (3H, d, 6,0)
1,60 (3H, s)
Tabela 15. Comparação dos dados espectroscópicos do dictyol E (16) obtidos por RMN
1
H (300 MHz, CDCl3) com dados apresentados na literatura.
n°
Carbono
Dictyol E
(presente estudo)
Dictyol E
(Gedara et al. 2003)
Dictyol E
(Viano 2010)
δ 1H (n° de hidrogênios, multiplicidade, J em Hz)
1
2,6 (1H, m)
2,56 (1H, m)
2
2,3-2,5 (2H, m)
2,2-2,46 (2H, m)
3
5
5,34 (1H, sl)
5,3 (1H, s)
2,35 (1H, m)
6
4,20 (1H, dd, 7,8; 2,2)
4,15 (1H, dl, 6,8)
12
1,75 (2H, m)
1,7-1,74 (2H, m)
13
1,9-2,0 (2H, m)
1,95-2,04 (2H, m)
14
5,13-5,18 (1H, m)
5,13 (1H, brt, 6,8)
16
17
1,69 (3H, s)
1,76 (3H, sl)
4,76 (1H, sl)
4,78 (1H, sl)
1,24 (3H, s)
1,62 (3H, sl)
1,68 (3H, s)
1,78 (3H, sl)
4,72 (1H, s)
4,74 (1H, s)
1,19 (3H, s)
1,6 (3H, s)
18
19
20
2,58 (1H, brq, 9,0)
2,2 (1H, dd, 15,0 e
8,0)
2,5 (1H, ddq, 15,0;
9,0; 2,5)
5,33 (1H, s)
2,37 (1H, brt, 8,5)
4,19 (1H, dd, 8,0;
2,5)
1,72 (2H, m)
2,01 (1H, dd, 15,0;
7,5)
2,1 (1H, dd, 15,0;
6,0)
5,14 (1H, dd, 7,0;
5,5)
1,68 (3H, s)
1,81 (3H, s)
4,75 (1H, s)
4,77 (1H, s)
1,23 (3H, s)
1,61 (3H, s)
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
122
Tabela 16. Comparação dos dados espectroscópicos do dichotomano (17) obtidos por
RMN 1H (300 MHz, CDCl3) com dados apresentados na literatura.
n°
Carbono
Dichotomano
(presente estudo)
Dichotomano
(Cavalcanti 2004)
δ 1H (n° de hidrogênios, multiplicidade, J em
Hz)
3
4
6
7
8
9
10
12
13
15
16
17
18
19
20
7,07 (1H, t, 3,73)
2,43 (2H, d, 3,72)
1,19 (1H, d, 4,96)
1,35 (1H, m)
1,24 (1H, d, 5,4)
1,75 (1H, d, 4,5)
2,38 (1H, d, 3,2)
3,60 (1H, s)
1,90 (1H, q, 7,4; 7,09)
2,01 (2H, dd, 7,65;
15,3)
5,11 (1H, t, 6,96)
1,61 (3H, s)
9,70 (1H, s)
9,40 (1H, s)
1,07 (3H, s)
0,47 (3H, d, 6,7)
1,69 (3H, s)
7,06 (1H, t, 3,6)
2,42 (2H, d, 3,6)
1,21 (1H, m)
1,38 (1H, m)
1,26 (1H, m)
1,69 (1H, m)
2,36 (1H, dl, 3,3)
3,58 (1H, s)
1,88 (1H, ql, 7,2)
2,00 (2H, q, 7,8)
5,09 (1H, dt, 7,2; 1,5)
1,59 (3H, s)
9,70 (1H, s)
9,40 (1H, s)
1,05 (3H, s)
0,47 (3H, d, 6,6)
1,67 (3H, d, 1,5)
Os resultados dos efeitos do pachydictyol A (1) e do dictyol E (16) sobre os
primeiros estágios do desenvolvimento embrionário de Lytechinus variegatus
mostraram um mesmo padrão onde somente foram encontradas diferenças
(p<0,05) na maior das concentrações (100 µg/mL) para cada caso, a proporção
dos zigotos que atingiram a clivagem IV nesta concentração no tratamento com o
pachydictyol A foi 32,9 ± 18,4% frente a 48,5 ± 6,3% do controle, no tratamento
com o dictyol E a proporção foi 23,5 ± 20,5% frente a 60,5 ± 4,9% do controle.
Os resultados obtidos nestas experiências não são suficientemente robustos
para atribuir um efeito antimitótico a estes diterpenos ambos do tipo guaiano
prenilado (Figura 46 e 47).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
123
Figura 46. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus variegatus
nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF) ovos não clivados; I-IV)
primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A) zigotos anômalos, nas experiências
com o diterpeno pachydictyol A (0; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
124
Figura 47. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus variegatus
nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF) ovos não clivados; I-IV)
primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A) zigotos anômalos, nas experiências
com o diterpeno dictyol E (0; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
125
Por outro lado, os resultados do tratamento com o diterpeno dichotomano (17)
mostraram diferenças (p< 0,05) de todos os estágios de desenvolvimento em
todas as concentrações frente ao seu controle, tendo como padrão que o
aumento da concentração diminuía o sucesso de desenvolvimento ate apresentar
uma inibição total a partir da concentração 25 µg/mL (Figura 48).
Figura 48. Media e desvio padrão da porcentagem dos zigotos de Lytechinus variegatus
nos diferentes estágios do desenvolvimento embrionário: OF) ovos não clivados; I-IV)
primeira, segunda, terceira e quarta clivagem e A) zigotos anômalos, nas experiências
com o diterpeno dichotomano (0; 6,25; 12,5; 25; 50 e 100 µg/mL).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
126
O EC50 para o sucesso do desenvolvimento até a clivagem IV dos zigotos
expostos ao pachydictyol A e ao dictyol E foi 97,64 µg/mL e 96,26 µg/mL,
respectivamente. Estes valores tão próximos demonstraram que a semelhança
estrutural do esqueleto destas substâncias e não a presença da hidroxila em C-11
no dictyol E, foi mais importante para a relação estrutura-atividade. Cabe ressaltar
que os valores de EC50 para estes dois diterpenos foram próximos à maior
concentração testada neste trabalho. Para aprimorar estes dados seria
necessário realizar uma experiência dose – resposta onde seja considerada 100
µg/mL como a menor concentração.
O diterpeno dichotomano atuou como um agente antimitótico tão efetivo que
não foi possível determinar o EC50, visto que este diterpeno inibiu em 100% o
sucesso de desenvolvimento dos zigotos até a clivagem IV em todas as
concentrações testadas. Segundo os resultados é recomendável realizar
experiências dose – resposta onde seja considerada 6,25 µg/mL como a maior
concentração.
Observações detalhadas no microscópio revelaram que o dichotomano atuou
na estabilização da tubulina (Figura 54) e apresenta um efeito similar ao da droga
Paclitaxel (10 µM) também testada em zigotos de ouriço-do-mar (Semenova et al.
2006). Esta droga atualmente é comercializada sob o nome Taxol® e é usada nos
tratamento de câncer de mama.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
127
Figura 49. Imagens microscópicas dos zigotos de Lytechinus variegatus. A) ovo
fecundado normal sem tratamento com dichotomano. B) zigoto normal na clivagem IV
sem tratamento com dichotomano. C) zigoto tratado com o dichotomano. As setas
indicam os pontos claros citoplasmáticos correspondentes ao indicativo da estabilização
do aparato mitótico. A media do diâmetro dos zigotos foi 110 µm.
Por outro lado, um recente estudo demonstra que a citotoxicidade do
dichotomano na linhagem celular PM-1 foi >200 µM considerado este valor como
baixa toxicidade (Pereira et al. 2004). Os nossos resultados mostram o grande
potencial antimitótico de este diterpeno que inclusive inibiu em 100% na menor
das concentrações o que corresponde a 0,02 µM. Esses resultados indicam que o
dichotomano isolado de D. menstrualis, é um bom candidato para futuros testes
para avaliar o potencial antitumoral.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 5
128
5.4. CONCLUSÃO
A atividade antimitótica dos extratos hexânicos de D. ciliolata (Ilha Grande,
Angra dos Reis) apresenta um EC50 em torno de 99,9 µg/mL, enquanto o extrato
de D. menstrualis do Arquipélago de São Pedro e São Paulo apresenta um EC50
igual a 60,24 µg/mL, e a população de D. menstrualis de Búzios, um EC50 = 25,45
µg/mL. Estes resultados mostram que o extrato bruto de D. menstrualis de Búzios
é 2,4 vezes mais ativo que o extrato de São Pedro e São Paulo e quatro vezes
mais ativo que o extrato de D. ciliolata.
Os diterpenos pachydictyol A e dictyol E não mostram ser agentes
antimitóticos significativos. No entanto, o dichotomano inibe até em 100% o
sucesso do desenvolvimento embrionário até a clivagem IV de L. variegatus. Esse
diterpeno mostra evidências de ser um potencial antitumoral que pode atuar na
estabilização da tubulina. Estes resultados sugerem que este diterpeno possa ser
considerado um recurso na luta contra o câncer e que seja alvo de mais estudos
para o entendimento do seu mecanismo de ação.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
129
CAPÍTULO 6. EFEITOS DOS PRODUTOS NATURAIS DE Dictyota menstrualis
E D. ciliolata SOBRE A AGREGAÇÃO PLAQUETÁRIA E COAGULAÇÃO
SANGUÍNEA
Resumo: Este capítulo apresenta os efeitos de extratos de diferentes populações
das algas pardas D. menstrualis e D. ciliolata na agregação plaquetária e
coagulação sanguínea. Os resultados revelam que a espécie, o local de coleta e o
solvente orgânico utilizado no processo de extração têm um perfil inibitório
diferenciado, onde destaca-se que o extrato hexânico de D. menstrualis da
população de Búzios, sendo o mais expressivo como agente antiplaquetário,
enquanto o extrato em acetato de etila foi o mais eficiente como anticoagulante.
Esta experiência em bioprospecção mostra o potencial biotecnológico dos
produtos naturais isolados de algas do gênero Dictyota da costa brasileira,
podendo servir de alvo para estudos de desenvolvimento de drogas
antitrombóticas.
Publicação produzida a partir deste capítulo:
LA, Moura; Ortiz-Ramírez, FA; Cavalcanti, DN; Ribeiro, SM; Muricy G; Teixeira, VL & Fuly, AL.
(2011). Evaluation of Marine Brown Algae and Sponges from Brazil as Anticoagulant and
Antiplatelet Products. Marine Drugs. 9: 1346-1358.
.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
130
6.1. INTRODUÇÃO
A hemostasia é um mecanismo fisiológico comum a todos os vertebrados que
garante o equilíbrio dinâmico da forma fluida do sangue. Esse processo envolve a
agregação plaquetária e a coagulação sanguínea. A coagulação apresenta as
fases de início e a de potencialização, as quais levam à geração da trombina,
enzima responsável pela formação de uma rede de fibras conhecida como fibrina,
resultando na formação de um coagulo que impede os processos hemorrágicos.
Finalmente, ocorre o processo conhecido como fibrinólise, que atua na dissolução
completa ou parcial do coagulo, promovendo a hemostasia que mantém o
equilíbrio do fluido do sangue (Esmon 2000; Allford & Machin 2004; Rosenberg
2011).
Quando o processo de coagulação não é revertido adequadamente, ou se
acontecer de forma patológica, diferentes distúrbios vasculares podem ocorrer,
levando a patologias como trombose, distúrbios cardiovasculares, embolia
pulmonar e acidentes isquêmicos (Austin 2009). De fato, esses problemas
contribuem na mobilidade e mortalidade de milhões de pessoas no mundo, e são
considerados como um problema de saúde publica (Agnelli 2005). Hoje em dia,
esses problemas são considerados como a maior causa de morte de pessoas,
inclusive com maior número de óbitos que aqueles causados pelos diferentes
tipos de câncer (Sattari & Lowenthal 2011).
Nos dias de hoje, a heparina é o principal polissacarídeo usado como droga
anticoagulante,
usada
na
prevenção
e
no
tratamento
das
desordens
hemostáticas. Sua atividade anticoagulante é atribuída ao seu complexo padrão
de grupamentos sulfato (Bournin & Lindahl 1993).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
131
Apesar das terapias pela heparina e seus derivados de baixo peso molecular
apresentar muitos benefícios, possuem muitas limitações clínicas, incluindo
eficácia insatisfatória, risco significativo de efeitos colaterais como hemorragias,
plaquetopenia e osteoporose, risco de resistência ou intolerância, além da
necessidade de constante de monitoramento e da administração via parenteral.
Outro problema, comum a todas as moléculas de origem animal, as quais são
extraídas de pulmões e intestino de bovinos e suínos, é o alto risco de
transmissão de doenças relacionadas a príons (Agnelli 2005; Nutesco et al. 2005).
Uma vez que as terapias atualmente disponíveis se apresentam insuficientemente
eficazes
e
seguras
no
controle
efetivo
dos
distúrbios
vasculares,
o
desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos se torna relevante (Nutesco et
al. 2005).
Atualmente, os produtos naturais bioativos são catalogados como bons
candidatos para tais fins (Usami 2009; Güven et al. 2010; Costello et al. 2010) e
das algas marinhas têm sido isolados um grande número de polissacarídeos
sulfatados com atividade antitrombótica (Melo et al. 2004; Mourão 2004; De
Azebedo et al. 2008; Melo & Mourão 2008)
Dentre as algas pardas, os extratos de Canistrocarpus cervicornis,
Stypopodium zonale e Dictyota pfaffii foram capazes de inibir a atividade
coagulante e a hemólise, ambos provocados pelo veneno da lagarta Lonomia
obliqua em ensaios in vitro (Domingos et al. 2009).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
132
Buscando contribuir na área da bioprospecção, o presente capítulo visa
avaliar com ensaios biológicos in vitro, o efeito de diferentes extratos orgânicos de
duas populações de D. menstrualis (Praia Rasa, Búzios e Arquipélago São Pedro
e São Paulo) e de D. ciliolata (Ilha Grande, Angra dos Reis) sobre a agregação
plaquetária e a coagulação sanguínea.
Para tal, temos como objetivos específicos:

A realização de uma triagem com os diferentes extratos das algas na
capacidade de inibir a agregação plaquetária e a coagulação sanguínea.

A identificação dos extratos mais ativos como antiplaquetários e
anticoagulantes.
.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
133
6.2. MATERIAL E MÉTODOS
Este capítulo foi realizado em cooperação com Laura de Andrade Moura
durante seu mestrado em Biologia Marinha, sendo a parte experimental realizada
no Laboratório de Venenos e Toxinas e Avaliacao de Inibidores (LAVENOTOX),
sob a coordenação do Dr. André Lopes Fuly, do Departamento de Biologia Celular
e Moleuclar, do nosso Instituto de Biologia.
6.2.1. Coleta do material algáceo e obtenção dos extratos
Amostras da alga marinha parda Dictyota menstrualis foram coletados no
Arquipélago de São Pedro e São Paulo, em abril de 2008, a profundidades entre 5
e 15 metros mediante mergulho autônomo. Outras amostras de D. menstrualis
foram coletados a uma profundidade de aproximadamente 2 metros, mediante
mergulho livre, na Praia do Forno e na Praia Rasa, Armação de Búzios – RJ, no
mês de julho de 2008.
Amostras da alga marinha parda Dictyota ciliolata foram coletados na Praia
Vermelha, Ilha Grande – RJ, em novembro de 2008, a profundidades entre 1 e 4
metros, mediante mergulho livre.
As exsicatas das algas utilizadas no presente estudo estão depositadas no
Herbário da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (HBRJ).
O material procedente das diferentes áreas de coleta foi separado de epífitas
e fauna acompanhante, e seco a temperatura ambiente em laboratório. Após a
secagem, o material biológico foi pesado em balança analítica e submetido à
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
134
extração exaustiva com os solventes hexano e acetato de etila, de modo
seqüencial, durante três semanas em solvente. As amostras de D. menstrualis
coletados na Praia Rasa foram extraídas em diclorometano. Após filtração e
evaporação do solvente, os extratos foram armazenados sob refrigeração.
Posteriormente, os diferentes extratos das algas marinhas pardas foram
dissolvidos em DMSO para a realização dos ensaios biológicos. O material foi
mantido armazenado a 4ºC e sob o abrigo da luz durante a realização do trabalho.
Os extratos das algas marinhas pardas avaliadas neste trabalho estão
relacionados na Tabela 14 de acordo com a espécie, o solvente utilizado no
preparo do extrato, o local da coleta da alga e o código utilizado na descrição dos
resultados.
Tabela 17. Relação das espécies estudadas, tipo de solvente utilizado para extração,
local de coleta das algas pardas e sua respectiva codificação.
Espécie
Solvente
Dictyota
menstrualis
Hexano
Dictyota
menstrualis
Hexano
Dictyota
menstrualis
Acetato de
Etila
Dictyota
menstrualis
Acetato de
Etila
Dictyota
menstrualis
Diclorometano
Dictyota
ciliolata
Hexano
Dictyota
ciliolata
Acetato de
Etila
Local da coleta
(Praia do Forno)
Armação de Búzios – RJ
22o45’S e 41o52’O
Arquipélago de São Pedro e
São Paulo – RN
00o55’N e 29o21’O
(Praia do Forno)
Armação de Búzios – RJ
22o45’S e 41o52’O
Arquipélago de São Pedro e
São Paulo – RN
00o55’N e 29o21’O
(Praia Rasa)
Armação de Búzios – RJ
22º45’S e 41º52’O
(Praia Vermelha, Ilha
Grande) Angra dos Reis – RJ
23o00’S e 44o19’O
(Praia Vermelha, Ilha
Grande) Angra dos Reis – RJ
23o00’S e 44o19’O
Código
Dm-H-PF
Dm-H-SP
Dm-AC-PF
Dm-AC-SP
Dm-DC
Dc-H
Dc-AC
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
135
6.2.2. Ensaios em plaquetas
A agregação plaquetária foi realizada em um Agregômetro Plaquetário (modelo
490 2D - Chrono-log Corporation), com a utilização do software AggroLink, e
monitorada turbidimetricamente de acordo com a metodologia de Carlini et al.
(1985) e Fuly et al. (1997;2002), com algumas modificações.
O sangue de doadores sadios foi coletado através de punção venosa
utilizando-se como anticoagulante citrato de sódio 3,8% p/v (1:9, citrato:sangue).
Em seguida, o sangue foi centrifugado a 1.800 rpm por 12 minutos à temperatura
ambiente para obtenção do Plasma Rico em Plaquetas (PRP). O Plasma Pobre
em Plaquetas (PPP) foi obtido através da centrifugação do sangue restante a
2.500 rpm por 12 minutos. Os doadores declararam não estar fazendo uso de
nenhum medicamento que poderia alterar os resultados obtidos nos ensaios
biológicos realizados.
Para a obtenção de plaquetas lavadas (WP – “Washed Platelets”), o sangue foi
coletado em 5 mM EDTA (concentração final) e centrifugado a 1.800 rpm por 12
minutos. O PRP obtido foi novamente centrifugado a 3.500 rpm por 15 minutos e
o “pellet” de plaquetas formado (precipitado) foi ressuspenso em tampão Tyrode
(0,137 M NaCl, 2 mM KCl, 11 mM NaHCO3, 0,4 mM NaH2PO4, 5,5 mM glicose,
0,35 % p/v albumina bovina), pH 6,5 acrescido de 0,1 mM EGTA e 1 mM MgCl2. O
mesmo procedimento foi realizado para “lavar” as plaquetas por mais duas vezes
com o mesmo tampão, até que o “pellet” final fora ressuspenso em um volume de
Tyrode (sem EGTA e MgCl2), pH 7,5 equivalente a 75 % do volume de PPP obtido
na primeira centrifugação. Assim, as plaquetas lavadas (WP) foram obtidas em
uma concentração aproximada de 3-4 X 105 plaquetas/mL. Tanto o PRP como o
WP foram mantidos em tubos plásticos a temperatura ambiente até a realização
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
136
das experiências.
Os ensaios foram realizados utilizando-se 300 µL de PRP ou WP (acrescido
de CaCl2 2 mM, concentração final) mantidos a 37ºC por 2 minutos em cubetas de
vidro siliconizadas sob agitação constante. Em seguida, a agregação plaquetária
foi iniciada pela adição de agonistas fisiológicos, como o colágeno (16 µg/mL ou
24 µg/mL, concentração final), ADP (15 µM, concentração final) ou trombina (10
nM, concentração final).
100% de agregação plaquetária foi obtida como a resposta plaquetária a
concentração supra-máxima do agonista após 6 minutos de reação e 0 % de
agregação plaquetária foi obtida pela transmitância causada pelo PRP ou WP
sozinho.
Para avaliar o efeito das algas sobre a agregação plaquetária, os extratos
foram pré-incubados com PRP ou WP por 2 minutos a 37ºC, sob constante
agitação. Em seguida, o agonista foi adicionado e a agregação plaquetária
monitorada. Controles foram realizados na qual, ao invés dos extratos, salina ou
DMSO foi adicionado às plaquetas e o mesmo procedimento realizado como
descrito anteriormente.
6.2.3. Ensaios na coagulação
Os ensaios sobre a coagulação sanguínea foram realizados em um
Coagulômetro Multicanal (Amelung, modelo KC4A micro) e em um Leitor de
Microplacas (Molecular Devices, modelo VersaMax Tunable), com o software
SoftMax Pro 5.
O “pool” de plasma humano utilizado nos ensaios foi obtido de doadores
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
137
voluntários sadios – no mínimo três doadores diferentes para cada “pool”
utilizado. O sangue foi coletado por punção venosa e em seguida foi adicionado
citrato 3,8% p/v (1:9, citrato:sangue) e centrifugado a 2200 rpm por 10 minutos à
temperatura ambiente para posterior retirada do plasma. Os doadores declararam
não estar utilizando medicamentos que pudessem interferir nos resultados dos
ensaios biológicos realizados.
6.2.4. Ensaio de recalcificação do plasma
200 µL de plasma diluídos 1:2 em salina foram incubados a 37ºC por 10
minutos e em seguida CaCl2 (12,5 mM, concentração final) foi adicionado ao meio
reacional e o tempo de coagulação monitorado no coagulômetro.
O efeito das algas sobre o tempo de recalcificação do plasma foi avaliado
através da pré-incubação dos extratos com o plasma por 10 minutos a 37ºC. Em
seguida, CaCl2 foi adicionado e o tempo de coagulação registrado foi comparado
com àquele obtido na ausência dos extratos. Em paralelo, salina ou DMSO foi
pré-incubado com o plasma, e similarmente CaCl2 fora adicionado para iniciar a
reação.
6.2.5. Ensaio de Tempo de Protrombina (TP)
Neste ensaio foi utilizado o kit Soluplastin (Wiener Lab) seguindo-se as
instruções do fabricante. 50 µL de “pool” de plasma diluídos 1:2 em salina foram
incubados à 37oC por 5 minutos e, em seguida, a reação foi iniciada pela adição
de 100 µL da tromboplastina cálcica (previamente aquecida à 37oC). O tempo de
coagulação, em segundos, foi observado no coagulômetro e comparado com
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
138
àquele obtido na presença dos extratos das algas.
6.2.6. Ensaio de Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA)
Neste ensaio foi utilizado o kit APTTest ellágico (Wiener Lab) seguindo-se as
instruções do fabricante. 100 µL de “pool” de plasma foram pré-incubados por 5
minutos a 37ºC juntamente com 100 µL da cefalina ativada fornecida no kit, na
ausência ou presença dos extratos. A reação foi iniciada pela adição de 100 µL de
cloreto de cálcio (CaCl2, 25 mM concentração final, previamente aquecido a 37 oC)
e o tempo de coagulação monitorado. Similarmente, DMSO ou salina foi
adicionado ao meio reacional, como controle, ao invés dos extratos de algas.
6.2.7. Fibrinocoagulação
200 µL de uma solução de fibrinogênio (2 mg/mL, concentração final) foram
pré-incubados com os extratos de algas durante 10 minutos à 37 oC. Em seguida,
trombina (10 nM, concentração final) foi adicionada ao meio reacional para iniciar
a coagulação. O tempo para a formação da rede de fibrina foi monitorado em um
coagulômetro, em segundos, e comparado com àquele obtido na ausência dos
extratos, na qual DMSO ou salina foi pré-incubado com o fibrinogênio.
6.2.8. Ensaio sobre substratos cromogênicos
Os substratos cromogênicos S-2238 (H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl) e S-2302
(H-D-Pro-Phe-Arg-pNA·2HCl) da Chromogenix foram utilizados para determinar o
efeito dos extratos das algas sobre a atividade catalítica da trombina. Os extratos
foram pré-incubados com trombina (0,05 – 0,1 mM, concentração final) por 10
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
139
minutos a 37ºC, e em seguida a reação foi iniciada através da adição dos
substratos cromogênicos (0,1 mM, concentração final) em um volume final de 100
µL. A cinética da atividade enzimática da trombina sobre cada substrato foi
monitorada em um leitor de microplacas em A405 nm durante 20 minutos a 37ºC.
Como controle, a trombina foi pré-incubada com DMSO ou salina, e os substratos
cromogênicos foram adicionados em seguida.
6.2.8. Análise estatística
Os resultados foram expressos em média ± erro padrão da média (SEM) de
um número indicado de experiências realizadas. Os resultados obtidos foram
analisados através do teste t de Student, utilizando-se o programa Microcal
Origin. Valores de p<0,05 foram considerados significativos.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
140
6.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.3.1. Efeitos dos extratos sobre a agregação plaquetária
O efeito dos extratos de algas sobre a agregação plaquetária em PRP
induzida por colágeno e ADP foi investigado (Figura 50). Como observado, a
maioria dos extratos de algas não foi capaz de inibir a agregação induzida pelo
colágeno ou ADP em PRP. Entretanto, o extrato hexânico da alga D. ciliolata (DcH) inibiu a agregação plaquetária induzida pelo ADP em cerca de 20%, mas não
pelo colágeno.
Os extratos de algas sozinhos não induziram a agregação plaquetária em PRP
e nem interferiram na mudança de forma das plaquetas (dados não mostrados). O
DMSO solvente dos extratos utilizado durante as experiências, na concentração
utilizada (1% v/v, concentração final) não induziu a agregação plaquetária e não
interferiu na agregação induzida pelo colágeno e pelo ADP (dados não
mostrados).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
141
Figura 50. Efeito dos extratos de algas sobre a agregação plaquetária em Plasma Rico
em Plaquetas (PRP).
Alíquotas dos extratos de algas (50 µg/mL) ou DMSO (1% v/v, concentração final) foram
pré-incubadas por 2 minutos a 37ºC com 300 µL de PRP. Em seguida, 16 µg/mL de
colágeno (A) ou 15 µM de ADP (B) foram adicionados para iniciar a agregação
plaquetária. 100% de agregação plaquetária foi definido como a altura, em milímetros, da
agregação na presença do DMSO após 6 minutos da adição dos agonistas. Os
resultados expressam a média de três experiências individuais (n = 2) ± SEM.
(*) Diferença significativa (p<0,05) em relação à agregação plaquetária obtida no controle
com DMSO (primeira coluna).
A figura 51 mostra os registros típicos (traçados) da agregação plaquetária
induzida por trombina e colágeno (Figura 51A). O extrato hexânico da alga D.
ciliolata (DcH) inibiu cerca de 85 % a agregação plaquetária induzida por trombina
(Figura 51B), e o DMSO não interferiu na agregação plaquetária induzida por
ambos agonistas (dados não mostrados).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
142
A
B
Figura 51. Registros típicos da agregação plaquetária em plaquetas lavadas (WP)
A: Registro típico da agregação plaquetária induzida por 24 µg/mL colágeno (registro
preto) e por 10 nM trombina (registro azul).
B: 300 µL de WP foram pré-incubados a 37ºC sob agitação constante por 2 minutos na
presença do extrato da alga D. ciliolata (Dc-H 50 µg/mL, registro azul) ou DMSO, registro
preto. Em seguida, trombina (10 nM) foi adicionada para iniciar a agregação plaquetária e
o processo monitorado até 6 minutos. As setas indicam a adição dos agonistas.
A Figura 52 mostra o efeito dos extratos das algas sobre a agregação
plaquetária em WP. Podemos observar que os extratos hexânicos de Búzios e os
diclorometânicos de D. menstrualis (DmHPF e DmDc, respectivamente), além do
extrato hexânico de D. ciliolata (DcH), inibiram a agregação plaquetária induzida
pela trombina e pelo colágeno, enquanto o extrato em acetato de etila de D.
ciliolata (DcAC) inibiu apenas a agregação induzida pelo colágeno.
.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
143
B
A
Colágeno
Trombina
100
*
*
80
*
Agregação Plaquetária (%)
60
40
*
20
*
80
*
60
*
40
20
Dc
H
Dc
AC
AC
H
Dc
Dc
S
Dm O
HP
Dm F
H
Dm SP
AC
PF
Dm
DC
DM
S
Dm O
HP
Dm F
H
Dm SP
AC
PF
Dm
DC
0
0
DM
Agregação Plaquetária (%)
100
Figura 52. Efeitos dos extratos das algas sobre a agregação plaquetária em Plaquetas
lavadas (WP).
Alíquotas dos extratos de algas (50 µg/mL) ou DMSO (1% v/v, concentração final) foram
pré-incubadas por 2 minutos com 300 µL de WP. Em seguida, 10 nM de trombina (A) ou
24 µg/mL de colágeno (B) foram adicionados para iniciar a agregação plaquetária. 100%
de agregação plaquetária foi definido como a altura, em milímetros, obtida pela curva de
agregação do WP na presença do DMSO após 6 minutos de agregação. Os resultados
expressam a média de três experiências individuais (n = 2) ± SEM.
(*) Diferença significativa (p<0,05) em relação à agregação plaquetária obtida no controle
com DMSO (primeira coluna).
Os dados de agregação plaquetária em PRP e WP dos diferentes extratos de
D. menstrualis e D. ciliolata mostrado nos gráficos anteriores foram expressos em
perfil inibitório relacionados na Tabela 18.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
144
Tabela 18. Perfil inibitório dos extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata sobre a
agregação plaquetária.
Amostra
Inibição em PRP (%)
Inibição em WP (%)
Colágeno
ADP
Trombina
Colágeno
Dm-H-PF
9,0
6,0
29
13,4
Dm-H-SP
4,4
14,5
0,0
5,4
Dm-AC-PF
9,5
0,8
3,0
15,4
Dm-AC-SP
11,8
15,8
n.d.
n.d.
Dm-DC
10,2
18,3
26,7
13,7
Dc-H
2,6
24,5
84,5
63,0
Dc-AC
2,7
11,5
13,4
29,0
6.3.2. Efeito dos extratos sobre a coagulação sanguínea
Para avaliar o efeito dos extratos das algas sobre a coagulação sanguínea e
determinar quais seriam os possíveis mecanismos de ação foram realizados
quatro diferentes ensaios biológicos utilizando-se um coagulômetro digital: 1)
Recalcificação do plasma, 2) TP, 3) TTPA e 4) Fibrinocoagulação (Tabela 19).
Como pode ser observado na Tabela 16, nenhum dos extratos de D.
menstrualis ou D. ciliolata foi capaz de prolongar o tempo de recalcificação do
plasma, porém, todos prolongaram o tempo de coagulação do fibrinogênio
induzida por trombina em cerca de 2 a 2,5 vezes. Além disto, o extrato em acetato
de etila de D. ciliolata (Dc-AC) também retardou o tempo de protrombina e o
tempo de tromboplastina parcial ativada, enquanto o extrato em acetato de etila
de D. menstrualis de Búzios (Dm-AC-PF) prolongou apenas o tempo de
protrombina.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
145
Tabela 19. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata sobre o
tempo de coagulação.
1) Recalcificação do plasma: As amostras de algas (50 µg/mL) ou o DMSO (1% v/v)
foram pré-incubados com 200 µL de plasma por 10 minutos a 37ºC antes da adição de
CaCl2 (12,5 mM).
2) Tempo de Protrombina (TP): Cada amostra de alga (100 µg/mL) ou o DMSO (2%
v/v) foram pré-incubados por 5 minutos a 37ºC com 50 µL de plasma e em seguida 100
µL de tromboplastina cálcica foi adicionada.
3) Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA): As amostras de algas (100
µL/mL) ou o DMSO (2% v/v) foram pré-incubadas com 100 µL de plasma e 100 µL de
cefalina por 5 minutos a 37ºC e em seguida CaCl2 (8,3 mM) foi adicionado.
4) Fibrinocoagulação: Cada amostra de alga (100 µg/mL) ou o DMSO (2% v/v) foi préincubado por 10 minutos a 37ºC com 200 µL de fibrinogênio (2 mg/mL) antes da adição
de trombina (10 nM). Os resultados expressam a média de duas experiências individuais
(n = 4) ± SEM.
Os resultados estão expressos em segundos.
(*) Diferença significativa (p<0,05) em relação ao tempo de coagulação obtido no controle
com DMSO.
Amostra
Recalcificação
TP
TTPA
Fibrinogênio
Salina
122,8 ± 16,2
21,7 ± 0,3
32,1 ± 1,2
26,4 ± 0,5
DMSO
149,7 ± 3,9
25,6 ± 0,2
38,8 ± 0,8
34,1 ± 1,4
Dm-H-PF
158,3 ± 11,0
24,5 ± 0,2
38,7 ± 2,0
46,8 ± 1,3 *
Dm-H-SP
156,0 ± 8,8
25,1 ± 0,4
39,3 ± 1,3
47,3 ± 1,6 *
Dm-AC-PF
172,3 ± 13,8
27,2 ± 0,6 *
40,5 ± 1,1
86,4 ± 2,6 *
Dm-AC-SP
155,6 ± 3,2
24,7 ± 1,0
39,0 ± 0,7
65,3 ± 3,5 *
Dm-DC
171,6 ± 14,7
23,3 ± 0,2
40,2 ± 0,5
66,7 ± 0,8 *
Dc-H
177,4 ± 13,6
27,3 ± 0,2
38,7 ± 2,4
42,7 ± 0,9 *
Dc-AC
166,0 ± 4,0
28,9 ± 0,2 *
46,0 ± 2,5 *
78,4 ± 11,0 *
6.3.3. Efeitos dos extratos sobre substratos cromogênicos
Além da atividade biológica da trombina em clivar o fibrinogênio, observada no
ensaio de tempo de coagulação do fibrinogênio (fibrinocoagulação), sua atividade
catalítica pode ser mensurada através da utilização de substratos cromogênicos.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
146
Neste trabalho, foram utilizados os substratos S-2238 e S-2302, que são
específicos para a trombina e para os fatores XIa e XIIa da coagulação,
respectivamente.
A hidrólise dos substratos cromogênicos leva a liberação de p-nitroanilina
(pNA), gerando uma mudança de cor no meio reacional. Isto promove uma
absorção em A 405nm diretamente proporcional a atividade enzimática da
trombina ou outra enzima do sistema de coagulação.
A Figura 53 ilustra o efeito dos diferentes extratos das algas sobre a cinética
de clivagem dos substratos S-2238 e S-2302 pela trombina. Como observado, a
trombina é capaz de hidrolisar ambos os substratos de maneira tempodependente, sendo que a partir de cerca de 100 segundos a velocidade da reação
sobre o S-2238 é zero (V0). Diferentemente, a hidrólise do S-2302 pela trombina
aumenta linearmente com o tempo de reação. Os extratos de D. menstrualis e D.
ciliolata não foram capazes de hidrolisar os substratos avaliados, bem como o
DMSO não interferiu na atividade enzimática da trombina (dados não mostrados).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
147
A
S-2238
0,32
Salina
DMSO
DmHPF
DmHSP
DmACPF
DmACSP
DmDC
DcH
DcAC
0,28
A405
0,24
0,20
0,16
0,12
0,08
0,04
0
50
100
150
200
250
300
Tempo (s)
B
S-2302
0,8
Salina
DMSO
Dm-H-PF
Dm-H-SP
Dm-AC-PF
Dm-AC-SP
Dm-DC
Dc-H
Dc-AC
0,7
0,6
A405
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0
200
400
600
800 1000 1200
Tempo (s)
Figura 53. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata sobre a
cinética da hidrólise dos substratos cromogênicos.
Os extratos de algas (100 µg/mL) ou o DMSO (2% v/v) foram pré-incubados com
trombina (0,05 - 0,1 mM) por 10 minutos a 37ºC e em seguida 0,1 mM dos substratos S2238 (A) e S-2302 (B) foram adicionados para iniciar a reação. A cinética da reação foi
monitorada em A 405 nm a 37ºC por 300 - 1200 segundos. Os resultados expressam a
média de duas experiências individuais (n = 2).
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
148
A leitura de 0,2 em A405 nm obtida durante a hidrólise do S-2238 e do S-2302
aos 30 segundos e 300 segundos de reação, respectivamente, foi designada de
concentração efetiva (CE) e considerada como 100 % da atividade enzimática da
trombina. A potência do efeito inibitório do extrato das algas sobre a hidrólise do
S-2238 e do S-2302 pela trombina foi avaliada neste parâmetro. (Figura 54).
A
B
S-2238
S-2302
100
100
*
80
*
40
20
0
*
80
*
*
*
60
*
*
40
20
*
DM
Dm SO
-H
Dm PF
-H
Dm -SP
-A
C
Dm -PF
-A
CSP
Dm
-D
C
Dc
-H
Dc
-A
C
0
DM
Dm SO
-H
Dm PF
-H
Dm -SP
-A
C
Dm -PF
-A
CSP
Dm
-D
C
Dc
-H
Dc
-A
C
60
Atividade da Trombina (%)
Atividade da Trombina (%)
*
Figura 54. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata sobre a
atividade catalítica da trombina sobre os substratos cromogênicos.
Os extratos de algas (100 µg/mL) ou o DMSO (2% v/v) foram pré-incubados com
trombina (0,05 – 0,1 mM) por 10 minutos, a 37ºC. Em seguida, 0,1 mM dos substratos S2238 (A) e S-2302 (B) foram adicionados para iniciar a reação. O total (100%) da
atividade enzimática foi definido para a leitura, em A405 nm, obtida pela atividade da
trombina na presença do DMSO, aos 30 segundos da reação para o S-2238 (A) e aos
300 segundos para o S-2302 (B). Os resultados expressam a média de duas
experiências individuais (n = 2) ± SEM.
(*) Diferença significativa (p<0,05) em relação à leitura obtida no controle com DMSO.
Como pode ser observado, apenas os extratos em acetato de etila (Búzios) e
em diclorometano da alga D. menstrualis (Dm-AC-PF e Dm-DC, respectivamente)
foram capazes de inibir a atividade da trombina sobre o substrato específico S-
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
149
2238, em cerca de 60% e 20%, respectivamente. Enquanto isto, todos os extratos
de algas, com exceção daquele em diclorometano de D. menstrualis (Dm-DC),
inibiram também a atividade da trombina sobre o substrato S-2302, em perfis de
inibição entre 15% e 85%.
O perfil inibitório dos extratos das algas sobre a hidrólise dos substratos
cromogênicos pela trombina, mostrada nas figuras anteriores, está relacionado na
Tabela 20.
Tabela 20. Perfil inibitório dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata
sobre a hidrólise dos substratos cromogênicos.
Amostra
Dm-H-PF
Dm-H-SP
Dm-AC-PF
Dm-AC-SP
Dm-DC
Dc-H
Dc-AC
Inibição da hidrólise do substrato (%)
S-2238
S-2302
11,5
39,5
19,0
12,5
57,0
84,5
5,5
49,5
19,5
15,0
6,5
26,5
6,5
39,5
Vários compostos, de origem natural ou sintética, são utilizados atualmente
para prevenir e tratar a trombose. Mas, estas terapias podem induzir diversos
efeitos colaterais nos pacientes. Por esta razão, existe uma intensa busca por
novos compostos que apresentem um efeito anticoagulante e antiplaquetário
satisfatório, porém que sejam clinicamente seguros (Nutesco et al. 2005).
Moléculas bioativas de origem natural são fortes candidatas.
A nossa avaliação dos diferentes extratos orgânicos de D. menstrualis e D.
ciliolata e seus efeitos sobre a agregação plaquetária e coagulação sanguínea
através de ensaios in vitro, resumidos na Tabela 21, apresenta em termos gerais
que não exibiram efeito inibitório sobre a agregação plaquetária induzida pelo
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
150
colágeno. Contudo, o extrato hexânico da alga D. ciliolata (Dc-H) causou uma
pequena inibição, de cerca de 20 %, na agregação plaquetária induzida pelo ADP.
Estes dois agonistas fisiológicos agem nas plaquetas por mecanismos distintos: o
colágeno atua se ligando diretamente aos receptores na superfície da plaqueta,
mas o ADP depende de fatores plasmáticos, como o fibrinogênio, para então
induzir a agregação plaquetária.
Tabela 21. Efeito dos diferentes extratos de Dictyota menstrualis e D. ciliolata nos
ensaios biológicos.
Inibição, em porcentagem, causada pelos extratos de algas sobre os ensaios de
agregação plaquetária induzida por agonistas e sobre os ensaios de hidrólise dos
substratos cromogênicos pela trombina. Aumento no tempo de coagulação, em vezes,
causado pelos extratos de algas sobre os ensaios de coagulação sanguínea nos
diferentes métodos.
Ensaios Biológicos
% Inibição
Aumento em vezes
Amostras
PRP
% Inibição
WP
Recal
TP
TTPA
Fib
S-2238
S-2302
1,3
-
39,5
-
-
-
-
1,4
-
12,5
-
-
-
1,1
-
2,5
57,0
84,5
-
n.d.
n.d.
-
-
-
1,9
-
49,5
-
-
26,7 13,7
-
-
-
1,9
19,5
-
Dc-H
-
24,5
84,5 63,0
-
-
-
1,2
-
26,5
Dc-AC
-
-
-
1,1
1,2
2,3
-
39,5
-
Dm-H-SP
-
-
-
Dm-AC-PF
-
-
Dm-AC-SP
-
Dm-DC
Trb
-
Col
-
ADP
-
Col
-
Dm-H-PF
29,0 13,4
-
29,0
n.d. Não determinado
- Não inibiu / Não aumentou
Col: colágeno; Trb: trombina; Recal: recalcificação do plasma; Fib: fibrinocoagulação.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
151
Em ensaios com plaquetas lavadas, onde as interações com componentes
plasmáticos são removidas, curiosamente alguns extratos inibiram a agregação
plaquetária induzida tanto pelo colágeno como pela trombina. Isto sugere que
alguma substância presente no plasma sanguíneo pode estar interferindo na
interação dos extratos com as plaquetas, impedindo assim a inibição da
agregação plaquetária.Os extratos das algas em hexano (Búzios) e em
diclorometano de D. menstrualis (DmHPF e DmDC, respectivamente) e os
extratos em hexano e em acetato de etila de D.ciliolata (DcH e DcAC,
respectivamente) inibiram a agregação plaquetária induzida pelo colágeno. D.
menstrualis em hexano de Búzios e em diclorometano (DmHPF e DmDc,
respectivamente) e D. ciliolata em hexano (DcH) inibiram também a agregação
plaquetária induzida pela trombina. Por outro lado nenhum dos extratos de algas
avaliados foi capaz de prolongar o tempo de recalcificação do plasma.
Além disto, todos os extratos das algas prolongaram o tempo de coagulação
do fibrinogênio induzida pela trombina (fibrinocoagulação). Estes resultados
sugerem que os extratos foram capazes de inibir a atividade da trombina,
impedindo esta enzima de expressar seu efeito biológico de converter o
fibrinogênio em fibrina, não levando assim a formação do coágulo. Por outro lado,
não se deve descartar a possibilidade de ligação de moléculas dos extratos com o
fibrinogênio.
Alguns extratos ainda inibiram a atividade catalítica da trombina, analisada
através da hidrólise de substratos cromogênicos. Os extratos em diclorometano e
acetato de etila (Búzios) da alga D. menstrualis (Dm-DC e Dm-AC-PF,
respectivamente) inibiram os efeitos da trombina sobre o S-2238, um substrato
específico da enzima trombina. Todos os extratos das algas, com exceção de D.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
152
menstrualis em diclorometano (Dm-Dc), causaram diferentes graus de inibição
sobre a ação da trombina sobre S-2302, um substrato específico para calicreína
plasmática e os fatores XI e XII do sistema da coagulação, ambos ativados
fisiologicamente pela trombina.
De acordo com os resultados obtidos, podemos inferir que o local da coleta e o
tipo do solvente utilizado no preparo dos extratos das algas influenciaram no perfil
inibitório nos ensaios biológicos realizados para cada amostra de uma mesma
espécie. Isto se deve principalmente a variações da quantidade de determinados
constituintes químicos segundo o local de coleta, além das variações químicas da
extração com solventes de diferentes polaridades. No caso das amostras de D.
menstrualis coletadas em Búzios e no Arquipélago de São Pedro e São Paulo foi
observado que elas possuem um padrão qualitativo semelhante, ambos com
abundância de diterpenos derivados de guaianos prenilados (tipo I) e xenianos
(tipo III). Entretanto, houve uma variação quantitativa em relação aos diterpenos
majoritários encontrados em cada uma destas duas populações (Ortiz-Ramírez et
al. 2008).
Alguns extratos obtiveram resultados expressivos em relação à inibição da
coagulação sanguínea, mas não apresentaram resultados expressivos em relação
à agregação plaquetária. Neste caso, uma substância que apresente atividade
anticoagulante, porém sem efeito em plaquetas pode ser interessante do ponto de
vista clínico, pois reduziria o risco de ocasionar hemorragias e/ou sangramentos
espontâneos como efeitos colaterais. A hemorragia é um dos principais
problemas relacionados aos atuais fármacos antitrombóticos, uma vez que seu
efeito antiplaquetário e anticoagulante é tão forte, levando a um estado de
incoagulabilidade sanguínea.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
153
De forma semelhante, um glicosaminoglicano isolado do pepino-do-mar
Ludwigothurea grisea e seu derivado carboxi-reduzido apresentaram efeitos
antitrombóticos in vivo, aparentemente não relacionados aos seus efeitos sobre a
agregação plaquetária. Ambos mostraram forte atividade anticoagulante devido a
inibição da trombina na presença do co-fator II da heparina. Entretanto, o efeito
antitrombótico obtido nos modelos experimentais foi diferente para os dois
compostos. O glicosaminoglicano nativo inibiu a trombose em desvio arteriovenoso em baixas concentrações e no modelo de trombose venosa, o efeito
antitrombótico do glicosainoglicano exigiu doses maiores. Por outro lado, o
derivado carboxi-reduzido impediu a trombose em desvio arterio-venoso, mas não
o fez no modelo de trombose venosa. Na verdade, observou-se que era possível
dissociar os efeitos anticoagulante, hemorrágico e antitrombótico destes
compostos. Foi mostrado também que os polissacarídeos podem inibir de forma
diferente cada tipo de episódio de trombose e que isto pode estar relacionado à
aderência do composto na parede dos vasos sanguíneos (Zancan & Mourão
2004).
Sobre a biotecnologia para a obtenção de um produto medicamentoso é
necessário entender que o desenvolvimento de fármacos de origem marinha, no
entanto, tem encontrado alguns obstáculos, principalmente no que diz respeito à
produção em larga escala. O cultivo de determinados macro-organismos
marinhos apresenta muitas dificuldades, seja por motivos técnicos e logísticos ou
pela própria biologia do organismo, e a coleta destes organismos em seu
ambiente natural se tornaria insustentável, podendo levar a espécie à extinção
(Sennett 2001; Faulkner 2002).
O presente trabalho representa apenas um pequeno aporte ao que deve ser
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 6
154
feito no extenso caminho no desenvolvimento de um novo fármaco.
6.4. CONCLUSÃO
Os resultados mostram que a maioria dos extratos avaliados é capaz de inibir
a agregação plaquetária induzida por agonistas fisiológicos e a hidrólise de
substratos cromogênicos provocada pela trombina, além de prolongar o tempo de
coagulação nos diferentes métodos de coagulação realizados. Entretanto, os
extratos apresentam potências diferentes.
A espécie, o local da coleta e o tipo de solvente usado na extração
influenciam no perfil inibitório apresentado por cada extrato avaliado, sendo que a
amostra da alga D. menstrualis, coletada em Búzios e extraída em acetato de etila
(Dm-Ac-PF) é a mais eficiente como anticoagulante, enquanto o extrato em
hexano da D. menstrualis coletada em Búzios, é o mais expressivo como
antiplaquetário.
Pode-se concluir que as espécies da Tribo Dictyotae avaliados neste trabalho
possuem moléculas orgânicas com atividade anticoagulante e antiplaquetária.
Estes produtos naturais marinhos representam então uma grande fonte de
substâncias
com
potencial
biotecnológico
desenvolvimento de novas drogas antitrombóticas.
como
protótipos
para
o
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 7
155
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
No desenvolvimento desta tese de doutoramento foram abordados diferentes
temas de estudo inter-relacionados entre si sobre os diterpenos da tribo
Dictyoteae e sua importância em diferentes áreas da ciência. Assim, o uso da
técnica de cromatografia em camada delgada (CCD) um procedimento rotinário
nos laboratórios de química de produtos naturais pode ser aplicável na
diferenciação ou não de populações de algas marinhas bentônicas, baseados na
expressão e quantificacao cromática dos diterpenos mediante análises de
imagem obtidas por dispositivos digitais, foi evidenciavel que com esta técnica
rápida e de baixo custo é possível diferenciar populações de algas (Dictyota
menstrualis e D. ciliolata) enquanto à produção dos diterpenos se forem seguidos
os critérios e procedimentos apropriados, nas análises de imagens por
decomposição do canal de cores RGB a cor azul (B) é a mais apropriada para as
quantificações cromáticas dos diterpenos que revelam como bandas roxas, como
é o caso dos guaianos prenilados pachydictyol A e isopachydictyol A ao serem
revelados com sulfato sérico (ver capítulo 1).
A síntese dos diterpenos esta regulada pelas carteristicas enzimáticas dos
indivíduos e reflete condições próprias de determinado táxon, o uso dos
diterpenos como marcadores taxonômicos da tribo Dictyoteae permitiu identificar
dentre varias amostras coletadas no Caribe colombiano aquelas que pertencem
ao gênero Canistrocarpus por serem indiviuos que sintetizam exclusivamente
diterpenos do tipo dolastano e secodolastano, análises morfológicas confirmaram
a identidade taxonômica como C. cervicornis, as comparações quantitativas em
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 7
156
CG/EM mostram que as populações do Caribe (Colombia) apresentam um perfil
padrao similar às populações estudadas no Brasil e diferem somente no diterpeno
majoritário (ver capítulo 2), assim mesmo alem das caracteristicas morfológicas o
uso dos diterpenos na taxonomia forneceu maiores evidencias que suportam a
proposta de uma nova espécie do gênero Dictyota no litoral fluminense. Dictyota
sp. nov. sintetiza diterpenos ineditos na tribo Dictyoteae, sendo esta não somente
uma contribuição para os inventários da biodiversidade desta região e do Atlântico
sudeste assim como também uma contribuição ao inventário molecular dos
metabolitos secundários sintetizados pelos indivíduos da tribo Dictyoteae (ver
capítulo 3).
Em quanto à atividade biológica dos componentes lipofílicos do extrato bruto
de C. cervicornis frente aos gametas e zigotos de Lytechinus variegatus e
baseados nas evidencias encontradas é possível afirmar que possuem a
capacidade de reduzir as taxas de fecundação e induzir a geração de anomalias
nos zigotos, neste ultimo aspecto o diterpeno dolastano majoritário é um dos
responsáveis o qual também tem a capacidade de gerar lise celular (ver capítulo
4), o uso do modelo biológico com zigotos de L. variegatus como triagem para
identificar atividade antimitótica evidenciou claras diferenças dentre duas
populações de D. menstrualis (Arquipélago São Pedro e São Paulo e Búzios) a
resposta de inibição mitótica é devida as diferenças do perfil químico destas
populações, o diterpeno majoritário dichotomano da população de Búzios tem
uma alta atividade antimitótica, pois inibiu o desenvolvimento embrionário até a
clivagem IV dos zigotos em todas as concentrações testadas e a presença de
pontos claros no citoplasma dos zigotos sugere que este metabolito atua sobre a
tubulina, estas evidencias fazem deste diterpeno um bom candidato para futuras
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – CAPITULO 7
157
pesquisas como agente antitumoral (ver capítulo 5). Por outro lado os extratos de
D. menstrualis e D. ciliolata tem a capacidade de inibir a agragação plaquetária e
prolongar os tempos de coagulação com potenciais diferenciados segundo seja o
tipo de extrato e população sendo assim estas espécies e a tribo Dictyoteae pode
ser considerada uma fonte promissóra de moléculas para o tratamento das
desordens da hemostasia (ver capítulo 6).
Como consideração final cabe notar que o estudo dos diterpenos da tribo
Dictyoteae fornece informações valiosas desde o ponto de vista do entendimento
das espécies, sua dispersão, suas relações com outras espécies e por fornecer
moléculas com alto potencial biotecnológico de uso em diferentes áreas
principalmente na luta contra diferentes doenças. A diversidade biológica dos
indivíduos expressada na diversidade molecular pode ser considerada um item de
avaliação na toma de desiçòes políticas principalmente quando uma identidade
biológica pode ser a esperança na cura de alguma doença.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
158
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Abrantes JL, Barbosa JP, Cavalcanti DN, Pereira RC, Fontes CFL, Teixeira VL,
Souza TM & Paixão ICP (2010) The effects of the diterpenes isolated from the
Brazilian brown algae Dictyota pfaffii and Dictyota menstrualis against the
herpes simplex type-1 replicative cycle. Planta Medica, 76(4): 339-344.
Adobe Systems Incorporated (2010) Photoshop CS5 Extended, Guia do usuário.
Agnelli G (2005) Current issues in Anticoagulation. Pathophysiology of
Haemostasis and Thrombosis, 34(1):2-9.
Aizman O, Ulhen P, Lal M, Brismar H & Asperia A (2001) Ouabain, a steroid
hormone that signals with slow calcium oscillations. Proceedings of the
National Academy of Sciences, 98(23):13420-24.
Allford SL, Machin SJ, (2004) Haemostasis. Medicine, 32(5):11-14.
Amsler CD (2001) Induced Defenses in Macroalgae: the Herbivore Makes a
Difference. Journal of Phycology, 37(3): 353-356.
Austin SK (2009) Haemostasis. Medicine, 37(3):133-136.
Ayyad SN, Makki MS, Al-Kayal NS, Basaif SA, El-Foty KO, Asiri AM, Alarif WM, &
Badria FA (2011) Cytotoxic and protective DNA damage of three new
diterpenoids from the brown alga Dictoyota dichotoma. European journal of
medicinal chemistry, 46(1): 175-82.
Ballesteros E, Martin D & Uriz MJ (1992) Biological Activity of Extracts from Some
Mediterranean Macrophytes. Botanica Marina, 35: 481-485.
Barbosa JP, Fleury BG, Da Gama B, Teixeira VL & Pereira RC (2007) Natural
products as antifoulants in the Brazilian brown alga Dictyota pfaffii
(Phaeophyta, Dictyotales). Biochemical Systematics and Ecology, 35(8): 549553.
Barbosa JP, Pereira RC, Abrantes JL, Cirne-Santos CC, Rebello MA, Frugulhetti
ICPP & Texeira VL (2004a) In vitro antiviral diterpenes from the Brazilian
brown alga Dictyota pfaffii. Planta medica 70(9): 856-60.
Barbosa JP, Teixeira VL & Pereira RC (2004b) A dolabellane diterpene from the
brown alga Dictyota pfaffii as chemical defense against herbivores. Botanica
Marina, 47(2): 147-151.
Barbosa JP, Teixeira VL, Villaça R, Pereira RC, Abrantes JL & Frugulhetti ICPP
(2003) A dolabellane diterpene from the brazilian brown alga Dictyota pfaffii.
Biochemical systematics and ecology, 31: 1451–1454.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
159
Bianco EM, Teixeira VL & Pereira RC (2010) Chemical defenses of the tropical
marine seaweed Canistrocarpus cervicornis against herbivory by sea urchin.
Brazilian Journal Oceanography, 58: 213-218.
Bianco ÉM, Teixeira VL, Pereira RC, De Souza AMT, Nucci P, Afonso IF,
Rodrigues CR & Castro HC (2009) Brown seaweed defensive chemicals: a
structure-activity relationship approach for the marine environment. Natural
Product Communications, 4(2): 173-178.
Bianco ÉM (2008) Aspectos Químicos, Ecológicos e Evolutivos dos Produtos
Naturais da Macroalga Marinha Canistrocarpus cervicornis. Tese de
Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Química Universidade Federal
Fluminense, Niterói, 146p.
Bianco ÉM, Rogers R, Teixeira VL & Pereira RC (2008) Antifoulant diterpenes
produced by the brown seaweed Canistrocarpus cervicornis. Journal of
Applied Phycology, 21(3): 341-346.
Bittner L, Payri CE, Couloux A, Cruaud C, Reviers B & Rousseau F (2008)
Molecular phylogeny of the Dictyotales and their position within the
Phaeophyceae, based on nuclear, plastid and mitochondrial DNA sequence
data. Molecular phylogenetics and evolution, 49(1):211-226.
Blunt JW, Copp BR, Munro MHG, Northcote PT & Prinsep MR (2010) Marine
natural products. Natural Product Reports, 27:165-237.
Bolser RC & Mark EH (1996) Are Tropical Plants Better Defended? Palatability
and Defenses of Temperate vs. Tropical Seaweeds. Ecology, 77:2269-2286.
Bourin MC & Lindahl U (1993) Glycosaminoglycans and the regulation of blood
coagulation. Biochemistry, 289:313-330.
Bula-Meyer G (1994) Notas sobre Dictyota pfaffii y D. humifusa (Dictyotales,
Phaeophyta). Anales del Instituto de Investigaciones Marinas y Costeras,
Punta Betin, 23:177-181.
Carlini CR, Guimarães JÁ & Ribeiro JM (1985) Platelet release reaction and
aggregation induced by canatoxin, a convulsant protein: evidence for the
involvement of the platelet lipoxygenase pathway. Brazilian Journal of
Pharmacoly, 84:551-560.
Cavalcanti DN (2004) Caracterização química da alga parda Dictyota menstrualis
(Dictyotales, Phaeophyta) e atividade antiviral de seus diterpenos. Tese de
Doutorado. Programa de Pós-graduação em Química, Universidade Federal
do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 229p.
Cavalcanti DN, Gomes MAV, Pinto AC, Rezende CM, Pereira RC & Teixeira VL
(2008) Effects of storage and solvent type in a lipophylic chemical profile of
the seaweed Dictyota menstrualis. Brazilian Journal of Oceanography,
56(1):51-57.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
160
Cavalcanti DN, Rezende CM, Pinto AC & Teixeira VL (2006) Diterpenoid
Constituents from the Brown Alga Dictyota menstrualis (Dictyotaceae,
Phaeophyta). Natural Product Communications, 1(8):609-611.
Christen R, Schackmann RW & Shapiro BM (1982) Elevation of the intracellular
pH activates respiration and motility of sperm of the sea urchin,
Strongylocentrotus purpuratus. Journal of Biological Chemistry, 257:1488114890.
Cirne-Santos CC, Souza TML, Teixeira VL, Fontes CFL, Rebello MA, CastelloBranco LRR, Abreu CM, Tanuri A, Frugulhetti ICPP & Bou-Habib DC (2008)
The dolabellane diterpene Dolabelladienetriol is a typical noncompetitive
inhibitor of HIV-1 reverse transcriptase enzyme. Antiviral research, 77(1):6471.
Cirne-Santos CC, Teixeira VL, Castello-Branco LR, Frugulhetti ICPP & Bou-Habib
DC (2006) Inhibition of HIV-1 replication in human primary cells by a
dolabellane diterpene isolated from the marine algae Dictyota pfaffii. Planta
medica, 72(4):295-299.
Costa-Lotufo LV, Wilke DV & Jimenez PC (2009) Organismos marinhos como
fonte de novos fármacos: histórico e perspectivas. Quimica Nova, 32(3):703716.
Costello MJ, Coll M, Danovaro R, Halpin P, Ojaveer H & Milolasvich PA (2010) A
census of marine biodiversity knowledge, Resources, and future challengers.
PLoS One, 5:12-110.
Crews P, Klein TE, Hogue ER & Myers BL (1982) Tricyclic diterpenes from the
brown marine algae Dictyota divaricata and Dictyota linearis. The Journal of
Organic Chemistry, 47(5):811–815.
Cronin G, Lindquist NL, Hay ME & Fenical W (1995) Effects of storage and
extraction procedures on yields of lipophilic metabolites from the brown
seaweeds Dictyota ciliolata and D. menstrualis. Marine Ecology Progress
Series, 119:265–273.
Cronin G, Valerie JP, Mark EH & Fenical W (1997) Are tropical herbivores more
resistant than temperate herbivores to seaweed chemical defenses?
Diterpenoid metobolites from Dictyota acutiloba as feeding deterrents for
tropical versus temperate fishes and urchins. Journal of Chemical Ecology,
23(2):289-302.
Cserháti T & Forgács E (2001) Liquid chromatographic separation of terpenoid
pigments in foods and food products. Journal of chromatography A, 936(12):119-37.
Da Gama BAP, Carvalho AGV, Weidner K, Soares AR, Coutinho R, Fleury BG,
Teixeira VL & Pereira RC (2008) Antifouling activity of natural products from
Brazilian seaweeds. Botanica Marina, 51(3):191–201.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
161
De Azevedo TCG, Bezerra MEB, Santos MGL, Souza LA, Marques CT,
Benevides NMB & Leite EL (2008) Heparinoids algal and their anticoagulant,
hemorrhagic activities and platelet aggregation. Biomedicine and
Pharmacotherapy, 63: 477-483.
De Clerck O, Leliaert F, Verbruggen H, Lane CE, De Paula JC, Payo DA &
Coppejans E (2006) A revised classification of the Dictyoteae (Dictyotales,
Phaeophyceae) based on rbcl and 26s ribosomal DNA sequence analyses1.
Journal of Phycology, 42(6):1271–1288.
De Clerck O, De Vos P, Gillis M & Coppejans E (2001) Molecular systematics in
the genus Dictyota (Dictyotales, Phaeophyta): A first attempt based on
restriction patterns of the internal transcribed spacer 1 of the rDNA (ARDRAITS1). Systematics and Geography of Plants, 71(1):25-35.
De Clerck O & Coppejans E (1997) The genus Dictyota (Dictyotaceae,
Phaeophyta) from Indonesia in the herbarium Weber-van Bosse, including the
description of Dictyota canaliculata spec. nov. Blumea, 42:407-420.
De Paula JC, Bueno L, Frugulhetti ICPP, Yoneshigue-Valentin Y & Teixeira VL
(2007) Dictyota dolabellana sp. nov. (Dictyotaceae, Phaeophyceae) based on
morphological and chemical data. Botanica Marina, 50(5-6):288-293.
De Paula JC, Bueno LB, Cavalcanti DN, Yoneshigue-Valentin Y & Teixeira VL.
(2008) Diterpenes from the brown alga Dictyota crenulata. Molecules,
13:1238-1245.
De Paula JC, Cassano V, Yoneshigue-valentin Y & Teixeira VL (2007) Diterpenes
from the Brazilian brown alga Dictyota crispata (Dictyotaceae, Phaeophyta).
Natural Product Communications, 2(2):135-137.
De Paula JC, Pedrini ADG, Pinheiro MD, Pereira RC & Teixeira VL (2001)
Chemical similarity between the brown algae Dictyota cervicornis and D.
pardalis (Dictyotales, Phaeophyta). Biochemical systematics and ecology,
29(4): 425-427.
De Paula JC, Vallim MA & Teixeira VL (2011). What are and where are the
bioactive terpenoids metabolites from Dictyotaceae (Phaeophyceae). Revista
Brasileira de Farmacognosia, 21(2):216-228.
De Paula JC (2007) Química e Morfologia de Especies Brasileiras da Tribo
Dictyoteae (Phaeophyceae) e Avaliação dos Diterpenos como Marcadores
Taxonômicos. Tese de Doutorado. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Rio de Janeiro, 143p.
De Paula JC (2000) Uma abordagem química, sistemática e biogeográfica sobre o
gênero Dictyota Lamouroux (Dictyotales, Phaeophyta). Dissertação de
Mestrado. Universidade Federal Fluminense, Niterói, 120p.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
162
Díaz MC, Bula-Meyer G, Zea S & Martínez A (2006) Ensayos de actividad
biológica y ecologia química de extractos orgánicos de macroalgas del Caribe
colombiano. Boletín de Investigaciones Marinas y Costeras, 35:241-247.
Diaz-Pulido G & Díaz-Ruíz M (2003) Diversity of benthic marine algae of the
Colombian Atlantic. Biota Colombiana, 4(2):203-246.
Domingos TFS, Carvalho C, Moura LDA, Teixeira VL, Pereira RC, Bianco EM,
Ferreira WJ, Ramos CJ, de Miranda AL, Melo PA, Guimarães JA & Fuly AL
(2009) Antilonomic effects of Brazilian brown seaweed extracts. Natural
Product Communications, 4(8):1075-1078.
Domingos TFS, Vallim MA, Carvalho C, Sanchez EF, Teixeira VL & Fuly AL
(2011) “Anti-snake venom effect of secodolastane diterpenes isolated from
Brazilian marine brown alga Canistrocarpus cervicornis against Lachesis
muta venom.” Revista Brasileira de Farmacognosia , 21(2):234-238.
Durán R, Zubía E, Ortega MJ & Salvá J (1997) New diterpenoids from the Dictyota
dichotoma. Tetrahedron, 53(25):8675-8688.
El Gamal AA (2010) Biological importance of marine algae. Saudi Pharmaceutical
Journal, 18(1):1-25.
Esmon CT (2000) Regulation of blood coagulation. Biochemistry and Biophysics
Acta, 1477:349-360.
Faulkner DJ (2002) Marine Natural Products. Natural Product Reports, 19:1-48.
Fériel S, Pesando D, Bodennec G, El Abed A & Girard J-P (2000) Toxic effects of
Gymnodinium cf. mikimotoi unsaturated fatty acids to gametes and embryos
of the sea urchin Paracentrotus lividus. Water Research, 34(2):550-556.
Fleury BG, Pereira MVG, Da Silva JRP, Kaisin M, Teixeira VL & Kelecom A (1994)
Sterols from brazilian marine brown algae. Phytochemistry, 37(5):1447-1449.
Freitas ODS, De Oliveira AS, De-Paula JC, Pereira RC, Cavalcanti DN & Teixeira
VL (2007) Chemical variation in the diterpenes from the Brazilian brown alga
Dictyota
mertensii
(Dictyotaceae,
Phaeophyta).
Natural
Product
Communications, 2(1):13-15.
Freitas, ODS (2006) Perfil químico e ação defensiva comparativa de extratos
brutos de diferentes localidades do litoral brasileiro da alga parda marinha
Dictyota mertensii (Dictyotales, Phaeophyta). Tese de Doutorado. Programa
de Pós-graduação em Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, 229.
Fuly AL, De Miranda AL, Zingali RB & Guimarães JA (2002) Purification and
characterization of a phospholipase A2 isoenzyme isolated from Lachesis
muta snake venom. Biochemical Pharmacology, 63:1589-1597.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
163
Fuly AL, Machado OL, Alves EW & Carlini CR (1997) Mechanism of inhibitory
action on platelet activation of a phospholipase A 2 isolated from Lachesis
muta (Bushmaster) snake venom. Journal of Thrombosis and Haemostasis,
78:1372-1380.
Garcia DG, Bianco EM, Batista C, Pereira RC, Faria MV, Teixeira VL & Burth P
(2009) Inhibition of mammal Na+ K+ -ATPase by diterpenes extracted from
the Brazilian brown alga Dictyota cervicornis. Phytotherapy Research, 23:943947.
Gedara SR, Abdel-Halim OB, El-Sharkawy SH, Salama OM, Shier TW & Halim AF
(2003) Cytotoxic hydroazulene diterpenes from the brown alga Dictyota
dichotoma. Zeitschrift für Naturforschung. C, Journal of biosciences, 58:17-22.
Godinho MS, Pereira RO, Ribeiro KO, Schimidt F, De Oliveira A & De Oliveira S
(2008) Classificação de refrigerantes através de análise de imagens e análise
de componentes principais (PCA). Química Nova, 31(6):1485-1489.
Gomes MS, Trevizan LC, Nóbrega JA & Kamogawa MY (2008) Uso de scanner
em espectrofotometria de absorção molecular: aplicação em experimento
didático enfocando a determinação de ácido ascórbico. Química Nova,
31(6):1577-1581.
Guiry MD & Guiry GM (2012) AlgaeBase World-wide electronic publication,
National University of Ireland, Galway. http://www.algaebase.org. 12-12-2011.
Güven KC, Percot A & Sezik A (2010) Alkaloids in marine algae. Marine Drugs,
8:269-284.
Haefner B (2003) Drugs from the deep: marine natural products as drug
candidates. Drug Discovery Today, 8(12):536–544.
Harper MK, Bugni TS, Copp BR, James RD, Lindsay BS, Richardson AD,
Schnabel PC, Tasdemir D, VanWagoner RM, Verbitski SM & Ireland CM
(2001) Introduction to the chemical ecology of marine natural products. In:
McClintock JB & Baker BJ (eds) Marine Chemical Ecology. CRC Press, Boca
Ratón, p. 3-70.
Hay ME (1991) Fish–seaweed interactions on coral reefs: effects of herbivorous
fishes and adaptations of their prey. In: Sale PF (ed.) The ecology of fishes on
coral reefs. Academic Press, New York, New York, USA, p. 96–119.
Hay ME, Duffy JE, Pfister CA & Fenical W (1987) Chemical defense against
different marine herbivores: are amphipods insect equivalents?. Ecology,
68:1567–1580.
Hay ME & Fenical W (1988) Marine Plant-Herbivore Interactions: The Ecology Of
Chemical Defense. Annual Review of Ecology and Systematics, 19:111-145.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
164
Hay ME, Fenical W & Gustafson K (1987) Chemical defense against diverse coralreef herbivores. Ecology, 68:1581–1591.
Hayakawa T & Hirai M (2003) An assay of ganglioside using fluorescence image
analysis on a thin-layer chromatography plate. Analytical chemistry,
75(23):6728-31.
Hill NA, Blount C, Poore AGB, Worthington D & Steinberg PD (2003) Grazing
effects of the sea urchin Centrostephanus rodgersii in two contrasting rocky
reef abitats: Effects of urchin density and its implications for the fi shery.
Marine & Freshwater Research, 54: 691-700.
Hoegh-Guldberg O & Manahan DT (1995) Coulometric measurement of oxygen
consumption during development of marine invertebrate embryos and larvae.
Journal of Experimental Biology, 198:19-30.
Hopp S & Herding B (1996) The Boreholes of the Sea Urchin Genus Echinometra
(Echinodermata: Echinoidea: Echinometridae) as a Microhabitat in Tropical
South America. Marine Ecology, 13: 181-186.
Jacobs RS & Wilson L (1986) Fertilized sea urchin egg as a model for detecting
cell division inhibitors. In: A. Aszalor (ed) Modern Analysis of Antibiotics.
Marcel Dekker, Inc. New York, NY, USA.
Jacobs RS, White & Wilson L (1981) Selective compound derived from marine
organisms: effects on cell division in fertilized sea urchin eggs. Federation
Proceedings, 40: 28-31.
Kelecom A & Teixeira VL (1986) Diterpenes of marine brown algae of the family
Dictyotaceae: their possible role as defense compounds and their use in
chemotaxonomy. The Science of the Total Environment, 58:109-115.
Kelecom A & Teixeira VL (1988) Dolastane diterpenes from the marine brown alga
Dictyota cervicornis. Phytochemistry, 27(9):2907 -2909.
Kiselyov AS, Semenova MN, Chernyshova NB, Leitao A, Samet AV, Kislyi KA,
Raihstat MM, Oprea T, Lemcke H, Lantow M, Weiss DG, Ikizalp NN,
Kuznetsov SA & Semenov W (2010) Novel derivatives of 1,3,4-oxadiazoles
are potent mitostatic agents featuring strong microtubule depolymerizing
activity in the sea urchin embryo and cell culture assays. European journal of
medicinal chemistry, 45(5):1683-1697.
Kosovel V, Avanzini A, Scarcia V & Furlani A (1988) Algae as possible sources of
antitumoural agents. Preliminary evaluation of the ‘in vitro’ cytostatic activity of
crude extracts. Pharmacological Research Communications, 20:27-31.
Lancaster M, Goodall DM, Bergstrom ET, McCrossen S & Myers P (2008)
Quantitative ultraviolet measurements on wetted thin-layer chromatography
plates using a charge-coupled device camera. Journal of Chromatography A,
1182(2):219-225.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
165
Lera S, Macchia S & Pellegrini D (2006) Standardizing the methodology of sperm
cell test with Paracentrotus Lividus. Environmental Monitoring and
Assessment,122:101-109.
Leong PK & Manahan DT (1999) Na+/K+-ATPase activity during early development
and growth of an Antarctic sea urchin. The Journal of Experimental Biology,
202: 2051-2058.
Lin L, Zhang J, Wang P, Wang Y & Chen J (1998). Thin-layer chromatography of
mycotoxins and comparison with other chromatographic methods.” Journal of
chromatography A, 815(1):3-20.
Lindquist N (2002) Chemical defense of early life stages of benthic marine
invertebrates. Journal of chemical ecology, 28(10):1987–2000.
López IZ, Díaz AN, Sánchez FG & Nava E (1999) Digital image analysis of
photochemically derivatized phenothiazines separated by HPTLC. Biomedical
Chromatography, 13:175-176.
Macaya E, Rothausler E, Thiel M, Molis M & Wahl M (2005) Induction of defenses
and within-alga variation of palatability in two brown algae from the northerncentral coast of Chile: Effects of mesograzers and UV radiation. Journal of
Experimental Marine Biology and Ecology, 325(2):214-227.
Magalhães HI, Ferreira PM, Moura ES, Torres MR, Alves AP & Pessoa OD (2010)
In vitro and in vivo antiproliferative activity of Calotropis procera stem extracts.
Anais da Academia Brasileira de Ciências, 82(2):407-416
Manzo E, Ciavatta ML, Bakkas S, Villani G, Varcamonti M, Zanfardino A &
Gavagnin M (2009) Diterpene content of the alga Dictyota ciliolata from a
Moroccan lagoon. Phytochemistry Letters, 2(4):211-215.
Martínez AM, Arias LA, Rueda JL, Diaz MC & Bula-Meyer G (2002) Estudio de la
actividad antimicrobiana de los extractos alcohólicos de algunas macroalgas
del Caribe Colombiano. Vitae, 9(2):49-55.
Maschek JA & Baker BJ (2008) The Chemistry of Algal Secondary Metabolism. In:
Amsler CD (ed) Algal chemical ecology. Springer, Berlin, p. 1-20.
Melo FR & Mourão PA (2008) An algal sulfated galactan has an unusual dual
effect on venous thrombosis due to activation of factor XII and inhibition of the
coagulation proteases. Thrombosis and Haemostasis, 99:531-538.
Melo FR, Pereira MS, Foguel D & Mourão PA (2004) Antithrombin-mediated
anticoagulant activity of sulfated polysaccharides: Different mechanisms for
heparin and sulfated galactans. The Journal of Biological Chemistry, 279:
20824–20835.
Moura LA, Bianco EM, Pereira RC, Teixeira VL & Fuly AL (2011) Anticoagulation
and antiplatelet effects of a dolastane diterpene isolated from the marine
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
brown alga Canistrocarpus
thrombolysis, 31(2):235-240.
cervicornis.
166
Journal
of
thrombosis
and
Moura LA, Ortiz-Ramírez FA, Cavalcanti DN, Ribeiro SM, Muricy G, Teixeira VL &
Fuly AL (2011) Evaluation of Marine Brown Algae and Sponges from Brazil as
Anticoagulant and Antiplatelet Products. Marine Drugs, 9(8):1346-1358.
Moura LA, Sanchez EF, Bianco EM, Pereira RC, Teixeira VL & Fuly AL (2011)
Antiophidian properties of a dolastane diterpene isolated from the marine
brown alga Canistrocarpus cervicornis. Biomedicine & Pharmacotherapy, in
press.
Mourão PAS (2004) Use of sulfated fucans as anticoagulant and antithrombotic
agents: future perspectives. Current Pharmaceutical Design, 10:967-981.
National
Cancer
Institute
(2011)
Dictionary
of
cancer
http://www.cancer.gov/dictionary?cdrid=306525. 10-09-2011.
terms.
Norris JN (2010) Marine Algae of the Northern Gulf of California: Chlorophyta and
Phaeophyceae. Smithsonian contributions to botany, 94:289.
Nutesco EA, Shapiro NL, Chevalier A & Amin AN (2005) A pharmacological
overview of current and emerging anticoagulants. Cleveland Clinic Journal of
Medice, 72(1):2-6.
Oehninger S, Clark GF, Acosta AA & Hodgen GD (1991) Nature of the inhibitory
effect of complex saccharide moieties on the tight binding of human
spermatozoa to the human zona pellucida. Fertility and Sterility, 55:165–169.
Oliveira AS, Cavalcanti DN, Bianco EM, De Paula JC, Pereira RC, YoneshigueValentin Y & Teixeira VL (2008) Chemical composition of diterpenes from the
brown alga Canistrocarpus cervicornis (Dictyotaceae, Phaeophyceae).
Natural Product Communications, 3(9):1469-1472.
Oliveira A (2006) Variação qualitativa e quantitativa e ação defensiva de
metabolitos secundários em macroalgas marinhas do gênero Dictyota
Lamouroux (Phaeophyta, Dictyotales). Dissertação de Mestrado.
Universidade Federal Fluminense, Niterói, 94p.
Ortiz-Ramírez FA, Cavalcanti DN, Villaça RC, De-Paula JC, Yoneshigue-Valentin
Y & Teixeira VL (2008) Chemical variation in the diterpenes from the Brazilian
brown alga Dictyota menstrualis (Dictyotaceae, Phaeophyceae). Natural
Product Communications, 3(11):1879-1884.
Ortiz-Ramírez FA (2008) Perfil químico de populações das algas pardas marinhas
Dictyota menstrualis (Brasil) e Dictyota ciliolata (Brasil – Colômbia)
(Dictyotales, Phaeophyta). Dissertação de Mestrado. Programa de Pósgraduação em Biologia Marinha, Universidade Federal Fluminense, Niterói,
93p.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
167
Paine RT (1992) Food-web analysis through field measurements of per capita
interaction strength. Nature, 355: 73–75.
Patankar MS, Oehninger S, Barnett T, Williams RL & Clark GF (1993) Arevised
structure for fucoidan may explain some of its biological activities. Journal of
Biological Chemistry, 268:21770–21776.
Pathirana C & Andersen RJ (1984) Diterpenoids from the brown alga Dictyota
binghamiae. Canadian Journal of Chemistry, 62(9):1666–1671.
Paul VJ, Kuffner IB, Walters LJ, Ritson-Williams R, Beach KS & Becerro MA
(2011) Chemically mediated interactions between macroalgae Dictyota spp.
And multiple life-history stages of the coral Porites astreoides. Marine Ecology
Progress Series, 426:161-170.
Pechenik JA (1999) On the advantages and disadvantages of larval stages in
benthic marine invertebrate life cycles. Marine Ecology Progress Series, 177:
269-297.
Pereira HS, Leão-Ferreira LR, Moussatché N, Teixeira VL, Cavalcanti DN, Da
Costa LJ, Diaz R & Frugulhetti ICPP (2005) Effects of diterpenes isolated
from the Brazilian marine alga Dictyota menstrualis on HIV-1 reverse
transcriptase.” Planta medica, 71(11):1019-24.
Pereira HS, Leão-Ferreira LR, Moussatché N, Teixeira VL, Cavalcanti DN, Costa
LJ, Diaz R & Frugulhetti ICPP (2004) Antiviral activity of diterpenes isolated
from the Brazilian marine alga Dictyota menstrualis against human
immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). Antiviral Research, 64(1):69-76.
Pereira RC, Da Gama BAP, Teixeira VL & Yoneshigue-Valentin Y (2003)
Ecological Roles of Natural Products of the Brazilian Red Seaweed Laurencia
obtusa. Brazilian Journal of Biology, 63(4): 665-672.
Pereira RC, Pinheiro MD, Teixeira VL & Da Gama BAP (2002) Feeding
preferences of the endemic gastropod Astraea latispina in relation to chemical
defenses of Brazilian tropical seaweed. Brazilian Journal of Biology, 62: 3340.
Pereira RC, Donato R, Teixeira VL & Cavalcanti DN (2000) Chemotaxis and
chemical defenses in seaweed susceptibility to herbivory. Revista Brasileira
de Biologia, 60(3):405-14.
Petrović M, Kaštelan-Macan M, Andrašić S & Bokić L (1997) Application of a
colour analyzer in quantitative thin-layer chromatography. Journal of
Chromatography A, 771(1-2):251–257.
Pomponi SA (2001) The oceans and human health: the discovery and
development of marine-derived drugs. Oceanography, 14(1):78–87.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
168
Potin P, Bouarab K, Salaun JP, Pohnert G & Kloareg B (2002) Biotic interactions
of marine algae. Current Opinion in Plant Biology 5:308-317.
Revilla M (2009) Protocolo del test de toxicidad de sedimentos marinos con larvas
del erizo de mar Paracentrotus lividus (Lamarck, 1816). Revista de
Investigación Marina, 11:2-25.
Rosenberg RD (2001) Vascular-bed-specific hemostasis and hypercoagulable
states: Clinical utility of activation peptide assays in predicting thrombotic
events in different clinical populations. Thrombosis and Haemostasis, 86:4150.
Santos AO, Britta EA, Bianco EM, Ueda-Nakamura T, Filho BPD, Pereira RC &
Nakamura CV (2011) 4-Acetoxydolastane diterpene from the Brazilian brown
alga Canistrocarpus cervicornis as antileishmanial agent. Marine Drugs,
9:2369-2383.
Sattari M, Lowenthal DT (2011) Novel Oral Anticoagulant in Development:
Dabigatran, Rivaroxaban and Apixaban. American Journal of Therapeutics,
18(4):332-338.
Schmitt TM, Lindquist N & Hay ME (1998) Seaweed secondary metabolites as
antifoulants: effects of Dictyota spp. diterpenes on survivorship , settlement ,
and development of marine invertebrate larvae. Chemoecology, 8:125 -131.
Schnetter R (1972) Nuevas algas bénticas del litoral Caribe de Colombia. Mutisia,
36:12-16.
Semenova M, Kiselyov A & Semenov V (2006) Sea urchin embryo as a model
organism for the rapid functional screening of tubulin modulators.
BioTechniques, 40(6):765-774.
Sennett SH (2001) Marine Chemical Ecology: Applications in Marine Biomedical
Prospecting. In: McClintock JB, Baker BJ (eds) Marine Chemical Ecology.
CRC Press, Boca Raton, p. 523-542.
Siamopoulou P, Bimplakis A, Iliopoulou D, Vagias C, Cos P, Berghe DV & Roussis
V (2004) Diterpenes from the brown algae Dictyota dichotoma and Dictyota
linearis. Phytochemistry, 65(14):2025-2030.
Soares AR, Abrantes JL, Souza TML, Fontes CFL, Pereira RC, Frugulhetti ICPP &
Teixeira VL (2007) In vitro antiviral effect of meroditerpenes isolated from the
Brazilian seaweed Stypopodium zonale (Dictyotales). Planta medica, 73(11):
1221-1224.
Soares AR, da Gama BAP, da Cunha AP, Teixeira VL & Pereira RC (2008)
Induction of attachment of the Mussel Perna perna by natural products from
the brown seaweed Stypopodium zonale. Marine Biotechnology, 10:158-65.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
169
Solé MA (2003) Dictyota hamifera Setchell (Dictyotales, Phaeophyceae): new
record for the Venezuelan Caribbean marine flora. Caribbean Journal of
Science, 39(2):227-229.
Solé MA & Foldats E (2003) El género Dictyota (Phaeophyceae, Dictyotales) en el
Caribe Venezolano. Acta Botánica Venezuelica, 26(1):41-82.
Solé MA, Vera B & Gómez S (1999) Nuevos registros para el Caribe venezolano y
el Atlántico del género Dictyota (Dictyotales, Phaeophyceae). Fundación La
Salle de Ciencias Naturales LIX, 151:133-148.
Soponar F, Cătălin Moţ A & Sârbu C (2008) Quantitative determination of some
food dyes using digital processing of images obtained by thin-layer
chromatography. Journal of chromatography. A, 1188(2):295-300.
Steinberg PD (1985) Feeding Preferences of Tegula Funebralis and Chemical
Defenses of Marine Brown Algae. Ecological Monographs, 55(3):333.
Stepanov AS (2003) Quantitative Determination of Eleutheroside in Elima Liquid
Extract by High-Performance Thin-Layer Chromatography. Pharmaceutical
Chemistry Journal, 37(4):217-219.
Tasdemir D, Bugni TS, Brent SL, James RD, Copp BR, Ireland M, Harper MK,
VanWagoner RM, Verbitski AD & Schnabel PC (2001) Introduction to the
chemical ecology of marine natural products. In: McClintock JB & Baker BJ
(eds) Marine Chemical Ecology. CRC Press. University of South Florida,
Tampa, USA, p.3-69.
Teixeira VL (2010) Taxonomia Química. In: Pedrini A (ed) Macroalgas, uma
introdução à taxonomia. Technical Books. Rio de Janeiro, p. 83-97.
Teixeira VL (2009) A cura que vem do mar. Scientific American do Brasil Série
Ocea, 79-82.
Teixeira VL, Almeida SADS & Kelecom A (1990) Chemosystematic and
biogeographic studies of the diterpenes from the marine brown alga Dictyota
dichotoma. Biochemical Systematics and Ecology, 18(2-3):87-92.
Teixeira VL, Cavalcanti DN & Pereira RC (2001) Chemotaxonomic study of the
diterpenes from the brown alga Dictyota menstrualis. Biochemical systematics
and ecology, 29:313-316.
Teixeira VL, Tomassini T, Fleury BG & Kelecom A (1986a) Dolastane and
secodolastane diterpenes from the marine brown alga Dictyota cervicornis.
Journal of Natural Products, 49(4):570-575.
Teixeira VL, Tomassini T & Kelecom A (1986b) Cervicol, a further secodolastane
diterpene from the marine brown alga Dictyota Cervicornis kützing
(Phaeophyceae, Dictyotaceae). Bulletin des Sociétés Chimiques Belges,
95(4):263–268.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
170
Teixeira VL, Tomassini T & Kelecom A (1985) Produtos Naturais de organismos
marinhos, uma revisao sobre os diterpenos da alga parda Dictyota spp.”
Química Nova, 302-313.
Teixeira VL & Kelecom A (1988) A chemotaxonomic study of diterpenes from
marine brown algae of the genus Dictyota. Science of the total environment,
75:271–283.
——— (1987) Geographic distribution of the diterpenes from the marine brown
alga Dictyota Lamouroux (Dictyotales, Phaeophyta). Nerítica, 2: 179-200.
Teixeira VL (2002) Produtos Naturais Marinhos. In: Soares-Gomes A, Pereira RC
(eds) Biologia Marinha. Interciência. Rio de Janeiro, p. 249-279.
Teixeira VL, Kelecom A & Gottlieb OR (1991) Revisão, Produtos naturais de algas
marinhas. Química Nova, 14(2):83-90.
Tittensor DP, Worm B & Myers RA (2009) Macroecological changes in exploited
marine systems. In: Witman JD, Roy K (eds) Marine Macroecology. The
Universy of Chicago Press, Chicago and London, p. 310-340.
Torres MR, Sousa AP, Da Silva EA, Pessoa C, Amaral ME, De Moraes MO &
Costa-Lotufo LV (2005) Biological Activity of Aqueous and Organic Extracts of
Seaweeds From Ceará State, Brazil. Arquivos de Ciências do Mar. 38:55- 63.
Trivedi P & Pundarikakshudu K (2006) Novel TLC Densitometric Method for
Quantification Of Solasodine in Various Solanum Species, Market Samples
and Formulations. Chromatographia, 65(3-4):239-243.
Tronholm A, Steen F, Tyberghein L, Leliaert F, Verbruggen H, Siguan MAR & De
Clerck O (2010) Species Delimitation, Taxonomy, and Biogeography of
Dictyota in Europe (Dictyotales, Phaeophyceae)1. Journal of Phycology,
46(6):1301-1321.
Usami Y (2009) Recent synthetic studies leading to structural revisions of marine
natural products. Marine Drugs, 7:314-330.
Vallim MA, Barbosa JEF, Cavalcanti DN, De-Paula JC, Da Silva VAG, Teixeira VL
& Paixão ICNP (2010) In vitro antiviral activity of diterpenes isolated from the
Brazilian brown alga Canistrocarpus cervicornis. Journal Of Medicinal Plants
Research, 4(22):2379-2382.
Vallim MA, De Paula JC, Pereira RC & Teixeira VL (2005) The diterpenes from
Dictyotacean marine brown algae in the Tropical Atlantic American region.”
Biochemical Systematics and Ecology, 33(1):1-16.
Vallim MA, Teixeira VL & Pereira RC (2007) Feeding-deterrent properties of
diterpenes of Dictyota mertensii (Phaeophyceae, Dictyotales). Brazilian
Journal of Oceanography, 55(3):223-229.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
171
Vasconcelos MA, Ferreira WJ, Pereira RC, Cavalcanti DN & Teixeira VL (2010)
Chemical constituents from the red alga Plocamium brasiliense (Greville) M.
Howe and W.R. Taylor. Biochemical Systematics and Ecology, 38(1):119-121.
Viano Y (2010) Recherche de molécules non-toxiques actives en antifouling à
partir d’organismes marins de Méditerranée. Thèse de doctorale. Ecole
doctorale des Sciences Chimiques (ED 250), Université du Sud Toulon-Var,
Toulon, France, 254p.
Williamson JE, De Nys R, Kumar N, Carson DG & Steinberg PD (2000) Induction
of metamorphosis in the sea urchin Holopneustes purpurascens by a
metabolite complex from the algal host Delisea pulchra. Biological Bulletin,
198: 332-345.
Wynne MJ (2011) The benthic marine algae of the tropical and subtropical
Western Atlantic: changes in our understanding in the last half century. Algae,
26(2):109-140.
Wysor B & De Clerck O (2003) An updated and annotated list of marine brown
algae (Phaeophyceae) of the caribbean coast of the Republic of Panama.
Botanica Marina, 46(2):151-160.
Yamase H, Umemoto K, Ooi T & Kusumi T (1999) Structures and absolute
stereochemistry of five new secospatanes and a spatane isolated from the
brown alga Dilophus okamurai Dawson. Chemical and Pharmaceutical
Bulletin, 47(6):813–818.
Zancan P & Mourão PA (2004) Venous and arterial thrombosis in rat models:
Dissociation of the antithrombotic effects of glycosaminoglycans. Blood
Coagulation & Fibrinolysis, 15:45–54.
Zar, J.H. 1996. Bioestatistical Analysis. Prentice Hall, New Jersey, 907 p.
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
APÊNDICE 1. ARTIGO PUBLICADO
Marine Drugs, (2011) 9: 1346-1358
172
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
173
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
174
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
175
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
176
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
177
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
178
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
179
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
180
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
181
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
182
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
183
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
184
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
185
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
APÊNDICE 2. ARTIGO NO PRELO
Latin American Journal of Aquatic Research, (2012)
186
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
187
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
188
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
189
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
190
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
191
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
192
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
193
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
194
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
195
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
196
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
197
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
198
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
199
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
200
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
201
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
APÊNDICE 3. APRESENTAÇÕES EM EVENTOS
202
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
203
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
204
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
205
Ortiz- Ramírez, Fredy A. (2012) – APÊNDICE
206