Protocolo de Precipitação com Isopropanol/ Etanol
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Pipetar 80µl de isopropanol 75% ou 60µl de isopropanol 100% + 20µl
de água miliQ. Concentração final de isopropanol: 60% +/- 5%.
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Vortexar, spin down e deixar no escuro a temperatura ambiente por no
mínimo 20 minutos.
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Centrifugar a 13.000 rpm por 25 minutos.
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Remova todo o isopropanol com pipeta (apoiando ponteira do lado
oposto ao do pellet) pois qualquer resíduo de isopropanol resultará em
manchas fluorescentes que atrapalham o sequenciamento.
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Adicinar 250µl de etanol 70%.
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Vortexar e centrifugar por 5 minutos a 13.000 rpm.
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Remova todo o etanol com pipeta (apoiando a ponteira do lado oposto
ao do pellet) pois qualquer etanol residual resultará em manchas
fluorescentes que atrapalham o sequenciamento.
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Secar as amostras no termociclador a 95°C por 3 minutos. O ttampa
do tubo e do termociclador devem estar abertas.
Depois que as amostras estiverem secas, guarda-las em uma caixa escura
na geladeira a 4°C. A caixa das amostras a serem seqüenciadas, deve estar
embrulhada em papel alumínio, para que as amostras não fiquem expostas a
luz, evitando assim, a perda de fotoluminescência do Big Dye.