RPCV (2006) 101 (557-558) 121-124
R E V I S TA P O R T U G U E S A
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Inibição do crescimento de Listeria monocytogenes em queijo Minas Frescal
elaborado com cultura de Lactobacillus acidophilus
Inhibition of the growing of Listeria monocytogenes in Minas frescal cheese
elaborated with Lactobacillus acidophilus culture
Tammy Priscilla Chioda*, Rubén Pablo Schocken-Iturrino, Gisela Rojas Garcia,
Suelen Fernanda Macri, Kátia Prochnon Trovo, Alessandra Aparecida Medeiros
Departamento de Microbiologia - Laboratório de Anaeróbios - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
UNESP Universidade Estadual Paulista
Via de Acesso: Prof: Paulo Donato Castellane s/n cep 14.884-900 Jaboticabal - São Paulo - Brasil
Resumo: O queijo Minas Frescal é um produto tipicamente
brasileiro, com alto teor de umidade sendo susceptível a
contaminações por bactérias do tipo Listeria monocytogenes. A
incorporação de microrganismos probióticos em queijo tem sido
desenvolvida como tentativa de inibir o crescimento de microganismos patogênicos. O objetivo do trabalho foi avaliar a
capacidade inibitória de Lactobacillus acidophilus sobre Listeria
monocytogenes inoculada em queijo Minas Frescal refrigerado á
8 0C por 10 dias. Amostras de Minas Frescal foram preparadas
contendo 106 UFC/ml de L.monocytogenes e 106 UFC/ml de
L.acidophilus. Cinco formulações foram realizadas: L.monocytogenes (F1); cultura lática tipo "O" (Lactococcus lactis subsp.
lactis e Lactococcus lactis subsp. Cremoris) (F2); L.monocytogenes + cultura lática tipo "O" (F3); L. acidophilus + L. monocytogenes (F4); ácido lático + L.monocytogenes (F5). Foi determinada contagem de L.monocytogenes em meio LSA (Oxoid)
após 1,5 e 10 dias de armazenamento. Os resultados indicaram
que L.acidophilus, foi capaz de inibir o crescimento de L.monocytogenes (F4). A adição de cultura lática tipo "O" (F3), apenas
reduziu a contagem do patógeno de 3,46 (1°dia) para 2,0 (10º
dia) log UFC/ml. As contagens de L.monocytogenes de F1
aumentaram de 3,11 (1º dia) para 3,31 (10° dia) log UFC/ml e de
F5 aumentaram de 3,08 (1°dia) para 4,18 (10° dia).
Palavras-chave: Lactobacillus acidophilus, Listeria monocytogenes, probioticos.
Summary: "Minas Frescal" is typically a Brazilian product,
with high water activity being susceptible to contamination by
Listeria monocytogenes. The incorporation of probiotic microorganisms in the cheese has been developed as an attempt of
inhibiting the pathogens growth. The objective of this work was
to evaluate the inhibitory capacity of Lactobacillus acidophilus
over Listeria monocytogenes artificially inoculated in Minas
Frescal cheese store refrigerated at 8 0C for 10 days. Minas
Frescal cheese samples were prepared containing 106CFU/mL
of L. monocytogenes and 106 CFU/mL of L. acidophilus. Five
formulations were accomplished: L. monocytogenes (F1); lactic
culture type "O" (F2); L.monocytogenes + lactic culture type "O"
*Correspondência: [email protected]
Tel: (16)32092652; Fax: (16)32024275
(F3); L. acidophilus + L. monocytogenes (F4); lactic acid +
L.monocytogenes (F5). The number of L. monocytogenes was
count on LSA (Oxoid) medium after 1,5 and 10 days of storage.
The results indicated that L. acidophilus, was able to inhibit L.
monocytogenes (F4). The use of lactic culture type "O" (F3), just
reduced the counts of the pathogen from 3.46 (1°day) to 2.0
(10°dia) log CFU/mL. The counts of L. monocytogenes in F1
increased from 3.11 (1°day) to 3.31 (10°day) log CFU/mL and in
F5 increased from 3.08 (1°dia) to 4.18 (10°day).
Keywords: Lactobacillus acidophilus, Listeria monocytogenes,
probiotics.
Introdução
Os queijos, devido à sua composição, constituem-se
em excelentes substratos para o crescimento de microrganismos, inclusive os da espécie de Listeria monocytogenes, considerada uma bactéria patogênica emergente possuindo capacidade de multiplicação em temperaturas de refrigeração e ainda habilidade de sobreviver durante longos períodos sob condições adversas
(Naldini, 2002). A listeriose é uma zoonose, sendo que
os animais parecem ser mais importantes na manutenção do agente no ambiente (Acha e Szyfres, 1987). A
relevância de Listeria monocytogenes em saúde pública
diz respeito, de um lado, à gravidade da manifestação
clínica, resultante do comprometimento do sistema
nervoso central, e de outro, à possibilidade da infecção
acometer preferencialmente as gestantes, com sérias
conseqüências para os fetos (Germano e Germano,
2003).
Os produtos lácteos já foram incriminados em vários
surtos nas últimas décadas, envolvendo produtos como
leite pasteurizado, queijo macio tipo Mexicano e queijo
mole tipo "Vacherin Mont d’Or" (Farber e Peterkin,
1991). O queijo Minas Frescal é amplamente consumido
no Brasil, possuindo sabor agradável e suave, contendo
121
Chioda TP et al.
alto teor de umidade. É um produto perecível susceptível aos fenômenos bioquímicos e microbiológicos
que afetam as suas características de qualidade, rendimento e durabilidade apresentando uma vida de prateleira curta, mesmo sob condições adequadas de refrigeração (Furtado et al., 1980). É conhecido que as bactérias láticas produzem vários compostos bactericidas
incluindo ácidos orgânicos, que fazem baixar o pH, o
peróxido de hidrogênio, enzimas bacteriolíticas e as
bacteriocinas (Demarigny et al., 1996; Giraffa et al.,
1997). Determinadas bactérias láticas atuam favoravelmente no produto alimentício ao qual foram adicionados, fazendo parte dos microrganismos capazes de
exercer efeitos benéficos no hospedeiro. São denominados microrganismos probióticos (Ziemer e Gibson,
1998), os quais podem apresentar um amplo espectro
de ação contra microrganismos deteriorantes e patogênicos (Moreno, 1996).
A adição de culturas probióticas têm sido testadas
em vários tipos de queijos, e a maior parte consegue
permanecer viável, alcançando as propriedades
tecnológicas desejadas no produto final. Estão incluídos estudos em queijo Cheddar (Dinakar e Mistry,
1994; Gardiner et al., 1998; Mc Brearty et al., 2001);
queijos frescos (Roy et al., 1997; Vinderola et al.,
2002). Entre as bactérias ácido láticas, o Lactobacillus
acidophilus é considerado um microrganismo com
potencial probiótico, sendo utilizado pela indústria de
laticínios na elaboração de vários produtos, os quais
podem apresentar inúmeras aplicações na nutrição
humana, tratamento e prevenção de doenças como
infecções intestinais, efeito anticarcinogênico, estímulo
da motilidade intestinal (Guedes-Neto et al., 2002).
Material e métodos
Microrganismos e condições de cultivo
Amostra de Lactobacillus acidophilus, pertencentes
á coleção de culturas do Laboratório de anaeróbios da
FCAV-UNESP, identificados por Medeiros (2002) e
testados "in vitro" contra bactérias patogênicas por
Garcia (2005), encontravam-se armazenadas a -15 0C
e mediante o processo de descongelamento em temperatura ambiente, foram reativadas em caldo MRS
(Oxoid), incubados a 37 0C durante 24 a 48 horas.
Após este período, as estirpes foram reisoladas em
placas de Agar De Man, Rogosa e Sharpe (MRSOxoid) e incubadas por 24 a 72 horas a 37 0C em jarras
de anaero-biose (sistema Gaspak®). Após as culturas
terem sido reativadas, foram novamente inoculadas
em caldo MRS a 37 0C por 24 a 48 horas até a concentração de 106 pela escala de Mac Farland. Volume
de 1 mL da cultura foi transferido para 100 mL de
água peptonada estéril a 0,1% para posterior inoculação na massa dos queijos.
122
RPCV (2006) 101 (557-558) 121-124
Isolado de Listeria monocytogenes, pertencente à
coleção de culturas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - USP de Ribeirão Preto SP - Brasil, gentilmente cedidas pela Profa. Dra. Elaine De Martinis,
encontrava-se em cultura estoque a -4 0C mantida em
tubos de ágar tripticase soja (TSA-Oxoid), inclinado
contendo 0,6% de extrato de levedura (TSAYE-Difco).
A ativação da cultura foi realizada mediante duas
transferências consecutivas para caldo BHI (Oxoid) e
incubadas a 35 0C durante 24 horas, até a concentração
de 106 pela escala de Mac Farland. Volume de 1 mL da
cultura foi transferido para 100 mL de água peptonada
estéril a 0,1% para posterior inoculação nos queijos.
Fabricação de queijo Minas Frescal
Todos os queijos foram elaborados segundo o procedimento tradicional descrito pelo Ministério da
Agricultura (Brasil, 1996). Foi utilizado leite pasteurizado pelo processo "HTST" (High Temperature Short
Time, 75 0C por 20 segundos) possuindo em média 16 0D.
Foram adicionados ao leite volumes de solução de
Cloreto de Cálcio a 50% (Base Química), necessários
para atingir uma concentração final de 250 ppm. Foi
utilizado coalho comercial liofilizado (HA-LA) na
proporção indicada pelo fabricante 20 minutos após a
adição das culturas bacterianas (cultura tipo "O" e
Lactobacillus acidophilus). Foi utilizada, cultura láctica
mesofílica homofermentativa tipo "O", consistindo de
Lactococcus lactis subsp. lactis e Lactococcus lactis
subsp. cremoris (R-704, Christian Hansen, Valinhos,
Brasil), na proporção de 1% (v/v). No tratamento em
que foi utilizado ácido lático (Synth) adicionou-se ao
leite a 0,025% (v/v) a 50%.
Após a adição dos ingredientes ao leite (coalho) o
coágulo foi formado após 40 minutos, o mesmo acontecendo no tratamento com ácido lático, o gel foi cortado em cubos, promoveu-se à remoção de 500 mL de
soro de cada tratamento, para padronização da quantidade de massa + soro a ser inoculada. Nesta etapa, foram
adicionadas as culturas de Listeria monocytogenes. A
massa foi colocada em fôrmas próprias para este tipo
de queijo, completando o processo de dessoragem. A
salga foi realizada logo após com cloreto de sódio
comercial na concentração de 1%, os queijos foram
embalados em sacos plásticos estéreis com ± 240 g
cada um e armazenados sob refrigeração a 8 0C por um
período de até 10 dias.
Tratamentos:
T1: Coalho + CaCl2 + Listeria monocytogenes (controle positivo)
T2: Coalho + CaCl2 + cultura lática comercial (controle negativo)
T3: Coalho + CaCl2 + cultura lática comercial +
Listeria monocytogenes
T4: Coalho + CaCl2 + Lactobacillus acidophilus +
Listeria monocytogenes
T5: ácido lático + Listeria monocytogenes
Chioda TP et al.
Análises microbiológicas
Foram realizadas análises no leite pasteurizado
(apenas coliformes totais e fecais). Os queijos foram
analisados com 1,5 e 10 dias de armazenamento, sob
temperatura controlada de 8 0C. Porções de 25 g de
cada queijo foram coletadas assepticamente de diferentes partes padronizadas e homogeneizadas com
225 mL de solução peptonada a 0,1% estéril, sendo
então submetidas às diluições decimais em solução
salina estéril até 10-3 UFC/mL. Contagens de Listeria
monocytogenes foram realizadas em duplicata, por
semeadura em superfície de placas de Agar LSA
(Listeria Selective Agar-Oxoid) incubadas a 35 0C por
24 a 48 horas. As placas foram examinadas por
colônias típicas, confirmadas através da reação de
catalase e em agar motilidade (Difco) (Lovett e
Hitchins, 1984). Além disso, foi testada atividade
ß-hemolítica em Agar sangue de cavalo das colônias
de L.monocytogenes (Pagotto et al., 1998).
Análises Estatísticas
O delineamento utilizado foi o esquema fatorial 5x3,
sendo 05 tratamentos com 10 repetições. As análises
foram conduzidas através do programa SAS (STAT, 1998).
Resultados e discussão
Medidas de pH dos queijos
O valor de pH dos queijos foi determinado com 1, 5, e
10 dias de armazenamento com potenciómetro (Analion)
modelo PM608, equipado com eletrodo de penetração da
mesma marca.
Os valores de pH obtidos nos queijos podem ser
observados na Tabela 1. Nota-se que desde o 1º dia, até
o 10º dia de monitoramento os valores de pH tiveram
uma redução progressiva. A adição de culturas láticas
nos tratamentos T2 e T3, proporcionou um menor valor
de pH em relação ao tratamento T1 que não recebeu culturas láticas nem ácido lático, que demonstrou estabilidade de pH, nos dias 1 e 5, tendo uma diminuição no 10º
dia de armazenamento. O fermento láctico geralmente
empregado no processo de obtenção do queijo Minas
Frescal constitui-se de bactérias responsáveis pela fermentação da lactose, com produção de ácido lático que
promove o abaixamento do pH e aparecimento de flavor
característico do queijo (Wolfschoon-Pombo et al.,
1978). No tratamento T4 a inoculação de cultura lática
de L. acidophilus assemelha aos mecanismos realizados
pelas bactérias láticas dos tratamentos T2 e T3. Como
observado no tratamento T5, o declínio do pH, ocorreu
em decorrência do teor de ácido lático no queijo, que por
sua vez tende a solubilizar o cálcio presente alterando
sua estrutura (Furtado, 1991). Deste modo observa-se
que as dife-renças de pH demonstradas, não influenciam
no comportamento de Listeria monocytogenes nos queijos.
RPCV (2006) 101 (557-558) 121-124
Tabela 1 - Valores médios de pH de queijos tipo Minas Frescal
em diferentes tratamentos* (T1, T2, T3, T4 e T5) com 1,5 e 10
dias de armazenamento á temperatura de 8 0C
Tratamentos
1d
5d
10d
1
6,30
6,20
5,48
2
5,82
5,20
4,77
3
5,75
5,34
5,04
4
6,21
5,64
5,23
5
5,87
5,22
4,88
* Tratamentos T1: Coalho + CaCl2 + Listeria monocytogenes (controle
positivo); T2: Coalho + CaCl2 + cultura lática comercial (controle negativo); T3: Coalho + CaCl2 + cultura lática comercial + Listeria monocytogenes; T4 Coalho + CaCl2 + Lactobacillus acidophilus + Listeria
monocytogenes e T5: ácido lático + Listeria monocytogenes
Sobrevivência de L. monocytogenes no queijo
Os resultados das análises microbiológicas referen-tes
às contagens de Listeria monocytogenes, nos tratamentos e a análise estatística, encontram-se na Tabela 2.
Pode-se observar que a ausência da inoculação de culturas láticas comerciais (Tipo "O"), na fabricação dos
queijos T1 e T5, permitiu o desenvolvimento do
patógeno estudado. Em análises microbiológicas
realizadas por Dornellas (1997) em queijos produzidos
por acidificação direta e inoculação de fermento, após
três e trinta dias de produção, embora tenha havido
crescimento microbiano durante o armazenamento,
observou-se sempre contagem maior para os queijos
produzidos por acidificação direta, evidenciando que,
ocorrendo uma contaminação, a mesma se desenvolve
mais facilmente no queijo sem fermento lático, pois a
flora do fermento não é capaz de inibir a flora contaminante. No tratamento T3, observou-se que, com a
aplicação de cultura lática comercial, houve diminuição
da contagem de Listeria monocytogenes de 3,46 log
ufc/g para 2.0 log ufc/g. Esses resultados assemelham-se aos encontrados por Schaack e Marth (1998)
onde se inoculou 103 UFC/mL de Listeria monocytogenes em leite desnatado juntamente com 0.1, 0.5, 1.0
e 5.0% de Lactococcus lactis subsp. cremoris ou
Lactococcus lactis subsp. lactis. Os autores observaram
um maior crescimento de Listeria monocytogenes com
a diminuição da quantidade de cultura lática. Nos
tratamentos T2 e T4, não houve diferenças estatísticas
significativas (P<0,05) permanecendo inalteradas
todas as contagens ao longo do período de armazenamento. No tratamento T4, houve total inibição de
Listeria monocytogenes, realizada pelo probiótico
Lactobacillus acidophilus C1, os resultados corroboram as pesquisas realizadas por Medeiros (2002), no
qual a mesma linhagem de L.acidophilus, apresentou
forte inibição "in vitro" do crescimento de Clostridium perfringens com zonas de inibição 6 a 15 mm, de
Escherichia coli com zonas de inibição de 6 a 15 mm
e de Salmonella enteritidis com zonas de inibição de 6
a 15 mm. Garcia (2005) verificando a inibição do
crescimento de bactérias patogênicas e seus produtos
metabólicos por diferentes estirpes de L. acidophilus
123
Chioda TP et al.
RPCV (2006) 101 (557-558) 121-124
denominadas C1, C2, C3, C4, C5, C6, C9, C11,
C12, C13 e C14, constatou-se inibição "in vitro"
de Escherichia coli, Clostridium perfringens e
Salmonella enteritidis sendo a inibição decorrida pela
produção de ácidos orgânicos, peróxido de hidrogênio
e bacteriocinas.
Tabela 2 - Contagem de cultura de Listeria monocytogenes
inoculada em queijo tipo Minas Frescal adicionado de cultura
de L. acidophilus em diferentes tratamentos denominados: T1,
T2, T3, T4 e T5 durante estocagem a 8 0C por 10 dias de
armazenamento
Queijos
T1
Dias de armazenamento
1
5
10
3,11
2,33
3,31
0
0
0
0
T3
3,46
2,21
2,0
T4
0
0
0
T5
3,08
3,92
4,18
Os valores da contagem microbiológica seguidos pela estatística foram
transformados em log 10
Conclusões
O uso de culturas láticas industriais demonstrou não
ser 100% efetivo na eliminação completa de Listeria
monocytogenes, atuando apenas na redução de sua
multiplicação. O probiótico Lactobacillus acidophilus
C1 mostrou-se eficiente na eliminação de L. monocytogenes, inoculada nos queijos. Os tratamentos
realizados com adição de ácido lático provou não ser
eficaz na eliminação do microrganismo patogênico
estudado, contribuindo para o seu aumento.
Bibliografia
Acha PN e Szyfres B (1987). Zoonoses and Communicable
Diseases Common to Man and Animals. Pan American
Health Organization, 2ª edição.
Brasil. Resolução Mercosul/GMC/RES.N145/96. Regulamento
Técnico MERCOSUL de Identidade e Qualidade de Queijo
Minas Frescal. Ministério da Agricultura, do Abastecimento
e da reforma Agrária. Brasília.
Demarigny Y, Beuvier E, Dasen A e Duboz G (1996).
Influence of Raw Milk Microflora on the Caracteristics of
Swiss-Type Cheeses. l. Evolution of Microflora During
Ripening and Characterization of Facultativelly Heterofermentative Lactobacilli. Lait, 76: 371-378.
Dinakar P e Mistry VV (1994) Growth and viability of
Bifidobacterium bifidum in cheddar cheese. Journal of
Dairy Science, 77: 2854-2864.
Dornellas JR(1997). Efeito do tipo de coagulantes e acidificante
no rendimento, proteólise e "shelf life" do queijo Minas
Frescal. Dissertação apresentada para Obtenção do Grau de
Mestre em Tecnologia de Alimentos - Faculdade de
Engenharia de Alimentos - Universidade Estadual de Campinas.
Farber JM e Peterkin PI (1991). Listeria monocytogenes,
a food-borne pathogen. Microbiological Reviews, 55: 476-511.
124
Furtado MM, Souza HM, Munck AV (1980). A fabricação
do queijo Minas Frescal sem o emprego de culturas
láticas. Revista do Instituto de Laticínios Cândido Tostes,
35: 15-21.
Furtado MM (1991). A arte e ciência do queijo. 2a edição,
editora Globo, São Paulo: 1-175.
Garcia GR (2005). Inibição de Bactérias Patogênicas por
Lactobacillus acidophilus. Dissertação apresentada para
Obtenção do Grau de Mestre em Microbiologia Agropecuária
- Universidade Estadual Paulista.
Gardiner G, Ross RP, Collins JK, Fitzgerald G e Stanton C
(1998). Development of a probiotic Cheddar cheese containing
human-derived Lactobacillus paracasei strains. Applied and
Environmental Microbiology, 64: 2192-2199.
Germano PML e Germano MIS (2003). Higiene e Vigilância
Sanitária de Alimentos, São Paulo, 2a edição. Varela (São
Paulo), 3-655.
Guedes-Neto LG, Penna CF, Fonseca ML, Cerqueira M,
Leite OM (2002). Lactobacillus acidophilus e a indústria
de laticínios. Revista Leite e Derivados, 66:17-23.
Giraffa G, Carminatti D e Nevani E (1997). Enterococci
Isolated from Dairy Products: a Review of Risks and
Potencial Techonological Use. J. Food Protection, 60: 732-738.
Lovett J e Hitchins AD (1984). Listeria isolation. In: U.S.Food
and Drug Administration, Bacteriologic Analytical Manual,
6a edição, 29.06-29.07.
Mc Brearty S, Ross RP, Fitzgerald GF, Collins JK, Wallace
JM e Stanton C (2001). Influence of two commercially
available bifidobacteria cultures on Cheddar cheese quality.
International Dairy Journal, 11: 599-610.
Medeiros AA (2002). Estudo da Microbiota Intestinal de
Avestruzes do Interior de São Paulo: Avaliação In Vivo de
Algumas Espécies Bacterianas para Utilização em Probióticos.
Tese apresentada para obtenção do grau de Doutor em
Medicina Veterinária. Universidade Estadual Paulista.
Moreno I (1996). Ocorrência e caracterização de bacteriocinas
de Lactococos e sua utilização no processamento de queijo
Minas Frescal. Dissertação para Obtenção do Grau de Mestre em
Tecnologia de Alimentos. Universidade de São Paulo.
Naldini MCM (2002). Comportamento Diferencial de
Listeria monocytogenes em Queijo Minas Frescal
Elaborados pelo Método Convencional e por Acidificação
Direta. Dissertação apresentada para Obtenção do Grau
de Mestre em Tecnologia de Alimentos. Universidade
Estadual de Campinas.
Pagotto CAF, Moreno JFG, Mestieri L (1998). Características
físico-químicas e microbiológicas de queijos Minas Frescal e
mussarela, produzidos em algumas fábricas de laticínios do
Estado de São Paulo. Higiene Alimentar, 12: 31-34.
Roy D, Mainville I e Mondou F (1997). Selective enumeration
and survival of bifidobacteria in fresh cheese. International
Dairy Journal, 7: 785-793.
Schaack MM e Mareth EH (1998). Behavior of Listeria
monocytogenes in skim milk fermentation with mesophilic
lactic starter cultures. Journal of Food Protection, 51:
600-606.
Vinderolla CG, Mocchiutti P e Reinheimer JA (2002).
Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria
used for fermented dairy products. Journal of Dairy Science,
85: 721-729.
Wolfschoon-Pombo AF, Furtado MM, Munck AV (1978).
Estudo da fabricação do queijo Minas Frescal com ácido
lático em substituição do fermento lático. In: Congresso
Nacional de Laticínios, 5: 160-182.
Ziemer CJ e Gibson GR (1998). An overview of probiotics,
prebiotics and synbiotics in the functional food concept:
perpectives an future strategies, Int. Dairy J. 8: 473-479.