Universidade Federal de Pelotas
Centro de Desenvolvimento Tecnológico - CDTec
Núcleo de Biotecnologia
Encontro de Inovação Tecnológica em Defesa Agropecuária – Leite
Belo Horizonte - 21/03/2013
Produção de Anticorpos Monoclonais contra
Listeria monocytogenes para Utilização em
Métodos Rápidos de Diagnóstico em Alimentos
Marcelo Mendonça
Médico Veterinário
Doutor em Biotecnologia
Pós-doutorando em Biotecnologia
Definição do Problema
Listeria spp. – 8 espécies
 Listeria monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi
 L. marthii, L. rocourtiae (Graves et al., 2010; Leclercq et al., 2010)
Causador da Listeriose
L. monocytogenes – Humanos e Animais
L. ivanovii – Animais, casos esporádicos em Humanos (Guillet et al., 2010)
Características

Bacilo Gram-positivo

Anaeróbico facultativo

Multiplicação (1°C a 45°C)

Ubiquitário
Todar, 2009
Definição do Problema
Presença de L. monocytogenes nos Alimentos
• Leite e seus derivados
• Produtos cárneos
• Vegetais e frutas (minimamente processados)
• Peixes e frutos do mar
•123 pessoas
• 25 mortes
(CDC, 2011)
Orgãos de fiscalização - deteminam “Zero Tolerance”
Prontos para consumo - Ready-to-eat (RTE) foods
Definição do Problema
Método de Diagnóstico para L. monocytogenes
Metodologia convencional utilizada para detecção em alimentos
30ºC / 24h
37ºC / 24 a 48h
37ºC / 48h
37ºC / 24h
OXFORD
LEB
Pré-enriquecimento
FRASER
enriquecimento
PALCAM
TSA-YE
5 – 10 dias
Mais dias!
Catalase
Farber e Daley, 1995
Motilidade
7 dias
Fermentação de
carboidratos
24h
-hemólise
24 – 48h
Solução do Problema e Diferencial
Métodos rápidos de diagnóstico de L. monocytogenes - Desejáveis
Técnicas de Imunoensaios
Alta sensibilidade, Especificidade e Reprodutíveis
Anticorpos Monoclonais (MAbs)
MAbs são imunoglobulinas secretadas por clones de células
(hibridomas) que são obtidas através da fusão in vitro de linfócitos B
produtores de anticorpos com células de mieloma (Linfócitos B tumorais)
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Após 6 Fusões Celulares – Listeria MAbs
 7 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria monocytogenes
• MAbs anti-InlA - 2D12, 3B7 e 4E4
Maior reatividade com Internalina A nativa
 4 hibridomas secretando MAbs anti-Listeria spp.
• MAb anti-proteína p30 - 3F8
Reconhece exclusivamente o gênero Listeria
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
ELISA indireto
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot
MAb 2D12 anti-InlA de Listeria monocytogenes
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot
MAb-3F8 anti-Listeria spp. – Proteína de 30 kDa (p30)
Reação com L. monocytogenes e L. marthii
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
35
27
Revelado com DAB
L. monocytogenes F4244
L. marthii
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis
Salmonella typhimurium
Bacillus thuringiensis
E. coli O157:H7
Lactococcus lactis
Enterococcus aerogenes
Lactobacillus paracasei
Klebsiella pneumoniae
Enterococcus faecalis
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Separação Imunomagnética
Immunomagnetic Separation (IMS)
 Separação e concentração do microrganismo alvo
 Ligação dos anticorpos em esferas magnetizadas
Fonte: Bhunia, 2008
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Eficiência de captura com
diferentes [ ] em PBS
 MAb-2D12 (InlA)
 108 a 103 UFC/mL
Diferença na captura
entre anticorpos
 MAb-2D12 (InlA)
 MAb-3F8 (p30 - gênero Listeria)
 Dynabeads anti-Listeria (Invitrogen)
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Separação Imunomagnética (IMS)
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos
Queijo de Cabra - artificialmente contaminado
10 mL
L. monocytogenes 4b
L. innocua
~ 1 UFC/g
10 g de Alimento
+ 90 mL Caldo Fraser
16 h a 37oC
IMS
Contagem em Placa
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Biossensor de Fibra Óptica
 Formato Sanduíche
Captura e Detecção
 Fibras de poliestireno - 5 cm
Sinal em tempo real
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Imunoseparação Magnética seguido por Sensor de Fibra Óptica
Queijo de Cabra - artificialmente contaminado
 Co-cultivo L.monocytogenes e L. innocua
 IMS seguido de ensaio com Fibra Óptica
MAb-2D12 marcado Cy-5
InlA de L. monocytogenes
Tempo Total da IMS + Fibra Óptica
Aproximadamente 21 horas
Potencial de mercado
Potencial de mercado
Diferenciais propostos em nossos estudos em comparação aos outros:
 Brasil gastou mais de 1 bilhão de reais entre 2008 e 2010 com importação de
anticorpos monoclonais (Reis et al. 2011)
 A produção de uma tecnologia 100% nacional, com custos mais baratos
 Os MAbs produzidos pelo Lab. de Imunologia Aplicada - UFPel demonstraram-se
altamente específicos para L. monocytogenes e Listeria spp., nenhum grupo de
pesquisa no Brasil obtiveram MAbs específicos para este gênero bacteriano
 Utilização de MAbs para a produção de ensaios e/ou kits, o tempo de
identificação de L. monocytogenes pode ser reduzidos para 48h ou menos
 Desenvolvimento e implementação de plataformas de testes rápidos para
detecção de L. monocytogenes e/ou Listeria spp. utilizando MAbs e antígenos
recombinantes previamente produzidos e caracterizados na UFPel
 Os testes propostos servirão de base tecnológica para criar outras plataformas,
que poderão ser empregadas no desenvolvimento de métodos rápidos de
diagnóstico para outras enfermidades importantes
Equipe de colaboradores – Listeria MAbs
Primeira e Segunda Parte do Projeto – Produção dos anticorpos e plataformas
• Prof. José Antonio Guimarães Aleixo (Imunologia e Microbiologia de Alimentos)
• Prof. Wladimir Padilha da Silva (Microbiologia de Alimentos)
• Prof. Arun K. Bhunia - Purdue University/USA (Imunologia e Biologia Molecular)
• Prof. Fabricio Rochedo Conceição (Imunologia e Biologia Molecular)
• Profa. Ângela Nunes Moreira (Imunologia e Microbiologia de Alimentos)
Segunda Parte do Projeto – Produção das plataformas
• Prof. Odir Antonio Dellagostin (Biologia Molecular e Bioinformática)
• Prof. Alan John Alexander McBride (Biologia Molecular e Proteômica)
• Mestrando Gustavo Schmidt Garcia Moreira (Imunologia e Bioinformática )
• Doutoranda Karla Sequeira Mendonça (Microbiologia e Biologia Molecular)
Obrigado!
Marcelo Mendonça
[email protected]
(53) 3725.7583 / 8134.0811
Slides Extras
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Fusão Celular
Extrato total
proteínas de L. monocytogenes
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Listeria monocytogenes expressando GFP
MAb-2D12 anti-rInlA
Mendonça et al. 2012 – BMC Microbiology
IMS
Queijo
Modified Oxford
BHI Plates
MAb- 2D12
Dynabeads
MAb-2D12
MAb-3F8
Dynabeads
MAb-3F8
> 105 UFC.mL-1
Fibra Óptica – 103 UFC.mL
Imunoseparação Magnética
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos
Queijo de cabra artificialmente contaminado
6
5
capture (%)
L. monocytogenes
+
L. innocua
4
BHI
3
MOX
2
1
0
MAb-2D12
MAb-3F8
PCR quantitativo em tempo real
Amplificação do gene hly de L. monocytogenes
Dynal
E. coli O157:H7
L. welshimeri
Dois MAbs juntos
Identificação específica
Gênero e espécie
L. marthii
Western blot
L. innocua F4248
L.monocytogenes
F4244
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
2D12 - InlA
100
75
Revelado com DAB
7.5% SDS-PAGE
37
3F8 - p30
25
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
MAb 2D12
Anti-InlA
L. monocytogenes
4b (F4244)
L. monocytogenes
4d (19117)
L. innocua 6a
Imunofluorescência
L. monocytogenes
4b (F4244)
L. monocytogenes
4d (19117)
L. innocua 6a
Estágio de desenvolvimento da tecnologia
Western blot
MAb-3F8 anti-Listeria spp.
35
27
SDS-PAGE 10% - Western blot PVDF
Revelado com DAB (3,3'-Diaminobenzidine)
7 (1323)
4ab (murray)
4e (19118)
4d (19117)
4c (19116)
4b (F4244)
4a (19114)
3c (2479)
3b (2540)
3a (19113)
1/2c (7644)
1/2b (F4260)
1/2a (V7)
Reação com todos os sorotipos de L. monocytogenes
Imunoseparação Magnética
Eficiência de captura de L. monocytogenes em Alimentos
Salsichas tipo hotdog artificialmente contaminado
10 g de hotdog + 90 mL Fraser
L. monocytogenes 4b e/ou L. innocua
Após IMS
Plaqueado
em agar BHI
PCR quantitativo em tempo real
Amplificação do gene hly de L. monocytogenes
LISTERIOSE
População de risco:
Cérebro

Indivíduos imunocomprometidos

Mulheres grávidas

Idosos e crianças

Adultos saudáveis (imunocompetentes)

Baixa morbidade - Alta mortalidade

Taxa de mortalidade: 30% da população suscetível
Após entrar no organismo e vencer a
barreira intestinal
Septicemia, Meningite, Meningoencefalite
 Aborto
 Natimorto
 Nascimento criança doente
Placenta
Fígado
Baço