U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D E S A N TA C ATA R I N A
P R O G R A M A D E P Ó S - G R A D U A Ç Ã O E M FA R M Á C I A
A L U N A : S U E L L E N G AV R O N S K I
FLORIANÓPOLIS, 25/08/2015
Introdução
 O termo epigenética refere-se a todas as mudanças reversíveis e
herdáveis no genoma funcional que não alteram a sequência de
nucleotídeos do DNA
 Existem três mecanismos principais de alterações epigenéticas:
metilação do DNA, modificação de histonas e ação de RNAs não
codificadores
Introdução
 Dentre as técnicas que elucidam a ligação de fatores de transcrição ao
DNA, destacam-se a PBM (protein binding microarray) (in vitro) e a
Chip ou Chip-Seq (Chromatin immunoprecipitation seguida de
sequenciamento) (in vivo).
 Desvantagens: utilização de FT purificados e de difícil manuseio, não
permitindo a análise complexa e multi-paramétrica das modificações
epigenéticas.
 A tecnologia MagPIE (magnetic protein immobilization on enhancer
DNA) foi desenvolvida com o objetivo de permitir a análise multiparamétrica e rápida das interações entre fatores de transcrição (FT),
cromatina e DNA, bem como suas modificações epigenéticas
resultantes.
Introdução
Metodologia
 Amplificação do DNA e ligação às beads
 Todas as sequências foram amplificadas e ligadas as beads com primers
com mínima afinidade por fatores de transcrição.
 Processo:
Beads magnéticas com streptavidina
são precipitadas com um ímã
Beads são resuspendidas no tampão de ligação
Adição de DNA biotinilado
Incubação por 20 a 60’
Lavagem e bloqueio com 4% de leite
Armazenamento
Metodologia
 Cultura de células
 Foram utilizadas células embrionárias murinas mantidas
em meio DMEM suplementadas com 15% de soro fetal
bovino. Quando necessário, as células foram tratadas com
doxiciclina para estimular a proliferação e induzir a
expressão de fatores de transcrição.
Metodologia
 Preparação do lisado nuclear
Lavagem dupla das células com PBS gelado
Células foram raspadas, colocadas num pellet e centrifugadas
Células são resuspendidas em solução de lise e incubadas por 15’ a 4°C
Adição de um agente detergente e centrifugação
Resuspensão em solução de lise nuclear, incubação e centrifugação
Purificação em coluna
Preparação de alíquotas, congelamento em nitrogênio líquido
e armazenamento a -80°C
Metodologia
 Ligação do DNA as proteínas
Descongelamento e diluição do lisado (~1/3mg/ml)
Incubação do lisado com as beads recobertas com o DNA
Incubação por 10’ a 37°C
Junto com DNA competidor
Resuspensão das beads em 10 μl de solução de anticorpos
primários e anticorpos secundários ligados a um
fluoróforo.
Incubação por 20-60’ a 4°C
Lavagem, resuspensão e avaliação por
citometria de fluxo
Análise
adicional por
espectrometria
de massas
Resultados
 Interação DNA-proteína
Amplificação de sequências de
DNA
Análise da interação por
citometria de fluxo
Sequência aleatória de 130pb
Ligação as beads
Sequência de 150pb de uma
região contendo um sítio forte de
ligação a Cdx2
Marcação com o
anticorpo anti-V5
Incubação com o
lisado contendo o FT
Cdx2 com o epítopo V5
Os FTs interagem
com sequências de
DNA contendo sítios
de ligação específicas
Resultados
 Para confirmar que a ligação do DNA ao FT Cdx2 é
dependente do sítio de ligação para Cdx2, foi analisado o
efeito de sítios de ligação mutados.
Sequências de 40pb com sítios de ligação
Cdx2 com um motif fraco e forte
Amplificação utilizando os primers
MagPIE biotinilados gerando uma
seqüência de 88 bp.
Resultados
 Somente a mutação do sítio de ligação forte diminui
a ligação ao FT
Resultados
 A ligação a outros fatores de transcrição (Sox2 e
Onecut1) com sítio de ligação mutada também foi
afetada.
Resultados
 Análise comparativa da afinidade de ligação da sequência
de DNA ao fator de transcrição
Seleção de 16 sequências com
afinidades variáveis ao sítio Cdx2
Incubação com o lisado
contendo o FT
Marcação e análise
por citometria de
fluxo
 A intensidade da imunofluorescência é relacionada ao
grau de afinidade com o sítio de ligação
Resultados
 Análise de múltiplos eventos epigenéticos
Resultados
 Metilação do DNA
 Sequências flanqueadoras de regiões com dinucleotídeos CG foram
amplificadas e marcadas com anticorpos contra citosinas metiladas
antes e após a incubação.
 A incubação com o lisado induz a reatividade da metil-citosina e pode
ser inibida com a pré-incubação do lisado com o inibidor de DNA
metiltransferase RG108.
Resultados
 Ligação das sequências de DNA a histonas após a
incubação com o lisado.
A análise de espectrometria de massas foi realizada
nas beads ligadas a sequências de DNA com o sítio
de ligação Cdx2 e sequências aleatórias de 88, 150 e
250 pb.
 Em todos os experimentos, histonas H1, H2 e H3
foram detectadas, indicando que ocorre a ligação de
histonas durante a realização da técnica analisada.
Resultados
 Foi analisado se sequência que possuíam a marcação para H3K4Me1
em células embrionárias apresentavam maior reatividade após
incubação com o lisado, o que foi posteriormente confirmado.
 Para isso, foram testadas 4 sequências com a marcação e 8 sequências
sem.
Resultados
 As sequências reativas apresentam uma região de 200pb com sítio de
ligação forte para o motif Sox-Oct, dois fatores de transcrição. As
sequências não reativas não apresentam este sítio de ligação.
Duplo positivo
Duplo negativo
 Logo, sabe-se que a sequência de H3K4Me1 apresenta sítio de ligação
para os FTs Sox-Oct.
Resultados
 Para testar a relação entre a ligação dos FT e a presença do marcador
H3K4Me1, foram sintetizadas sequências com mutações pontuais nos sítios de
ligação Oct e Sox2.
 Mutações no sítio Oct4 reduziram a reatividade para H3K4Me1 em maior grau
quando comparada com a mutação do sítio Sox2
 Além disso, a mutação no sítio Oct diminuiu a reatividade do FT Sox2,
indicando um relação de cofatores
 Isso indica que a metilação de histonas é dependente da ligação com FTs
(principalmente Oct4)
Resultados
 Para saber se as histonas são ligadas na forma de nucleossomos, foi
feita a digestão com Dnase I, uma vez que a presença de nucleossomos
impede a ação desta enzima.
 Uma região H3K4Me1 de 250 bp foi sintetizada e ligada as beads e
sujeitada a digestão com DNAse I antes e após a incubação com o
lisado. A incubação com o lisado impediu a digestão por DNAse I o que
sugere a presença de nucleossomos.
DNA ladder
Sequência de 250 pb com o
sítio de ligação Sox-Oct antes
de ser ligado as beads
Sequência após a ligação as
beads e incubação com o
lisado (não digerido)
Sequência após ligação as beads
e digestão com DNase
Resultados
 Para saber se ocorria a metilação das histonas durante o
MagPIE, foi realizado o ensaio na presença de um análogo
não hidrolisável do ATP (ATP gama S), o que diminuiu a
atividade da H3K4Me1, sugerindo que ocorre a metilação
das histonas durante a incubação com o lisado.
Discussão
 É possível monitorar as interações entre DNA e fatores de transcrição
pela técnica.
 Consiste em uma técnica rápida (resultados são obtidos após 2h), com
pequenas quantidades de proteína e cujos complexos DNA-FT são
estáveis por várias horas.
 Todos esses processos detectados estão relacionados a incubação com o
lisado nuclear bruto, uma vez que o mesmo possui as enzimas
catalizadoras
Discussão
 A técnica de MagPIE permite analisar:
1. metilação de histonas;
2. metilação do DNA;
3. ligação de fatores de transcrição;
4. ligação de histonas;
5. ligação de nucleosomos;
6. atuação de cofatores.
 A ligação de FTs são dependentes de sequências específicas.
Conclusão
 Como alguns citômetros podem ler >10 λ, a análise de simultâneas
interações pode ser visualizada por esta técnica.
 Espera-se que com o desenvolvimento de mais anticorpos para FTs e
modificações de histonas, tais eventos possam ser investigados de
forma mais aprofundada.
 De forma geral, esta continua sendo uma metodologia promissora para
a análise multi-paramétrica de interações e modificações do material
genético analisado.
Obrigada!