i
INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA – INPA
Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Botânica)
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FARMACOGNÓSTICA DOS ÓRGÃOS
VEGETATIVOS AÉREOS DE TRÊS ESPÉCIES DE Piper L. (PIPERACEAE):
PARÂMETROS DE AUTENTICIDADE E DE GRAU DE PUREZA PARA O
CONTROLE DE QUALIDADE
ROLF JUNIOR FERREIRA SILVA
Manaus, Amazonas
Janeiro, 2015
ii
ROLF JUNIOR FERREIRA SILVA
CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FARMACOGNÓSTICA DOS ÓRGÃOS
VEGETATIVOS AÉREOS DE TRÊS ESPÉCIES DE Piper L. (PIPERACEAE):
PARÂMETROS DE AUTENTICIDADE E DE GRAU DE PUREZA PARA O
CONTROLE DE QUALIDADE
ORIENTADORA: Dra. MARIA SÍLVIA DE MENDONÇA
COORIENTADORA: Dra. Ana Cristina Andrade de Aguiar-Dias
Tese apresentada ao Instituto Nacional de
Pesquisas da Amazônia como parte dos
requisitos para obtenção do título de Doutor
em Ciências Biológicas, área de concentração
em Botânica.
Manaus, Amazonas
Janeiro, 2015
iii
RELAÇÃO DA BANCA EXAMINADORA DA AULA DE QUALIFICAÇÃO:
Profa. Dra. Maria Gracimar Pacheco de Araújo (Universidade Federal do Amazonas)
Prof. Dr. Marcos Batista Machado (Universidade Federal do Amazonas)
Dr. Sergio Massayoshi Nunomura (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia)
Prof. Dr. Antônio Carlos Webber (Universidade Federal do Amazonas)
Dra. Maria de Lourdes da C. Soares (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia)
RELAÇÃO DA BANCA EXAMINADORA DA DEFESA PÚBLICA:
Profa. Dra. Maria Gracimar Pacheco de Araújo (Universidade Federal do Amazonas)
Dr. Sergio Massayoshi Nunomura (Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia)
Profa. Dra. Tatiane Pereira de Souza (Universidade Federal do Amazonas)
Dra. Poliana Roversi Genovese-Marcomini (Instituto Federal do Amazonas)
Profa. Dra. Débora Teixeira Ohana (Universidade Federal Fluminense)
iv
S586
Silva, Rolf Junior Ferreira
Caracterização Estrutural e Farmacognóstica dos Órgãos
Vegetativos Aéreos de Três Espécies de Piper L. (Piperaceae):
Parâmetros de Autenticidade e de Grau de Pureza para o Controle de
Qualidade / Rolf Junior Ferreira Silva. --- Manaus: [s.n.], 2015.
xvi, 123 p. : il. color.
Tese (Doutorado) --- INPA, Manaus, 2015.
Orientador: Maria Sílvia de Mendonça.
Coorientador: Ana Cristina Andrade de Aguiar-Dias.
Área de concentração: Botânica.
1. Morfologia vegetal. 2. Piperaceae. I. Título.
CDD 581.4
Sinopse:
O estudo estrutural e farmacognóstico das folhas e do caule de Piper arboreum Aubl.
var. arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. e P. tuberculatum Jacq. foi realizado para
estabelecer parâmetros de autenticidade e de grau de pureza ao controle de qualidade
das matérias-primas vegetais (planta medicinal e droga vegetal) dessas espécies.
Aspectos macro e microscópicos, histoquímicos e físico-químicos foram analisados.
Palavras-chave: Morfoanatomia. Estruturas secretoras. Histoquímica. Físico-química.
v
DEDICO
Aos meus pais Sra. Vera Regina e
Sr. Antônio Carlos, alicerces de minha vida.
À Dra. Raimunda Potiguara (in
memoriam), minha eterna e grande amiga.
Ao
Vinicius
meu
Brasil
grande
Campos,
amigo
Max
por
toda
compreensão e companheirismo durante esta
jornada.
vi
AGRADECIMENTOS
Ao UNO ABSOLUTO, força motriz que impulsiona o meu caminhar cotidiano
pari passu e que tem me mantido em retos pensamentos.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela concessão da bolsa de doutorado.
À coordenação do Programa de Pós-graduação em Botânica do Instituto Nacional
de Pesquisas da Amazônia (Pós-Bot/INPA), pelo empenho da melhoria do curso.
Ao Museu Paraense Emílio Goeldi (MPEG) e ao Instituto Evandro Chagas (IEC),
por permitirem o uso dos laboratórios para o desenvolvimento prático da tese.
Às minhas orientadoras e amigas Dra. Maria Sílvia de Mendonça e Dra. Ana
Cristina Andrade de Aguiar-Dias, pela confiança em mim depositada.
Ao corpo docente do Pós-Bot/INPA, pelos ensinamentos ministrados durantes as
disciplinas.
Ao amigo Dr. Hilton Túlio Costi, pelo valioso apoio ao ter-me fornecido a
estrutura física para o desenvolvimento da tese.
Ao amigo Dr. Francisco Berrêdo, pelo constante incentivo.
À Dra. Glória Melo - irmã amazonense- pela amizade, valioso apoio dado à minha
chegada a Manaus e por toda a atenção durante minha estadia nessa cidade.
Às minhas grandes mestras M.Sc. Cristiane Menezes, M.Sc. Eunice Macedo e
Dra. Adalgiza Alvarez, pelos ensinamentos e companheirismo ao longo de minha jornada
acadêmico-científica.
Ao Prof. Cid Aimbiré M. Santos (Editor-chefe da Revista Brasileira de
Farmacognosia), pelas valiosas opiniões para a estruturação do artigo que compõe o capítulo
três da tese.
Ao Prof. Dewey Litwiller (University of Saskatchewan Language CentreCanadá), pela revisão da língua inglesa dos artigos que compõem os capítulos dois e três da
tese.
Aos colegas do Pós-Bot/INPA, pela convivência, respeito e compartilhamento de
conhecimentos.
Às secretarias Sras. Neide, Jéssica e Léia, por serem sempre solícitas.
Os meus sinceros agradecimentos,
Muito obrigado!
vii
“Oxalá os astros me tratem tal como a
semente o faz ao campo e o campo à semente,
de forma que apareça ao mundo algum fruto
útil e glorioso do meu trabalho, por despertar
o espírito e abrir o sentimento àqueles que
estão privados de luz.”
Giordano Bruno
“Sou farmacêutico, porque gosto das pessoas.”
Carlos Drummond de Andrade
viii
Caracterização estrutural e farmacognóstica dos órgãos vegetativos aéreos de três
espécies de Piper L. (Piperaceae): parâmetros de autenticidade e de grau de pureza para
o controle de qualidade
Resumo. O objetivo deste estudo foi estabelecer parâmetros de autenticidade e de grau de
pureza para o controle de qualidade das folhas e do caule de Piper arboreum Aubl. var.
arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. e P. tuberculatum Jacq., espécies vegetais de ampla
utilização etnomedicinal, comercializadas como produtos tradicionais fitoterápicos e com
potencial químico e farmacológico para tornarem-se fitomedicamentos. Para tanto, amostras
de indivíduos férteis das três espécies foram coletadas em Manaus e Belém, processadas e
analisadas segundo protocolos padrões para microscopias de luz e eletrônica de varredura,
histoquímica, microanálises de Raios-X por dispersão de energia, espectrometria de emissão
ótica com plasma indutivamente acoplado e determinações físico-químicas de umidade, perda
por dessecação, pH e cinzas totais, sulfatadas e ácido-insolúveis. Aspectos como dimensões,
forma, cor, sabor, textura, características da superfície de fratura e da secção transversal e
padrões de venação foliar são caracteres morfodiagnósticos macroscópicos para as drogas
vegetais íntegras das espécies de Piper estudadas. Emergências calosas foliares em P.
callosum, assim como emergências glandulares foliares e caulinares em P. tuberculatum são
caracteres-chave à identificação macroscópica das drogas vegetais dessas espécies. Os
macropadrões cristalinos, os padrões de cera epicuticular e de flanges cuticulares, o tipo e
posição do colênquima, o padrão de organização dos feixes vasculares peciolares e a forma
em secção transversal da nervura central, margem foliar, pecíolo e caule são caracteres
morfodiagnósticos microscópicos tanto para as plantas medicinais como para as drogas
vegetais das três espécies, pois ambas as matérias-primas vegetais não diferiram
anatomicamente. A esses caracteres somam-se a presença de fibras subjacentes à epiderme e o
padrão de organização dos feixes vasculares na nervura central, bem como a morfologia dos
grãos de amido em P. callosum; os tipos de ornamentação cuticular e de tricomas tectores, o
padrão de organização dos feixes vasculares caulinares e o tipo de hilo dos grãos de amido em
P. arboreum var. arboreum e P. tuberculatum. Lipídios ácidos, óleos essenciais, mistura de
essências e resinas, esteroides, taninos e flavonoides são comuns às três espécies. Terpenoides
com grupo carbonila e alcaloides foram identificados apenas em P. arboreum var. arboreum e
P. tuberculatum respectivamente. Óleos-resina foram detectados em P. callosum e P.
tuberculatum. Os valores dos teores de umidade e voláteis e de cinzais totais, sulfatadas e
ácido-insolúveis das drogas vegetais das espécies estudadas estão dentro dos limites
permitidos e, geralmente, foram maiores nas drogas vegetais foliares que nas caulinares. As
concentrações dos metais analisados (alumínio, cádmio, cobalto, cromo, cobre, manganês,
molibdênio, níquel, chumbo, titânio, vanádio, mercúrio e arsênio) nas drogas vegetais das três
espécies estão abaixo dos níveis considerados tóxicos à saúde humana. Dentre esses metais,
alumínio, cobre, manganês e vanádio tiveram as maiores concentrações. O presente estudo
relatou pela primeira vez as características estruturais e farmacognósticas dos órgãos
vegetativos aéreos de Piper arboreum var. arboreum, P. callosum e P. tuberculatum, que
devem ser utilizadas como parâmetros seguros de autenticidade e de grau de pureza para o
controle de qualidade das matérias-primas vegetais, planta medicinal e droga vegetal, dessas
espécies.
Palavras-chave: elixir paregórico, pimentas longas, morfoanatomia, estruturas secretoras,
histoquímica, drogas vegetais, análises físico-químicas, metais potencialmente tóxicos.
ix
Structural and pharmacognostical characterization of the aerial vegetative organs of
three Piper L. species (Piperaceae): authenticity and purity degree parameters for their
quality control
Abstract. The purpose this study was to establish authenticity and purity degree parameters
for the quality control of Piper arboreum Aubl. var. arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. and
P. tuberculatum Jacq leaves and stem, plant species of large ethno-medicinal usage, currently
being traded as traditional phytotherapeutic products, and with chemical and pharmacological
potential to become phytomedicines. Fertile samples of the three Piper species were collected
in Belém and Manaus states. The samples were processed and analyzed according to standard
methods for light and scanning electron microscopies, histochemistry, energy-dispersive Xray spectroscopic microanalyses, inductively coupled plasma optical emission spectrometry,
and physicochemical determinations, such as moisture, pH, loss on drying, and total,
sulphated and acid-insoluble ash. Size, shape, color, texture, fracture surface and transection
characteristics, and leaf venation patterns are macroscopic morpho-diagnostic characters to
identify the herbal drugs of the studied Piper species when they are not ground or powdered.
Leaf callosus emergences in P. callosum and leaf and stem glandular emergences in P.
tuberculatum are key-characters to identify the whole herbal drugs of both species. Since
medicinal plants and herbal drugs do not differ anatomically, the following characters for the
studied Piper species can be used for microscopic morpho-diagnosis purposes of both types
raw plant materials: crystal macropatterns; epicuticular wax and cuticular flanges patterns;
type and position of the collenchyma; arrangement pattern of the vascular bundles of the
petiole; shape in transection of the midrib, leaf margin, petiole, and stem. In addition to these
characters are: the occurrence of fibers immediately beneath the epidermis, and arrangement
pattern of the vascular bundles in the midrib as well as starch grain morphology in P.
callosum; the types of cuticular ornamentation and non-glandular trichomes, arrangement
pattern of the stem vascular bundles, and type of hilum of the starch grains in P. arboreum
var. arboreum and P. tuberculatum. Acid lipids, essential oils, mixture of essentials and
resins, steroids, tannins, and flavonoids are common metabolic compounds for the three Piper
species. Terpenoids with carbonyl group and alkaloids were identified only in P. arboreum
var. arboreum and P. tuberculatum, respectively. Oleoresins were detected in P. callosum and
P. tuberculatum. The moisture, volatile, and total, sulphated and acid-insoluble ash values of
the herbals drugs of these species are within the permissible limits. In general, these values
were higher in the leaf herbal drugs than in the stem herbal drugs. The metal levels analyzed
(aluminum, cadmium, cobalt, chromium, copper, manganese, molybdenum, nickel, lead, tin,
vanadium, mercury and arsenic) in the herbal drugs of the studied Piper species are below the
toxic levels for human health. The highest metal levels were of aluminum, copper, manganese
and vanadium. The structural and pharmacognostical characteristics reported herein for first
time for Piper arboreum var. arboreum, P. callosum, and P. tuberculatum should be used as
safe parameters of authenticity and purity degree for the quality control of the raw plant
materials (i.e. medicinal plants and herbal drugs) of these species.
Keywords: “elixir paregórico,” “pimentas longas,” morphoanatomy, secretory structures,
histochemistry, herbal drugs, physicochemical analyses, potentially toxic metals.
x
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS E QUADROS ................................................................................ xii
LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................ XIV
1. INTRODUÇÃO GERAL.................................................................................................. 1
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 4
CAPÍTULO 1 ....................................................................................................................... 6
Rosetas e concrescências cristalinas silicificadas em Piper (Piperaceae): registros inéditos de
macropadrões ......................................................................................................................... 7
INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 8
MATERIAL E MÉTODOS ......................................................................................................... 10
Resultados ........................................................................................................................... 12
Discussão ............................................................................................................................. 14
Conclusões........................................................................................................................... 18
Bibliografia Citada ............................................................................................................... 19
Tabelas ................................................................................................................................ 21
Figuras ................................................................................................................................. 25
CAPÍTULO 2 ..................................................................................................................... 30
Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae: macroscopic, microscopic and physicochemical
analysis of leaves and stem for their quality control ............................................................. 31
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 32
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................ 33
Resultados ........................................................................................................................... 36
Discussão ............................................................................................................................. 41
Conclusão ............................................................................................................................ 44
Referências .......................................................................................................................... 45
Quadros E Tabelas ............................................................................................................... 50
Figuras ................................................................................................................................. 55
xi
CAPÍTULO 3 ..................................................................................................................... 65
Comparative pharmacognosy of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and Piper tuberculatum
Jacq., Piperaceae: morphoanatomical and physicochemical analysis for their quality control
........................................................................................................................................... .66
INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 67
MATERIAIS E MÉTODOS ........................................................................................................ 68
Resultados E Discussão........................................................................................................ 71
Conclusão ............................................................................................................................ 76
Referências .......................................................................................................................... 77
Quadros E Tabelas ............................................................................................................... 82
Figuras ................................................................................................................................. 91
3. SÍNTESE ...................................................................................................................... 107
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................................ 110
ANEXOS................................................................................................................................121
xii
LISTA DE TABELAS E QUADROS
Capítulo 1:
Rosetas e concrescências cristalinas silicificadas em Piper (Piperaceae): registros inéditos de
macropadrões
Tabela 1. Morfotipos, padrões de composição química elementar e macropadrões dos cristais
caulinares e foliares observados em Piper (Piperaceae)...........................................................22
Tabela 2. Categorias dos macropadrões cristalinos caulinares e foliares observados em Piper
(Piperaceae)...............................................................................................................................23
Tabela 3. Composição química elementar e caracterização histoquímica dos morfotipos de
cristais caulinares e foliares observados em Piper (Piperaceae)...............................................24
Capítulo 2:
Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae: macroscopic, microscopic and physicochemical
analysis of leaves and stems for their quality control
Quadro 1. Triagem histoquímica realizada nas folhas e no caule de Piper callosum Ruiz &
Pav., Piperaceae (Histochemical screening performed in leaves and stem of Piper callosum
Ruiz & Pav., Piperaceae)..…………………………………………………………………....51
Quadro 2. Resultados da triagem histoquímica realizada nas folhas e no caule de Piper
callosum Ruiz & Pav., Piperaceae (Results of the histochemical screening performed in leaves
and stem of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae).............................……………………52
Tabela 1. Resultados dos parâmetros físico-químicos determinados nas drogas vegetais de
Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae (Results of physicochemical parameters determined
in herbal drugs of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae)................................…………..53
Tabela 2. Resultados da determinação de metais das drogas vegetais de Piper callosum Ruiz
& Pav., Piperaceae (Results of determination of metals in herbal drugs of Piper callosum Ruiz
& Pav., Piperaceae)....................................................................……………………………54
xiii
Capítulo 3:
Comparative pharmacognosy of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and Piper tuberculatum
Jacq., Piperaceae: morphoanatomical and physicochemical analysis for their quality control
Quadro 1. Triagem histoquímica realizada nas folhas e no caule de Piper arboreum Aubl. var.
arboreum e P. tuberculatum Jacq., Piperaceae (Histochemical screening performed in leaves
and stem of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and P. tuberculatum Jacq.,
Piperaceae)................................................................................................................................83
Quadro 2. Características macroscópicas comparativas das drogas vegetais íntegras de Piper
L., Piperaceae (Comparative macroscopic characteristics of the whole herbal drugs of Piper
L., Piperaceae)...........................................................................................................................84
Quadro 3. Características anatômicas comparativas de Piper L., Piperaceae (Comparative
anatomical characteristics of Piper L., Piperaceae)..................................................................85
Quadro 4. Resultados da triagem histoquímica realizada nas folhas e no caule de Piper
arboreum Aubl. var. arboreum, Piperaceae (Results of the histochemical screening performed
in
leaves
and
stem
of
Piper
arboreum
Aubl.
var.
arboreum,
Piperaceae)......................................................………………………………………………..86
Quadro 5. Resultados da triagem histoquímica realizada nas folhas e no caule de Piper
tuberculatum Jacq., Piperaceae (Results of the histochemical screening performed in leaves
and stem of Piper tuberculatum Jacq., Piperaceae)..................……………………………....87
Quadro 6. Características microscópicas comparativas das drogas vegetais pulverizadas de
Piper L., Piperaceae (Comparative microscopic characteristics of the powdered herbal drugs
of Piper L., Piperaceae)............................................................................................................88
Tabela 1. Resultados dos parâmetros físico-químicos determinados nas drogas vegetais de
Piper L., Piperaceae (Results of physicochemical parameters determined in herbal drugs of
Piper L., Piperaceae).................................................................................................................89
Tabela 2. Resultados da determinação de metais das drogas vegetais de Piper L., Piperaceae
(Results
of
determination
of
metals
in
herbal
drugs
of
Piper
L.,
Piperaceae)................................................................................................................................90
xiv
LISTA DE FIGURAS
Capítulo 1:
Rosetas e concrescências cristalinas silicificadas em Piper (Piperaceae): registros inéditos de
macropadrões
Figura 1. Eletromicrografias de varredura dos morfotipos de cristais observados nas secções
transversais dos órgãos vegetativos aéreos de Piper L. (Piperaceae).......................................26
Figura 2. Espectros das microanálises químicas por EDS (Energy Dispersive Spectroscopy)
feitas nos cristais (A-E) e em células sem cristais (F) dos órgãos vegetativos aéreos de Piper
(Piperaceae), mostrando os padrões de composição química elementar (PCE).......................27
Figura 3. Fotomicrografias de secções transversais dos órgãos vegetativos aéreos de Piper
(Piperaceae), evidenciando cristais com reação de Yasue positiva e anisotropia
óptica.........................................................................................................................................28
Figura 4. Dendograma da quimiometria por HCA (Hierarchical Cluster Analysis) realizada
nos morfotipos cristalinos dos órgãos vegetativos aéreos de Piper (Piperaceae).....................29
Capítulo 2:
Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae: macroscopic, microscopic and physicochemical
analysis of leaves and stem for their quality control
Figura 1. Características macroscópicas das drogas vegetais foliares de Piper callosum Ruiz
& Pav., Piperaceae (Macroscopic features of the leaf herbal drugs of Piper callosum Ruiz &
Pav., Piperaceae).......................................................................................................................56
Figura 2. Características macroscópicas das drogas vegetais caulinares de Piper callosum
Ruiz & Pav., Piperaceae (Macroscopic features of the stem herbal drugs of Piper callosum
Ruiz & Pav., Piperaceae)..........................................................................................................57
Figura 3. Vista frontal da epiderme da lâmina foliar de Piper callosum Ruiz & Pav.,
Piperaceae (Frontal view of the epidermis of the leaf blade of Piper callosum Ruiz & Pav.,
Piperaceae)................................................................................................................................58
Figura 4. Secções transversais da lâmina foliar de Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae
(Transections of the leaf blade of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae)...........................59
xv
Figura 5. Pecíolo de Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae (Petiole of Piper callosum Ruiz
& Pav., Piperaceae)...................................................................................................................60
Figura 6. Bainha foliar de Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae (Leaf sheath of Piper
callosum Ruiz & Pav., Piperaceae)...........................................................................................61
Figura 7. Caule de Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae (Stem of Piper callosum Ruiz &
Pav., Piperaceae).......................................................................................................................62
Figura 8. Fotomicrografias de secções transversais das folhas e do caule de Piper callosum
Ruiz & Pav., Piperaceae, mostrando resultados fortemente positivos dos testes histoquímicos
(Photomicrographs of transections of leaves and stem of Piper callosum Ruiz & Pav.,
Piperaceae, showing intense positive results from histochemical tests)...................................63
Figura 9. Características microscópicas das drogas vegetais pulverizadas de Piper callosum
Ruiz & Pav., Piperaceae (Microscopic features of the powdered herbal drugs of Piper
callosum Ruiz & Pav., Piperaceae)...........................................................................................64
Capítulo 3:
Comparative pharmacognosy of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and Piper tuberculatum
Jacq., Piperaceae: morphoanatomical and physicochemical analysis for their quality control
Figura 1. Características macroscópicas das drogas vegetais foliares de Piper arboreum Aubl.
var. arboreum, Piperaceae (Macroscopic features of the leaf herbal drugs of Piper arboreum
Aubl. var. arboreum, Piperaceae).............................................................................................92
Figura 2. Características macroscópicas das drogas vegetais foliares de Piper tuberculatum
Jacq., Piperaceae (Macroscopic features of the leaf herbal drugs of Piper tuberculatum Jacq.,
Piperaceae)................................................................................................................................93
Figura 3. Características macroscópicas das drogas vegetais caulinares de Piper arboreum
Aubl. var. arboreum, Piperaceae (Macroscopic features of the stem herbal drugs of Piper
arboreum Aubl. var. arboreum, Piperaceae)............................................................................94
Figura 4. Características macroscópicas das drogas vegetais caulinares de Piper tuberculatum
Jacq., Piperaceae (Macroscopic features of the stem herbal drugs of Piper tuberculatum Jacq.,
Piperaceae)................................................................................................................................95
Figura 5. Vista frontal da epiderme da lâmina foliar de Piper L., Piperaceae (Frontal view of
the epidermis of the leaf blade of Piper L., Piperaceae)...........................................................96
xvi
Figura 6. Fotomicrografias de secções transversais da lâmina foliar de Piper L., Piperaceae
(Photomicrographs of transections of the leaf blade of Piper L., Piperaceae).........................97
Figura 7. Pecíolo de Piper L., Piperaceae (Petiole of Piper L., Piperaceae)............................98
Figura 8. Bainha foliar de Piper L., Piperaceae (Leaf sheath of Piper L., Piperaceae)............99
Figura 9. Caule de Piper L., Piperaceae (Stem of Piper L., Piperaceae)................................100
Figura 10. Fotomicrografias por luz polarizada de secções transversais das folhas e do caule
de Piper L., Piperaceae, mostrando drusas e cristais prismáticos birrefringentes
(Photomicrographs by polarized light of transections of leaves and stem of Piper L.,
Piperaceae, showing birefringent druses and prismatic crystals)............................................101
Figura 11. Estruturas secretoras de Piper L., Piperaceae (Secretory structures of Piper L.,
Piperaceae)..............................................................................................................................102
Figura 12. Fotomicrografias de secções transversais das folhas e do caule de Piper arboreum
Aubl. var. arboreum, Piperaceae, mostrando resultados fortemente positivos dos testes
histoquímicos (Photomicrographs of transections of leaves and stem of Piper arboreum Aubl.
var.
arboreum,
Piperaceae,
showing
intense positive
results
from
histochemical
tests)........................................................................................................................................103
Figura 13. Fotomicrografias de secções transversais das folhas e do caule de Piper
tuberculatum Jacq., Piperaceae, mostrando resultados fortemente positivos dos testes
histoquímicos (Photomicrographs of transections of leaves and stem of Piper tuberculatum
Jacq.,
Piperaceae,
showing
intense
positive
results
from
histochemical
tests)........................................................................................................................................104
Figura 14. Características microscópicas das drogas vegetais pulverizadas de Piper arboreum
Aubl. var. arboreum, Piperaceae (Microscopic features of the powdered herbal drugs of Piper
arboreum Aubl. var. arboreum, Piperaceae)..........................................................................105
Figura 15. Características microscópicas das drogas vegetais pulverizadas de Piper
tuberculatum Jacq., Piperaceae (Microscopic features of the powdered herbal drugs of Piper
tuberculatum Jacq., Piperaceae)..............................................................................................106
1
1. INTRODUÇÃO GERAL
A Amazônia é detentora de inúmeras espécies com potencial econômico,
especialmente as medicinais e aromáticas, e mesmo assim configura, ainda, como uma região
em desigualdade científica, tecnológica e econômica em relação às demais, principalmente sul
e sudeste. Há a necessidade da identificação botânica correta das espécies, de fazer-se o
inventário de estruturas secretoras de biocompostos e do controle de qualidade de produtos e
insumos farmacêuticos oriundos de vegetais, visando assegurar à saúde de quem utiliza
plantas e/ou derivados vegetais como fitoterápicos ou como alimentos.
Inúmeras famílias botânicas nativas e aclimatadas têm sido utilizadas como
recursos terapêuticos pela população amazônica, destacando-se aquelas produtoras de óleos
essenciais (Berg, 2010). Segundo Maia et al. (1987), das quase 280 espécies de plantas
medicinais produtoras de óleos essenciais, 60% pertencem à Piperaceae que é considerada
uma família de reputada importância econômica, cujos representantes são de interesse
medicinal, culinário e ornamental (Pio Corrêa, 1984).
Piperaceae compreende cerca de 2500 espécies em cinco gêneros (Piper L.,
Peperomia Ruiz & Pav., Sarcorhachis Trel., Zippelia Blume e Macropiper (Miq.) Dahlst.),
com táxons amplamente distribuídos e outros endêmicos (Tebbs, 1989a; Jaramillo e Manos,
2001). Possui distribuição pantropical, com maior número de espécies ocorrendo na região
neotropical, sendo as Américas Central e do Sul os principais centros de diversidade da
família (Jaramillo e Manos, 2001). No Brasil, Piperaceae está representada por cerca de 700
espécies pertencentes a três gêneros (Piper, Peperomia e Sarcorhachis) amplamente
distribuídos no território nacional (Tebbs, 1989b).
Piper é o maior gênero de Piperaceae, com aproximadamente 500 das 2500
espécies da família. Grande parte dessas espécies possui valor econômico indiscutível como
medicinal, cosmético, inseticida e condimento devido, principalmente, à produção de óleos
essenciais (Yuncker, 1972; 1973; Silva e Machado, 1999). Embora espécies de Piper sejam
relativamente bem estudadas sob os aspectos fitoquímicos e farmacológicos, raros são os
trabalhos morfoanatômicos e químicos para fins de controle de qualidade dessas espécies
enquanto matérias-primas vegetais.
Piper está bem estudado no Brasil sob o ponto de vista taxonômico, com destaque
aos trabalhos de Yuncker (1972; 1973), Guimarães et al. (1984; 1992), Guimarães (1993;
1994a; 1994b; 1997; 1999), Guimarães e Miguel (2000), Guimarães e Valente (2001),
Ruschel (2004) e Medeiros (2006). Mesmo assim, a grande semelhança morfológica entre as
2
espécies desse gênero contribui para problemas de identificação, troca e até mesmo
falsificação quando as espécies coletadas de populações naturais são comercializadas como
medicinais (Albiero et al., 2005). Tal problema é bastante crítico com as espécies de Piper na
Amazônia, dado à diversidade de ecotipos que apresentam entre e dentre os ecossistemas que
compõem a região, a citar como exemplos P. arboreum Aubl. var. arboreum, P. callosum
Ruiz & Pav. e P. tuberculatum Jacq.
Os indexadores bibliográficos mostram um elevado número de estudos
fitoquímicos
para
Piper,
sendo
identificados
e
isolados
alcaloides,
flavonoides,
fenilpropanoides, lignanas, neolignanas, ésteres, esteroides, terpenos, derivados do ácido
benzoico e outros (Andrade et al. 2009; Facundo et al., 2004; 2005; 2006; 2008; BarbosaFilho et al., 2008; Regasini et al., 2008; 2009). Grande parte desses metabólitos secundários
está presente nas espécies de Piper mencionadas acima e investigações farmacológicas
comprovaram a bioatividade desses biocompostos como antiparasitário (tripanocida),
antifúngico (fungicida e fungistático), inseticida (ovicida, larvicida e moluscolicida),
antimalárico, repelente, sedativo, ansiolítico, antidepressor, antiespasmódico e antioxidante
(Richtzenhain, 1989; Capron e Wiemer, 1996; Facundo, 2005; Felipe et al., 2007; Andrade et
al., 2009; Regasini et al., 2008; 2009).
Enquanto crescem os estudos fitoquímicos e farmacológicos, os trabalhos
anatômicos e farmacognósticos sobre Piper são escassos. Assim, demais características
estruturais diagnósticas, aspectos farmacognósticos e possíveis sítios de acúmulo e/ou síntese
de substâncias biologicamente ativas do gênero tornam-se praticamente desconhecidos,
evidenciando a importância da ampliação de tais conhecimentos às espécies de Piper.
Solereder (1908) e Metcalfe e Chalk (1950) relataram como relevantes para a
diagnose dos órgãos vegetativos aéreos de Piper a ocorrência de tricomas tectores,
glandulares e de glândulas peroladas com conteúdo oleífero, de cristais de oxalato de cálcio
nas formas de drusas e prismas, bem como folhas sempre hipoestomáticas com mesofilo
dorsiventral. Todas as descrições dos autores foram baseadas em espécies da América do
Norte e Europa, não havendo citações sobre espécies da Américas Central e do Sul,
negligenciando, assim, outras possíveis características diagnósticas.
As estruturas secretoras são de grande importância à farmacognosia, pois atuam
como caractere diagnóstico para confirmar ou não a autenticidade do material vegetal
medicinal (Fahn, 1979; Dickson 2000; Oliveira e Akisue, 2003). Em adição, o
reconhecimento das estruturas secretoras e o diagnóstico in situ do conteúdo químico nelas
3
presentes possibilitam justificar ambos a(s) parte(s) ou órgão(s) vegetal(s) utilizado(s) pela
população e os usos terapêuticos tradicionais.
Além da autenticidade botânica da amostra vegetal, a verificação da pureza é
igualmente necessária para a avaliação da qualidade de matérias-primas vegetais. Análises de
teor de umidade e voláteis, de cinzais, pesquisa de metais tóxicos, dentre outras, são prérequisitadas pelas agências reguladoras oficiais para materiais vegetais medicinais (WHO,
1998; ANVISA, 2010; Farmacopeia Brasileira, 2010). Sendo assim, os parâmetros de
autenticidade botânica e de grau de pureza são as bases do controle de qualidade e garantem a
segurança, eficácia e qualidade das plantas medicinais, das drogas vegetais e de seus
derivados (Leśniewicz et al., 2006).
O aumento pelo interesse da flora da biodiversidade brasileira, especialmente por
plantas medicinais, drogas vegetais, derivados vegetais e nutracêuticos, o estímulo à
implementação e ao uso de farmácias vivas, a implantação no Sistema Único de Saúde (SUS)
da Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares (PNPIC) (Brasil, 2006), a
Relação Nacional de Plantas Medicinais de Interesse ao SUS (RENISUS, 2009), as resoluções
RDC nº 10 de 09/03/2010, RDC nº 14 de 31/03/2010 e mais recentemente a RDC nº 26 de
13/05/2014 (ANVISA, 2010a; 2010b; 2014) fizeram crescer o volume de publicações
referentes à etnobotânica, etnofarmacologia, determinação estrutural e ensaios sobre atividade
biológica de biocompostos, análise de marcadores estruturais (morfoanatômicos) e
quimiotaxonômicos para controle de qualidade, avaliação da qualidade e da segurança clínica
e toxicidade de fitoterápicos, interações medicamentosas entre fitoterápicos e fármacos,
descontaminação de fitoterápicos, suplemento alimentar, desenvolvimento de formulações a
base de plantas entre outras conforme mostram os indexadores bibliográficos (Pupo et al.,
2007).
Apesar do quadro apresentado acima, a maioria dos fitoterápicos regularizada pelo
governo brasileiro é de origem exótica, o que reflete uma grande lacuna: os estudos sobre a
flora medicinal brasileira, principalmente de importantes domínios fitogeográficos como a
Amazônia, são ainda incipientes frente às exigências em segurança, eficácia e qualidade
estabelecidas pelas agências reguladoras oficiais.
Ademais, pesquisas com plantas medicinais tornam-se cada vez mais necessárias e
relevantes. Estimativas da Organização Mundial da Saúde (WHO, 2002) mostraram que 7080% da população mundial, principalmente de países em desenvolvimento, utilizam fontes
vegetais para atender às suas necessidades de cuidados primários à saúde. Se essa estimativa
fosse atualizada para os dias atuais, tal percentual, provavelmente, teria um acréscimo.
4
Entretanto, como o uso indiscriminado de plantas medicinais sem qualquer suporte
técnico/científico pode acarretar resultados desastrosos à saúde humana, torna-se
imprescindível e estratégica a realização de pesquisas que garantam à população o acesso à
matéria-prima vegetal (planta medicinal, droga vegetal e derivado vegetal) e a fitoterápicos
(medicamentos fitoterápicos e produtos tradicionais fitoterápicos) de qualidade, seguros e
eficazes.
Piper callosum, vernaculamente denominada de “elixir paregórico” e “matrica,”
P. arboreum var. arboreum e P. tuberculatum, chamadas em geral de “pimentas longas” ou
“pimenta de água,” “pimenta de arta,” “pimenta de ardo” e “pimenta de arda” (P.
tuberculatum) e “pau de angola,” “alecrim de angola,” “jaborandi,” “jaborandi do rio,”
“jaborandi-pimenta,”
jaborandi-falso,”
“pimenta
do
mato,”
“pimenta
de
índio,”
“nhamboarndi,” “palim,” “raiz de pahiu” e “fruto de morcego” (P. arboreum var. arboreum)
(Regasini et al., 2009; Paes-Gonçalves et al., 2012), são espécies medicinais e aromáticas
com potencial terapêutico e químico para tornassem-se fitomedicamentos, principalmente
medicamentos fitoterápicos, cujas folhas e caules são comercializadas em feiras livres e
ervanários sob a forma de garrafadas, desidratados ou in natura para o uso medicinal e banhos
aromáticos. Como não há dados histológicos e físico-químicos que auxiliem, respectivamente,
na identificação botânica e verificação do grau de pureza dessas espécies, considerados prérequisitos básicos para obtenção de registro e notificação de fitoterápicos (ANVISA, 2010),
tornam-se imprescindíveis estudos estruturais e farmacognósticos que visem gerar dados que
contribuam, de forma efetiva e significativa, ao controle de qualidade dessas matérias-primas
vegetais nas formas de planta medicinal e de droga vegetal.
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
Realizar um estudo estrutural e farmacognóstico dos órgãos vegetativos aéreos de
Piper arboreum Aubl. var. arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. e P. tuberculatum Jacq.,
visando estabelecer parâmetros de autenticidade e de grau de pureza para o controle de
qualidade das matérias-primas vegetais (planta medicinal e droga vegetal) dessas espécies.
5
2.2 Específicos

Caracterizar microscopicamente folhas e caule das espécies em questão;

Localizar nas três espécies as estruturas secretoras foliares e caulinares que atuam
como sítios de armazenamento e/ou síntese de metabólicos;

Detectar através da triagem histoquímica as principais classes de substâncias presentes
nas estruturas secretoras foliares e caulinares das espécies estudadas;

Preparar e caracterizar macro e microscopicamente as drogas vegetais padrões
(íntegras e pulverizadas) obtidas das folhas e do caule das espécies estudadas;

Determinar os valores de pH, de voláteis a 105 ºC, de umidade e de cinzais totais,
sulfatadas e ácido-insolúveis das drogas vegetais foliares e caulinares das três
espécies;

Determinar as concentrações de metais potencialmente tóxicos (Al, Cd, Co, Cr, Cu,
Mn, Mo, Ni, Pb, Ti, V, Hg e As) nas drogas vegetais foliares e caulinares das espécies
em questão.
Esses objetivos são abordados em três capítulos distintos e conjuntamente avaliados na
síntese:
Capítulo 1: Rosetas e concrescências cristalinas silicificadas em Piper (Piperaceae): registros
inéditos de macropadrões;
Capítulo 2: Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae: macroscopic, microscopic and
physicochemical analysis of leaves and stem for their quality control;
Capítulo 3: Comparative pharmacognosy of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and Piper
tuberculatum Jacq., Piperaceae: morphoanatomical and physicochemical analysis for their
quality control.
6
Capítulo 1
___________________________________________________________________________
Silva, R.J.F.; Aguiar-Dias, A.C.A. & Mendonça, M.S. 2014. Rosetas e concrescências
cristalinas silicificadas em Piper (Piperaceae): registros inéditos de macropadrões. Acta
Amazonica 44: 435-446.
7
Rosetas e concrescências cristalinas silicificadas em Piper (Piperaceae):
registros inéditos de macropadrões
Rolf Junior Ferreira SILVA1*, Ana Cristina Andrade de AGUIAR-DIAS2, Maria Sílvia de
MENDONÇA3
1
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Coordenação de Botânica. Av. André Araujo,
2936,
Aleixo,
CEP:
69060-001.
Manaus,
AM,
Brasil.
*Autor
Correspondente:
[email protected]
2
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas. Av. Perimetral, 2501,
Montese, CEP: 66077-530. Belém, PA, Brasil.
3
Universidade Federal do Amazonas, Faculdade de Ciências Agrárias. Av. Gal. Rodrigo
Octávio Jordão Ramos, 3000, Setor Sul, Coroado I, CEP: 69077-000. Manaus, AM, Brasil.
Resumo
Piper L. (Piperaceae) é monofilético, com espécies de difícil distinção taxonômica, sendo
necessárias ferramentas que auxiliem a identificação interespecífica. Os objetivos do trabalho
foram descrever os macropadrões e caracterizar in situ a composição química dos cristais
caulinares e foliares de Piper arboreum Aubl. var. arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. e P.
tuberculatum Jacq., visando avaliar o uso dos cristais para a separação interespecífica. Para
tanto, amostras foram submetidas à análise em microscopias de luz e eletrônica de varredura,
microanálises espectroscópicas de raios-X por dispersão de energia e testes histoquímicos.
Foram observados cristais prismáticos cuneiformes, tabulares, cúbicos e bipiramidais; ráfides;
estiloides; drusas de cristais em bloco; rosetas cristalinas de estiloides e concrescências
cristalinas. Foram descritos 15 macropadrões cristalinos reunidos em três categorias. Os
cristais foram classificados quimicamente como: puros de oxalato de cálcio e misturas entre
oxalatos e sulfatos e entre oxalatos, sulfatos e sílica. Rosetas cristalinas, concrescências
cristalinas silicificadas e 14 dos 15 macropadrões cristalinos descritos são registros inéditos
para inclusões biominerais de Piper e Piperaceae. Os macropadrões cristalinos caulinares e
foliares observados são constitutivos e úteis à separação interespecífica das espécies
8
estudadas. Ademais, os cristais desempenham funções relevantes para a autoecologia dos taxa
de Piper analisados.
Palavras-Chave: Cristais, MEV-EDS, Histoquímica, Quimiometria.
Silicified crystal concretions and rosettes in Piper (Piperaceae): unpublished reports on their
macropatterns
Abstract
Piper L. (Piperaceae) is monophyletic, with species of difficult taxonomic distinction, and
thus tools that facilitate interspecific identification are needed. The aims of this study were to
describe the macropatterns and characterize in situ the chemical composition of leaf and stem
crystals of Piper arboreum Aubl. var. arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. and P.
tuberculatum Jacq., in order to evaluate the use of the crystals on interspecific distinction.
Samples were submitted to analyses under light and scanning electron microscopies, energydispersive x-ray spectroscopic microanalyses, and histochemical tests. We observed
cuneiform, tabular, cubic, and bipiramidal prismatic crystals; raphides; styloids; blocky
crystal druses; styloid crystal rosettes; and crystal concretions. We described 15 crystal
macropatterns, which were distributed along three categories. The crystals were chemically
classified as: pure calcium oxalate; and mixtures of oxalates and sulfates, and of oxalates,
sulfates and silica. Crystal rosettes, silicified crystal concretions, and 14 out of the 15
macropatterns described are unpublished reports on biomineral inclusions in Piper and
Piperaceae. The stem and leaf crystal macropatterns observed are constitutive and useful for
interspecific separation of the studied species. Moreover, the crystals present relevant
functions for the autecology of the analyzed taxa from Piper.
Keywords: Crystals, SEM-EDS, Histochemistry, Chemometrics.
Introdução
A biomineralização é um processo comum nos vegetais e ocorre no interior da
câmara vacuolar dos idioblastos cristalíferos (Franceschi e Nakata 2005). Em geral, apenas
um morfotipo cristalino ocorre por idioblasto, mas a coexistência de dois morfotipos
cristalinos no mesmo idioblasto (idioblastos cristalíferos duplos) foi relatada (Lersten e
9
Horner 2011). O cálcio é predominante na biomineralização vegetal e minerais de cálcio
compreendem cerca de 50% dos biominerais conhecidos (Weiner e Dove 2003). Sílica e
cristais de oxalato e carbonato de cálcio estão entre os biominerais mais abundantes nos
vegetais (Weiner e Dove 2003). Em contraste, cristais de sulfato de cálcio e oxalato de
magnésio são citados como raros nos vegetais (He et al. 2012).
Funções de balanço iônico celular; regulação osmótica; defesa vegetal contra
herbivoria; suporte mecânico tissular; detoxificação de alumínio e metais pesados; captação e
reflexão da energia solar são atribuídas aos cristais de oxalato de cálcio (Franceschi e Nakata
2005). Funções de remoção do excesso citosólico de magnésio e enxofre para cristais de
oxalato de magnésio e sulfato de cálcio, respectivamente, e de defesa vegetal contra
patógenos para cristais de sulfato de cálcio têm sido sugeridas (Pritchard et al. 2000; He et al.
2012).
Os macropadrões cristalinos, por serem taxa específicos e determinados pela
expressão gênica durante a ontogenia vegetal, são relevantes em investigações sistemáticas,
filogenéticas e ecofisiológicas de várias famílias vegetais (Lersten e Horner 2011). No
entanto, para Piperaceae, particularmente em Piper L., os cristais são descritos de forma
genérica ou como observações incidentais. Estudos de Horner et al. (2012) demonstram que
os macropadrões cristalinos possuem significância taxonômica e filogenética para Piper, além
do valor funcional. Nesses estudos, análises in situ da composição química dos cristais são
escassas ou ausentes embora sejam fundamentais para se compreender o significado funcional
que possuem para a biologia das espécies.
Piper é monofilético, com partes florais diminutas e uniformidade morfológica
dos órgãos vegetativos que geram problemas taxonômicos ao grupo (Jaramillo e Manos 2001;
Gogosz et al. 2012). Portanto, outras ferramentas podem ser úteis para a identificação
específica. Deste modo, o presente trabalho objetivou descrever os macropadrões e
caracterizar in situ a composição química dos cristais caulinares e foliares de Piper arboreum
Aubl. var. arboreum, P. callosum Ruiz & Pav. e P. tuberculatum Jacq., visando avaliar o uso
potencial dos cristais para a separação interespecífica. As possíveis funções biológicas dos
cristais nessas três espécies foram também propostas.
10
Material e Métodos
Amostras férteis de Piper arboreum var. arboreum, P. callosum e P. tuberculatum
foram coletadas nas cidades de Manaus (AM) e Belém (PA). Foram analisados 14 indivíduos
por espécie, sendo sete para cada área amostrada. Material testemunho foi depositado no
herbário João Murça Pires (MG) do Museu Paraense Emílio Goeldi com as seguintes
especificações: P. arboreum var. arboreum (MG 206890), P. callosum (MG 206892) e P.
tuberculatum (MG 206891). Duplicatas foram também depositadas no herbário do Instituto
Nacional de Pesquisas Amazônicas (Herbário INPA).
Para o estudo dos biominerais, amostras retiradas ao longo da lâmina (nervura
central, margem e região entre nervura central e margem), do pecíolo e da bainha (regiões
proximal, distal e mediana) de folhas totalmente expandidas do 4º nó, bem como da região
mediana de caules do 4º entrenó, foram lavadas exaustivamente com água ultrapura após
coleta e, em seguida, fixadas em F.A.A.70 (formaldeído PA, ácido acético PA e etanol 70%,
1:1:18 (v/v)) por 24 horas, sob vácuo, lavadas e conservadas em etanol 70% (Johansen 1940).
Para a análise em microscopia de luz, amostras desidratadas em série butílica
terciária, infiltradas e incluídas em Paraplast® (Johansen 1940) foram seccionadas
transversalmente, com 14 µm de espessura, em micrótomo rotativo de avanço automático
(Leica® RM 2245, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nussloch, Alemanha), sendo parte das
secções montada sem coloração em resina sintética Permount ® entre lâmina e lamínula e a
outra, destinada aos testes histoquímicos. As fotomicrografias por luz transmissível e
polarizada foram obtidas com câmera fotográfica digital (Motic 2.500, Motic Group Co.,
LTD., Hong Kong, China) acoplada ao microscópio óptico (Motic BA 310, Motic Group Co.,
LTD., Hong Kong, China).
Para a caracterização da natureza aniônica dos cristais, foram utilizados testes
histoquímicos de solubilidade ácida (Chamberlain 1932), submetendo-se secções ao ácido
acético PA e ao ácido nítrico aquoso 10% (v/v) específicos para carbonato e oxalato,
respectivamente, e de precipitação para sulfato (Johansen 1940), tratando-se secções com
ácido clorídrico aquoso 10% (v/v), seguido de cloreto de bário aquoso 10% (p/v). Para a
identificação de oxalato de cálcio na estrutura cristalina e verificação da pureza dos cristais
em relação a esse mineral, foi utilizada a reação de Yasue (1969), tratando-se secções com
ácido acético aquoso 5% (v/v) por 30 minutos, seguido da lavagem com água ultrapura e
11
imersão em nitrato de prata aquoso 5% (p/v) por 15 minutos. Posteriormente, as secções
foram lavadas com água ultrapura; passadas pela série etanólica (de 30% a 70%); tratadas
com ácido rubeânico (etanoditioamida) saturado em etanol 70% (p/v), contendo duas gotas de
solução aquosa de amônia 28% (v/v) para cada 100 ml da solução, por 1 minuto e lavadas
com etanol 70%. Testes-controle foram feitos, assim como observações de secções sem
tratamento para a verificação do aspecto natural dos cristais (branco).
Para a análise em microscópio eletrônico de varredura (MEV) e microanálises
químicas espectroscópicas de raios-X por dispersão de energia (EDS: Energy Dispersive
Spectroscopy), amostras desidratadas pela série etanólica crescente (Johansen 1940) foram
processadas em ponto crítico de CO2, montadas em suportes metálicos através de fita de
carbono dupla face e metalizadas com camada de ouro de 20 nm de espessura, por 150
segundos em corrente de 25 mA. As eletromicrografias de varredura foram obtidas por
captura em microscópio eletrônico (Leo 1450 VP, Leo Electron Microscopy LTD.,
Cambridge, Reino Unido), utilizando-se detector de elétrons secundários, aceleração
eletrônica de 25 kV, distância de trabalho de 15 mm e alto vácuo. As microanálises químicas
por EDS, realizadas nos cristais e em células sem cristais (controle) amostrados
aleatoriamente, foram feitas com detector de raios-X Gresham de Si(Li) (Sirius 10/7.5,
Gresham Scientific Instruments, London, Reino Unido) acoplado ao mesmo MEV e nas
mesmas condições de operacionalidade para a captura das eletromicrografias. Foram
considerados significativos, os picos de absorbância (Pa) que indicavam concentração
química elementar relativa ≥ 0,5% e intervalo de erro 0-1. Foram analisados de 20 a 30
cristais para cada morfotipo observado e os espectros apresentados foram os mais
representativos para os padrões de composição química elementar (PCE) verificados.
Todos os reagentes utilizados foram de grau analítico. O preparo de todas as
soluções utilizadas e as lavagens realizadas durante os protocolos foram feitas com água
ultrapura (resistividade 18,2 MΩ-cm a 25 °C) obtida por sistema Milli-Q (Direct-Q® 3 UV-R,
Merck Millipore, Darmstadt, Alemanha).
Para avaliar o grau de similaridade entre os morfotipos de cristais observados, foi
realizada uma análise quimiométrica com base nos dados de EDS e histoquímicos obtidos in
situ, utilizando-se o método de análise hierárquica de agrupamento (HCA: Hierarchical
Cluster Analysis) feito com o auxílio do programa Minitab versão 14 (Minitab Inc., USA).
Para a nomenclatura dos macropadrões cristalinos, foram utilizadas siglas. Os
tecidos e as regiões dos órgãos e/ou estruturas vegetais, nos quais os morfotipos cristalinos
ocorrem, foram sobrescritos ao morfotipo cristalino. Os tecidos foram relatados fora de
12
parênteses e separados por ponto. As regiões dos órgãos e/ou estruturas vegetais foram
relatadas entre parênteses e separadas por ponto e vírgula. Macropadrões cristalinos
sucessivos foram separados por barra horizontal, correspondendo a uma categoria (Tabela 2).
A tipificação morfológica dos cristais foi feita segundo Metcalfe (1983), Lersten e
Horner (2011) e He et al. (2012). A notação científica e classificação dos cristais com base
nos PCE por EDS seguiram He et al. (2012).
Resultados
Cristais com formas variadas foram visualizados em idioblastos cristalíferos
caulinares e foliares das espécies de Piper analisadas, exceto no caule de P. callosum (Figura
1). Foram observados ráfides (Figura 1A); estiloides (Figura 1B); cristais prismáticos
cuneiformes (Figura 1C), tabulares (Figura 1D), cúbicos (Figura 1E) e bipiramidais (Figura
1F); drusas de cristais em bloco (Figura 1G); rosetas cristalinas de estiloides (Figura 1H) e
concrescências cristalinas (Figura 1I).
Concrescências cristalinas, ráfides, cristais prismáticos bipiramidais e rosetas
cristalinas de estiloides foram específicos para P. arboreum var. arboreum, P. callosum e P.
tuberculatum respectivamente. Entre as três espécies de Piper, P. tuberculatum foi a que teve
maior diversidade estrutural de cristais (Tabela 1). Idioblastos cristalíferos duplos foram
observados, não havendo um padrão de associação entre morfotipos cristalinos, e.g. estiloides
com cristais prismáticos cúbicos ou cuneiformes (Figuras 1E, 3H). Ráfides, drusas de cristais
em bloco, rosetas cristalinas de estiloides e concrescências cristalinas não coexistiram com
outro morfotipo cristalino. Os demais cristais observados estavam ou não associados a outros
morfotipos cristalinos.
Quinze macropadrões cristalinos, reunidos em três categorias, foram reconhecidos
dentre os cristais caulinares e foliares das três espécies de Piper (Tabelas 1, 2). Em geral, os
macropadrões cristalinos foram característicos para cada espécie, salvo os macropadrões
ETPF(Bf;Pc;Nc;Mc), comum entre P. arboreum var. arboreum e P. tuberculatum, e DCBMs,
comum entre P. callosum e P. tuberculatum. As categorias dos macropadrões cristalinos
foram espécie-específicas. Ráfides e drusas de cristais em bloco foram os únicos morfotipos
cristalinos que não possuíram localização restrita ao parênquima fundamental, pois ocorreram
também na hipoderme da lâmina foliar e no mesofilo respectivamente (Tabelas 1, 2).
13
As microanálises por EDS mostraram cinco PCE aos cristais caulinares e foliares
das espécies de Piper analisadas (Figura 2, Tabela 3). O PCE 1 (Ca;C;O) consistiu de Pa de
cálcio (Ca) elevado, de oxigênio (O) intermediário e de carbono (C) discreto (Figura 2A). O
PCE 2 (Ca;Mg;C;O) apresentou Pa de Ca e C elevados, de O intermediário e de magnésio
(Mg) baixo (Figura 2B). O PCE 3 (Ca;S;C;O) mostrou Pa de C elevado, de Ca e O discretos e
de enxofre (S) baixo (Figura 2C). O PCE 4 (Ca;Mg;S;C;O) consistiu de Pa de C elevado, de
Ca e O discretos, de S e Mg baixos (Figura 2D). O PCE 5 (Ca;Mg;K;Si;S;C;O) apresentou Pa
de Mg elevado, de O intermediário, de potássio (K) discreto, de Ca, S, C e silício (Si) baixos,
havendo ainda o registro de baixos Pa para manganês (Mn), titânio (Ti) e alumínio (Al)
(Figura 2E).
O espectro do EDS das células sem cristais (controle) mostraram Pa de C elevado,
de O discreto e de ouro (Au) baixo (Figura 2F, padrão controle), confirmando que os Pa de
Ca, Mg, K, Si, S, Mn, Ti e Al foram oriundos apenas dos cristais e os Pa de C e O resultaram
tanto dos cristais como das células-controle. Os Pa de Au foram provenientes da metalização
das amostras.
O PCE 1 ocorreu em quase todos morfotipos cristalinos, com exceção das
concrescências cristalinas. Os PCE 2 e 4 foram observados nos cristais de P. callosum e P.
tuberculatum. Os PCE 3 e 5 foram específicos aos cristais de P. arboreum var. arboreum. Os
cristais nos idioblastos cristalíferos duplos tiveram PCE iguais. Cristais do mesmo morfotipo
de alguns idioblastos cristalíferos adjacentes, como as ráfides da hipoderme abaxial da lâmina
foliar de P. callosum, possuíram PCE diferentes (Tabelas 1, 3).
Os testes histoquímicos indicaram que os cristais caulinares e foliares das três
espécies de Piper pertenciam a duas naturezas aniônicas, oxalato e sulfato (Tabela 3). Os
morfotipos cristalinos com PCE 1 e oxalato positivos foram classificados como oxalato de
cálcio. Os morfotipos cristalinos com PCE 2 e oxalato positivos foram possíveis misturas
entre oxalato de cálcio e oxalato de magnésio, sendo classificados como oxalato de
cálcio.oxalato de magnésio. Os morfotipos cristalinos com PCE 3, 4 e 5 e oxalato-sulfato
positivos foram possivelmente misturas complexas entre oxalatos e sulfatos (cristais com PCE
3 e 4) e entre oxalatos, sulfatos e sílica (cristais com PCE 5), sendo classificados como
oxalato.sulfato de cálcio (cristais com PCE 3), oxalato.sulfato de cálcio.oxalato de magnésio
(cristais com PCE 4) e oxalato.sulfato de cálcio.oxalato de magnésio.sílica (cristais com PCE
5).
Cristais de todos os morfotipos e PCE apresentaram reação de Yasue positiva
(Figura 3A-E, Tabela 3). A reação foi fortemente positiva, com coloração preta intensa, nos
14
cristais com PCE 1 e oxalato positivos, caracterizando-os como cristais puros de oxalato de
cálcio (Figuras 3A, 3B), e fracamente positiva, com coloração em tons de marrom, nos
cristais com PCE 2 e oxalato positivos, PCE 3, 4 e 5 e oxalato-sulfato positivos,
caracterizando-os como cristais de composição química mista com presença de oxalato de
cálcio na estrutura cristalina (Figura 3C-E).
Os cristais caulinares e foliares das três espécies de Piper, exceto a concrescência
cristalina, apresentaram anisotropia óptica ao serem analisados com luz polarizada,
birrefringindo com diferentes cores de interferência ao giro de 360º do polarizador analisador
(Figura 3F-J). Cristais puros de oxalato de cálcio birrefringiram com cor branca de alta
luminosidade (Figuras 3F, 3G). Cristais de composição química mista birrefringiram com
cores de interferência variadas (Figura 3H-J).
A quimiometria por HCA organizou os morfotipos cristalinos caulinares e foliares
das espécies de Piper analisadas em oito grupos (Figura 4). Os níveis de distanciamento
Euclidiano variaram entre 0,00 e 3,76 com valores de similaridade entre 27,28 e 100,00. Entre
os morfotipos cristalinos, cristais prismáticos bipiramidais, drusas de cristais em bloco e
rosetas cristalinas de estiloides tiveram a maior similaridade (100,00). A menor similaridade
(27,28) ocorreu para as concrescências cristalinas.
Discussão
Piper arboreum var. arboreum, P. callosum e P. tuberculatum possuem cristais
com formas diversificadas nos órgãos vegetativos aéreos, citados como padrões morfológicos
aos cristais (Metcalfe 1983). Entre as formas cristalinas descritas, concrescências cristalinas
não são consideradas morfotipos padrões, mas sim uma nova forma de agregado cristalino
com estrutura atípica (Lersten e Horner 2011).
Rosetas e concrescências cristalinas são registradas pela primeira vez para Piper e
Piperaceae, não sendo relatadas em descrições anatômicas anteriores (Solereder 1908;
Metcalfe e Chalk 1950; Gogosz et al. 2012). Piper carece de informações taxonômicas
adicionais, pois apenas a morfologia das partes reprodutivas e vegetativas não é suficiente à
distinção das espécies e, tais achados, se somarão as demais características micromorfológicas
com fins taxonômicos. Similarmente, são as descrições morfológicas stricto sensu feitas para
as drusas e aos cristais prismáticos, geralmente negligenciados ao grupo.
15
Os idioblastos cristalíferos duplos observados nas três espécies de Piper
analisadas já foram mencionados para outras espécies de Piper (Horner et al. 2012), bem
como para espécies pertencentes a famílias filogeneticamente distintas (Solereder 1908;
Lersten e Horner 2004; Lersten e Horner 2011), sugerindo que idioblastos cristalíferos duplos
não são meros eventos de desenvolvimento, raro ou anômalo, mas sim células cristalíferas
altamente especializadas e com capacidade genética de produzirem duas formas cristalinas
distintas, atuando como marcadores anatômicos nas espécies em que ocorrem (Lersten e
Horner 2011; Horner et al. 2012).
A ocorrência de macropadrões cristalinos comuns entre as espécies de Piper em
questão refutam a afirmação que cristais com formas variadas, quando localizados no mesmo
órgão, ocorrem em diferentes tecidos ou regiões (Franceschi e Nakata 2005). Características
semelhantes foram observadas em espécies de Peperomia Ruiz e Pav. (Horner et al. 2009),
Piper (Horner et al. 2012 ), Fagaceae (Lersten e Horner 2008) e Fabaceae (CervantesMartinez et al. 2005; Lersten e Horner 2007; He et al. 2012).
Entre os 15 macropadrões cristalinos aqui reconhecidos para as espécies de Piper
estudadas, apenas o macropadrão DCBMs foi anteriormente descrito para Piper (Horner et al.
2012). Os macropadrões cristalinos nas Angiospermas são característicos para famílias,
subfamílias, tribos, gêneros e espécies por estarem sob forte regulação genética (Franceschi e
Nakata 2005; Lersten e Horner 2011; Horner et al. 2012). Para Piperaceae, estudos sobre
macropadrões cristalinos estão em fase inicial e, ao lado da presente contribuição, há apenas
duas publicações (Horner et al. 2009; Horner et al. 2012), uma delas sobre Piper (Horner et
al. 2012) em que são descritos 10 macropadrões cristalinos distribuídos em três categorias.
A precisão das estruturas e macropadrões cristalinos, assim como a constatação
dos idioblastos cristalíferos duplos nas espécies de Piper estudadas corroboram a hipótese da
imposição do genoma vegetal sobre o desenvolvimento morfológico dos cristais e reforçam a
ideia que as espécies devem possuir programas específicos para fazê-lo, nos diversos órgãos
vegetativos e reprodutivos e, até mesmo, em diferentes células do mesmo tecido e/ou órgão
(Franceschi e Nakata 2005).
O fato dos cristais das espécies de Piper em questão serem quimicamente puros
ou misturas revela que mais de um hábito cristalino, com base na composição química, pode
ocorrer na mesma planta e que os biominerais não são necessariamente de sílica, carbonato e
oxalato de cálcio (He et al. 2012).
Cálcio é o elemento químico prevalente nos cristais das espécies de Piper
analisadas e oxalato de cálcio, o mineral em comum, independe se os cristais são puros ou
16
não. Isto porque o cálcio na forma divalente (Ca2+) constitui o principal cátion disponível nos
vacúolos ao processo de biomineralização, estando os biominerais de cálcio entre os mais
citados, e.g. os cristais de oxalato de cálcio estão presentes em no mínimo 75% das
Angiospermas (Weiner e Dove 2003; Franceschi e Nakata 2005; He et al. 2012).
Os cristais de sulfato de cálcio e oxalato de magnésio presentes nas espécies de
Piper estudadas podem ser considerados naturais, pois foram coletadas amostras foliares e
caulinares em excelente estado de fitossanidade, provenientes de ambiente no qual não há
ocorrência de chuva ácida. Tal tipo de formação é rara, e havia sido anteriormente atribuída
como precipitações secundárias decorrentes de chuva ácida e infecções patogênicas
respectivamente (Pritchard et al. 2000; He et al. 2012).
Afora as especulações ecofisiológicas sobre a natureza química de minerais
biogênicos, as diferenças de solubilidade entre os sais podem explicar a presença dos cristais
de sulfato e oxalato identificados nas espécies de Piper estudadas. O sulfato de cálcio, com
constante do produto de solubilidade (Kps) igual a 4,93 10-5 (Lide 2005), é cerca de 20.000
vezes mais solúvel que o oxalato de cálcio, com kps = 2,32 10-9 (Lide 2005), o que pode
justificar a prevalência dos cristais de oxalato de cálcio nas Angiospermas como citado por
Weiner e Dove (2003), Franceschi e Nakata (2005) e He et al. (2012). De maneira análoga, o
sulfato de magnésio, com solubilidade (s) de 0,357 g ml-1 de água a 25 ºC (Lide 2005), é cerca
de 900 vezes mais solúvel que o oxalato de magnésio, com s = 0,00038 g ml-1 de água a 25 ºC
(Lide 2005), o que explica a não constatação, até então, de cristais de sulfato de magnésio nos
vegetais quando presentes, no mesmo padrão espectral, Pa de Ca, Mg, S, C e O. Como a
solubilidade do sulfato de cálcio, s = 0,00205 g ml-1 de água a 25 ºC (Lide 2005), tem valor
próximo, embora cerca de cinco vezes maior, à solubilidade do oxalato de magnésio e mesmo
não sendo mensuradas as concentrações de Ca, Mg, oxalato e sulfato nos cristais analisados,
em razão da natureza semiquantitativa do EDS, os dados aqui apresentados corroboram que
os cátions cálcio e magnésio e os anions correspondentes oxalato e sulfato sejam precipitados
como cristais de sais mais insolúveis, seguindo uma ordem crescente de solubilidade (oxalato
de cálcio << oxalato de magnésio < sulfato de cálcio << sulfato de magnésio) e independente
de fatores antropomórficos e/ou fitopatológicos.
As birrefringências mostradas pelos cristais das três espécies de Piper são
características anisotrópicas de cristais com os padrões químicos composicionais verificados
(Hammond 2009). Cristais de composição química mista são referidos como não
birrefringentes (He et al. 2012), devido a serem analisados sem rotação do polarizador
analisador, impossibilitando, assim, avaliar os diferentes índices de refração que possuem,
17
pois apresentam alterações de propriedades ópticas em relação aos cristais puros (Hammond
2009).
Concrescências cristalinas foram os únicos cristais que não mostraram
birrefringência. Possivelmente, o conteúdo silicoso da sua composição química ocasionou
opalescência da estrutura cristalina. A ocorrência de sílica nas inclusões biominerais de Piper
é uma característica conflitante. Células silicosas na epiderme da lâmina foliar foram citadas
para algumas espécies do gênero (Solereder 1908; Metcalfe e Chalk 1950) embora sem
comprovações químicas. Picos de absorbância de silício verificados nos cristais de 63
espécies de Piper foram considerados inconclusivos, pois poderiam ser provenientes de
paredes celulares (Horner et al. 2012). No presente estudo, a ausência de picos de absorbância
de elementos químicos catiônicos no padrão espectral controle e a não birrefringência das
concrescências cristalinas confirmam que esses cristais contêm sílica.
A presença de sílica nas inclusões biominerais celulares de Piperaceae pode ser
indicativa de simplesiomorfia com monocotiledôneas e plesiomorfia com eudicotiledôneas.
Inclusões biominerais mistas entre oxalato de cálcio e sílica são somadas aos caracteres que
sustentam a monofilia de várias famílias de Zingiberales (Baran et al. 2010), o que suscita a
relevância de estudos direcionados para melhor investigar a ocorrência e elucidar os
significados evolutivo e sistemático da sílica nos biominerais de Piper e Piperaceae.
O agrupamento quimiométrico com grau de similaridade máxima entre morfotipos
cristalinos distintos de mesma composição química evidencia que estrutura e composição
química de cristais independem entre si. Se a estrutura de um cristal estivesse em função da
sua composição química, distanciamentos Euclidianos mínimos seriam esperados entre
morfotipos cristalinos de composição química idêntica tais como ráfides, cristais prismáticos
cúbicos e cuneiformes, o que não ocorreu. A forma dos cristais é imposta pelo genoma
vegetal e a composição química resultado da interação entre atividade biológica e meio
ambiente (Weiner e Dove 2003; Franceschi e Nakata 2005), afirmações pela primeira vez
constatadas através de análise estatística multivariada no presente estudo. O grau de maior
dissimilaridade das concrescências cristalinas (27,28) foi ocasionado pela peculiaridade da
sua composição química.
Os cristais nas espécies de Piper estudadas podem estar atuando como auxiliares
da rigidez tissular e defensores contra patógenos e herbívoros, pois os espécimes amostrados
não tinham sinais de predação e infecção (observações de campo), e a bainha e lâmina foliares
possuem poucos tecidos mecânicos (dados não publicados). Funções de remoção do excesso
citosólico de cálcio, magnésio e enxofre nas três espécies de Piper; de potássio e silício em P.
18
arboreum var. arboreum, assim como de detoxificação de alumínio, manganês e titânio em P.
arboreum var. arboreum são prováveis aos cristais com base na composição química
elementar observada. Para as drusas do mesofilo, funções de captação da energia solar em P.
arboreum var. arboreum e P. callosum, oriundas de ambiente umbrófilo, e reflexão em P.
tuberculatum, desenvolvidas a pleno sol, são possíveis e já foram atribuídas para cristais de
Piperaceae (Horner 2012; Horner et al. 2012).
Conclusões
A precisão estrutural e localização caulinar e foliar dos cristais das espécies de
Piper em questão sugerem a imposição genética sobre o controle da biomineralização nessas
espécies, o que faz dos macropadrões cristalinos observados caracteres úteis à separação
interespecífica. Os cristais atuam como componentes anatômico e fisiológico relevantes para
a autoecologia dos taxa de Piper analisados.
Agradecimentos
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq),
pela concessão da bolsa de doutorado ao primeiro autor. Ao Dr. Hilton Tulio Costi e à Dra.
Alba Lins, por permitirem, respectivamente, o uso dos Laboratórios de Microscopia
Eletrônica de Varredura e de Anatomia Vegetal pertencentes ao Museu Paraense Emílio
Goeldi para a realização das análises. À Dra. Elsie Franklin Guimarães do Instituto de
Pesquisas Jardim Botânico do Rio de Janeiro, pela identificação botânica das espécies
estudadas. Aos editores e revisores da Revista Acta Amazonica, pelas contribuições dadas ao
artigo.
19
Bibliografia Citada
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21
TABELAS
22
Tabela 1. Morfotipos, padrões de composição química elementar e macropadrões dos cristais caulinares e foliares observados em Piper (Piperaceae). Hipoderme (Hp). Mesofilo (Ms). Parênquima
fundamental (Pf). 1 (Ca;C;O). 2 (Ca;Mg;C;O). 3 (Ca;S;C;O). 4 (Ca;Mg;S;C;O). 5 (Ca;Mg;K;Si;S;C;O). Cálcio (Ca). Magnésio (Mg). Potássio (K). Silício (Si). Enxofre (S). Carbono (C). Oxigênio (O)
Morfotipos cristalinos (Padrão de
composição química elementar)
Distribuição tissular por espécie
P. arboreum Aubl. var. arboreum
P. callosum Ruiz & Pav.
P. tuberculatum Jacq.
Ráfides (1)
Ausentes
Hp: face abaxial da lâmina foliar; Pf: nervura
central
Ausentes
Ráfides (2)
Ausentes
Pf: bainha foliar e pecíolo
Ausentes
Ráfides (4)
Ausentes
Hp: face abaxial da lâmina foliar
Ausentes
Estiloides (1)
Pf: bainha foliar, pecíolo e nervura central
Pf: pecíolo
Pf: pecíolo, nervura central e medula caulinar
Estiloides (2)
Ausentes
Pf: bainha foliar
Pf: bainha foliar
Estiloides (3)
Pf: medula caulinar
Ausentes
Ausentes
Cristal prismático cuneiforme (1)
Pf: pecíolo e nervura central
Pf: bainha foliar
Cristal prismático cuneiforme (2)
Ausentes
Ausentes
Pf: bainha foliar e pecíolo
Cristal prismático cuneiforme (4)
Ausentes
Pf: bainha foliar
Ausentes
Cristal prismático tabular (1)
Pf: bainha foliar, pecíolo e nervura central
Ausentes
Pf: pecíolo, nervura central e medula caulinar
Cristal prismático tabular (4)
Ausentes
Ausentes
Pf: bainha foliar
Cristal prismático cúbico (1)
Ausentes
Ausentes
Pf: bainha foliar e emergências glandulares da
bainha foliar
Cristal prismático cúbico (2)
Ausentes
Pf: bainha foliar
Ausentes
Cristal prismático bipiramidal (1)
Ausentes
Ausentes
Pf: bainha foliar, pecíolo e nervura central
Drusa de cristais em bloco (1)
Ms: clorênquimas paliçádico e lacunoso; Pf:
bainha foliar
Ms: clorênquimas paliçádico e lacunoso
Ms: clorênquimas paliçádico e lacunoso
Roseta cristalina de estiloides (1)
Ausentes
Ausentes
Pf: nervura central
Concrescência cristalina (5)
Pf: medula caulinar
Ausentes
Ausentes
Pf: bainha foliar, nervura central e medula
caulinar
23
Tabela 2. Categorias dos macropadrões cristalinos caulinares e foliares observados em Piper (Piperaceae). Ráfides (RF). Estiloides (ET). Cristal
prismático cuneiforme (CC). Cristal prismático tabular (CT). Cristal prismático cúbico (CCU). Cristal prismático bipiramidal (CBP). Drusa de
cristais em bloco (DCB). Roseta cristalina de estiloides (RET). Concrescência cristalina (CCR). Bainha foliar (Bf). Hipoderme (Hp). Lâmina
foliar (Lf). Emergências glandulares (Eg). Medula caulinar (Mc). Mesofilo (Ms). Nervura central (Nc). Pecíolo (Pc). Parênquima fundamental
(Pf).
Categorias dos macropadrões cristalinos
Espécies
1- ETPf(Bf;Pc;Nc;Mc)|CCPf(Pc;Nc)|CTPf(Bf;Pc;Nc)|DCBPf(Bf).Ms|CCRPf(Mc)
P. arboreum Aubl. var. arboreum
2- RFPf(Bf;Pc;Nc).Hp(Lf)|ETPf(Bf;Pc)|CCPf(Bf)|CCUPf(Bf)|DCBMs
P. callosum Ruiz & Pav.
3- ETPf(Bf;Pc;Nc;Mc)|CCPf(Bf;Pc;Nc;Mc)|CTPf(Bf;Pc;Nc;Mc)|CCUPf(Bf;Eg(Bf))|CBPPf(Bf;Pc;Nc)|DCBMs|RETPf(Nc)
P. tuberculatum Jacq.
24
Tabela 3. Composição química elementar e caracterização histoquímica dos morfotipos de cristais caulinares e foliares observados em Piper (Piperaceae). Não solúvel (NS). Parcialmente solúvel (PS). Solúvel
(S). Solúvel com posterior formação de precipitado branco (SP). Cristais de composição química mista com presença de oxalato de cálcio na estrutura cristalina ((+)). Cristais puros de oxalato de cálcio ((++)).
Ânion presente (+). Ânion ausente (-). Ráfides (RF). Estiloides (ET). Cristal prismático cuneiforme (CC). Cristal prismático tabular (CT). Cristal prismático cúbico (CCU). Cristal prismático bipiramidal (CBP).
Drusa de cristais em bloco (DCB). Roseta cristalina de estiloides (RET). Concrescência cristalina (CCR). Cálcio (Ca). Magnésio (Mg). Potássio (K). Silício (Si). Enxofre (S). Carbono (C). Oxigênio (O). Ácido
acético pró-análise (C2H4O2 PA). Ácido nítrico (HNO3). Ácido clorídrico (HCl). Cloreto de bário (BaCl2). Volume por volume (v/v). Peso por volume (p/v).
Composição química
elementar (Padrão)
Morfotipos cristalinos
RF
ET
CC
X
X
X
X
X
X
CT
X
CCU
X
CBP
X
DCB
X
RET
CCR
X
X
X
X
X
X
X
Testes histoquímicos
Natureza aniônica
C2H4O2
PA
HNO3
10% (v/v)
HCl 10% (v/v)/
BaCl2 10% (p/v)
Reação
de Yasue
Carbonato
Oxalato
Sulfato
Ca;C;O (1)
NS
S
S
(++)
-
+
-
Ca;Mg;C;O (2)
NS
S
S
(+)
-
+
-
Ca;S;C;O (3)
NS
PS
SP
(+)
-
+
+
Ca;Mg;S;C;O (4)
NS
PS
SP
(+)
-
+
+
Ca;Mg;K;Si;S;C;O (5)
NS
PS
SP
(+)
-
+
+
25
FIGURAS
26
Figura 1. Eletromicrografias de varredura dos morfotipos de cristais observados nas secções
transversais dos órgãos vegetativos aéreos de Piper L. (Piperaceae). P. arboreum Aubl. var.
arboreum (D; G e I). P. callosum Ruiz & Pav. (A e E). P. tuberculatum Jacq. (B; C; F e H).
Hipoderme abaxial da lâmina foliar (A). Parênquima fundamental da bainha foliar (C-G), da
nervura central (B e H) e da medula caulinar (I). A. Ráfides. B. Estiloide. C. Cristal prismático
cuneiforme. D. Cristal prismático tabular, notar a membrana da câmara vacuolar (seta). E. Cristal
prismático cúbico, notar estiloides (setas). F. Cristal prismático bipiramidal. G. Drusa de cristais
em bloco. H. Roseta cristalina de estiloides. I. Concrescência cristalina, notar a membrana da
câmara vacuolar (setas).
27
Figura 2. Espectros das microanálises químicas por EDS (Energy Dispersive Spectroscopy) feitas
nos cristais (A-E) e em células sem cristais (F) dos órgãos vegetativos aéreos de Piper
(Piperaceae), mostrando os padrões de composição química elementar (PCE). A. PCE 1 (Ca;C;O).
B. PCE 2 (Ca;Mg;C;O). C. PCE 3 (Ca;S;C;O). D. PCE 4 (Ca;Mg;S;C;O). E. PCE 5
(Ca;Mg;K;Si;S;C;O), notar Pa de Ti, Mn e Al. F. Padrão das células sem cristais (controle). Picos
de absorbância (Pa). Pa de Au são resultantes da metalização das amostras. Cálcio (Ca). Magnésio
(Mg). Potássio (K). Silício (Si). Enxofre (S). Carbono (C). Oxigênio (O). Titânio (Ti). Manganês
(Mn). Alumínio (Al). Ouro (Au). Os espectros A, C, B, D e E foram obtidos dos cristais das
figuras 1A, 1B, 1C, 1D e 1I respectivamente.
28
Figura 3. Fotomicrografias de secções transversais dos órgãos vegetativos aéreos de Piper
(Piperaceae), evidenciando cristais com reação de Yasue positiva (A-E, luz transmissível) e
anisotropia óptica (F-J, luz polarizada). P. arboreum Aubl. var. arboreum (E e J). P.
callosum Ruiz & Pav. (D e I). P. tuberculatum Jacq. ( A-C; F-H). Lâmina foliar, região do
mesofilo (B e G). Parênquima fundamental da bainha foliar (C; D; H e I), da lâmina foliar na
região da nervura central (A e F) e da medula caulinar (E e J). A, B, F e G. Cristais puros de
oxalato de cálcio, notar no inset estiloides com coloração preta intensa (A) e birrefringência
branca de alta luminosidade (F), características desse padrão composicional. C-E e H-J.
Cristais de composição química mista com presença de oxalato de cálcio na estrutura
cristalina, notar coloração em tons de marrom (C-E) e birrefringência com cores de
interferência variadas (H-J), características desse padrão composicional. Cristal prismático
cuneiforme (CC). Cristal prismático tabular (CT). Estiloide (ET). Xilema birrefringente (X).
Esclerênquima birrefringente (‫)٭‬.
29
Figura 4. Dendograma da quimiometria por HCA (Hierarchical Cluster Analysis) realizada
nos morfotipos cristalinos dos órgãos vegetativos aéreos de Piper (Piperaceae). 1. Ráfides. 2.
Estiloide. 3. Cristal prismático cuneiforme. 4. Cristal prismático tabular. 5. Cristal prismático
cúbico. 6. Cristal prismático bipiramidal. 7. Drusa de cristais em bloco. 8. Roseta cristalina de
estiloides. 9. Concrescência cristalina.
30
Capítulo 2
___________________________________________________________________________
Silva, R.J.F.; Aguiar-Dias, A.C.A. & Mendonça, M.S. Piper callosum Ruiz & Pav.,
Piperaceae: macroscopic, microscopic and physicochemical analysis of leaves and stem for
their quality control. Submetido a Brazilian Journal of Pharmacognosy.
31
Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae: macroscopic, microscopic and
physicochemical analysis of leaves and stem for their quality control
Rolf J. F. Silva1*, Ana Cristina A. de Aguiar-Dias2, Maria Sílvia de Mendonça3
1
Programa de Pós-Graduação em Botânica, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,
Coordenação de Botânica, Manaus, AM, Brazil
2
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Belém, PA, Brazil
3
Universidade Federal do Amazonas, Faculdade de Ciências Agrárias, Manaus, AM, Brazil
Correspondence: [email protected]
Abstract: Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae, popularly known as “elixir paregórico”
and “matricá” in Brazil, is used in folk medicine to treat gonorrhea, general pain, and
digestive disorders, and has repellent, astringent, diuretic, depurative, and haemostatic
properties. Despite the fact that this plant is sold as a traditional phytotherapeutic product, we
did not find reports on its quality control. We, therefore, performed macroscopic,
microscopic, histochemical, and physicochemical analyses using standard methods to
establish botanical authentication and purity degree parameters for leaves and stem of this
species in two forms: medicinal plant and herbal drug. We observed the size, shape, color,
texture, fracture surface and transection characteristics, leaf venation patterns, and calluses are
valuable diagnostic characters to identify the herbal drugs when they are not ground or
powdered. Since medicinal plants and herbal drugs did not differ anatomically, the following
key anatomical characters for P. callosum can be used for diagnostic purposes of both types
raw plant materials: epicuticular wax and cuticular flanges patterns; collenchyma features;
fibers in the midrib; arrangement pattern of the vascular bundles of the midrib and petiole;
shape of the midrib, leaf margin, petiole, and stem; occurrence of raphides; and morphology
of the starch grains. Acid lipids, essential oils, oleoresins, steroids, tannins and flavonoids
were histochemically identified. Total ash (leaves: 11.250%; stem: 5.250%), sulphated ash
(leaves: 68.023%; stem: 12.500%), acid-insoluble ash (leaves: 2.820%; stem: 0.270%),
32
moisture (leaves: 8.600%; stem: 6.100%), loss on drying (leaves: 11.080%; stem: 8.585%),
and pH (leaves: 5.570, stem: 5.277) values were determined. The order of analyzed metal
levels in leaf and stem herbal drugs was Al>V>Cu>Mn>Cr>Ni. Similar levels of Cd and Co
and low levels of Hg were found. Mo, Pb, Ti and As were below the detection limit. The
results obtained should be used as quality control parameters for medicinal plants and herbal
drugs of P. callosum.
Keywords: secretory idioblasts, callosus emergences, histochemical screening, metal content,
pharmacognostical features, raw plant material.
Conflicts of interest: The authors declare no conflicts of interest.
Introduction
Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae, popularly known as “elixir paregórico,”
“óleo elétrico,” “ventre-livre,” “erva de soldado,” “panquilé,” “matricá” and “joão brandin” in
Brazil (Andrade et al., 2009; Berg, 2010), is a shrub native to Bolivia, Brazil, Peru, and
Colombia. In Brazil, it occurs in Acre, Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia, Distrito Federal,
Mato Grosso, Espírito Santo, Rio de Janeiro, and Paraná States (Guimarães et al., 2014).
In Brazilian folk medicine, P. callosum leaves and young stem are used in the
form of infusion or poultice to treat dysmenorrhea, intestinal colic, diarrhea, nausea,
toothache, rheumatic and muscular pain, mosquito bites, and gonorrhea, and have repellent,
astringent, haemostatic, digestive, diuretic, and depurative properties (Andrade et al., 2009;
Berg, 2010). At open-air markets in northern Brazil, vegetative aerial parts of P. callosum are
sold fresh, dried, ground, and rarely powdered or as an ingredient in artisanal preparations
called “garrafadas” for medicinal purposes. The plant is also cultivated in backyards and
medicinal gardens (authors’ observations).
A number of volatile and fixed phytoconstituents have been isolated from P.
callosum, including alkaloid amides; terpenes, such as hydrocarbon monoterpenes,
oxygenated monoterpenes, hydrocarbon sesquiterpenes, oxygenated sesquiterpenes, and
steroids; and phenolics, such as oxygenated flavonoids and phenylpropanoids (Parmar et al.,
1997; Facundo et al., 2004; Andrade et al., 2009). Studies of essential oils obtained from P.
33
callosum have demonstrated antifungal, insecticidal, and larvicidal activities (Andrade et al.,
2009; Fanela, 2012).
P. callosum, currently being traded as a traditional phytotherapeutic product,
represents a promising medicinal plant for phytopharmaceutical development due to the
ethnopharmacological evidence for the numerous popular medicinal uses attributed to this
plant and of the pharmacological potential of its phytoconstituents. Despite this, we did not
find any systematic reports of its quality control parameters. The quality of raw plant
materials represents the first step for the establishment of minimum criteria of acceptance and
is a pre-requisite for the production and registration of phytomedicines (ANVISA, 2010;
Couto et al., 2013). Hence, the present work aimed to establish parameters of botanical
authentication and purity degree for the quality control of P. callosum leaves and stem as raw
plant materials in forms of medicinal plant and herbal drug.
Materials and Methods
Plant material
Fertile samples (n = 14 specimens; 7 specimens per sampled area) of Piper
callosum Ruiz & Pav., Piperaceae, were collected from natural populations of two Brazilian
states: Manaus-AM, and Belém-PA. A voucher specimen (MG 206892) was deposited at the
João Murça Pires (MG) Herbarium of the Emílio Goeldi Paraense Museum. Duplicates were
deposited at the National Amazon Research Institute Herbarium (INPA Herbarium). The
taxonomic identity was confirmed by Dr. Elsie Franklin Guimarães, specialist in Piperaceae
(Rio de Janeiro Botanical Garden Research Institute).
Preparation of the standard herbal drugs (SHD)
Aerial parts of P. callosum (leaves from the 1st to 4th nodes and stem up to the 4th
internode) were washed in 70% (v/v) ethanol and dried at 40 ºC in a hot-air oven (Sterilifer
SX 1.5 DTMS) until reaching a constant weight (Oliveira and Akisue, 2003; Farmacopeia
Brasileira, 2010). Part of the leaf and stem SHD were ground to a powder in a knife mill. The
whole and powdered SHD were stored at room temperature in airtight, light-resistant
containers (WHO, 1998; Farmacopeia Brasileira, 2010).
34
Pharmacobotanical analysis
Macroscopic and organoleptic characterization was performed on the whole and
powdered SHD using standard methods (WHO, 1998; Oliveira and Akisue, 2003;
Farmacopeia Brasileira, 2010). The leaf herbal drugs were rehydrated (Costa, 2000), clarified,
and stained (Monteiro et al., 1979) for observation of the leaf venation. The
photomacrographs were obtained using a digital camera (Nikon D 3100). The stereoscopic
photomicrographs by reflective light (RL) and by differential interference contrast (DIC) were
captured with a digital camera (Motic 2500) attached to a stereoscopic microscope (Motic
SMZ-168) using Motic Images Plus 2.0 software.
Microscopic characterization was performed on the SHD and fresh plant
materials. For the latter, leaf (fully expanded mature leaves from the 4 th node) and stem (from
the 1st to 4th internodes) samples were obtained according to Silva et al. (2014), fixed in NBFneutral buffered formalin (Lillie, 1965) and buffered glutaraldehyde/osmium tetroxide (Souza,
1998), and preserved (Johansen, 1940). NBF and glutaraldehyde/osmium tetroxide-fixed
samples were used for light microscopy (LM) and scanning electron microscopy (SEM)
observations, respectively.
Epidermal peels of the leaf blade were obtained through maceration in Jeffrey’s
solution, stained with astra blue, and mounted on glass slides with glycerol jelly (Johansen,
1940). Samples were infiltrated and embedded in methacrylate resin (Historesin, Leica®), and
sectioned in a rotary, auto-advance microtome (Leica® RM 2245). The histological sections
(transverse and longitudinal, 1.5-3.5 µm thick) were stained with citrate-buffered toluidine
blue, pH 4.7 (O’Brien et al., 1964), and mounted on glass slides with synthetic resin
(Permount-Fisher®) for structural characterization. Histological sections from fresh plant
materials were made by hand with a steel razor and used for histochemical screening (Chart
1). For all tests, standard control procedures were carried out simultaneously using the same
procedures, and untreated sections were used to verify the natural coloration of the analyzed
tissues (white). The photomicrographs by transmitted and polarized light were obtained with a
digital camera (Motic 2500) attached to an optical microscope (Motic BA 310) equipped with
an epifluorescence unit.
The SEM analysis followed the procedures described by Silva et al. (2014).
Samples boiled in chloroform for one hour for partial or total removal of waxy deposits were
also used. A Leo 1450 VP scanning electron microscope was used for the observations and
capture of images.
35
Microscopic characterization of the SHD was performed by LM and SEM. The
whole SHD were rehydrated (Costa, 2000) and submitted to the above-mentioned methods,
apart from histochemical screening. The powdered SHD were processed according to WHO
(1998) and Farmacopeia Brasileira (2010) for LM observations. For SEM observations,
samples were mounted on SEM metal stubs, following procedures described by Silva et al.
(2014).
Pharmacognostical analysis
Pooled samples of the SHD were used for the physicochemical analysis. The total
ash, acid-insoluble ash, sulphated ash, pH, moisture (Azeotropic method) and loss on drying
(INFRATEST) were determined using standard procedures (WHO, 1998; Farmacopeia
Brasileira, 2010). The analytical method to determine the selected metals (Al, Cd, Co, Cr, Cu,
Mn, Mo, Ni, Pb, Ti, V, Hg and As) followed Pratsmoya et al. (1997), and the measurements
were performed by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES)
using a VARIAN model VISTA-MPX spectrometer for Al, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb,
Ti and V, and a THERMO model ICAP 6000 spectrometer for Hg and As. Standard
Reference Material (SRM 1547: peach leaves) from the National Institute of Standard and
Technology (NIST) was used for validation of the applied analytical method using the same
procedures.
All reagents were of analytical grade. Ultrapure water (18.2 MΩ-cm at 25 °C)
from a Milli-Q system (Merck Millipore) was used. All determinations were performed in
triplicate, and the results were expressed as mean ± standard deviation (mean ± S.D.).
Adopted terminology
The definitions of raw plant material, medicinal plant, herbal drug, and traditional
phytotherapeutic products followed ANVISA (2014). For the macroscopic characterization of
the SHD, terminology from Hickey (1973), WHO (1998), Oliveira and Akisue (2003), and
Farmacopeia Brasileira (2010) was adopted. The distal end of the petiole was named leaf
sheath following Tebbs (1989a). The leaf venation patterns were based on Hickey (1973). The
anatomical features were described according to Metcalfe and Chalk (1950; 1979), Fahn
(1979; 1990), Evert (2006) and Potiguara et al. (2013).
36
Results
Pharmacobotanical characterization
The herbal drugs of whole leaves are complete, i.e. with leaf blade, petiole, and
leaf sheath; ca. 3.4-8.7 cm long and 1.2-4.6 cm wide; wrinkled or folded; friable in texture;
greenish in color on both faces, somewhat bright on the adaxial face; characteristic aromatic
odor; taste predominantly characteristic aromatic, turning slightly bitter, and ending slightly
spicy. The herbal drugs of powdered leaves are dark-green in color and have the same odor
and taste as the whole herbal drugs (Figure 1 A and Q).
Leaf blade is ca. 5-9.6 cm long and 2.5-4.9 cm wide; symmetric; ovate-elliptical;
entire margin; acuminate apex; cuneate base with callus in basilaminar position on each side
of the adaxial face; surface rough to the touch on abaxial face; surface glabrous to the eye on
both faces; smooth-granular fracture surface; prominent veins on both faces, mainly on the
abaxial face; eucamptodromous major venation; veins branched until 6º order; incomplete
marginal ultimate venation; linear or curved simple veinlets; veinlets branched x1-3; irregular
areoles with imperfect development and random arrangement (Figure 1 B-J).
Petiole is ca. 0.1-0.7 cm long and 0.05-0.1 cm wide; curved or twisted; inserted
laterally; surface longitudinally striate to the eye on both faces; concave-convex in
transection, with lignified elements in U-shaped pattern (Figure 1 B, K-N). Leaf sheath is ca.
0.025-0.3 cm long and 0.05-0.4 cm wide; concave-convex; surface smooth on the adaxial face
and longitudinally striate on the abaxial face to the eye (Figure 1 K, L, O and P).
The herbal drugs of whole stem have evident nodes; surface smooth to the touch;
surface glabrous and longitudinally finely striate to the eye; greenish in color; characteristic
aromatic odor; taste predominantly characteristic aromatic and ending slightly spicy. The
herbal drugs of powdered stem are somewhat fibrous, mixed in color, ranging from yellowish
green to gray with black spots, and present the same odor and taste as the whole herbal drugs
(Figure 2 A, B and I).
1st and 2nd internodes easily broken, with smooth-granular outer fracture surface,
and predominantly granular inner fracture surface. In transection, they show primary growth;
irregular shape; outer region of the section greenish brown in color; inner region of the section
green in color, with yellowish spots; outer and inner lignified elements with no defined
arrangement (Figure 2 C-E).
37
3rd and 4th internodes easily broken, with smooth outer fracture surface, and
predominantly granular inner fracture surface. In transection, they show initial secondary
growth; circular shape; outer region of the section dark-green in color; inner region of the
section mixed in color, with brownish yellow central area, and greenish brown elliptical
peripheral areas with yellowish spots separated by yellowish strands; inner lignified elements
arranged in two concentric circles (Figure 2 F-H).
Fresh leaves and stem and their herbal drugs did not differ anatomically. In frontal
view, the anticlinal epidermal cell walls of the leaf blade are straight to wavy on the adaxial
face and sinuous on the abaxial face. The cuticle is smooth, with continuous plate of granular
epicuticular wax parallel to the epidermal surface on both faces (Figure 3 A-C).
The leaves are hypostomatic and possess tetracytic and cyclocytic (with four or
five subsidiary cells) stomata (Figure 3 C-E). Sunken, sac-like glandular trichomes are coated
with smooth cuticle and occur randomly spread on both faces of the leaf epidermis. They are
bicellular with a chalice-like lignified short basal cell encircled by epidermal cells and a saclike secretory apical cell, which lies upon the epidermal surface (Figure 3 F).
Transections showed that the leaf epidermis is uniseriate on both faces. The
cuticle is thickened, except in the leaf sheath, and forms V-shaped flanges on both faces of the
petiole and on the abaxial face of the leaf sheath (Figures 4 A and E; 5 D; 6 C). Stomata are
raised above the level of the other epidermal cells and have guard cells with piriformis lumen
and horn-like outer ledges (Figure 4 D). Uniseriate hypodermis occurs on both faces of the
leaf blade and is replaced by sclerenchyma in the leaf margin. Some hypodermal cells on the
abaxial face contain raphides (Figure 4 A, B, E, H and I).
The mesophyll is dorsiventral with one-layered palisade parenchyma on the
adaxial face and three-layered spongy parenchyma on the abaxial face. It is relatively
undifferentiated in the leaf margin. Minor collateral vascular bundles are encircled by
parenchymatic sheath. Druses are observed (Figure 4 A, B and H).
The midrib in transection is biconvex with 1-2 layers of fibers occurring
immediately beneath the epidermis on both faces. The palisade parenchyma cells become
gradually shorter toward the middle region. The hypodermal cells, present only on the adaxial
face, are comparatively smaller than those of the inter-vein regions. Collateral vascular
bundles in a straight line are centrally embedded in the ground parenchyma and encircled by
parenchymatic sheath, with fibers in the xylem and phloem poles (Figure 4 E). Raphides are
observed in the ground parenchyma (Figure 4 F). The leaf margin in transection is revolute.
38
Sclerenchyma cells, mainly fibers, replace the mesophyll and occupy the distal region (Figure
4 G-I).
The petiole in frontal view possesses epidermis coated with smooth cuticle on
both faces. Scattered non-ornamental epicuticular wax occurs in crusts on the adaxial face and
in plates parallel to the epidermal surface on the abaxial face (Figure 5 A and B). The petiole
in transection resembles an arch in shape (Figure 5 C). Continuous strata of lamellar
collenchyma are located immediately beneath the epidermis (Figure 5 D). Collateral vascular
bundles in an arch-shaped pattern are embedded in the peripheral ground parenchyma. One or
two minor collateral vascular bundles encircled by parenchymatic sheath occur on the abaxial
face, located externally to the other bundles (Figure 5 C and E). Prismatic crystals and
raphides occur throughout the ground parenchyma (Figure 5 F).
Transections of the base of the leaf blade showed that calluses are structures of the
petiole. The dermal, fundamental, and vascular tissues of calluses originate from the tissue
systems of the petiole (Figure 5 G). The epidermis is coated with thick cuticle and has cell
protuberances that consist of phenolic-containing cells in periclinal and anticlinal divisions,
forming what somewhat resembles meristem at some sites (Figure 5 G-I). Continuous strata
of lamellar collenchyma occur beneath the cell protuberances and coalesce into the enlarged
distal end of the calluses, wholly occupying this region (Figure 5 G and H). The vascular
system consists of xylem and phloem, either as transverse commissures or as inconspicuous
collateral vascular bundles embedded in the ground parenchyma (Figure 5 J).
The leaf sheath in frontal view presents epidermis coated with smooth cuticle on
both faces (Figure 6 A). The leaf sheath in transection is concave-convex (Figure 6 B). The
epidermal cells are vertically elongated on the adaxial face (Figure 6 D). Continuous strata of
lamellar collenchyma occur immediately beneath the epidermis on both faces (Figure 6 C-E).
Collateral vascular bundles in an arc are embedded in the ground parenchyma. Two or three
minor collateral vascular bundles may occur on the abaxial face, located externally to the
other bundles (Figure 6 B and C). Prismatic crystals and raphides are observed in the ground
parenchyma (Figure 6 F).
The stem epidermis in frontal view presents smooth cuticle. Aggregate crusts of
non-ornamental epicuticular wax occur on epidermal surface (Figure 7 A). Sac-like glandular
trichomes like those described for the leaf epidermis are rarely observed. The stem growth is
predominantly primary from the 1st to 2sd internodes and inconspicuously secondary from the
3rd to 4th internodes (Figure 7 B-I).
39
The stem in transection is elliptical with wavy outline regardless of the type of
growth (Figure 7 B). The uniseriate epidermis is coated with thick cuticle that forms V-shaped
flanges (Figure 7 D). Lenticels in initial developmental stage protrude above the stem surface
(Figure 7 C). The cortex consists of continuous strata of lamellar collenchyma,
collenchymatous fibers, and ground parenchyma (Figure 7 C and D). The collenchyma occurs
immediately beneath the epidermis, and the inner collenchyma cells are differentiated as
fibers (Figure 7 D). The collateral vascular bundles are arranged in two concentric circles
(Figure 7 C and E). The peripheral circle of bundles is bound internally and separated from
the pith by a sinuous zone of fibers (Figure 7 C). The phloem pole may present fibers (Figure
7 C). The medullary bundles are encircled by parenchymatic sheath, and some may present a
fiber cap next to the xylem (Figure 7 C and E). The pith is parenchymatic, in which
amyloplasts with convex-biconcave aggregate starch grains occur (Figure 7 E and F).
Fascicular and interfascicular cambia occur from the 3 rd internode (Figure 7 G and
H). In the 4th internode, the secondary growth is restricted to the peripheral vascular region.
Both xylem and phloem become radially elongated and remain organized as collateral bundles
separated by parenchymatic rays. The fiber zone is interrupted, and the fiber cap next to the
xylem is formed (Figure 7 I). The epidermal, cortical, and medullary features remain as
previously described.
The secretory idioblasts have a spherical to elliptical shape, and their cell wall
presents a trilamellar structural aspect with a lignified intermediary layer (Figure 9K). They
occur in the mesophyll (Figure 4 A, C and G), in the ground parenchyma of the midrib
(Figure 4 E), among the sclerenchyma cells situated beneath the epidermis on the adaxial face
of the leaf margin (Figure 4 H), in the ground parenchyma and collenchyma of the petiole and
leaf sheath (Figures 5 D; 6 E; 8 M), in the ground parenchyma of the calluses (Figure 5 G),
and in the cortical and medullary ground parenchyma of the stem (Figure 7 C and E).
Secretory idioblasts are also observed in the phloem and xylem parenchyma of leaf and stem
vascular bundles. In the xylem parenchyma, they have a generally wavy outline (Figures 5 E;
7 C and G; 8 I).
The histochemical tests indicated that the secretion is heterogeneous and rich in
lipids, mainly acid lipids, in the glandular trichomes, secretory idioblasts, and calluses (Chart
2, Figure 8 A-F). Essential oils, oleoresins, mixture of essentials and resins, and steroids
(Chart 2, Figure 8 G-M) as well as tannins and flavonoids (Chart 2, Figure 8 N-S) were
identified. The other histochemical tests rendered negative results (Chart 2).
40
The herbal drugs of powdered leaves possess leaf blade fragments with straight to
wavy (adaxial face) or sinuous (abaxial face) anticlinal epidermal cell walls, sac-like
glandular trichomes encircled by epidermal cells, tetracytic and cyclocytic stomata (abaxial
face), smooth cuticle, continuous plates of granular epicuticular wax parallel to the epidermal
surface, raphides, and secretory idioblasts of acidophilic content. Isolated secretory idioblasts
of acidophilic or yellowish-colored content and tracheary elements with annular wall
thickening are also observed (Figure 9 A-G).
The herbal drugs of powdered stem have isolated fibers, fiber bundles, and
blackish-colored particles as predominant elements. Also present are fragments with very
thick and straight to wavy anticlinal epidermal cell walls, smooth cuticle, and aggregate crusts
of non-ornamental epicuticular wax; tracheary elements with helical wall thickening;
secretory idioblasts of acidophilic content; and non-aggregate convex-biconcave starch grains
(Figure 9 H-L).
Pharmacognostical characterization
The levels of volatile and inorganic matter were comparatively higher in the leaf
herbal drugs than in the stem herbal drugs. The stem herbal drugs resulted in a high reduction
of the pH value of the distilled water (Table 1). The distilled water used had a pH of 7.010 ±
0.032.
The highest concentrations of most of the examined metals, except for Cd and Cr,
were observed in the leaf herbal drugs. For the leaf herbal drugs, the metals with high
concentrations were Al, V, Cu and Mn, in order of increasing concentration. For the stem
herbal drugs, the high metal concentrations were of Al, Cu, V and Mn, in order of increasing
concentration. Al presented the highest concentration of all examined metals, and Hg and Co
the lowest concentrations in both leaf and stem herbal drugs. Both leaf and stem herbal drugs
contained Mo, Pb, Ti and As below the detection limit. The stem herbal drugs did not contain
detectable amounts of Hg. The results are considered satisfactory, with recoveries being
within the range 76.48-117.20% (Table 2).
41
Discussion
The general external morphological features observed in Piper callosum leaf and
stem herbal drugs are in accordance with the morphological descriptions of the taxon
(Yuncker, 1972). External and internal macroscopic characteristics, leaf venation patterns,
and sensory characteristics are described herein for first time for the P. callosum herbal drugs.
Since the macroscopic and organoleptic examinations serve as valuable pharmacognostical
parameters to establish the botanical identity and the degree of purity of medicinal plant
materials and should be carried out before any further tests are undertaken (WHO, 1998;
Periyanayagam et al., 2012), the organoleptic and morphological features reported here for the
P. callosum herbal drugs are useful diagnostic characters for their quality control.
Regarding anatomical aspects of the leaf and stem, P. callosum displayed
conservative and distinctive characteristics for Piper and Piperaceae. The following can be
considered as conservative characteristics of P. callosum because they have been cited as
common ones for Piperaceae (Metcalfe and Chalk, 1950) and mentioned for other Piper
species (Marinho et al., 2011; Gogosz et al., 2012; Periyanayagam et al., 2012; Silva et al.,
2014): epidermal cells of leaf blade with straight to wavy or sinuous anticlinal walls; smooth
cuticle; hypostomatic leaves; tetracytic and cyclocytic stomata; sac-like glandular trichomes;
uniseriate leaf and stem epidermis; leaf hypodermis; occurrence of hypodermis and palisade
parenchyma into the midrib; dorsiventral mesophyll; lamellar collenchyma; sclerification of
the stem collenchyma; structure of the leaf collateral vascular bundles; arrangement pattern of
the vascular bundles of the leaf sheath; organization pattern of the stem vascular system;
shape in transection of the leaf sheath; prismatic crystals; druses; and presence of secretory
idioblasts in the leaf and stem tissues.
Concerning the distinctive characteristics that were observed in P. callosum, we
recorded for both leaves and stem the following: ornamentation and disposition patterns of the
epicuticular wax; cuticular flanges patterns; type and position of the leaf and stem
collenchyma; type of supporting tissue in the midrib; arrangement pattern of the vascular
bundles of the midrib and petiole; shape in transection of the midrib, leaf margin, petiole, and
stem; occurrence of raphides; and morphology of the starch grains. The crystal macropatterns
described for P. callosum (Silva et al., 2014) must be added to these diagnostic microscopic
characteristics as they are species specific.
42
The pharmacognostical and taxonomic significance of the above-cited characters
as distinctive for P. callosum have been emphasized (Metcalfe and Chalk, 1979; Costa, 2000;
Dickison, 2000; Oliveira and Akisue, 2003; Potiguara et al., 2013) and used successfully to
separate closely related species, e.g. Smilax (Martins et al., 2013) and Piper (Gogosz et al.,
2012; Horner et al., 2012; Silva et al., 2014).
We emphasize that the conservative and distinctive anatomical characteristics
should be considered together for an accurate botanical authentication; the former are
designed for general taxonomic delimitation and the latter for specific taxonomic diagnosis.
With regard to the powdered herbal drugs, the anatomical markers of
authentication must be based on the distinctive characteristics of leaf and stem of P. callosum.
For the leaf herbal drugs, the distinctive characteristics are the epicuticular wax features as
well as the presence of raphides in the leaf fragments. For the stem herbal drugs, the
anatomical markers are the parietal and epicuticular wax features of the stem fragments,
blackish-colored particles, and form of the starch grains.
The types of wall thickening of the tracheary elements cannot be considered
anatomical markers for P. callosum powdered herbal drugs because they also occur in other
Piper species (Periyanayagam et al., 2012; Silva et al., unpublished data).
The small callosities present at the base of the P. callosum leaf blade constitute an
important distinctive morphological character of this species to distinguish it from other Piper
species (Yuncker, 1972). The anatomical features of the calluses are reported here for the first
time. From an anatomical viewpoint, the calluses of P. callosum can be considered as
complex glandular emergences of petiolar origin. The cell protuberances of the callus
epidermis may be a periderm differentiated due to the arrangement of the cells in division,
such as phellogen, and their phenolic (tannin) content. According to Beckman (2000), there is
strong positional, biochemical and physiological evidence to suggest that phenolic-storing
cells may be intimately involved in processes that result in periderm formation.
As callus is a general morphological term that describes excrescent or protuberant
tissues without distinctive features (Gonçalves and Lorenzi, 2011), we suggest that the
calluses of P. callosum be termed callosus emergences, denoting both morphological and
anatomical aspects.
The mixture of hydrophobic and hydrophilic compounds identified in the
secretion of the P. callosum secretory structures is in agreement with the phytoconstituents of
this species (Parmar et al., 1997; Facundo et al., 2004; Andrade et al., 2009). The complexity
of content has already been cited in secretory structures of Piper (Marinho et al., 2011;
43
Gogosz et al., 2012), although the idioblasts are commonly characterized by the secretion of
oil or mucilage (Evert, 2006). In Piperaceae, the idioblasts are considered to be oil-secreting
cells (Judd et al., 2009), and anatomical studies in Piper generally describe such structures as
oil cells (Marinho et al., 2011; Gogosz et al., 2012; Periyanayagam et al., 2012). According to
Marinho et al. (2011), the term oil cell can be partially justified by the presence of an oily
secretion or conspicuous oil drops in oil-secreting cells, mainly in fresh material, but it fails to
describe accurately the chemical diversity of the content of these idioblasts. The results
achieved by the histochemical screening of P. callosum leaves and stem corroborate the
arguments of the authors, and the term secretory idioblasts or cells adequately describes such
structures because it does not make inferences from its chemical content.
The different therapeutic utilizations in folk medicine of the P. callosum leaves
and stem (Andrade et al., 2009; Berg, 2010) are likely related to the chemical variety of the
metabolic content identified histochemically in the idioblasts. The following pharmacological
properties have been reported for phenolic compounds, such as tannins and flavonoids,
steroids, and essential oils (Costa, 1994; Simões et al., 2003; Monteiro et al., 2005):
antibacterial, antifungal, insecticidal, larvicidal, antispasmodic, carminative, choleretic,
cholagogue, antidiarrheal, astringent, anti-inflammatory, anti-allergic, anesthetic, analgesic,
antihemorrhagic, and diuretic.
From a pharmacognostical viewpoint, the P. callosum leaf and stem herbal drugs
present excellent quality, which is ensured by preservation in the herbal drugs of
morphoanatomical characteristics observed in the fresh plant materials, e.g. the occurrence of
secretory idioblasts with content. Likely, the proper conditions of preparation of the herbal
drugs, such as time and temperature of drying, contributed to this fact. Plant materials when
subjected to high temperatures can undergo both morphological and cell content alterations of
the tissues (Fontes and Fontes, 2005). On the other hand, the drying of plant materials until
constant weight makes it impossible for portions to remain moist due to inefficient drying and
prevents the degradation of chemical compounds by excessive drying (Hubinger et al., 2009).
The moisture content value of the P. callosum herbal drugs is below the maximum
recommended limit of 14% (Simões et al., 2003), indicating that the conditions of drying,
storage, and conservation of the herbal drugs was satisfactory. The water content is an
important quality parameter for herbal drugs because residual water encourages microbial
growth, insect infestation, deterioration, and enzymatic hydrolysis of the chemical compounds
(WHO, 1998; Costa, 2000; Oliveira and Akisue, 2003). The loss on drying values above the
moisture values reveals the presence of other types of volatile matter in the P. callosum herbal
44
drugs, which are likely thermo-unstable organic compounds that occur in the content of its
idioblasts. The analysis for loss on drying determines both water and volatile matter (WHO,
1998; Farmacopeia Brasileira, 2010); therefore, the difference between the loss on drying and
moisture values may correspond to volatiles, such as essential oils. The total and acidinsoluble ash values in the P. callosum herbal drugs are in accordance with specifications of
the British Herbal Pharmacopeia (1990), in which the maximum limit of total and acidinsoluble ash is 15% (w/w) and 5% (w/w), respectively. The Brazilian Pharmacopeia does not
establish limit values for ash. For sulphated ash, the higher values than that of total ash are
due to (1) the addition of mass in the form of sulphuric acid in the samples and (2) the
treatment of the samples with sulphuric acid, which transforms the oxides, carbonates, and
halogen compounds into sulphates, forming firmer ash that is more stable at high
temperatures (Evans, 2009). Regardless of the type of ash, the higher ash values for the leaf
herbal drugs compared to the stem herbal drugs are likely due to the high crystal content of P.
callosum leaves. Crystalline mineral inclusions in plants contribute to high amounts of ash,
mainly for the sulphated ash values (Mohamad et al., 2013).
The reduction observed in the pH value of the distillate water reveals the
occurrence of acid compounds in the P. callosum herbal drugs, which is in agreement with the
richness of acid metabolic classes identified histochemically in the content of the idioblasts of
this species.
The metal concentrations found in the P. callosum herbal drugs are within safety
baseline levels for human consumption (WHO, 1996; 1998; WHO and FAO, 2006;
Farmacopeia Brasileira, 2010) and can be used as a quality criterion since the regulatory
agencies do not establish permissible levels of metals in raw plant materials, except for
arsenic, cadmium, and lead (WHO, 1998), and the increase of metal content in plants, mainly
those that are potentially toxic or termed “heavy metals,” can indicate external contamination
by environmental factors and/or processing methods (Başgel and Erdemoğlu, 2006).
Conclusion
The results obtained in the present study concerning the macroscopic,
microscopic, and physicochemical analysis of P. callosum leaves and stem should be used as
safe parameters for quality control of raw plant materials in both forms: medicinal plant and
herbal drug. The macro- and microscopic data will contribute to the botanical authentication,
45
the physicochemical data will permit the evaluation of purity degree, and the organoleptic
characteristics could be used for both botanical authentication and purity degree.
Acknowledgment
The first author wishes to thank the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq) for the doctorate scholarship granted. We thank Dr.
Kelson Fail (Physicochemical Laboratory, Environment Section, Evandro Chagas Institute,
Brazil), who provided the facilities to use optical emission spectrometers with inductively
coupled argon plasma.
Authors’ contributions
RJFS (Doctoral student) contributed in the collection and identification of plant
samples, preparation of herbarium specimens, laboratory work, analysis of data, design of the
study and the writing of the paper. ACAAD supervised the laboratory work. ACAAD and
MSM contributed to critical reading of the manuscript. All the authors have read the final
manuscript and approved the submission.
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50
QUADROS E TABELAS
51
Chart 1. Histochemical screening performed in leaves and stem of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae.
Compound groups
Metabolic classes
Reagents (Authors)
Total lipids
Sudan black B (Pearse, 1980)
Acid and neutral lipids
Nile blue A (Cain, 1947)
Unsaturated lipids
Osmium tetroxide (Ganter and Jollés, 1969;
1970)
Fatty acids
Copper acetate/rubeanic acid ( Ganter and
Jollés, 1969; 1970)
Essential oils and oleoresins
NADI reagent (David and Carde, 1964)
Steroids
Antimony trichloride (Hardman and
Sofowora, 1972; Mace et al., 1974)
Sesquiterpene lactones
Abraham reaction (Caniato et al., 1989)
Terpenoids with carbonyl group
2,4-dinitrophenylhydrazine (Ganter and
Jollés, 1969; 1970)
Total phenolics
Ferric trichloride (Johansen, 1940)
Tannins
Vanillin–hydrochloric acid (Mace and
Howell, 1974)
Flavonoids
Aluminum trichloride* (Charriére-Ladreix,
1976)
Neutral polysaccharides
Periodic acid–Schiff (PAS) reagent (Feder
and O’Brien, 1968)
Pectins
Ruthenium red (Johansen, 1940)
Mucins
Mayer’s tannic acid-ferric chloride stain
(Pizzolato and Lillie, 1973)
Acid mucopolysaccharides
Alcian blue (Pearse, 1980)
Alkaloids
Total alkaloids
Dragendorff reagent (Svendsen and
Verpoorte, 1983)
Proteins
Total proteins
Xylidine-Ponceau (Vidal, 1977)
Lipids
Terpene compounds
Phenolic compounds
Polysaccharides
*Observed under UV light.
52
Chart 2. Results of the histochemical screening performed in leaves and stem of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae.
Metabolic classes
Reagents
Secretory idioblasts
Callosus emergences
Leaf
Mesophyll
Midrib (GP)
Petiole
Stem
Leaf Sheath
Xylem Parenchyma
Phloem Parenchyma
Ground Parenchyma
Vascular Bundles
GP
CO
GP
CO
MD
PE
LES
MD
PE
LES
Cortical
Medullary
XYP
PHP
Glandular trichomes
SID
CPT
Leaf
Stem
Total lipids
Sudan black B
+
+
++
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
++
++
+
Neutral lipids
Nile blue A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Acid lipids
Nile blue A
+
+
++
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
++
++
+
Unsaturated lipids
Osmium tetroxide
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Fatty acids
Copper
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
acetate/rubeanic acid
Essential oils
NADI reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
Oleoresins
NADI reagent
+
++
+
+
+
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
-
-
-
-
-
Mixture of essentials and
resins
NADI reagent
-
-
++
-
-
+
+
++
-
-
++
-
-
-
+
+
-
-
-
-
Steroids
Antimony trichloride
++
+
-
++
-
+
-
-
-
-
-
-
++
+
-
-
+
-
-
-
Sesquiterpene lactones
Abraham reaction
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Terpenoids with carbonyl
2,4group
dinitrophenylhydrazine
Total phenolics
Ferric trichloride
-
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
++
+
Tannins
Vanillin–hydrochloric
acid
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
Flavonoids
Aluminum trichloride*
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
Neutral polysaccharides
Periodic acid–Schiff
(PAS) reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Pectins
Ruthenium red
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mucins
Mayer’s tannic acidferric chloride stain
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Acid
mucopolysaccharides
Alcian blue
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Total alkaloids
Dragendorff reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Total proteins
Xylidine-Ponceau
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Positive (+). Intense positive (++). Negative (-). Ground parenchyma (GP). Collenchyma (CO). Midrib (MD). Petiole (PE). Leaf sheath (LES). Xylem parenchyma (XYP). Phloem parenchyma (PHP). Secretory idioblast (SID). Cell protuberances (CPT). *Observed under UV light.
-
53
Table 1. Results of physicochemical parameters determined in herbal drugs of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae.
Herbal drug
Parameters (mean ± S.D.; n = 3)
Loss on drying
(INFRATEST)
Moisture content
Total ash
Sulphated ash
Acid-insoluble
ash
pH
Leaf
11.080% ± 0.001
8.600% ± 0.300
11.250% ± 0.007
68.023% ± 0.028
2.820% ± 0.001
5.570 ± 0.010
Stem
8.585% ± 0.006
6.100% ± 0.200
5.250% ± 0.007
12.500% ± 0.047
0.270% ± 0.007
5.277 ± 0.136
n is the number of independent determinations.
Standard Deviation (S.D.).
54
Table 2. Results of determination of metals in herbal drugs of Piper callosum Ruiz & Pav., Piperaceae.
Metal content (mean ± S.D. mg Kg -1 ; n = 3)
Herbal drug
Al
Cd
Co
Cr
Cu
Mn
Mo
Ni
Pb
Ti
V
Hg
Leaf
100.954 ± 8.372
0.032 ± 0.005 0.046 ± 0.032 0.807 ± 0.049
9.501 ± 0.596
6.029 ± 0.116
<LODb
0.440 ± 0.278
<LODb
<LODb
19.017 ± 1.003 0.019 ± 0.011
Stem
32.754 ± 6.679
0.033 ± 0.004 0.012 ± 0.005 0.878 ± 0.141
8.522 ± 1.082
2.416 ± 0.346
<LODb
0.184 ± 0.039
<LODb
<LODb
3.895 ± 0.356
SRMa 1547
233.672 ± 4.976
0.031 ± 0.007 0.059 ± 0.014 1.172 ± 0.024
3.100 ± 0.354
74.900 ± 3.467
<LODb
0.615 ± 0.102
<LODb
1.100 ± 0.283
0.400 ± 0.289
Recovery (%)
93.84
82.86
76.48
**
89.07
**
***
113.55
102.96
83.85
117.20
n is the number of independent determinations.
Standard Deviation (S.D.).
a
Standard Reference Material.
b
LOD (Detection limit): Mo = 0.001 mg Kg -1 ; Pd = 0.005 mg Kg-1; Ti = 0.002 mg Kg-1; Hg = 0.00004 mg Kg-1 ; As = 0.00012 mg Kg-1.
** Non-satisfactory recovery.
*** Value not certified.
<LODb
As
<LODb
<LODb
0.029 ± 0.007 0.064 ± 0.018
93.84
102.96
55
FIGURAS
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
Capítulo 3
___________________________________________________________________________
Silva, R.J.F.; Aguiar-Dias, A.C.A. & Mendonça, M.S. Comparative pharmacognosy of Piper
arboreum Aubl. var. arboreum and Piper tuberculatum Jacq., Piperaceae: morphoanatomical
and physicochemical analysis for their quality control. Manuscrito formatado para Brazilian
Journal of Pharmacognosy.
66
Comparative pharmacognosy of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and Piper
tuberculatum Jacq., Piperaceae: morphoanatomical and physicochemical
analysis for their quality control
Rolf J. F. Silva1*, Ana Cristina A. de Aguiar-Dias2, Maria Sílvia de Mendonça3
1
Programa de Pós-Graduação em Botânica, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia,
Coordenação de Botânica, Manaus, AM, Brazil
2
Universidade Federal do Pará, Instituto de Ciências Biológicas, Belém, PA, Brazil
3
Universidade Federal do Amazonas, Faculdade de Ciências Agrárias, Manaus, AM, Brazil
Correspondence: [email protected]
Abstract: Piper arboreum Aubl. var. arboreum and P. tuberculatum Jacq., Piperaceae, are
frequently misidentified. Despite the fact that both species are sold as traditional
phytotherapeutic products, there are not reports on their quality control. We, therefore,
performed morphoanatomical, histochemical, and physicochemical studies of both species
using standard methods to establish botanical authentication and purity degree parameters for
their leaves and stem in two forms: medicinal plant and herbal drug. Size, shape, color, taste,
texture, fracture surface and transection characteristics, and leaf venation patterns are valuable
diagnostic characters to distinguish herbal drugs of both species when they are not ground or
powdered. The following key anatomical characters must be used for diagnostic purposes of
the medical plants and herbal drugs of both species: epicuticular wax, cuticular
ornamentation, and cuticular flange patterns; types of non-glandular trichomes; stratification
of the leaf blade hypodermis; type and position of the collenchyma; arrangement pattern of
the vascular bundles of the petiole and stem; shape of the midrib, leaf margin, petiole, and
stem; and type of hilum of the starch grains. In P. tuberculatum, the volcano-like glandular
emergences are reliable distinctive macro- and microscopic features as they occur not in P.
arboreum var. arboreum. Lipids, terpenes, and phenolics were identified in both species.
Alkaloids occurred only in P. tuberculatum. Physicochemical parameter values were similar
67
in both species, except acid-insoluble ash value which was higher in the P. arboreum var.
arboreum stem herbal drugs. Overall, P. arboreum var. arboreum herbal drugs had the
highest metal concentrations. Al, Cu, Mn and V concentrations were the highest, whereas Cd,
Co and Hg concentrations were the lowest in herbal drugs of both species. Mo, Pb, Ti and As
were below the detection limit. The results obtained should be used as quality control
parameters for medical plants and herbal drugs of both species.
Keywords: secretory idioblasts, volcano-like glandular emergences, histochemical screening,
metal content, raw plant material.
Conflicts of interest: The authors declare no conflicts of interest.
Introduction
Piper arboreum Aubl. var. arboreum and P. tuberculatum Jacq., Piperaceae, are
shrubs or small trees found in Antilles and Central and South Americans (Andrade et al.,
2009). In Brazil, both species have wide distribution and occur from the North to South of the
country (Guimarães et al., 2014).
In Brazilian folk medicine, leaves and young stem of P. arboreum var. arboreum
(vernacular names: “pimenta longa,” “pau de angola,” “alecrim de angola,” “jaborandi,”
“jaborandi do rio,” “jaborandi-pimenta,” jaborandi-falso,” “pimenta do mato,” “pimenta de
índio,” “nhamboarndi,” “palim,” “raiz de pahiu,” and “fruto de morcego”) and
P.
tuberculatum (vernacular names: “pimenta longa,” “pimenta de água,” “pimenta de arta,”
“pimenta de ardo,” and “pimenta de arda”) are traditionally used as a stimulant, therapy for
stomach problems, diuretic, and against venereal diseases and urinary tract infections
(Regasini et al., 2009; Paes-Gonçalves et al., 2012). Furthermore, P. arboreum var. arboreum
is also utilized as anti-rheumatic, sudorific, expectorant, emollient, and antidote to poisonous
plants, and P. tuberculatum has been employed as sedative, analgesic and anesthetic for
toothache, and against snakebite (Pio Corrêa, 1984; Andrade et al., 2009; Ferreira et al.,
2010).
Phytochemical investigations of both species have identified fixed and volatile
compounds, such as alkaloid amides, terpenes (hydrocarbon monoterpenes, oxygenated
68
monoterpenes, hydrocarbon sesquiterpenes and oxygenated sesquiterpenes), and phenolics
(flavonoids and phenylpropanoids) in addition to steroids found only in P. tuberculatum
(Parmar et al., 1997; Facundo et al., 2008; Andrade et al., 2009; Regasini et al., 2009).
Antileishmanial, trypanocidal and antifungal activities have been cited for P. arboreum var.
arboreum and P. tuberculatum, and insecticidal, larvicidal, cytotoxic, antitumor, sedative,
analgesic, hypotensive, anxiolytic, anticonvulsant and antiplatelet aggregation proprieties are
mentioned for P. tuberculatum (Andrade et al., 2009; Regasini et al., 2009; Ferreira et al.,
2010; Trindade et al., 2012).
P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum are closely related species
(Yuncker 1973). Their aerial vegetative parts, which are sold fresh, dried, ground, rarely
powdered or as an ingredient in artisanal preparations called “garrafadas,” are obtained from
field where natural populations of both species may coexist. In consequence,
misidentifications or substitutions can easily occur (authors’ observations).
P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum share morphological and
chemical similarities and are traded as traditional phytotherapeutic products at open-air
markets in Brazil. Both species present potential to become herbal medicines due to their
ethnopharmacological uses and the biological activities of the phytoconstituents. Despite this,
we did not find any systematic reports on their quality control assessment. The correct species
identification and the establishment of purity degree represent the first steps for the quality
assurance of raw plant materials and are a pre-requisite for the production and registration of
phytomedicines (ANVISA, 2010; Cortés et al., 2014). Hence, the present work performed
comparative pharmacognostical study of P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum in
order to establish botanical authentication and purity degree parameters for the quality control
of leaves and stem of both species in two forms: medicinal plant and herbal drug.
Materials and Methods
Plant material
Fertile samples (n = 14 specimens per species; 7 specimens per sampled area) of
Piper arboreum Aubl. var. arboreum and P. tuberculatum Jacq., Piperaceae, were collected
from natural populations of two Brazilian states: Manaus-AM, and Belém-PA. Voucher
specimens (P. arboreum var. arboreum: MG 206890; P. tuberculatum: MG 206891) were
deposited at the João Murça Pires (MG) Herbarium of the Emílio Goeldi Paraense Museum.
69
Duplicates were deposited at the National Amazon Research Institute Herbarium (INPA
Herbarium). The taxonomic identity was confirmed by Dr. Elsie Franklin Guimarães,
specialist in Piperaceae (Rio de Janeiro Botanical Garden Research Institute).
Preparation of the standard herbal drugs (SHD)
Aerial parts of P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum (leaves from the
1st to 4th nodes and stem up to the 4th internode) were washed in 70% (v/v) ethanol and dried
at 40 ºC in a hot-air oven (Sterilifer SX 1.5 DTMS) until reaching a constant weight (Oliveira
and Akisue, 2003; Farmacopeia Brasileira, 2010). Part of the leaf and stem SHD were ground
to a powder in a knife mill. The whole and powdered SHD were stored at room temperature in
airtight, light-resistant containers (WHO, 1998; Farmacopeia Brasileira, 2010).
Pharmacobotanical analysis
Macroscopic and organoleptic characterization was performed on the whole and
powdered SHD using standard methods (WHO, 1998; Oliveira and Akisue, 2003;
Farmacopeia Brasileira, 2010). The leaf herbal drugs were rehydrated (Costa, 2000), clarified,
and stained (Monteiro et al., 1979) for observation of the leaf venation. The
photomacrographs were obtained using a digital camera (Nikon D 3100). The stereoscopic
photomicrographs by reflective light (RL) and by differential interference contrast (DIC) were
captured with a digital camera (Motic 2500) attached to a stereoscopic microscope (Motic
SMZ-168) using Motic Images Plus 2.0 software.
Microscopic characterization was performed on the SHD and fresh plant
materials. For the latter, leaf (fully expanded mature leaves from the 4th node) and stem (from
the 1st to 4th internodes) samples were obtained according to Silva et al. (2014), fixed in NBFneutral buffered formalin (Lillie, 1965) and buffered glutaraldehyde/osmium tetroxide (Souza,
1998), and preserved (Johansen, 1940). NBF and glutaraldehyde/osmium tetroxide-fixed
samples were used for light microscopy (LM) and scanning electron microscopy (SEM)
observations, respectively.
Epidermal peels of the leaf blade were obtained through maceration in Jeffrey’s
solution, stained with astra blue, and mounted on glass slides with glycerol jelly (Johansen,
1940). Samples were infiltrated and embedded in methacrylate resin (Historesin, Leica®), and
sectioned in a rotary, auto-advance microtome (Leica® RM 2245). The histological sections
(transverse and longitudinal, 1.5-3.5 µm thick) were stained with citrate-buffered toluidine
70
blue, pH 4.7 (O’Brien et al., 1964), and mounted on glass slides with synthetic resin
(Permount-Fisher®) for structural characterization. Histological sections from fresh plant
materials were made by hand with a steel razor and used for histochemical screening (Chart
1). For all tests, standard control procedures were carried out simultaneously using the same
procedures, and untreated sections were used to verify the natural coloration of the analyzed
tissues (white). The photomicrographs by transmitted and polarized light were obtained with a
digital camera (Motic 2500) attached to an optical microscope (Motic BA 310) equipped with
an epifluorescence unit.
The SEM analysis followed the procedures described by Silva et al. (2014).
Samples boiled in chloroform for one hour for partial or total removal of waxy deposits were
also used. A Leo 1450 VP scanning electron microscope was used for the observations and
capture of images.
Microscopic characterization of the SHD was performed by LM and SEM. The
whole SHD were rehydrated (Costa, 2000) and submitted to the above-mentioned methods,
apart from histochemical screening. The powdered SHD were processed according to WHO
(1998) and Farmacopeia Brasileira (2010) for LM observations. For SEM observations,
samples were mounted on SEM metal stubs, following procedures described by Silva et al.
(2014).
Pharmacognostical analysis
Pooled samples of the SHD were used for the physicochemical analysis. The total
ash, acid-insoluble ash, sulphated ash, pH, moisture (Azeotropic method) and loss on drying
(INFRATEST) were determined using standard procedures (WHO, 1998; Farmacopeia
Brasileira, 2010). The analytical method to determine the selected metals (Al, Cd, Co, Cr, Cu,
Mn, Mo, Ni, Pb, Ti, V, Hg and As) followed Pratsmoya et al. (1997), and the measurements
were performed by inductively coupled plasma optical emission spectrometry (ICP-OES)
using a VARIAN model VISTA-MPX spectrometer for Al, Cd, Co, Cr, Cu, Mn, Mo, Ni, Pb,
Ti and V, and a THERMO model ICAP 6000 spectrometer for Hg and As. Standard
Reference Material (SRM 1547: peach leaves) from the National Institute of Standard and
Technology (NIST) was used for validation of the applied analytical method using the same
procedures.
71
All reagents were of analytical grade. Ultrapure water (18.2 MΩ-cm at 25 °C)
from a Milli-Q system (Merck Millipore) was used. All determinations were performed in
triplicate, and the results were expressed as mean ± standard deviation (mean ± S.D.).
Adopted terminology
The definitions of raw plant material, medicinal plant, herbal drug, and traditional
phytotherapeutic products followed ANVISA (2014). For the macroscopic characterization of
the SHD, terminology from Hickey (1973), WHO (1998), Oliveira and Akisue (2003), and
Farmacopeia Brasileira (2010) was adopted. The distal end of the petiole was named leaf
sheath following Tebbs (1989a). The leaf venation patterns were based on Hickey (1973). The
anatomical features were described according to Metcalfe and Chalk (1950; 1979), Fahn
(1979; 1990), Evert (2006) and Potiguara et al. (2013).
Results and Discussion
Pharmacobotanical characterization
The leaf and stem herbal drugs obtained from P. arboreum var. arboreum and P.
tuberculatum are morphologically distinctive (Chart 2; Figures 1-4). The herbal drugs of
whole leaves of both species show significant differences in: general morphology; texture;
color; taste; shape of the leaf blade and petiole; surface ornamentation of the leaf blade,
petiole, and leaf sheath; type of apex, base and fracture surface; type of simple veinlets; major
and marginal ultimate venation; and characteristics of the transection of the petiole (Chart 2;
Figures 1 A-C and E-L; 2 A-C and E-N). The dimensions of the leaf herbal drugs can be
added to their identification (Chart 2). The herbal drugs of whole stem of these species differ
in: general morphology; color; taste; characteristics of the transection as shape, color, and
arrangement pattern of the inner lignified elements; and type of fracture surface (Chart 2;
Figures 3 A-C and F-H; 4 A-C and F-H).
Glandular emergences were observed only in P. tuberculatum whole herbal drugs
and can be considered as a valuable morphological characteristic for their macroscopic
identification (Chart 2; Figures 2 J and K; 4 B). The powdered herbal drugs of leaves and
stem of the studied Piper species differ only in color (Chart 2; Figures 1 M; 2 O; 3 I; 4 I).
Pharmacognostical studies of Piper species are rare (Pessini et al., 2003;
Periyanayagam et al., 2012; Silva et al., data for publication). As macroscopic and
72
organoleptic examinations are the first steps to establish botanical identity and purity degree
of medicinal plant materials, important factors to guarantee safety and efficacy (WHO, 1998;
Cheng et al., 2014), the sensory and morphological features reported here for the P. arboreum
var. arboreum and P. tuberculatum herbal drugs are valuable pharmacognostical parameters
for their quality control.
Fresh leaves and stem and their herbal drugs did not differ anatomically in both
species. As are shown in Chart 3 and Figures 5-10, P. arboreum var. arboreum and P.
tuberculatum present distinctive and conservative anatomical characters. The following are
distinctive leaf characters: cuticular ornamentation and epicuticular wax patterns; types of
non-glandular trichomes; cuticular flanges pattern; type and position of the collenchyma;
arrangement pattern of the vascular bundles of the petiole; and shape in transection of the
midrib, leaf margin, and petiole. For the stem, we recorded as distinctive characters: nonglandular trichomes of the type III; arrangement pattern of the vascular bundles; type of hilum
of the starch grains; and shape in transection. Similarly for the macroscopic diagnosis,
occurrence of glandular emergences in P. tuberculatum leaves and stem is a reliable
distinctive microscopic feature. Moreover, the crystal macropatterns described for both
species (Silva et al., 2014) must be added to these diagnostic features as they are species
specific.
Studies have demonstrated the relevance of the above-mentioned distinctive
characters in pharmacognostical and taxonomic investigations (Metcalfe and Chalk, 1979;
Costa, 2000; Dickison, 2000; Oliveira and Akisue, 2003; Potiguara et al., 2013), mainly to
separate closely related species, such as Piper (Gogosz et al., 2012; Horner et al., 2012; Silva
et al., data for publication).
Concerning the conservative characters, we cited the following: course of the
anticlinal epidermal cell walls of the leaf blade; sac-like glandular trichomes; non-glandular
trichomes of the type IV; hypostomatic leaves; tetracytic and cyclocytic stomata; dorsiventral
mesophyll; occurrence of hypodermis and palisade parenchyma into the midrib; coalescent
hypodermis into the distal region of the leaf margin; shape in transection of the leaf sheath;
smooth stem cuticle; lenticels in the stem in initial secondary growth; uniseriate leaf and stem
epidermis; type and position of the stem collenchyma; structure of the leaf and stem collateral
vascular bundles; presence of secretory idioblasts in the leaf and stem tissues; druses;
prismatic crystals; and shape of the simple starch grains (Chart 3; Figures 5-10).
Although anisocytic stomata have occurred only in P. arboreum var. arboreum
(Chart 3; Figure 5 H), and differences in layer number of the mesophyll and hypodermis have
73
been observed between the analyzed Piper species (Chart 3; Figure 6 A and B), both features
have not taxonomical diagnostic value herein. Stomatal complexes cannot be applied
successfully in Piperaceae taxonomy due to their complexity and morphological variation
(Gogosz et al., 2012), and stratification of mesophyll and hypodermis is influenced by
environmental factors (Dickison, 2000). P. arboreum var. arboreum, for instance, grows in
shady environment, whereas P. tuberculatum develops in sunny and shady environment (field
observations).
The secretory idioblasts are spherical to elliptical and occur in the mesophyll
(Figure 6 A, B and J), among the hypodermal cells (Figure 6 A and B), in the xylem and
phloem parenchyma of leaves and stem (Figures 6 D; 7 J and L; 8 G and H; 9 I), and in the
collenchyma and ground parenchyma of the midrib (Figure 6 D-F and H), petiole (Figure 7 GI), leaf sheath (Figure 8 G and H), and stem (Figure 9 E-I) of the two Piper species. The
cupule of the secretory idioblasts is observed when their vesicular secretion is retracted
(Figure 11 A and B).
In P. tuberculatum, glandular emergences resemble volcano in shape occur on the
abaxial face of the midrib (basal region) and leaf sheath, on both faces of the petiole, and
along the stem. The glandular emergences in frontal view present a cover of non-glandular
trichomes and have cuticular striae in the apical region where one central stoma is encircled
by papillae. As observed in transection the epidermis is uniseriate, and both ground
parenchyma cells and secretory idioblasts are arranged in rays (Chart 3; Figure 11 C-I).
Secretory idioblasts or cells are typical secretory structures in Piperaceae
(Metcalfe and Chalk, 1950; Fahn 1979; Judd et al., 2009). On the other hand, glandular
emergences are restrictive for Piper species and morphologically important for their
taxonomic delimitation (Yuncker, 1972; 1973). We performed herein for first time an
anatomical and histochemical study for Piper glandular emergences.
P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum contain similar heterogeneous
chemical constituents in their secretory structures, including lipids, and terpene and phenolic
compounds. Acid lipids, essential oils, mix of essentials and resins, steroids, tannins, and
flavonoids were identified in both species. Neutral lipids and terpenoids with carbonyl group
were identified only in P. arboreum var. arboreum, whereas oleoresins and alkaloids were
identified only in P. tuberculatum. The other histochemical tests rendered negative results
(Charts 4 and 5; Figures 12 and 13).
The heterogeneity of content in Piper secretory structures has been reported
(Marinho et al., 2011; Gogosz et al., 2012; Silva et al., data for publication). The mix of
74
hydrophobic and hydrophilic compounds verified in the secretion of the secretory structures is
in agreement with the phytoconstituents of the studied Piper species (Parmar et al., 1997;
Facundo et al., 2008; Andrade et al., 2009; Regasini et al., 2009). However, steroids had not
been previously identified in P. arboreum var. arboreum and are not mentioned for vegetative
organs of P. tuberculatum.
The ethnopharmacological usages in traditional medicine of P. arboreum var.
arboreum and P. tuberculatum leaves and stem (Pio Corrêa, 1984; Andrade et al., 2009;
Regasini et al., 2009; Ferreira et al., 2010; Paes-Gonçalves et al., 2012) may be justified by
metabolic classes present in the secretory structures. The following pharmacological activities
are reported for tannins, flavonoids, steroids, alkaloids, and essential oils (Costa, 1994;
Simões et al., 2003; Monteiro et al., 2005): antimicrobial, carminative, choleretic, cholagogue,
diuretic, antipyretic, anti-inflammatory, sedative, stimulant, antitoxic, anesthetic, and
analgesic.
The powdered herbal drugs of both species are similar in anatomy (Chart 6;
Figures 14 and 15). However, anatomical markets base on the distinctive characters between
the species were observed. For the leaf herbal drugs, the anatomical markets are: cuticular and
epicuticular wax features, and type of wall thickening of the tracheary elements (Chart 6;
Figures 14 B and H; 15 B and F). For the stem herbal drugs, the anatomical markets are: nonbirefringent crystal fragments, brownish-colored particles, idioblasts of acidophilic content,
sclereids, types of wall thickening of the tracheary elements, and hilum of the starch grains
(Chart 6; Figures 14 L-P; 15 M-O). Volcano-like glandular emergences and non-glandular
trichomes of the type III are key anatomical markets for the P. tuberculatum herbal drugs
(Chart 6; Figure 15 D, E and J).
Crystals should be evaluated with caution for the microscopic diagnosis of the
powdered herbal drugs of both analyzed Piper species, and the crystal morphotypes cited as
specific for these species (Silva et al., 2014) should be used as anatomical markets in order to
avoid mistakes. E.g., styloids were observed only in P. arboreum var. arboreum powdered
herbal drugs although they are common in both species.
Pharmacognostical characterization
Volatile and moisture content and pH value of the P. arboreum var. arboreum
herbal drugs were similar to those of the P. tuberculatum herbal drugs. The contents of total
and sulphated ash of the P. tuberculatum herbal drugs were comparatively higher than those
75
of the P. arboreum var. arboreum herbal drugs. Acid-insoluble ash content of the leaf herbal
drugs of both species was similar (Table 1).
The maximum recommended limit of moisture in herbal drugs is 14% (Simões et
al., 2003). For total and acid-insoluble ash, the British Herbal Pharmacopeia (1990)
recommends maximum limit of 15% (w/w) and 5% (w/w), respectively. Therefore, moisture
and total and acid-insoluble ash values found for the herbal dugs of both species are within
allowable limits. High value (4.350% ± 0.320) of acid-insoluble ash in P. arboreum var.
arboreum stem herbal drugs was not caused by external contamination, but it was due to the
natural occurrence of silicified mineral inclusions named crystal concretions (Silva et al.,
2014).
The high levels of total and sulphated ash were likely caused by high crystal
content of the leaves and stem of both species (Table 1; Figure 10). Mohamad et al. (2013)
pointed out the crystalline mineral inclusions in plants contribute to high amounts of ash,
mainly for the sulphated ash values. Furthermore, higher values of sulphated ash than those of
total ash, observed in the herbal drugs of both species (Table 1), were due to the addition of a
sulphuric acid mass for the samples causing increase in weight and the formation of firmer
ash that is more stable at high temperatures (Evans, 2009).
The herbal drugs of the studied Piper species resulted in a high reduction of the
pH value of the distillate water (pH = 7.010 ± 0.032) indicating occurrence of acid
compounds (Table 1). These results are in accordance with the richness of acid metabolic
classes identified histochemically in the secretion of the idioblasts of these species (Charts 4
and 5).
The proper processing of the P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum
leaves and stem, such as cleaning, time and temperature of drying, and the optimal conditions
of storage and conservation permitted to obtain herbal drugs of excellent pharmacognostical
quality. The preservation in the herbal drugs of morphoanatomical characteristics observed in
the fresh plant materials of both species, and the physicochemical parameter values found
below the acceptable maximum limit ensure this quality. High temperatures and excessive
drying can cause tissue morphological damages and degradation of cell chemical content
(Fontes and Fontes, 2005; Hubinger et al., 2009). In addition, the residual water favours the
action of enzymes whose activity may lead to the degradation of chemical compound as well
as enabling the microbial development, deterioration, and insect attack (WHO, 1998; Costa,
2000; Oliveira and Akisue, 2003).
76
The highest concentrations of most of the analyzed metals were observed in the P.
arboreum var. arboreum herbal drugs. Al, Cu, Mn and V concentrations were the highest,
whereas Cd, Co and Hg concentrations were the lowest in the herbal drugs of both species.
Take our attention high Mn concentrations in P. arboreum var. arboreum herbal drugs. The
herbal drugs of both species contained Mo, Pb, Ti and As below the detection limit. The
results are considered satisfactory, with recoveries being within the range 76.48-117.20%
(Table 2).
The metal concentrations in the herbal drugs of the analyzed Piper species are
within levels for human consumption without detriment to health (WHO, 1996; 1998; WHO
and FAO, 2006; Farmacopeia Brasileira, 2010). Since the official regulatory authorities do not
establish permissible levels of metals in raw plant materials, except for arsenic, cadmium, and
lead (WHO, 1998), and the increase of metal content in plants, mainly those that are
potentially toxic or termed “heavy metals”, can indicate external contamination by
environmental factors and/or processing methods (Başgel and Erdemoğlu, 2006), the metal
content determined for P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum herbal drugs can be
used as a quality criterion.
Conclusion
The results obtained in the present study concerning the morphoanatomical and
physicochemical characterization of P. arboreum var. arboreum and P. tuberculatum leaves
and stem should be used as safe parameters for their quality control while raw plant materials
in the forms of medicinal plants and herbal drugs. The morphoanatomical data will contribute
to the botanical authentication, the physicochemical data will permit the evaluation of purity
degree, and the organoleptic characteristics could be used for both botanical authentication
and purity degree.
Acknowledgment
The first author wishes to thank the National Council for Scientific and
Technological Development (CNPq) for the doctorate scholarship granted. We thank Dr.
Kelson Fail (Physicochemical Laboratory, Environment Section, Evandro Chagas Institute,
77
Brazil), who provided the facilities to use optical emission spectrometers with inductively
coupled argon plasma.
Authors’ contributions
RJFS (Doctoral student) contributed in the collection and identification of plant
samples, preparation of herbarium specimens, laboratory work, analysis of data, design of the
study and the writing of the paper. ACAAD supervised the laboratory work. ACAAD and
MSM contributed to critical reading of the manuscript. All the authors have read the final
manuscript and approved the submission.
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82
QUADROS E TABELAS
83
Chart 1. Histochemical screening performed in leaves and stem of Piper arboreum Aubl. var. arboreum and P. tuberculatum Jacq.,
Piperaceae.
Compound groups
Metabolic classes
Reagents (Authors)
Total lipids
Sudan black B (Pearse, 1980)
Acid and neutral lipids
Nile blue A (Cain, 1947)
Unsaturated lipids
Osmium tetroxide (Ganter and Jollés, 1969;
1970)
Fatty acids
Copper acetate/rubeanic acid ( Ganter and
Jollés, 1969; 1970)
Essential oils and oleoresins
NADI reagent (David and Carde, 1964)
Steroids
Antimony trichloride (Hardman and
Sofowora, 1972; Mace et al., 1974)
Sesquiterpene lactones
Abraham reaction (Caniato et al., 1989)
Terpenoids with carbonyl group
2,4-dinitrophenylhydrazine (Ganter and
Jollés, 1969; 1970)
Total phenolics
Ferric trichloride (Johansen, 1940)
Tannins
Vanillin–hydrochloric acid (Mace and
Howell, 1974)
Flavonoids
Aluminum trichloride* (Charriére-Ladreix,
1976)
Neutral polysaccharides
Periodic acid–Schiff (PAS) reagent (Feder
and O’Brien, 1968)
Pectins
Ruthenium red (Johansen, 1940)
Mucins
Mayer’s tannic acid-ferric chloride stain
(Pizzolato and Lillie, 1973)
Acid mucopolysaccharides
Alcian blue (Pearse, 1980)
Alkaloids
Total alkaloids
Dragendorff reagent (Svendsen and
Verpoorte, 1983)
Proteins
Total proteins
Xylidine-Ponceau (Vidal, 1977)
Lipids
Terpene compounds
Phenolic compounds
Polysaccharides
*Observed under UV light.
84
Chart 2. Comparative macroscopic characteristics of the whole herbal drugs of Piper L., Piperaceae.
Herbal drug
Aerial part
Species
Characteristics
General
aspects
Leaf blade
P. arboreum Aubl. var. arboreum
Morphology
Complete (leaf blade, petiole, and leaf sheath); ca. 12.6-25.6 cm long and 3.7-7.4 cm wide; wrinkled (Figure 1 A)
Complete (leaf blade, petiole, and leaf sheath); ca. 3.6-12.2 cm long and 0.8-8.3 cm wide; folded (Figure 2 A)
Texture
Friable
Flexible
Color
Gray or greenish gray on both faces (Figure 1 A)
Pale- or dark-green on both faces (Figure 2 A)
Odor
Characteristic aromatic
Characteristic aromatic
Taste
Predominantly characteristic aromatic, turning slightly bitter, and ending slightly spicy
Initially characteristic aromatic, turning predominantly bitter, and ending slightly spicy
Dimension
Ca. 12.7-25.4 cm long and 4.4-8.1 cm wide (Figure 1 B)
Ca. 3.5-16.5 cm long and 2-9 cm wide (Figure 2 B)
Symmetry
Asymmetric (Figure 1 B)
Asymmetric (Figure 2 B)
Shape
Lance-elliptic (Figure 1 B)
Elliptic-ovate (Figure 2 B)
Apex
Acuminate (Figure 1 C)
Acute (Figure 2 C)
Margin
Entire (Figure 1 D)
Entire (Figure 2 D)
Base
Inequilaterally oblique (Figure 1 E)
Inequilaterally rounded, more or less cordate (Figure 2 E)
Surface
To the touch: rough on both faces. To the eye: glabrous, wavy, and verrucose on both faces
To the touch: rough on both faces. To the eye: glabrous, wavy, bright, and verrucose on both faces; puberulent along
the veins on the abaxial face
Fracture surface
Granular (Figure 1 F)
Smooth-granular (Figure 2 F)
Abaxially prominents
Abaxially prominents and puberulents. Midrib with glandular emergences in the basal region on the abaxial face
Major
Camptodromous-brochidodromous: brochidodromous in the apex (Figure 1 G)
Brochidodromous (Figure 2 G)
Orders
Up to 6º. Intersecondary veins present (Figure 1 G)
Up to 6º. Intersecondary veins present (Figure 2 G)
Veinlets
Simple (linear and curved), and branched (x1-3) (Figure 1 H)
Simple (curved), and branched (x1-3) (Figure 2 H)
Areoles
Development: imperfect. Arrangement: random. Shape: irregular (Figure 1 G and H)
Development: imperfect. Arrangement: random. Shape: irregular (Figure 2 G and H)
Marginal
ultimate
Incomplete (Figure 1 I)
Looped (Figure 2 I)
Dimension
Ca. 0.5-0.9 cm long and 0.3-0.4 cm wide (Figure 1 J)
Ca. 0.5-0.7 cm long and 0.1-0.2 cm wide (Figure 2 J and K)
Shape
Straight (Figure 1 J)
Straight (Figure 2 J) or curved (Figure 2 K)
Insertion
Lateral (Figure 1 E)
Lateral (Figure 2 E)
Surface to the eye
Longitudinally striate, glabrous, and with fissures on both faces (Figure 1 J)
Longitudinally striate, glabrous or puberulent, and with glandular emergences on both faces (Figure 2 J-L)
Transection
Irregular shape with circular trend. Lignified elements with no defined arrangement and with tendency for a circle
(Figure 1 K)
Irregular shape with concave-convex trend. Lignified elements with no defined arrangement and with tendency for
U-shaped pattern (Figure 2 M)
Dimension
Ca. 0.2-0.4 cm long and 0.4-0.9 cm wide (Figure 1 J and L)
Ca. 0.2-0.3 cm long and 0.1-0.5 cm wide (Figure 2 J, K and N)
Shape
Concave-convex (Figure 1 L)
Concave-convex (Figure 2 J and N)
Surface to the eye
Verrucose on the adaxial face (Figure 1 L), and longitudinally striate on the abaxial face (Figure 1 J)
Longitudinally striate on both faces (Figure 2 N), and with glandular emergences on the abaxial face (Figure 2 K)
Greenish gray in color (Figure 1 M). Possesses the same odor and taste of the whole herbal drugs
Green in color (Figure 2 O). Possesses the same odor and taste of the whole herbal drugs
Morphology
Nodose with lenticels (Figure 3 A and B)
Conspicuously nodose with lenticels and glandular emergences (Figure 4 A and B)
Color
Brownish (Figure 3 A and B)
Greenish (Figure 4 A and B)
Odor
Slightly characteristic aromatic
Slightly characteristic aromatic
Taste
Initially characteristic aromatic, and turning predominantly spicy
Predominantly characteristic aromatic, and ending slightly spicy
Surface
To the touch: smooth (1st and 2nd internodes); rough (3rd and 4th internodes). To the eye: longitudinally striate (1st-4th
internodes) (Figure 3 B)
To the touch: smooth (1st and 2nd internodes); rough (3rd and 4th internodes). To the eye: longitudinally striate (1st-4th
internodes) (Figure 4 B)
Developmental
stage
1st and 2nd internodes: primary (Figure 3 C and D). 3rd and 4th internodes: initial secondary (Figure 3 F and G)
1st and 2nd internodes: primary (Figure 4 C and D). 3rd and 4th internodes: initial secondary (Figure 4 F and G)
Shape/Lignified
elements
1st and 2nd internodes: irregular shape; inner lignified elements with no defined arrangement (Figure 3 C and D). 3rd
and 4th internodes: circular shape; inner lignified elements arranged in three concentric circles (Figure 3 F and G)
1st and 2nd internodes: irregular shape; inner lignified elements with no defined arrangement (Figure 4 C and D). 3rd
and 4th internodes: elliptical shape; inner lignified elements arranged in two concentric circles (Figure 4 F and G)
Color
Outer region: dark-green (1st-4th internodes) (Figure 3 C and F). Inner region: greenish with yellowish spots (1st and
2nd internodes) (Figure 3 C); mixed in color, with yellowish green central area, and brownish green elliptical
peripheral areas separated by yellowish strands (3rd and 4th internodes) (Figure 3 F)
Outer region: mix of dark-green and yellow (1st and 2nd internodes) (Figure 4 C); dark-green (3rd and 4th internodes)
(Figure 4 F). Inner region: green with yellowish spots (1st and 2nd internodes) (Figure 4 C); mixed in color, with
greenish yellow central area, and greenish brown elliptical peripheral areas separated by yellowish strands (3rd and
4th internodes) (Figure 4 F)
Obtainment
1st and 2nd internodes: easily broken. 3rd and 4th internodes: not easily broken
1st and 2nd internodes: easily broken. 3rd and 4th internodes: not easily broken
Surface
Outer: smooth-granular (1st and 2nd internodes) (Figure 3 E); smooth (3rd and 4th internodes) (Figure 3 H). Inner:
predominantly granular (1st-4th internodes) (Figure 3 E and H)
Outer: smooth-granular (1st and 2nd internodes) (Figure 4 E); granular (3rd and 4th internodes) (Figure 4 H). Inner:
predominantly granular (1st-4th internodes) (Figure 4 E and H)
Somewhat fibrous; green in color (Figure 3 I). Possesses the same odor and taste of the whole herbal drugs
Somewhat fibrous; mixed in color, ranging from brownish green to gray (Figure 4 I). Possesses the same odor and
taste of the whole herbal drugs
General aspect
LEAF
WHOLE
Veins
Petiole
P. tuberculatum Jacq.
Venation
patterns
Leaf sheath
POWDERED
General aspects
WHOLE
STEM
Transection
Fracture
POWDERED
85
Chart 3. Comparative anatomical characteristics of Piper L., Piperaceae.
Aerial part
Characteristics
Species
P. arboreum Aubl. var. arboreum
Anticlinal epidermal cell walls
(Frontal view of the leaf blade)
Adaxial face: straight to wavy (Figure 5 A). Abaxial face: sinuous ( Figure 5 H-J)
Adaxial face: straight to wavy. Abaxial face: sinuous
Leaf blade
Adaxial and abaxial faces: smooth (Figure 5 B)
Adaxial and abaxial faces: striate (Figure 5 C and E)
Petiole
Adaxial and abaxial faces: smooth (Figura 7 A and C)
Adaxial face: smooth (Figure 7 B). Abaxial face: striate (Figure 7 D)
Leaf sheath
Adaxial and abaxial faces: smooth (Figure 8 A and C)
Adaxial face: smooth (Figure 8 B). Abaxial face: striate (Figure 8 D)
Leaf blade
Adaxial and abaxial faces: in continuous plate parallel to the epidermal surface (Figure 5 B)
Adaxial and abaxial faces: in aggregated crusts (Figure 5 D)
Petiole
Adaxial and abaxial faces: in scattered crusts (Figura 7 C)
Absent epicuticular wax (Figure 7 B and D)
Leaf sheath
Adaxial face: absent epicuticular wax (Figure 8 A). Abaxial face: in scattered crusts (Figure 8 C)
Absent epicuticular wax (Figure 8 B and D)
Non-glandular
Type I: short, acuminate shape, up to 3 cells, uniseriate, smooth cuticle, and with epicuticular wax in crust (Figure 8
C). Occurrence: randomly spread on both faces of the petiole, and on the abaxial face of the leaf sheath
Type II: short, acute shape, up to 3 cells, uniseriate, conspicuously striate cuticle, and with epicuticular wax in crust
(Figures 5 E; 6 I). Type III: filiform, over 3 cells, uniseriate, and with slightly striate cuticle (Figure 5 F). Both types
occur: along the veins of the leaf blade on the abaxial face; randomly spread on both faces of the petiole and leaf
sheath; and on the volcano-like glandular emergences (Figure 11 C, D, G and H)
Bicellular with chalice-like lignified short basal cell and sac-like secretory apical cell which lies upon the epidermal
surface, being named “sac-like”. They are coated with smooth cuticle and placed at the same level of the other
epidermal cells. Occurrence: randomly spread on both faces of the leaf, except on the veins of the leaf blade (Figure
5 G)
“Sac-like” and are placed at the same level of the other epidermal cells. Occurrence: randomly spread on both faces of
the leaf, except on the veins of the leaf blade
Type
Anisocytic; tetracytic; and cyclocytic with four or five subsidiary cells (Figure 5 H-J)
Tetracytic; and cyclocytic with four subsidiary cells
Occurrence
Abaxial face at lower level than the other epidermal cells (Figure 6 A)
Abaxial face at higher level than the other epidermal cells (Figure 6 B)
Leaf epidermis
Adaxial and abaxial faces: uniseriate (Figures 6 A, F, H and J; 7 G; 8 E)
Adaxial and abaxial faces: uniseriate (Figures 6 B, G, I and K; 7 H; 8 H)
Cuticular flanges
Type: U-shaped curves. Occurrence: on both faces of the midrib (Figure 6 F and H)
Absent
Leaf blade hypodermis
2 cell layers on the adaxial face; 3 cell layers on the abaxial face; becomes uniseriate toward the leaf margin on both
faces; coalesces into the distal region of the leaf margin; presence of content (Figure 6 A, D and J)
1 cell layer on the adaxial face; 2 cell layers on the abaxial face; becomes uniseriate toward the leaf margin on both
faces; coalesces into the distal region of the leaf margin; presence of content (Figure 6 B, E and K)
Type
Dorsiventral; continuous until next to the distal region of the leaf margin (Figure 6 A and J)
Dorsiventral; continuous until next to the distal region of the leaf margin (Figure 6 B and K)
Palisade
parenchyma
1 cell layer on the adaxial face; palisade cells become gradually shorter toward the midrib and leaf margin (Figure 6
A, D and J)
2-3 cell layers on the adaxial face; palisade cells become gradually shorter toward the midrib and leaf margin (Figure
6 B, E and K)
Spongy
parenchyma
3 cell layers on the abaxial face (Figure 6 A and J)
2-3 cell layers on the abaxial face (Figure 6 B and K)
Vascular
bundles
Collateral encircled by parenchymatic sheath, with fiber cap next to the xylem
Collateral encircled by parenchymatic sheath, with fiber cap next to the xylem (Figure 6 C)
Shape
Concave-convex (Figure 6 D)
Slightly flat on the adaxial face, and costate on the abaxial face (Figure 6 E)
Collenchyma
Adaxial face: lamellar in strand. Abaxial face: angular in strand. Both types are separated from the epidermis by 1
layer of ground parenchyma (Figure 6 D, F and H)
Adaxial face: predominantly lamellar in strand and occurs immediately beneath the epidermis. Abaxial face: lamellarangular in strand and is separated from the epidermis by 1 layer of ground parenchyma (Figure 6 E, G and I)
Vascular
bundles
Collateral with fiber cap next to the xylem and phloem. Arrangement: V-shaped pattern (Figure 6 D)
Collateral with fiber cap next to the xylem and phloem. Arrangement: V-shaped pattern (Figure 6 E)
Curved toward the abaxial face. The distal region is occupied by hypodermal cells (Figure 6 J)
Slightly bent toward the abaxial face. The distal region is occupied by hypodermal cells (Figure 6 K)
Shape
Crescent (Figure 7 E)
Circinnate (Figure 7 F)
Collenchyma
Adaxial and abaxial faces: predominantly angular in strand and is separated from the epidermis by 2-3 layers of
ground parenchyma (Figure 7 G and I)
Adaxial and abaxial faces: lamellar in strand and is separated from the epidermis by 3-4 layers of ground parenchyma
(Figure 7 H and K)
Vascular
bundles
Collateral encircled by parenchymatic sheath. Arrangement: in a crescent (Figure 7 E and J)
Collateral encircled by parenchymatic sheath. Arrangement: circinnate-shaped pattern (Figure 7 F and L)
Shape
Concave-convex (Figure 8 E)
Concave-convex (Figure 8 F)
Collenchyma
Adaxial and abaxial faces: angular in strand and is separated from the epidermis by 2-3 layers of ground
parenchyma (Figure 8 G and I)
Adaxial and abaxial faces: lamellar in strand and is separated from the epidermis by 2-3 layers of ground parenchyma
(Figure 8 H and J)
Vascular
bundles
Collateral encircled by parenchymatic sheath. Arrangement: in an arc (Figure 8 E and G)
Collateral encircled by parenchymatic sheath. Arrangement: in an arc (Figure 8 F and H)
Crystals
Druses: mesophyll; ground parenchyma of the leaf sheath. Prismatic crystals: ground parenchyma of the midrib,
petiole, and leaf sheath (Figure 10 A, C, E and G)
Druses: mesophyll. Prismatic crystals: ground parenchyma of the midrib, petiole, and leaf sheath (Figure 10 B, D, F
and H)
Secretory structures
Sac-like glandular trichomes and secretory idioblasts (Figures 5 G; 6 A, D, F, H and J; 7 G, I and J; 8 G; 11 A and
B)
Sac-like glandular trichomes, secretory idioblasts and volcano-like glandular emergences (Figures 6 B and E; 7 H and
L; 8 H; 11 C-G)
Cuticular ornamentation
Smooth, regardless of the stem developmental stage (Figure 9 A)
Smooth, regardless of the stem developmental stage (Figure 9 B)
Non-glandular
Type IV: short, acute shape, up to 3 cells, uniseriate, and with smooth cuticle (Figure 9 A). Occurrence: randomly
spread on the epidermal surface, regardless of the stem developmental stage
Type III occurs on the volcano-like glandular emergences (Figure 11 H). Type IV occurs randomly spread on the
other regions (Figure 9 B). Both types occur regardless of the stem developmental stage
Glandular
“Sac-like” and are observed regardless of the stem developmental stage
“Sac-like” and are observed regardless of the stem developmental stage
Epidermis
Uniseriate, regardless of the stem developmental stage. Lenticels occur in the stem in initial secondary growth
(Figure 9 C, E, I and G)
Uniseriate, regardless of the stem developmental stage. Lenticels occur in the stem in initial secondary growth (Figure
9 D, F and H)
Shape
Circular, regardless of the stem developmental stage (Figure 9 C)
Elliptical, regardless of the stem developmental stage (Figure 9 D)
Cortex
Strands of lamellar collenchyma are separated from the epidermis by 3-4 layers of ground parenchyma, regardless
of the stem developmental stage (Figure 9 E and G)
Strands of lamellar collenchyma are separated from the epidermis by 3-4 layers of ground parenchyma, regardless of
the stem developmental stage (Figure 9 F, H and J)
Vascular Organization
Primary growth: collateral vascular bundles in two concentric circles; peripheral bundles in differentiation; presence
of parenchymatic sheath (Figure 9 E). Initial secondary growth: collateral vascular bundles in three concentric
circles; the peripheral circle of bundles is bound internally and separated from the pith by a sinuous zone of fibers,
the xylem and phloem are radially elongated, presence of sclerenchyma cap next to the phloem, parenchymatic rays
occur among the bundles; the medullary bundles are encircled by parenchymatic sheath, fibers present in the xylem
and phloem poles may form a cap (Figure 9 G)
Primary growth: collateral vascular bundles in two concentric circles; presence of parenchymatic sheath (Figure 9 F).
Initial secondary growth: collateral vascular bundles in two concentric circles; the peripheral circle of bundles is
bound internally and separated from the pith by a sinuous zone of fibers, the xylem and phloem are radially elongated,
fibers present in the phloem pole may form a cap, parenchymatic rays occur among the bundles; the medullary
bundles are encircled by parenchymatic sheath, fibers present in the xylem and phloem poles may form a cap next to
the xylem (Figure 9 H)
Pith
Parenchymatic; presence of amyloplasts that possess polyhedrical simple starch grains with plane, concave and
convex facets, and centric and stellate hilum (Figures 9 G; 14 P); prismatic crystals present (Figure 10 I)
Parenchymatic; presence of amyloplasts that possess polyhedrical simple starch grains with plane, concave and
convex facets, and centric and fissured hilum (Figures 9 H; 15 O); prismatic crystals present (Figure 10 J)
Secretory structures
Sac-like glandular trichomes and secretory idioblasts (Figure 9 E, G and I)
Sac-like glandular trichomes, secretory idioblasts and volcano-like glandular emergences (Figures 9 F and H; 11 H
and I)
Cuticular
ornamentation
Epicuticular
wax pattern
Trichomes
Glandular
Stomata
LEAF
Mesophyll
Midrib
Leaf margin
Petiole
Leaf sheath
Trichomes
STEM
P. tuberculatum Jacq.
86
Chart 4. Results of the histochemical screening performed in leaves and stem of Piper arboreum Aubl. var. arboreum, Piperaceae.
Metabolic classes
Reagents
Secretory idioblasts
Leaf
Glandular trichomes
hypodermis
Leaf
Among the
Mesophyll
Midrib
Petiole
Stem
Leaf sheath
Xylem parenchyma
Phloem parenchyma
CP
MP
CO
XYP
PHP
Leaf
Stem
hypodermal
cells
GP
CO
GP
CO
GP
CO
MD
PE
LES
MD
PE
LES
Total lipids
Sudan black B
-
-
++
-
+
-
++
-
-
-
-
+
+
+
-
++
-
-
+
++
++
+
Neutral lipids
Nile blue A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
-
-
-
Acid lipids
Nile blue A
-
-
++
-
+
-
++
-
-
-
-
++
+
+
-
++
-
-
+
++
++
+
Unsaturated lipids
Osmium tetroxide
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Fatty acids
Copper acetate/rubeanic
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
acid
Essential oils
NADI reagent
++
-
-
-
++
-
+
-
+
+
+
+
+
++
++
-
-
+
+
-
-
-
Oleoresins
NADI reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mixture of essentials
and resins
NADI reagent
-
-
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
++
-
-
Steroids
Antimony trichloride
-
++
-
-
++
-
++
-
-
-
-
-
-
++
-
++
-
-
-
-
-
-
Sesquiterpene lactones
Abraham reaction
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Terpenoids with
carbonyl group
2,4dinitrophenylhydrazine
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
-
++
-
-
Total phenolics
Ferric trichloride
-
-
++
+
++
+
+
+
-
-
-
-
-
-
+
++
+
-
-
++
-
-
Tannins
Vanillin–hydrochloric
acid
-
-
++
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
++
-
-
-
++
-
-
Flavonoids
Aluminum trichloride*
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
Neutral polysaccharides
Periodic acid–Schiff
(PAS) reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Pectins
Ruthenium red
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mucins
Mayer’s tannic acidferric chloride stain
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Acid
mucopolysaccharides
Alcian blue
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Total alkaloids
Dragendorff reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Total proteins
Xylidine-Ponceau
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Positive (+). Intense positive (++). Negative (-). Ground parenchyma (GP). Collenchyma (CO). Xylem parenchyma (XYP). Phloem parenchyma (PHP). Midrib (MD). Petiole (PE). Leaf sheath (LES). Cortical parenchyma (CP). Medullary parenchyma (MP). *Observed under
UV light.
87
Chart 5. Results of the histochemical screening performed in leaves and stem of Piper tuberculatum Jacq., Piperaceae.
Metabolic classes
Reagents
Secretory idioblasts
Leaf
Glandular emergences
Glandular trichomes
hypodermis
Leaf
Stem
Midrib
Petiole
Leaf
Stem
Leaf
Stem
sheath
Among the
Mesophyll
Midrib
Petiole
Leaf sheath
Xylem parenchyma
Phloem parenchyma
CP
MP
CO
XYP
PHP
hypodermal
cells
GP
CO
GP
CO
GP
CO
MD
PE
LES
MD
PE
LES
Total lipids
Sudan black B
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
+
Neutral lipids
Nile blue A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Acid lipids
Nile blue A
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
+
Unsaturated lipids
Osmium
tetroxide
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Fatty acids
Copper
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
acetate/rubeanic
acid
Essential oils
NADI reagent
+
-
++
-
-
-
-
-
+
+
+
++
++
++
-
++
-
-
++
++
++
++
++
++
-
-
Oleoresins
NADI reagent
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
++
++
++
++
-
-
Mixture of essentials
and resins
NADI reagent
-
-
-
-
++
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Steroids
Antimony
trichloride
-
++
++
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
++
++
++
++
-
-
Sesquiterpene
lactones
Abraham
reaction
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Terpenoids with
carbonyl group
2,4dinitrophenylhy
drazine
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Total phenolics
Ferric
trichloride
-
++
-
+
++ ++
+
+
-
-
-
-
-
-
+
++
+
-
-
++
++
++
++
++
-
-
Tannins
Vanillin–
hydrochloric
acid
-
-
-
-
++
-
++
-
-
-
-
-
-
-
+
++
+
-
-
++
++
++
++
++
-
-
Flavonoids
Aluminum
trichloride*
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
Neutral
polysaccharides
Periodic acid–
Schiff (PAS)
reagent
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Pectins
Ruthenium red
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Mucins
Mayer’s tannic
acid-ferric
chloride stain
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Acid
mucopolysaccharides
Alcian blue
Total alkaloids
Dragendorff
reagent
-
-
-
-
++
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
++
-
-
-
++
++
++
++
++
-
-
Total proteins
XylidinePonceau
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
Positive (+). Intense positive (++). Negative (-). Ground parenchyma (GP). Collenchyma (CO). Xylem parenchyma (XYP). Phloem parenchyma (PHP). Midrib (MD). Petiole (PE). Leaf sheath (LES). Cortical parenchyma (CP). Medullary parenchyma (MP). *Observed under UV light.
88
Chart 6. Comparative microscopic characteristics of the powdered herbal drugs of Piper L., Piperaceae.
Herbal drug
Species
P. arboreum Aubl. var. arboreum
LEAF
STEM
P. tuberculatum Jacq.
Leaf blade fragments with: straight to wavy (adaxial face) or
sinuous (abaxial face) anticlinal epidermal cell walls, sac-like
glandular trichomes, anisocytic, tetracytic and cyclocytic stomata
(abaxial face), smooth cuticle, continuous plate of epicuticular
wax parallel to the epidermal surface, secretory idioblasts of
acidophilic content, and druses (Figure 14 A-D)
Leaf blade fragments with: straight to wavy (adaxial face) or
sinuous (abaxial face) anticlinal epidermal cell walls, sac-like
glandular trichomes, non-glandular trichomes of the type III,
tetracytic and cyclocytic stomata (abaxial face), striate cuticle,
aggregated crusts of epicuticular wax, volcano-like glandular
emergences, secretory idioblasts of acidophilic content, tracheary
elements with helical wall thickening, and druses (Figure 15 A-G)
Presence of: fiber bundles, tracheary elements with annular,
helical and pitted wall thickening, styloids, and cuneiform
prismatic crystals (Figure 14 E-H)
Presence of: fiber bundles, and cuneiform prismatic crystals (Figure
15 H and I)
Fragments with: thick and straight to wavy anticlinal epidermal
cell walls, smooth cuticle, sac-like glandular trichomes, and nonglandular trichomes of the type IV (Figure 14 I and J)
Fragments with: thin and straight to wavy anticlinal epidermal cell
walls, smooth cuticle, non-glandular trichomes of the types III and
IV, and volcano-like glandular emergences (Figure 15 J and K)
Presence of: idioblasts with styloids, non-birefringent crystal
fragments, brownish-colored particles, fiber bundles,
brachysclereids and macrosclereids, tracheary elements with
annular wall thickening, and polyhedrical simple starch grains
with plane, concave and convex facets, and centric and stellate
hilum (Figure 14 K-P)
Presence of: idioblasts with prismatic crystals, secretory idioblasts
of acidophilic content, fiber bundles, tracheary elements with
annular and helical wall thickening, and polyhedrical simple starch
grains with plane, concave and convex facets, and centric and
fissured hilum (Figure 15 L-O)
89
Table 1. Results of physicochemical parameters determined in herbal drugs of Piper L., Piperaceae.
Species
Herbal drug
Parameters (mean ± S.D.; n = 3)
Loss on drying
(INFRATEST)
Moisture content
pH
Total ash
Sulphated ash
Acid-insoluble
ash
Leaf
8.220% ± 0.003
6.800% ± 0.140
4.545% ± 0.007
11.230% ± 0.021
64.932% ± 0.687
1.240% ± 0.870
Stem
8.030% ± 0.002
5.400% ± 0.103
4.420% ± 0.325
8.932% ± 0.001
16.534% ± 0.820
4.350% ± 0.320
Leaf
8.890% ± 0.004
6.600% ± 0.264
4.134% ± 0.231
14.198% ± 0.006
77.455% ± 0.720
1.360% ± 0.220
Stem
8.355% ± 0.003
5.300% ± 0.628
4.668% ± 0.035
12.320% ± 0.003
21.756% ± 0.298
1.278% ± 0.323
P. arboreum Aubl.
var. arboreum
P. tuberculatum Jacq.
n is the number of independent determinations.
Standard Deviation (S.D.).
90
Table 2. Results of determination of metals in herbal drugs of Piper L., Piperaceae.
Species
Metal content (mean ± S.D. mg Kg -1; n = 3)
Herbal drug
Al
Cd
Co
Cr
Cu
Mn
Mo
Ni
Pb
Ti
V
Hg
As
Leaf
40.070 ± 2.313
0.036 ± 0.003
0.034 ± 0.022
0.972 ± 0.184
15.477 ± 0.058
195.325 ± 2.839
<LODb
5.251 ± 0.118
<LODb
<LODb
14.970 ± 0.413
0.014 ± 0.003
<LODb
Stem
27.535 ± 5.496
0.043 ± 0.006
0.026 ± 0.032
0.883 ± 0.057
19.368 ± 0.125
70.137 ± 1.202
<LODb
0.938 ± 0.272
<LODb
<LODb
9.270 ± 0.333
0.017 ± 0.007
<LODb
Leaf
52.747 ± 2.613
0.031 ± 0.004
0.032 ± 0.025
0.884 ± 0.063
10.184 ± 0.207
29.708 ± 1.749
<LODb
0.302 ± 0.283
<LODb
<LODb
8.964 ± 0.605
0.004 ± 0.003
<LODb
Stem
18.818 ± 1.898
0.036 ± 0.004
0.042 ± 0.012
1.053 ± 0.281
10.126 ± 0.587
13.985 ± 0.739
<LODb
0.296 ± 0.182
<LODb
<LODb
9.345 ± 0.566
0.005 ± 0.001
<LODb
SRMa 1547
233.672 ± 4.976
0.031 ± 0.007
0.059 ± 0.014
1.172 ± 0.024
3.100 ± 0.354
74.900 ± 3.467
<LODb
0.615 ± 0.102
<LODb
1.100 ± 0.283
0.400 ± 0.289
0.029 ± 0.007 0.064 ± 0.018
Recovery (%)
93.84
102.96
83.85
117.20
82.86
76.48
**
89.07
**
***
113.55
P. arboreum Aubl.
var. arboreum
P. tuberculatum
Jacq.
n is the number of independent determinations.
Standard Deviation (S.D.).
a
Standard Reference Material.
b
LOD (Detection limit): Mo = 0.001 mg Kg -1 ; Pd = 0.005 mg Kg-1 ; Ti = 0.002 mg Kg-1 ; Hg = 0.00004 mg Kg-1 ; As = 0.00012 mg Kg-1.
** Non-satisfactory recovery.
*** Value not certified.
93.84
102.96
91
FIGURAS
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
3. SÍNTESE
As investigações realizadas para Piper L. estão relacionadas, principalmente, a
estudos taxonômicos, fitoquímicos, agronômicos e sobre a atividade biológica de
fitoconstituintes fixos e voláteis. Estudos farmacognósticos são raros. No presente trabalho,
foram levantados dados macroscópicos para as drogas vegetais, assim como microscópicos e
químicos para as plantas medicinais e drogas vegetais de P. arboreum Aubl. var. arboreum,
P. callosum Ruiz & Pav. e P. tuberculatum Jacq., espécies vegetais de ampla utilização
etnofarmacológica e com potencial para tornarem-se fitomedicamentos. A elucidação
estrutural e histoquímica de estruturas secretoras, observadas até então apenas sobre o ponto
de vista morfológico, a elaboração de um inventário de caracteres morfoanatômicos dos
órgãos vegetativos aéreos e o estabelecimento de parâmetros físico-químicos foram os
principais pontos abordados nos três capítulos da tese que, em conjunto, contribuem para o
controle de qualidade (autenticidade e grau de pureza) das matérias-primas vegetais dessas
três espécies de Piper.
No primeiro capítulo, os morfotipos de cristais e macropadrões cristalinos
observados são características relevantes à identificação microscópica de folhas e caule, in
natura ou na forma de drogas vegetais, das espécies estudadas. Ademais, a riqueza em
conteúdo mineral dessas espécies possibilitou justificar os teores elevados de cinzas,
principalmente cinzas sulfatadas, apresentados pelas drogas vegetais das espécies de Piper em
questão.
No segundo e terceiro capítulos, foram abordados aspectos referentes à
morfodiagnose macroscópica e microscópica e à caracterização físico-química das espécies de
Piper em questão. O segundo capítulo versa sobre P. callosum e o terceiro capítulo trata de P.
arboreum var. arboreum e P. tuberculatum.
Concernente à morfodiagnose macroscópica, as drogas vegetais das três espécies
apresentaram morfologia semelhante às descrições de cada espécie feitas na literatura,
ratificando que a coleta da espécie correta é um fator crucial quando se objetiva estabelecer
parâmetros de qualidade através da autenticidade. Demais características como cor, odor
sabor, textura, superfície, padrões de venação foliar e aspectos da superfície de fratura e da
secção transversal foram em geral peculiares para as drogas vegetais das espécies de Piper
estudadas. As calosidades presentes na face superior da base da lamina foliar das drogas
vegetais de P. callosum são características-chave para identificá-las quando íntegras.
Similarmente, as emergências glandulares observadas nas drogas vegetais caulinares e foliares
108
de P. tuberculatum permitem diferenciá-las daquelas de P. arboreum var. arboreum, estejam
as drogas vegetais íntegras ou não.
Em relação à morfodiagnose microscópica, o conjunto de caracteres anatômicos
distintivos observados nas três espécies de Piper é relevante à identificação tanto das plantas
medicinais como das drogas vegetais, pois ambas não diferiram anatomicamente. Destacamse entre esses caracteres os padrões de cera epicuticular, de cutícula e de flange cuticular, o
tipo e posição do colênquima, os padrões de arranjo dos feixes vasculares, a forma em secção
transversal da nervura central, da margem foliar, do pecíolo e do caule, assim como a
morfologia dos grãos de amido.
As análises físico-químicas das drogas vegetais das espécies de Piper estudadas
revelaram em geral valores semelhantes para os teores de voláteis e umidade, pH e cinzas
totais, sulfatadas e ácido-insolúveis. Para o conteúdo metálico, as concentrações elevadas de
Al, Cu, Mn e V em relação a Cd, Co, Cr, Mo, Ni, Pb, Ti, Hg e As, somada à capacidade dos
cristais de incorporarem metais na sua estrutura, como observado nas concrescências
cristalinas ocorrentes no caule de P. arboreum var. arboreum, podem ser indicativos que as
três espécies são hiperacumuladoras de metais. Sendo assim, a avaliação do conteúdo
metálico dessas plantas constitui um critério de qualidade de fundamental importância,
assegurando-lhes o uso para fins medicinais, principalmente na forma de chás, pois tais metais
são potencialmente tóxicos e podem causar danos à saúde humana quando em concentrações
acima dos níveis toleráveis. Ressalta-se que todos os valores das análises físico-químicas
realizadas estão dentro dos valores-limite preconizados como satisfatórios pelas agências
reguladoras oficiais.
A histoquímica, embora não possa ser utilizada como parâmetro de controle de
qualidade, permitiu diagnosticar in situ o conteúdo metabólico das espécies de Piper em
questão, o que possibilitou correlacionar as atividades biológicas atribuídas às diferentes
classes metabólicas com os usos terapêuticos tradicionais dessas espécies vegetais.
Afora as implicações puramente farmacognósticas, o presente trabalho fez o
registro de dados inéditos para as três espécies de Piper, ao gênero Piper e para a família
Piperaceae, trazendo contribuições relevantes ao conhecimento estrutural, taxonômico e
químico do grupo. A estrutura e histoquímica das calosidades e das emergências glandulares
de P. callosum e P. tuberculatum, respectivamente, foram elucidadas. Esteroides não haviam
sido mencionados anteriormente para P. arboreum var. arboreum. Rosetas cristalinas,
concrescências cristalinas silicificadas e 14 novos macropadrões cristalinos foram reportados
pela primeira vez para Piper e Piperaceae.
109
Por fim, sugere-se que P. arboreum var. arboreum, P. callosum e P. tuberculatum
sejam melhor avaliadas sobre os aspectos farmacológicos, devido aos inúmeros usos
etnofarmacológicos que possuem e ao fato de serem comercializadas como produtos
fitoterápicos tradicionais, o que as torna espécies promissoras para o desenvolvimento de
fitomedicamentos, principalmente fitoterápicos, visto que os pré-requisitos fundamentais
exigidos ao controle de qualidade de matérias-primas vegetais para fins farmacêuticos foram
estabelecidos às três espécies no presente estudo.
110
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Albiero, A.L.M., PAOLI, A.A.S., SOUZA, L.A., MOURÃO, K.S.M. 2005. Morfoanatomia
dos órgãos vegetativos de Piper crassinervium H.B. & K. (Piperaceae). Acta Bot. Bras. 19,
305-312.
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Doutorado
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