UNIR – FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
MESTRADO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA - IPEPATRO
ATIVIDADE ANTI-HEMORRÁGICA, AÇÃO
ANALGÉSICA, ATIVIDADE DE INIBIÇÃO DE EDEMA E
DE CRESCIMENTO DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE
LEISHMANIA AMAZONENSIS DO ÁCIDO 3,4,5TRIMETOXI BENZENOPROPANÓICO ISOLADO DO
EXTRATO DOS FRUTOS DE PIPER TUBERCULATUM
JACQ.
Maria Goretty Pelegrini Ramos
Ferreira
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Biologia Experimental do
Departamento de Medicina da Fundação
Universidade Federal de Rondônia, para
obtenção do título de Mestre em Biologia
Experimental.
Porto Velho – RO
2006
UNIR – FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE RONDÔNIA
MESTRADO EM BIOLOGIA EXPERIMENTAL
LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA E BIOTECNOLOGIA - IPEPATRO
ATIVIDADE ANTI-HEMORRÁGICA, AÇÃO
ANALGÉSICA, ATIVIDADE DE INIBIÇÃO DE EDEMA E
DE CRESCIMENTO DE FORMAS PROMASTIGOTAS DE
LEISHMANIA AMAZONENSIS DO ÁCIDO 3,4,5TRIMETOXI BENZENOPROPANÓICO ISOLADO DO
EXTRATO DOS FRUTOS DE PIPER TUBERCULATUM
JACQ.
Maria Goretty Pelegrini Ramos
Ferreira
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Biologia Experimental do
Departamento de Medicina da Fundação
Universidade Federal de Rondônia, para
obtenção do título de Mestre em Biologia
Experimental.
ORIENTADOR:
Guerino Stábeli
Porto Velho – RO
2006
Prof.
Drº
Rodrigo
FERREIRA, Maria Goretty Pelegrini Ramos
Atividade Anti-Hemorrágica, Ação Analgésica, Atividade
de Inibição de Edema e de Crescimento de Formas
Promastigotas de Leishmania amazonensis do Ácido 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico Isolado do Extrato dos Frutos de
Piper tuberculatum Jacq
Porto Velho, 2006.
79p.
Dissertação de Mestrado, apresentada à Fundação
Universidade Federal de Rondônia/UNIR – Laboratório de
Bioquímica e Biotecnologia/IPEPATRO.
DEDICATÓRIA
Aos meus pais Francisco e Maria Aparecida.
Às minhas irmãs Ana Paula e Ana Maria,
Que mesmo distantes sempre me apoiaram e incentivaram para esta conquista.
À José Torres Ferreira
Pelo apoio, carinho e incentivo, mas acima de tudo,
Pelo amor que me deu forças para superar as dificuldades
Que passei durante o caminho.
AMO TODOS VOCÊS
Ao meu orientador Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli,
Por sua valorosa colaboração para o mundo das pesquisas
E pelo grande incentivo, convivência e companheirismo de todas as horas dedicado aos
seus alunos.
MUITO OBRIGADA
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus, que me deu forças para continuar mesmo quando já não
as tinha mais, e por ter me concedido a oportunidade de obter novos conhecimentos.
Em especial, ao Prof. Dr. Rodrigo Guerino Stábeli, pela orientação, amizade e
principalmente paciência durante todo período em que com ele aprendi e pela farta
transmissão de seus conhecimentos científico-laboratoriais.
A toda minha família, especialmente aos meus pais Francisco e Maria Aparecida, pela
educação e valores recebidos, e por proporcionar toda a minha formação.
Com todo carinho ao meu esposo Torres, por estar sempre ao meu lado e pelo apoio
incondicional.
Ao Prof. Dr. Valdir Alves Facundo do Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos
Naturais (UNIR), pela ajuda e incentivo durante a elaboração deste trabalho.
À Drª. Izaltina Silva Jardim do Laboratório de Quimioterapia (IPEPATRO), pela
generosa ajuda e colaboração para a conclusão deste trabalho.
À Profª. Mariza Gomes Pires do Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos
Naturais (UNIR) e à Drª. Anita J. Marsaioli do Instituto de Química da Universidade
Estadual de Campinas, Campinas-SP, pelo auxílio para a elaboração dos gráficos de
Ressonância Magnética Nuclear (RMN).
Ao Dr. René de Oliveira Beleboni do laboratório de Biotecnologia de Plantas da Unaerp
e a aluna Rosana Gomes, pela colaboração com os testes de algesia e analgesia.
Aos meus companheiros de laboratório, pela amizade em todas as horas, e
principalmente ao Kayano pela ajuda na elaboração do trabalho.
Aos alunos do Laboratório de Pesquisa em Química de Produtos Naturais (UNIR), pelas
dicas e ajuda em todo tempo que estivemos juntos.
Aos todos meus amigos, pela força, amizade, compreensão, companheirismo e pelo
incentivo para que eu conseguisse chegar até o fim.
“O que sabemos é uma gota, o que ignoramos
é um oceano”.
Isaac Newton
RESUMO
FERREIRA, Maria Goretty Pelegrini Ramos. Atividade Anti-Hemorrágica, Ação
Analgésica, Atividade de Inibição de Edema e de Crescimento de Formas
Promastigotas
de
Leishmania
amazonensis
do
Ácido
3,4,5-trimetoxi
benzenopropanóico Isolado do Extrato dos Frutos de Piper tuberculatum Jacq. 2006.
78 p. Dissertação de Mestrado – Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto
Velho/RO.
O Brasil tem a maior biodiversidade do planeta com cerca de 55 mil espécies de plantas
superiores conhecidas. A maioria é usada pelo ser humano como fonte de alimento e
matéria-prima para construção, bem como medicamentos para cura de enfermidades ou
no uso de aromatizantes. Piper tuberculatum Jacq., popularmente conhecida como
“pimenta d’arda”, é utilizada na medicina popular como sedativa, antídoto para mordida
de cobra, estimulante, para problemas estomacais entre outras aplicações. O estudo
fitoquímico dos frutos de P. tuberculatum levou ao isolamento e identificação do ácido
3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico. Este ácido foi identificado através de métodos
espectroscópicos de RMN 1H e 13C e espectrometria de massa. Ensaios biológicos do
ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico revelaram que ele apresenta atividade antihemorrágica contra o veneno de Bothrops alternatus quando induzida em camundongos,
mas não inibiu a indução de edema ocasionada pela proteína BthTX-1, uma Fosfolipase
A2 do veneno de B. jararacussu, mostrando que a ação de inibição de hemorragia deve
ser sobre as metaloproteinases do veneno. Outra atividade biológica, foi a inibição do
crescimento de formas promastigotas de Leishmania amazonensis. O ácido 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico quando ensaiado para verificar a atividade analgésica
central e periférica, não produziu nenhum efeito significativo.
Palavras-chave: Piperaceae; Piper tuberculatum; Atividade Anti-Hemorrágica;
Leishmania amazonensis.
ABSTRACT
FERREIRA, Maria Goretty Pelegrini Ramos. Anti-Hemorrhagic Activity, Analgesic
Action, Edema Inhibition of Activity and of the Promastigotes Forms Growth of
Leishmania amazonensis of 3(3,4,5-trimethoxyybenzene) propionic acid Isolated of
the Extract Piper tuberculatum Jacq fruits. 2006. 78 p. Dissertação de Mestrado –
Fundação Universidade Federal de Rondônia, Porto Velho/RO.
Brazil has the large biodiversity of the planet with about 55 thousand species of known
superior plants. The majority is used by human being as source of food and raw
material for construction, as well as medicines or in perfuming. Piper tuberculatum
Jacq., popularly known as "pepper d'arda", is used in the popular medicine as sedative,
antidote for snake bite, stimulant, for stomachal problems, among others applications.
The phytochemistry study of the fruits of P. tuberculatum lead to the isolation and
identification of 3(3,4,5-trimethoxyybenzene) propionic acid. This acid was identificad
by spectroscopic methods of RMN 1H and 13C and spectrometry of mass. Biological
assays of the 3(3,4,5-trimethoxyybenzene) propionic acid resulted in anti-hemorrhagic
activity against the poison of Bothrops alternatus in mice, but did not inhibit edema
caused by the BthTX-1 protein, a Fosfolipase A2 of the poison of B. jararacussu,
indicating that the action of hemorrhage inhibition relays be on metaloproteinases of
the poison. Another biological activity, was the inhibition of the growth of
promastigotes forms of Leishmania amazonensis. The 3(3,4,5-trimethoxyybenzene)
propionic acid when assayed to verify the central and peripheral analgesic activity, it
did not produce no significant effect.
Word-key: Piperaceae; Piper tuberculatum; Anti-Hemorrhagic Activity; Leishmania
amazonensis.
LISTA DE FIGURAS E TABELA
Figura 1
Distribuição geográfica do gênero Piper.
05
Figura 2
Foto da folhas e frutos de P. tuberculatum.
07
Figura 3
Foto de P. tuberculatum cedida pelo Dr. Valdir Alves
Facundo
08
Figura 4
Estrutura química proposta para o ácido 3,4,5-trimetoxi
benzenopropanóico isolado do extrato dos frutos de P.
tuberculatum
28
Espectro de massas (I. E. 75 eV) do ácido 3,4,5trimetoxi benzenopropanóico.
29
Espectro de RMN 1H (CDCl3 500 MHz) do ácido 3,4,5trimetoxi benzenopropanóico.
30
Espectro de RMN 13C (CDCl3 126 MHz) do ácido
3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico
31
Figura 5
Figura 6
Figura 7
Espectro de RMN 13C (CDCl3 126 MHz) do ácido
3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico, utilizando a técnica
DEPT 135.
32
Figura 9
Peso das patas em gramas.
35
Figura 10
Produção de hemorragia em camundongos após
procedimento de inoculação de substâncias, expressado
por medição do halo hemorrágico formado em cm2.
37
Curva de crescimento de promastigotas de L.
amazonensis na presença de PtFE-2
40
Porcentagem de inibição do crescimento do parasita em
relação a substância utilizada.
41
Figura 8
Figura 11
Figura 12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Tabela 2
Tabela demonstrativa do procedimento realizado para o
teste de atividade anti-hemorrágica
22
Deslocamentos químicos de RMN 1H e 13C registrados
em CDCl3 de todos os átomos de carbono e hidrogênio
do ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico.
33
LISTA DE ABREVIATURAS
BthTX-1
Bothrops Toxina-1
CCD
Cromatografia de Camada Delgada
DEPT
Distortioness Enhancement by Polarization Transfer
ICAM
Molécula de Adesão Intercelular
INPA
Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia
MHz
Mega Hertz
PLA2
Fosfolipase A2
ppm
Partes Por Milhão
PtFE
Piper tuberculatum fração etanólica
PtFE-1
Piper tuberculatum fração etanólica-1
PtFE-2
Piper tuberculatum fração etanólica-2 ou Ácido 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico
RMN 13C
Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13
RMN 1H
Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio-1
SVMP
Metaloproteinase de Veneno de Serpente
TNF-α
Fator de Necrose Tumoral
SUMÁRIO
1.
INTRODUÇÃO
01
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
02
04
05
1.7.
O Uso de Plantas como Medicamentos
Considerações Botânicas sobre a Família Piperaceae
Considerações Botânicas sobre Gênero Piper
Constituintes Químicos e Atividades Biológicas de Espécies do
Gênero Piper.
Piper tuberculatum
Constituintes do Veneno de Serpentes do Gênero Bothrops e
Tratamentos Antiofídicos no Brasil
Leishmania sp e Tratamentos para Leishmaniose
2.
OBJETIVOS
14
2.1.
2.2.
Objetivos gerais
Objetivos específicos
15
15
3.
MATERIAIS E MÉTODOS
16
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
Animais
Veneno e Frações
Obtenção do extrato etanólico dos frutos de P. tuberculatum
Isolamento
e
Purificação
do
Ácido
3,4,5trimetoxibenzenopropanóico dos Frutos de P. tuberculatum
Identificação e Caracterização do Composto Químico Isolado
dos Extrato dos Frutos de P. tuberculatum
Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de
Hidrogênio-1 (RMN 1H) e de Carbono-13 (RMN 13C) e
Espectrometria de Massas
Teste de Inibição de Edema
Atividade Anti-Hemorrágica
Ensaio Antiparasitário
Efeito
de
Interferência
do
Ácido
3,4,5trimetoxibenzenopropanóico sobre a Replicação de Formas
Promastigotas dos Parasitas Leishmania
Teste de Contorção Abdominal em Camundongos
Experimento Hargreaves (Analgesia Central)
RESULTADOS E DISCUSSÃO
17
17
18
1.5.
1.6.
3.5.
3.5.1.
3.6.
3.7.
3.8.
3.8.1
3.9.
3.10
4.
4.1.
Isolamento e Determinação Estrutural do Ácido 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico
06
07
09
11
18
20
20
21
22
23
23
24
25
26
27
Atividade de Inibição de Edema
Atividade Anti-Hemorrágica
Ação de Inibição de Crescimento de Formas Promastigotas de
Leishmania amazonensis
Experimento Hargreaves (Analgesia Central) e Teste de
Contorção Abdominal (Analgesia Periférica) em Camundongos
34
36
5.
CONCLUSÃO
43
6.
REFERÊNCIAS
45
4.2.
4.3.
4.4.
4.5.
39
42
1 – INTRODUÇÃO
1. INTRODUÇÃO
1.1.
O Uso de Plantas como Medicamentos
O interesse pela ação de produtos naturais para a saúde é muito antigo e a
humanidade, em um contexto cultural, sempre utilizou o poder terapêutico de extratos
animais e vegetais, em formas processadas de chás, pomadas, emplastos, vapores,
tinturas e até mesmo de incensos. Estas práticas são utilizadas até hoje, principalmente
em países subdesenvolvidos ou seguidores de terapias não convencionais (Maciel et al.,
2002).
A Organização Mundial da Saúde estima que 80% da população mundial dependem
da medicina tradicional para suas necessidades básicas de saúde, e que quase 85% da
medicina tradicional envolvem o uso de plantas medicinais, ou seus extratos vegetais e
princípios ativos (IUCN, 1993), despertando assim grandes interesses nacionais e
internacionais pelo potencial terapêutico e econômico que representam (Berg, 1993).
Atualmente, 25% dos medicamentos do mercado farmacêutico possuem extratos em sua
composição, alguns dos quais têm sido usados como matéria-prima de drogas semisintéticas (Bergmann et al., 1997).
O uso de plantas medicinais pela população tem demonstrado que caule, raízes,
folhas, sementes e frutos de plantas têm trazido eficiência na cura de diversos males,
suscitando assim grande interesse no estudo científico destas plantas (Bergmann et al.,
1997). Esta prática é comum no Brasil, a qual tem sido transmitida de geração em
geração, tendo, possivelmente, origem na cultura dos diversos grupos indígenas que
habitavam o país, misturada, ainda, com as tradições de uso dos europeus e africanos,
colonizadores posteriores (Simões et al., 1998).
Mundialmente, estima-se que existam 500 mil espécies de plantas, mas apenas 267
mil espécies já foram classificadas (Wilson, 1997; Barbosa, 2000), e o Brasil é um dos
grandes detentores da biodiversidade do planeta com aproximadamente 22% do total
registrado no planeta (Prance, 1977; Giulietti et al., 1990; Pinto et al., 2002) localizadas
em uma área territorial extensa de 8.5 milhões de quilômetros quadrados e vários biomas
(Mata Atlântica, Cerrado, Pantanal, Amazônia e Caatinga), que apresentam uma grande
diversidade de solos e climas favorecendo a riqueza e a variedade de tipos de vegetação e
espécies de floras distribuídas nos ecossistemas brasileiros (Dias, 1995).
A utilização e comercialização de plantas com potenciais medicinais e
biotecnológicos têm sido estimuladas pela crescente demanda da indústria por novas
fontes naturais de medicamentos para buscar alternativas aos efeitos colaterais causados
pelos fármacos sintéticos (Berg, 1993). O Curare indígena ou Dedaleira (Digitalis
purpurea) utilizada na preparação de chá contra a hidropisia, provocada pela
insuficiência cardíaca antes de ser descoberta a ação da Digitalina sobre o músculo
cardíaco (Carrara, 1995) é um grande exemplo de plantas endêmicas brasileiras com
potenciais biotecnológicos ou biomédicos. Ainda, a Casca D’anta (Drimys brasiliensis)
com propriedades estomacais; a Quina (Cinchona calisaya) utilizada na cura da malária;
a Ipecacuanha (Cephaelis ipecacuanha) utilizada para tratar diarréias, disenteria
amebiana, catarros crônicos, hemorragias e asmas, e Sapucainha, (Carpotroche
brasiliensis) com efeitos antiinflamatórios comprovados cientificamente e cujo óleo
extraído da semente é empregado no tratamento de lepra; a Sarsaparrilla, empregada na
sífilis, dermatoses, e como depurativo do sangue (Carrara, 1995).
As observações populares sobre o uso e a eficácia de plantas medicinais contribuem
de forma relevante para a divulgação das virtudes terapêuticas dos vegetais, apesar de
não terem seus constituintes químicos conhecidos. De maneira indireta, este tipo de
cultura medicinal desperta o interesse de pesquisadores em estudos envolvendo áreas
multidisciplinares, como por exemplo, botânica, farmacologia e fitoquímica, que juntas
enriquecem os conhecimentos sobre a inesgotável fonte medicinal natural: a flora
mundial (Maciel et al., 2002).
1.2.
Considerações Botânicas sobre a Família Piperaceae
A família Piperaceae possui 14 gêneros e cerca de 1950 espécies, sendo amplamente
distribuída no território brasileiro com 5 gêneros: Ottonia Spreng., Piper L.., Peperomia Ruiz
& Pav, Pothomorphe Miq. e Sarcorchachis Trel. (Yuncker, 1972; Yuncker, 1973; Yuncker,
1974; Barroso et al., 1986; Maciel et al., 2002). Apresentam-se como arbustos, pequenas
árvores ou lianas, terrestres ou epífitas, com caules providos de nós. As folhas são verticiladas
ou basais, freqüentemente com glândulas contendo óleo aromático. As flores são pequenas,
sem perianto, freqüentemente esbranquiçadas ou amareladas e os frutos são drupáceos,
carnosos ou secos (Ribeiro et al., 1999).
1.3.
Considerações Botânicas sobre o gênero Piper
O gênero Piper possui 700 espécies distribuídas em todas as regiões tropicais e
subtropicais de todo mundo (figura 1) e possui várias espécies, como por exemplo, P.
tuberculatum, P. hispidum, P. belte, P. nigrum, P. amapaense, P. duckei, P.
bartlingianum, P. arboreum, P. callosum, P.methysticum, Piper amalago, entre outras
(Maia et al., 1997; Machado et al., 1994; Parmar et al., 1997).
Figura 1: Distribuição geográfica do gênero Piper. As espécies são distribuídas em todas as
regiões tropicais e subtropicais do mundo, onde cada região possui números de espécies
diferentes (Jaramillo et al., 2001).
Podem apresentar hábitos arbustivos, arbóreos, escandentes ou herbáceos, crescendo
geralmente no interior ou na margem de formações florestais. As folhas são sempre
simples, com formas variadas e venação pinada ou palmada. As flores (brácteas) são
pequenas, aperiantadas, reunidas em racemos ou mais comumente em espigas, solitárias
ou fasciculadas. Os frutos são pequenas drupas dispersadas por pássaros e morcegos, mas
principalmente pelo vento (Parmar et al. 1997; Barroso et al., 1986).
1.4.
Constituintes Químicos e Atividades Biológicas de Espécies do
Gênero Piper.
Vários compostos já foram isolados das diferentes espécies de Piper, entre eles citase, amidas, alcalóides, lignanas, terpenos, esteróides, flavonóides e fenil-propanóides
(Parmar et al., 1997).
As espécies de Piper são utilizadas na medicina popular de diversas maneiras, para
doenças gastrintestinais, doenças venéreas e de reumatismo (Irvine et al., 1961; Maia et
al., 1997; Facundo et al., 2000; Facundo et al., 2003); no tratamento de dores de
estômago (Asprey et al., 1954, Parmar et al., 1997); utilizada para aliviar dores de cabeça
e como o agente antiinflamatório (Dominguez et al., 1985); usadas como antídoto eficaz
para o envenenamento ofídico, para hipertensão (Parmar et al., 1997); são utilizados
contra asma, bronquite, febre, dor no abdômen, como um estimulante e nas afecções
hemorroidais (Kirtikar et al., 1933); além de ação inseticida e de repelência (Parmar et
al., 1993; Olsen et al., 1993; Asprey et al., 1954, Parmar et al., 1997; Matsui et al., 1975;
Irvine et al., 1961).
1.5.
Piper tuberculatum
Com base nos conhecimentos tradicionais referente ao gênero Piper, a espécie Piper
tuberculatum foi selecionada para nossos estudos. Na Paraíba, Piper tuberculatum Jacq.,
conhecida popularmente como “pimenta-longa” ou “pimenta d’arda” (Araújo et al.,
1997; Pereira et al., 2002). Apresenta-se como arbusto com cerca de 2,5 m de altura e
ramos pubérulos (figura 3); folhas com bainha alada e espigas eretas; bractéolas (flores)
triangular-subpeltadas (Guimarães et al., 2004).
P. tuberculatum tem sido largamente empregada na medicina tradicional como
sedativo, no tratamento de vitimados em ataques ofídicos, em dor de dente (Junior et al.,
1999), e para problemas estomacais (Da-Cunha et al., 2001; Chaves et al., 2003). Outros
estudos demonstraram que também possui atividades: antifúngica (Homans et al., 1970;
Navickiene et al., 2000; Lago et al., 2004); e, atividade inseticida (Scott et al., 2003;
Scott et al., 2002; Pohlit et al., 2004).
Figura 2: Foto das folhas e frutos de P. tuberculatum (Disponível em:
http://digi.azz.cz/showpage.php?BookID=2&PageID=11&lng=2).
Figura 3: Foto de P. tuberculatum cedida pelo Dr. Valdir Alves Facundo do Laboratório de
Pesquisa em Produtos Naturais – UNIR.
1.6.
Constituintes do Veneno de Serpentes do Gênero Bothrops e
Tratamento Antiofídico no Brasil.
As serpentes do gênero Bothrops são distribuídas por todo o continente Americano,
com ampla incursão no Brasil (Kashima et al., 2004). Os venenos de serpente são uma
fonte rica de compostos farmacologicamente ativos (Bailey et al., 2001), compostos
geralmente de uma mistura complexa de proteínas, enzimas, peptídeos, ácidos nucléicos,
inibidores enzimáticos, neurotoxinas e de componentes inorgânicos (Bailey et al., 2001;
Balsinde et al., 1999; Marsh et al., 2001, Soares et al., 2000; Stábeli et al., 2004) que
causam hemorragias e coagulopatias, e ocasionalmente neurotoxicidade, das patologias
ao envenenamento do paciente (Harrison et al., 2003; Stábeli et al., 2004).
São notificados, anualmente, mais de 20 mil acidentes por serpentes peçonhentas no
Brasil e mais de 2 mil somente no Estado de São Paulo. Bothrops (jararacas), Crotalus
(cascavel), Lachesis (surucucu) e Micrurus (coral verdadeira) foram responsáveis por,
respectivamente, 88,3%, 8,3%, 2,7% e 0,7% dos acidentes notificados no país (Ribeiro,
1990; Ribeiro et al., 1993), e é possível que ocorra sub-notificação na região Norte, tendo
em vista as dificuldades de acesso aos serviços de saúde, o mesmo ocorrendo para o
Nordeste (FUNASA, 2001).
O tratamento para o envenenamento ofídico é feito com a administração de soros
poliespecíficos e monoespecíficos, produzidos através de soro eqüino ou caprino
(Harrison et al., 2003). Os antivenenos monoespecíficos são usados preferencialmente se
o paciente envenenado identificar a serpente responsável para os sintomas que são
característicos dentro de uma região (por exemplo, antiveneno monoespecífico da víbora
de Echis na África ocidental). Os antivenenos poliespecíficos são preparados com uma
mistura dos venenos brutos das espécies Bothrops, Lachesis e Crotalus, que são
utilizados quando o acidentado ofídico não sabe qual a espécie da serpente (Harrison et
al., 2003; Bon et al., 1996; Ministério da Saúde, 1991; Jorge et al., 1990)
Em algumas regiões do Brasil, o Metronidazol está sendo utilizado como tratamento
aditivo de pacientes acidentados por ofídios (Nahas, 1975; Praxedes et al., 1976), mas a
eficácia deste medicamento é obtida somente quando utilizado em dosagens tóxicas
(Praxedes et al., 1976).
1.7.
Leishmania sp. e Tratamentos para Leishmaniose
A organização mundial de saúde (OMS) classificou a leishmaniose como principal
problema emergente de saúde pública, particularmente na África, Ásia e América Latina
(UNDP/WB/WHO, 1989). Existem cerca de 12 milhões de pessoas infectadas no mundo
e aproximadamente 350 milhões de pessoas com potencial de risco de infecção em áreas
onde a enfermidade pode ser adquirida (Zhai et al., 1999), isto é, em áreas endêmicas. Os
números de novos casos são em torno de 1,5 milhão a cada ano, dos quais 500 mil são de
leishmaniose visceral (Modabber, 1993).
As leishmanioses são um complexo de doenças causadas por pelo menos 17 espécies
de protozoários parasitas do gênero Leishmania sp (Croft et al., 2003). O parasita
apresenta duas formas: as promastigota e as amastigotas. A promastigota é uma forma
alongada e flagelada, que vive no lúmen do tubo digestivo do inseto vetor, a fêmea dos
mosquitos Flebotomíneos (Lainson et al., 1987). E a amastigota é uma forma
arredondada, sem flagelo aparente, que infecta células do sistema mononuclear do
hospedeiro vertebrado (Chang et al., 1981). Amastigota é parasita obrigatório intracelular
dos macrófagos (e raramente dos outros tipos de célula), onde sobrevivem e multiplicam
dentro de um compartimento fagolisossomo (Croft et al., 2003).
De acordo com as manifestações clínicas, a leishmaniose pode ser classificada em
visceral (VL), cutânea (CL) e mucocutânea (MCL), que têm imunopatologia e graus
diferentes de morbidade e de mortalidade. A maioria dos casos de leishmaniose visceral
(VL) causada pela Leishmania donovani é fatal se não tratada, visto que a leishmaniose
cutânea (CL), causada pelas espécies L. major, L. mexicana, L. braziliensis e L.
panamensis, freqüentemente cura-se dentro de 3-18 meses, deixando cicatrizes (Croft et
al., 2003).
As drogas atualmente recomendadas para o tratamento da leishmaniose incluem o
antimonial pentavalente estibogluconato de sódio, o antimoniato N-metil glucamine,
anfotericina B, e pentamidina. Os antimoniais foram primeiramente introduzidos em
1945 e continuam eficazes nos tratamentos de algumas formas de leishmanioses (World
Health Organization, 1995; Croft et al., 2003). Na França e no Brasil têm-se utilizado o
Glucantime® (antimoniato de N-metil glucamine), e nos países de língua inglesa
utilizam o Pentostan® (estibogluconato de sódio), que apresenta a vantagem de ser
administrado pos via intravenosa. (FIOCRUZ, 1997).
Na leishmaniose, estudos químicos e imunofarmacológicos dos compostos isolados
das espécies vegetais, têm sido realizados com o intuito de encontrar novos compostos
menos tóxicos para os hospedeiro, economicamente mais viáveis, de efeito específico e
que reverta a resistência do parasita às drogas, dentre as numerosas plantas estão: a
Kalanchoe pinata (Bergmann et al., 1997); a Solanum lyratum Thunb (Solanaceae (Kim
et al., 1999); Artemisia annua (Yang et al., 1992); Peperomia galioides (Mahiou et al.,
1995); a Guarea rhophalocarpa (Camacho et al., 2000); Holarrhena curtisii (Kam et al.,
1997); a Pera benensis (Fournet et al., 1992; Kayser et al., 2000); a Picrorhiza kurroa
(Mittal et al., 1998); a Centrolobium sclerophyllum (Araújo-Júnior et al., 1998); e a
Virola surinamensis (Barata et al., 2000); entre outras.
O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior
floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os
produtos naturais. A Química de Produtos Naturais (QPN) é, dentro da química
brasileira, a área mais antiga e a que, talvez ainda hoje, congregue o maior número de
pesquisadores (Pinto et al., 2002). As pesquisas com plantas medicinais envolvem
investigações da medicina tradicional e popular (etnobotânica); isolamento, purificação e
caracterização de princípios ativos (química orgânica: fitoquímica); investigação
farmacológica de extratos e dos constituintes químicos isolados (farmacologia);
transformações químicas de princípios ativos (química orgânica sintética); estudo da
atividade e dos mecanismos de ação dos princípios ativos (química medicinal e
farmacológica) e finalmente a operação de formulações para a produção de fitoterápicos.
A integração destas áreas na pesquisa de plantas medicinais conduz a um caminho
promissor e eficaz para descobertas de novos medicamentos (Maciel et al., 2002).
Enfim, algumas características desejáveis das plantas medicinais com potenciais
biotecnológicos são: sua eficácia, baixo risco de uso, assim como reprodutibilidade e
constância de sua qualidade. Entretanto, devem ser levados em conta alguns pontos para
formulação dos fitoterápicos, necessitando do trabalho multidisciplinar, para que a
espécie vegetal seja selecionada corretamente, o cultivo seja adequado, a avaliação dos
teores dos princípios ativos seja feita e para que a manipulação e a aplicação na clínica
médica ocorram (Nakazawa, 1999).
2 – OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
2.1.

Objetivo Geral
O presente trabalho tem como objetivo geral o isolamento do ácido 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico purificado do extrato dos frutos de Piper
tuberculatum, conhecida popularmente como “pimenta d’arda” , e estudo
de suas atividades farmacológicas.
2.2.
Objetivo Específico

Purificar e identificar estruturalmente o constituinte químico, 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico, isolado dos frutos de Piper tuberculatum;

Estudo farmacológico dos constituintes químicos isolados, com relação à
suas atividades: antiparasitária, analgésica, anti-hemorrágica e de inibição
de edema.
3 – MATERIAIS E MÉTODOS
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.
Animais
Camundongos da linhagem Balb/C, machos jovens adultos microisolados, foram
obtidos e mantidos ad libitum no Biotério do Instituto de Pesquisa em Patologias
Tropicais (IPEPATRO), Porto Velho, Rondônia/Brasil, com luminosidade e temperatura
ambiente, sem restrições quanto alimentação e água.
Cumpre ressaltar que todos os procedimentos com relação aos animais estão em
acordo com as normas estabelecidas no Manual de Cuidados e Usos de Animais de
Laboratório, e todo o esforço foi despendido para que nenhum estresse ou dor
desnecessária fosse causado aos animais de experimentação.
3.2.
Veneno e Frações
O veneno bruto de B. alternatus, que encontra-se seco e estocado a 4ºC, e a proteína
BthTX-1 (Fosfolipase A2 do veneno de B. jararacussu), que encontra-se liofilizada e
armazenada a -20ºC, foram extraídos de serpentes catalogadas e mantidas no serpentário
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP).
3.3.
Obtenção do extrato etanólico dos frutos de P. tuberculatum
Os frutos de Piper tuberculatum Jacq. (1,5 kg), foram coletados pelo Drº Valdir
Alves Facundo, do Laboratório de Pesquisa em Química de produtos Naturais –
Universidade Federal de Rondônia, no município de Porto Velho em 05/03/2004. A
identificação botânica foi realizada no herbário do Instituto Nacional de Pesquisa da
Amazônia (INPA) e identificada pelo Dr. J. Gomes. Uma exsicata encontra-se depositado
neste herbário sob o número 211724.
O extrato etanólico dos frutos (1,5 kg) de P. tuberculatum, foi obtido por percolação
(Maciel et al., 2002), onde consistiu em deixar o material a ser extraído, devidamente
seco e macerado, em contato com o etanol por cinco dias em temperatura ambiente. A
destilação do solvente sob pressão reduzida forneceu 40,0 g de extrato etanólico dos
frutos de Piper tuberculatum, denominado de PtFE.
3.4.
Isolamento e Purificação do Ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico
dos Frutos de P. tuberculatum.
Parte do PtFE (25 g) foi pulverizado em grau de porcelana, adsorvido em 70 g de gel
de sílica 60 da Vetec (Ф 0,063-0,2mm) e acondicionado sobre 180 g de gel de sílica 60
da Vetec (Ф 0,063-0,2mm) em uma coluna cromatográfica de 500 ml (coluna A). Na
eluição, os solventes utilizados como fase móvel foram: éter de petróleo, hexano, acetato
de etila e acetona (em gradientes crescentes de polaridade). Foram coletadas frações de
200 ml, concentradas por evaporação do solvente e acondicionados em frascos pequenos
com numeração crescente. As frações foram analisadas por CCD (cromatografia de
camada delgada) em placas, comparadas e reunidas.
Uma nova coluna (coluna B) foi feita do eluato denominado de PtFE-1 (34,6 g), que
foi adsorvido em 40 g de gel de sílica, pulverizado em grau de porcelana, acondicionado
sobre 100 g de sílica em coluna cromatográfica e eluído com os seguintes solventes: éter
de petróleo, hexano e acetato de etila (em polaridades crescentes). As frações foram
coletadas e concentradas por destilação do solvente sob pressão reduzida, foram
analisadas por CCD em placas, comparadas e reunidas.
A revelação das substâncias em placas de CCD se deu por pulverização com
revelador universal, uma mistura de etanol: ácido acético: ácido sulfúrico – 8:1:1,
seguido de aquecimento a 100ºC por aproximadamente 5 minutos.
Obteve-se assim, a fração B-20, com 500 mg e apresentava-se como um sólido
branco que denominamos de PtFE-2 (ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico) a qual foi
isolado utilizando Hexano:Acetato de Etila (4:1).
3.5.
Identificação e Caracterização do Composto Químico Isolado dos
Extrato dos Frutos de P. tuberculatum
3.5.1.
Espectroscopia
de
Hidrogênio-1 (RMN
Ressonância
1
Magnética
Nuclear
H) e de Carbono-13 (RMN
13
de
C) e
Espectrometria de Massas
Para a identificação estrutural da substância química isolada (PtFE-2) foram obtidos
espectros de RMN de 1H e 13C. Os espectros de RMN unidimensionais e bidimensionais
foram registrados em espectrômetros da Varian (modelo Inova-500) operando a 500
MHz para Hidrogênio-1 (1H) e Carbono-13 (13C). Os deslocamentos químicos foram
fornecidos em ppm utilizando como referência interna o tetrametilslano (δ = 0 ppm).
Os espectros de RMN unidimensionais de carbono-13 desacoplado (RMN
13
C
utilizando técnica DEPT 135) foram registrados em espectrômetros da Varian (modelo
Inova-500) operando a 125,69 MHz. Os deslocamentos químicos foram fornecidos em
ppm, utilizando o CDCl3 como referência interna (δ = 77.00 ppm).
Os espectros apresentados neste trabalho foram obtidos em aparelhos pertencentes ao
Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas, Campinas – São Paulo.
3.6.
Teste de Inibição de Edema
Em um grupo de 06 camundongos, onde foram realizados 3 repetições, foram
injetados, na pata direita por via coxim plantar 50 µl, diferentes amostras:
- 02 camundongos com BHTX-1 1µg/µl
- 02 camundongos com BHTX-1 1µg/µl + PtFE-2 2µg/µl
- 02 camundongos com PtFE-2 2µg/µl
Na pata esquerda foram aplicados, por via coxim plantar, 50 µl de solução de PBS,
50 µl de solução de PBS+10%DMSO e 50 µl de solução de PBS+10%DMSO,
respectivamente, para serem utilizadas como controle. Após 1 hora da inoculação, os
camundongos foram sacrificados com éter, as patas cortadas próximo à articulação e
pesadas (Gutiérrez et al., 1986 - com algumas alterações). O edema foi expresso em
porcentagem e o aumento do peso da pata com as amostras foi comparado com o peso da
pata controle (com PBS ou com PBS+10%DMSO).
Os tampões utilizados para dissolver a amostra purificada foram: PBS 1X (tampão
salina fosfato, composto por: NaCl 145mM, Na2HPO4 9mM, NaH2PO4 1mM, pH 7,6) e
DMSO (Dimetilsulfóxido P.A. ((CH3)2SO, P.M. 78,13)) da Labsynth. Os materiais
utilizados foram seringas plásticas com agulhas de 01 ml da SR®, e placas de culturas
estéreis com 24 poços da TPP®.
3.7.
Atividade Anti-Hemorrágica
Para o procedimento do teste da atividade anti-hemorrágica (Nikai et al., 1984 – com
algumas alterações), foi utilizado um grupo de 12 camundongos Balb/C adultos machos,
onde foram realizados 03 repetições, distribuídos em grupos da seguinte maneira:
- 03 camundongos com PBS+10%DMSO (grupo controle – grupo A).
- 03 camundongos com veneno bruto de B. alternatus 1µg/µl (grupo B).
- 03 camundongos com veneno bruto de B. alternatus 1µg/µl + PtFE-2 2µg/µl (D).
- 03 camundongos foram injetados com veneno bruto de B. alternatus 1µg/µl + PtFE-2
2µg/µl (previamente incubados – grupo E).
Tabela 1: Tabela demonstrativa do procedimento realizado para o teste de atividade
anti-hemorrágica.
Tempo: 0 hora
Local e
Camundongos
Quantidade
Tempo: 1 hora
Local e
Substância
Inoculada
Quantidade
Substância
Inoculada
02
IP – 150 ul
PBS + 10%DMSO
SC – 50 ul
Ven. Bruto 1µg/µl
02
IP – 150 ul
Pt.FE-2 2ug/ul
SC – 50 ul
PBS + 10%DMSO
02
IP – 150 ul
PBS + 10%DMSO
SC – 50 ul
PBS + 10%DMSO
02
IP – 150 ul
Pt.FE-2 2ug/ul
SC – 50 ul
Ven. Bruto 1µg/µl
02
IP – 150 ul
Pt.FE-2 2ug/ul
SC – 50 ul
Ven. Bruto 1µg/µl
+ Pt.FE-2 2µg/µl
(incubado)
Após 3 horas (tempo 2) da primeira aplicação (tempo 0), os animais foram
sacrificados com éter, as peles removidas e o halo hemorrágico medido em dois ângulos
retos e expressos em milímetros (mm).
3.8.
3.8.1.
Ensaio Antiparasitário
Efeito de Interferência do Ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico
sobre a Replicação de Formas Promastigotas dos Parasitas
Leishmania
Os parasitas utilizados para este trabalho foram Leishmania (Leishmania)
amazonensis da cepa IFLA/BR/67/PH8, na forma promastigota e mantidas em meio de
cultura RPMI-1640 a 23ºC, que foram gentilmente cedidas pela Drª. Izaltina Silva
Jardim, do Laboratório de Quimioterapia, Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais
(IPEPATRO), Porto Velho, Rondônia, Brasil.
Para examinar os efeitos de PtFE-2 sobre o parasita e sobre seu crescimento, formas
promastigotas de L. amazonensis foram incubadas na presença de várias concentrações
de PtFE-2, 800ug, 400µg, 200µg e 100µg. A curva de crescimento foi feita utilizando-se
um inóculo inicial de 5 x 105 promastigotas obtidas de culturas de 5º dia de crescimento
(final da fase logarítmica) em 500 µl de meio de cultura (RPMI–1640 contendo
antibióticos e suplementado com 10% de soro fetal bovino). O crescimento dos parasitas,
que foram mantidos em estufa a 24ºC, era avaliado durante 5 dias por contagens diárias
de alíquotas de 10µl de cultura diluídos em PBS contendo 0,04% do corante eritrosina B.
A contagem era feita em câmara hemocitométrica de Neubauer em microscópio óptico,
com objetiva de 40X, este experimento foram realizados 03 repetições. Os parasitas
corados de vermelho eram considerados mortos e aqueles birrefringentes eram
considerados vivos (Silva-Jardim et al., 2004, com algumas modificações).
Como controles, foram utilizadas preparações de Leishmania sem nenhum tipo de
tratamneto, Leishmania incubada com PBS+20%DMSO, e Leishmania incubada com
Pentamidina® (800µg) e Glucantime® (800µg), que são as drogas utilizadas para o
tratamento de leishmaniose.
3.9.
Teste de Contorção Abdominal em Camundongos (Analgesia
Periférica)
Os camundongos Swiss albinos, devidamente habituados, foram distribuídos entre
grupos controle e experimental, contendo dez animais cada. O grupo experimental foi
tratado com solução aquosa de liofilizado de PtFE-2 em diferentes concentrações (0,695
mg/Kg de animal; 1,391 mg/Kg de animal; e, 2,782 mg/Kg de animal) para elaboração
de curvas dose-respostas. Os grupos controle positivo e negativo foram tratados com
indometacina 10 mg/Kg e salina, respectivamente. Todos os tratamentos foram
realizados por via intraperitoneal. Após tais manipulações e pausa de 60 minutos, foi
administrada por via intraperitoneal 0,1% de solução de ácido acético a 1% (v/v), agente
irritante indutor da liberação de mediadores inflamatórios nociceptivos. Os animais então
foram acondicionados em funis de vidro, mantidos em sala silenciosa para observação, e
foram registrados, em intervalos regulares de 5 minutos, o número de contorções
abdominais durante os 30 minutos subseqüentes, após a administração do agente irritante
(Koster et al., 1959).
Este experimento foi realizado no laboratório de Biotecnologia de Plantas da Unaerp
pela aluna Rosana Gomes, orientada pelo Prof. Dr. Renê de Oliveira Beleboni.
3.10.
Experimento Hargreaves (Analgesia Central)
Ratos machos Wistar foram distribuídos, entre grupos controle e experimental,
contendo dez animais, sendo administrado, no grupo controle positivo, solução de
tramadol na dose de 10 mg/Kg e no grupo controle negativo solução salina. O grupo
experimental foi tratado com solução aquosa de liofilizado de PtFE-2 em diferentes
concentrações (64 µg/Kg de animal, 128 µg/Kg de animal, e, 256 µg/Kg de animal) para
elaboração de curvas dose-respostas. Todos os tratamentos serão realizados por via
intraperitoneal. Após as diferentes manipulações, os animais foram colocados
individualmente nos compartimentos do aparelho de Hargreaves e medidos os tempos de
latência para retirada da pata traseira direita quando submetidas a aquecimento de luz
infravermelha na região plantar dos animais. Foram feitas avaliações do limiar de dor
após 60, 75, 90, 105 minutos após os diferentes tratamentos. Salienta-se que os testes
estarão de acordo com os protocolos descritos por Hargreaves et al., 1988.
Este experimento foi realizado no laboratório de Biotecnologia de Plantas da Unaerp
pela aluna Rosana Gomes, orientada pelo Prof. Dr. Renê de Oliveira Beleboni.
4 – RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.
Isolamento
e
Determinação
Estrutural
do
Ácido
3,4,5-
trimetoxibenzenopropanóico.
Com a técnica de CCD, obtivemos o isolamento de 500 mg de uma substância que
apresentava-se como um sólido branco, amorfo, ponto de fusão 106 ºC e solúvel em
clorofórmio, onde foi denominada de PtFE-2.
O espectro de massas (figura 5) exibiu o pico do íon molecular em m/z 240,
sugerindo uma fórmula molecular C12H16O5.
O espectro de RMN de 1H a 500 MHz (figura 6) exibiu as seguintes absorções: dois
tripletos em  2,68 (2H, J=15,5 Hz) e  2,90 (2H, J=15,5 Hz), que representam quatro
hidrogênios presentes em dois carbonos da cadeia alifática; um singleto em  3,84 (9H),
que representa nove hidrogênios presentes em três grupamentos metoxilas; um singleto
em  6,43 (2H), que representa dois hidrogênios presentes no anel aromático; e um
singleto largo em 10,24 (1H), que representa um hidrogênio do grupamento hidroxila.
O espectro de RMN de
13
C (figura 7) apresentou 9 linhas espectrais, sendo quatro
linhas na região de átomos de carbonos aromáticos  153,2;  136,4;  135,8;  105,2,
representando os cinco carbonos presentes no anel aromático; uma absorção em  178,8
de carbonila de ácido carboxílico; duas absorções em  60,8 e  56,0 de três grupamentos
metoxilas; e duas absorções em  35,7 e  30,9 de carbonos alifáticos. A análise do
espectro de RMN de
13
C utilizando a técnica DEPT (Distortioness enhancement by
polarization transfer) (figura 8), revelou que a absorção em  105,2 corresponde a um
carbono aromático monohidrogenado; as absorções em  35,7 e 30,9 correspondem a
dois carbonos dihidrogenados; e duas absorções em  56,0 e  60,8 correspondente aos
três grupamentos metoxilas.
Estes
dados
permitiram
propor
a
estrutura
trimetoxibenzenopropanóico para PtFE-2 (figura 4).
do
ácido
3,4,5
Esta é a primeira vez que esta
substância está sendo identificada em Piper tuberculatum. Na tabela 1, encontram-se os
deslocamentos químicos de RMN 1H e 13C de PtFE-2
Figura 4: Estrutura química proposta para o ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico isolado do
extrato dos frutos de P. tuberculatum, mostrando a numeração de cada carbono.
240
181
225
195
137
151
165
Figura 5: Espectro de massas (I. E. 75 eV) do ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico.
Figura 6: Espectro de RMN 1H (CDCl3 500 MHz) do ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico.
Figura 7: Espectro de RMN 13C (CDCl3 126 MHz) do ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico
Figura 8: Espectro de RMN 13C (CDCl3 126 MHz) do ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico,
utilizando a técnica DEPT 135.
Tabela 2: Deslocamentos químicos de RMN 1H e
13
C registrado em CDCl3. Relação de todos os
carbonos, hidrogênios e radicais presentes no ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico
C
c
H
C
c
H
1
105,2
-
9
178,8
-
2/6
153,2
2,68 (2H, J= 15,5 Hz)
CH3O-4
60,8
3,84 (s, 3H)
3/5
153,2
2,90 (2H, J= 15,5 Hz)
CH3O-5/3
56,0
3,82 (s, 6H)
4
136,4
-
OH
-
10,24 (sl, 1H)
7
30,9
6,43 (s, 2H)
8
35,7
-
O ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico já foi isolado de P. retrofractum e, de P.
longum foi sintetizado a partir do composto etil 3’,4’,5’-trimetoxicinamate isolado do extrato
hexânico onde recebeu o nome de ácido 3,4,5-trimetoxidihidrocinamico, os autores relatam
atividade antiinflamatória contra a ação do TNF-α sobre liberação de ICAM-1 pelas células
(Parma et al., 1997; Kumar et al., 2005)
.
4.2.
Atividade de Inibição de Edema
Venenos de origem animal, particularmente de serpentes, contêm um grande número
de proteínas que afetam a hemostasia por diferentes maneiras. Alguns deles não têm a
atividade enzimática, como as lectinas tipo-C e desintegrinas, visto que outros, tais como
nucleotidases, as fosfolipases A2 (PLA2), as serinoproteases e as metaloproteinases são
potentes enzimas (Perales et al., 2005).
As Fosfolipases A2 (PLA2s) podem induzir diversos efeitos biológicos tais como,
neurotoxicidade pré ou pós-sináptica, cardiotoxicidade, miotoxicidade, inibição da
agregação plaquetária, hemólise, edema, anti-coagulação, convulsão e hipotensão (Soares
et al., 1998). O edema local é uma conseqüência típica do envenenamento por serpentes,
este efeito é clinicamente importante porque é responsável pela perda tecidual local
chegando a levar, dependendo da gravidade a perda total do membro afetado (Gutiérrez
et al., 1986). Para o teste da atividade de inibição de edema utilizamos a proteína BthTX1, que é uma fosfolipase A2-like (PLA2-like)
purificada do veneno de Bothrops
jararacussu.
Não houve inibição relativa da formação de edema pelo ácido 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico nas doses administradas. Este resultado evidencia que o
ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico não possui nenhum tipo de interação inibitória
sob enzima BthTX-1 (figura 9).
A produção do edema é exclusivamente produzida por fosfolipase A2 (PLA2), e como
estas enzimas são altamente conservadas em seus mecanismos de ação para a formação
de edema, podemos generalizar nossos resultados, afirmando que possivelmente não
ocorra inibição de formação de edema para nenhum dos venenos de serpentes
encontradas do Brasil.
pata controle
0,5
pata teste c/ amostras
Massa das Patas (g)
0,4
0,3
0,2
0,1
0
BthTX-1
PtFE-2
BthTX-1 + PtFE-2
Substâncias
Figura 9: Peso das patas em gramas, a coluna em rosa de cada experimento mostra o peso das
patas direitas utilizadas como controle (tratadas com 50 µl de PBS+DMSO); a coluna em verde,
representa o peso relativo das patas esquerdas tratadas com 50 µl de BthTX-1 e 50 µl de 3,4,5trimetoxibenzenopropanóico. A quantidade de BthTX-1 utilizada em cada experimento foi de
50µg e para PtFE-2 foi de 100µg.
4.3.
Atividade Anti-Hemorrágica
Para avaliação da atividade anti-hemorrágica foi utilizado o veneno bruto da serpente
B. alternatus, o qual possui tanto as fosfolipases A2 quanto as metaloproteinases ativas
para atividade hemorrágica. O grupo controle negativo (com PBS+DMSO) e o grupo
que contêm o ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico, não produziram hemorragia.
Enquanto que o grupo controle positivo, que continha apenas o veneno bruto, como
esperado, produziu hemorragia.
O grupo teste onde foi aplicado por via intraperitoneal o ácido 3,4,5-trimetoxi
benzenopropanóico e por via subcutânea no dorso do camundongo o veneno bruto,
houve inibição da hemorragia, cerca de aproximadamente 27% de eficiência contra a
ação hemorrágica do veneno de B. alternatus. No último grupo, pré-incubamos o ácido
3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico com o veneno bruto, com objetivo de analisar se
desta maneira o ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico teria uma ação ainda maior.
Podemos
notar
que
a
pré-incubação
aumenta
a
ação
do
ácido
3,4,5-
trimetoxibenzenopropanóico, chegando a inibir ainda mais a atividade hemorrágica do
veneno, aproximadamente 77% (figura 10).
Sabe-se que hemorragia causada pelo veneno de B. alternatus possui duas vias para
causar a hemorragia: a primeira via seria pelas metaloproteinases, que agem diretamente
nas integrinas que constituem a membrana basal do tecido, promovendo uma
desagregação tecidual celular; a segunda via pela ação de fosfolipase A2, não agindo na
membrana basal, mas diretamente na membrana celular que constituem os vasos
sangüíneos (Stábeli et al., 2004).
4
3,5
Halo Hemorrágico (cm2 )
3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
O
DMS
PBS+
ruto
Ven .B
g
-2
-2
c.)
PtFE
P tFE
-2 5 m
- 2 ( in
+
E
E
F
o
F
t
t
t
P
u
P
r
ruto +
ruto +
Ven .B
Ven .B
Ven .B
Figura 10: Produção de hemorragia em camundongos após procedimento de inoculação de
substâncias, expressado por medição do halo hemorrágico formado em cm2. O PBS+DMSO foi
utilizada como controle negativo; Veneno bruto (controle positivo), foi aplicado uma
concentração de 50µg; PtFE-2 (teste), aplicado na concentração de 300µg; Veneno bruto 50ug +
PtFE-2 300µg (teste); Veneno bruto 50ug + PtFE-2 300µg pré-incubados (teste); o objetivo da
aplicação de 50µg de veneno via subcutânea no dorso com aplicação de 5mg de PtFE-2 por via
intraperitoneal, era verificar a concentração ideal da amostra PtFE-2.
As metaloproteinases possuem um papel importante no processo de envenenamento
por venenos de serpente, elas causam ferimento sistêmico por degradação ou ativação
dos fatores do sangue, e os danos locais por agir em proteínas endoteliais da superfície da
célula (Perales et al., 2005) e são responsáveis pela atividade hemorrágica, característica
dos venenos de serpentes da família Viperidea (Gutiérrez et al., 2005). As
metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMPs) degradam vários componentes da
membrana e pode também hidrolizar proteínas endoteliais da membrana da célula, tais
como as integrinas e as caderinas, envolvidos na adesão da célula-matriz e da célulacélula. A hemorragia induzida pelas SVMPs é um evento extremamente rápido in vivo,
com as células capilares endoteliais que mostram alterações estruturais drásticas dentro
de poucos minutos (Gutiérrez et al., 2005).
Inicialmente, as SVMPs degradam proteínas da superfície da membrana e de adesão,
assim enfraquecendo a parede capilar e perturbando as interações entre células
endoteliais e a membrana capilar. Então, a pressão que age na parede capilar, que está
enfraquecida, causa uma distenção. Consequentemente, as células endoteliais tornam-se
muito finas, até que a integridade da parede do capilar esteja perdida em alguns pontos,
onde ocorre extravasamento do sangue (Gutiérrez et al., 2005).
4.4.
Ação de Inibição de Crescimento de Formas Promastigotas de
Leishmania amazonensis
A observação das propriedades terapêuticas de produtos naturais tem levado à
pesquisa dos princípios ativos de várias espécies vegetais. Metabólitos secundários tais
como alcalóides, terpenóides, flavonóides, considerados no passado como inativos, são
hoje ferramentas importantes no tratamento e investigação clínica. Compostos que
estimulam o sistema imune são úteis quando usados como adjuvantes no tratamento de
certas doenças causadas por fungos, bactérias e protozoários, como na leishmaniose
(Bergmann et al., 1997; FIOCRUZ, 2006).
Para investigar o efeito do ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico (PtFE-2) sobre o
crescimento in vitro dos parasitas Leishmania, adicionamos às culturas de promastigotas
o PtFE-2, e o número de promastigotas era contado diariamente, utilizando-se o corante
eritrosina B para distinção entre parasitas vivos e mortos. O ácido 3,4,5-trimetoxi
benzenopropanóico
em
todas
as
concentrações
interferiu
na
replicação
das
promastigotas, e após os 5 dias de incubação do PtFE-2 nas concentrações nas
concentrações de 100 µg, 200 µg, 400 µg e 800 µg, observamos uma inibição das
promastigotas de cerca de 25, 70, 90 e 95%, respectivamente (figura 11 e 12).
A concentração de 100µg apresentou uma inibição de cerca de 25%, que é
compatível com a inibição gerada pelo uso do medicamento Glucantime®, que foi de
20% (figura 12) e estava com concentração de 800 µg. Utilizando o medicamento
Pentamidina® na concentração final de 800 µg, observamos que ele foi capaz de matar
100% dos parasitas com 24 h de incubação. Neste experimento, notamos também que no
grupo controle negativo, que o DMSO estava numa concentração inicial de 10%, teve
ação sobre a morfologia dos parasitas Leishmania, porque os parasitas ficaram mais
arredondados. Outro grupo que também continha 10% DMSO era o 3,4,5-trimetoxi
benzenopropanóico 800µg, onde notamos que os parasitas também estavam com suas
formas modificadas, estavam arredondados. Mas não sabemos mencionar onde e nem
como o DMSO está agindo para mudar as formas dos parasitas Leishmania. Ressaltamos
que a concentração permitida para utilizar sem que o DMSO atue sobre o parasita seria
de no máximo 2%, e os únicos grupos que estavam abaixo e próximo do permitido eram,
respectivamente, os de 100 µg e 200 µg.
Nº de Promastigotas/ml
sem tratamento
PBS+DMSO
glucantime
pentamidina
800ug PtFE
400ug PtFE
200ug PtFE
100ug PtFE
10
7
10
6
1º dia
2º dia
3º dia
4º dia
5º dia
Tempo
Figura 11: Curva de crescimento de formas promastigotas de L. amazonensis na presença de
PtFE-2. O experimento partiu de uma concentração de 5x105 de parasitas, a contagem foi feita
retirando uma alíquota do meio de cultura com as Leishmanias, e isto foi realizado em todos os
dias do ciclo de crescimento do parasita (5 dias).
No primeiro dia partimos de uma concentração em todos os grupos de 5x105
parasitas/ ml. A contagem foi realizada durante os 5 dias do ciclo de crescimento do
parasita, no 3° dia houve uma diminuição significativa do crescimento nos grupos do
ácido 3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico com 800µg e 400µg, e notamos também alguns
parasitas mortos, enquanto que nas concentrações de 200µg e 100µg a inibição foi
pequena (figura 11). Quando analisamos os resultados obtidos no 5° dia, podemos
concluir que mesmo tendo inibido a replicação e ter interferido na sobrevivência dos
parasitas, as concentrações de 800 µg e 400 µg não é significativa porque o PtFE-2 está
em 10% de DMSO, e sabe-se que nesta concentração o DMSO é agressivo para o
parasita. Enquanto que nas concentrações de 200 µg (inibição de 70%) e na concentração
de 100 µg (inibição de 25%), o DMSO não agiu sobre o parasita, pois estava em uma
concentração mais baixa. Com todos os dados encontrados, podemos assim concluir que
a DL50 do ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico deve estar entre as concentrações de
100 µg e 200 µg, sendo assim baixas concentrações de uso comparadas com as dosagens
utilizadas dos medicamentos de tratamento para leishmaniose.
100ug PtFE
200ug PtFE
400ug PtFE
800ug PtFE
Pentamidina
Glucantime
PBS+DMSO
0
20
40
60
80
100
Porcentagem de Inibição do Crescimento
Figura 12: Porcentagem de inibição do crescimento do parasita em relação a substância
utilizada, os dados na figura representam a contagem realizada apenas no 5º dia do ciclo de
crescimento da Leishmania.
4.5.
Experimento Hargreaves (Analgesia Central) e Teste de Contorção
Abdominal em Camundongos (Analgesia Periférica).
Os testes de contorção e hargreaves foram realizados, em modelos animais, com o
3,4,5-trimetoxi benzenopropanóico em diferentes concentrações, para determinar a
atividade analgésica periférica e/ou central, contudo não apresentando efeito significativo
de atividade analgésica em relação aos grupos controles.
5 – CONCLUSÃO
5. CONCLUSÃO

Isolamento,
purificação
ecaracterização
do
ácido
3,4,5-
trimetoxibenzenopropanóico isolado do extrato dos frutos de Piper tuberculatum.

Os frutos de Piper tuberculatum já foram estudados em várias partes do mundo,
inclusive
no
Brasil,
e
é
a
primeira
vez
que
o
ácido
3,4,5-
trimetoxibenzenopropanóico é isolado nesta planta, porém já foi isolado em Piper
retrofractum.

A ação hemorrágica causada pelo veneno de B. alternatus é parcialmente inibida
pelo ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico.

Não existe inibição de edema quando incubado com BthTX-1 (PLA2) do veneno
de B. jararacussu.

O ácido 3,4,5-trimetoxibenzenopropanóico interfere na replicação dos parasitas
Leishmania amazonensis na forma promastigota.

Não houve efeito de analgesia central ou periférica pelo ácido 3,4,5-trimetoxi
benzenopropanóico quando ensaiados em camundongos.
6 – REFERÊNCIAS
6. REFERÊNCIAS
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