UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JULIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
FELIPE DE OLIVEIRA SOUZA
Atividade citotóxica, pró-apoptótica, genotóxica e
mutagênica de nitensidina B em células tumorais
cervicais humanas
Araraquara, SP
2013
FELIPE DE OLIVEIRA SOUZA
Atividade citotóxica, pró-apoptótica, genotóxica e
mutagênica de nitensidina B em células tumorais
cervicais humanas
Dissertação
apresentada
ao
Programa
de
Pós-Graduação
em
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à
Farmácia, da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas
de
Araraquara,
Universidade Estadual Paulista –
UNESP, como arte dos requisitos para
obtenção do título de mestre em
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à
Farmácia. Área de Concentração:
Citologia Clínica e Biologia Celular.
Orientadora: Profa. Dra. Christiane Pienna Soares
ARARAQUARA-SP
2013
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Souza, Felipe de Oliveira
Atividade citotóxica, pró-apoptótica, genotóxica e mutagênica de
S829a
nitensidina B em células tumorais cervicais humanas / Felipe de Oliveira
Souza . – Araraquara, 2013
80 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de
Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós
Graduação em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia
Orientador: Christiane Pienna Soares
.
1. Câncer cervical. 2. Nitensidina B. 3. HPV. 4.Apoptose. I. Soares,
Christiane Pienna, orient. II. Título.
CAPES: 40300005
Dedico este trabalho à minha estimada Mãe, ao meu
pai, a todos meus amigos, por toda força e apoio que
sempre me deram em momentos importantes da minha
vida.
AGRADECIMENTOS
À minha estimada mãe Maria Cristina, que mesmo tendo ficado pouco tempo comigo, ficou
tempo suficiente para me passar ótimos princípios, ser meu maior exemplo de força e caráter.
Ao, meu pai José Carlos que contribuiu com toda minha trajetória acadêmica e de vida.
À minha irmã Raíssa por ser companheira de todas as horas
À toda minha famíla, em especial, minhas tias Celina, Tera, Tia Darci, por todo apoio e
carinho
Ao meu amigo Antônio, só tenho que agradecer por ter você como meu amigo, ou melhor
irmão, vou levar sempre comigo todos os bons momentos que passamos e que ainda
passaremos.
À todos os meus amigos, de Araraquara, em especial a Márcia, Thaís e ao Mário Moretti e de
Lençóis Paulist ,Isabella, Michel, Renan, Luís, Alan, Wagnão, Bicudo, e mais alguns ainda
por fazerem parte da minha vida e de contribuirem para a formação do meu caráter e de me
aturarem.
À republica federativa dos inocente, e todos que passaram por essa maravilhosa família,
Guilherme, Rudy, Mário, Danilo, Joaquim, Rodrigo, por tornarem este apartamento como o
meu ponto de apoio, pela alegria e companhia durante todo o tempo.
À professora Christiane Pienna Soares por ter me incentivado a seguir esta trilha, pela
paciência, confiança e por ser um grande exemplo de persistência e superação.
À Juliana, grande pessoa que conheci e que mudou minha vida completamente, tenho você
como uma pessoa muito especial e que sempre levarei comigo.
Ao pessoal do laboratório de Citologia Clínica e Biologia celular, em especial ao Flávio e
Jamile por contribuir diretamente com os resultados, a Bel, grande amiga, Rodolfo, Luís,
Mauro, Marcão e Valéria por estarem sempre dispostos a ajudar.
Ao Luís Otávio pela colaboração e contribuição com nosso laboratório e aos laboratórios
vizinhos, Micologia Clínica, Bioquímica Clínica e Imunologia, por compartilharem várias
vezes parte de sua estrutura para que este projeto fosse realizado.
Aos funcionários da FcFar-UNESP que colaboraram com seu excelente trabalho direta ou
indiretamente para este trabalho.
À FcFar-UNESP pelo acolhimento e estrutura proporcionada.
“Não confunda derrotas com fracasso, nem vitórias com
sucesso. Na vida de um campeão sempre haverá algumas
derrotas, assim como na vida de um perdedor sempre haverá
vitórias. A diferença é que, enquanto os campeões crescem
nas derrotas, os perdedores se acomodam nas vitórias.”
Roberto Shinyashiki
RESUMO
Atualmente, o câncer cervical é considerado a segunda causa mais comum entre as
mulheres e encontra-se associado ao Papilomavírus Humano (HPV), que infecta células
epiteliais escamosas, dando origem a grandes lesões. Em face da necessidade de se
encontrar novos fármacos com atividade antineoplásica, têm-se procurado identificar
substâncias isoladas de plantas brasileiras capazes de impedir a proliferação de células
neoplásicas infectadas por HPV. A nitensidina B é um alcalóide guanidínico isolado de
Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae), que possui atividade citotóxica e antifúngica. O
presente estudo teve por objetivo, verificar a atividade citotóxica, pró-apoptótica,
genotóxica e mutagênica de nitensidina B, por meio de experimentos in vitro, utilizando
células de carcinoma cervical infectadas por HPV-16 (SiHa) e não infectadas pelo vírus
(C-33A). Para avaliar a citotoxicidade da nitensidina B o teste MTT foi realizado, sendo
possível observar um efeito concentração-resposta nas duas linhagens testadas SiHa e
C-33A, CI50 = 28,95 µM e 25,78 µM, respectivamente por 24 horas de tratamento e
SiHa e C-33A, CI50 = 20,77 µM e 20,96 µM, respectivamente por 48 horas de
exposição a nitensidina B. Com o intuito de avaliar a ação pró-apoptótica, foi realizado
o ensaio de anexina V por citometria de fluxo e o ensaio do Hoechst-Iodeto de propídio,
na qual pode-se verificar que a nitensidina B apresentou morte celular por apoptose
tardia na linhagem de células infectadas por HPV-16 (SiHa) e baixa porcentagem de
células apoptóticas nas células não infectadas pelo HPV-16 (C-33A), tanto por apoptose
precoce, quanto na apoptose tardia/necrose, em todas as concentrações. Para o ensaio de
genotoxicidade foi realizado o ensaio do cometa, onde observou-se alta porcentagem de
DNA na cauda das células SiHa e C-33A. Na linhagem celular SiHa, observou-se
genotoxicidade significante em todas as concentrações testadas no tratamento por 6
horas e concentração de DNA na cauda em 5,00 µM e 16,0 µM na exposição das células
por 24 horas. Para a linhagem C-33A observou-se os mesmos perfis de genotoxicidade
da linhagem celular SiHa nos dois tempos de tratamento. Não houve indução de
mutagenicidade nas células de estudo nas condições testadas. Sendo assim pode-se
sugerir que a nitensidina B como um candidato a agente citotóxico contra células SiHa e
C-33A.
Palavras Chave: câncer cervical, HPV, nitensidina B, citotoxicidade, apoptose.
ABSTRACT
Nowadays, cervical cancer is considered the second most common among women, and
have been associated with human papillomavirus (HPV), which infects squamous
epithelial cells resulting in major injuries. Given the need to find new drugs with
antineoplastic activity, have sought to identify compounds antineoplastic from plants,
wich are capable of preventing the proliferation of neoplastic cells infected by HPV.
Nitensidine B is a guanidine alkaloid isolated from Pterogyne nitens Tul. (Fabaceae),
which has cytotoxic and antifungical activies. This study aimed verify by cytotoxic, proapoptotic, genotoxic and mutagenic of nitensidine B through in vitro experiments, using
cervical carcinoma cells infected by HPV-16 (SiHa) and not infected (C -33A). To
evaluate the cytotoxicity of nitensidine B, by MTT assay, it being possible to observe an
effect concentration response in both strains tested SiHa and C-33A, IC50 = 28.95 µM
and 25.78 µM, respectively, by 24 hours of treatment and SiHa and C-33A, IC50 = 20.77
µM and 20.96 µM, respectively, by 48 hours. In order, to investigate pro-apoptotic
activity, it was carried out annexin V flow cytometric and Hoechst-propidium iodide
assay, which it could be seen that the nitensidine B showed apoptotic cell death late in
the lineage of cells infected by HPV-16 (SiHa) and lower percentages of apoptotic cells
in the cells not infected by HPV-16 (C-33A), both early apoptotic, late apoptotic and in
necrosis at all concentrations used. For the genotoxicity assay was performed comet
assay, where there was a high percentage of DNA in the tail of the cells studied. In SiHa
cell line was observed significant genotoxicity at all concentrations tested in treatment
for 6 hours and the concentration of DNA in the tail at 5.00 µM to 16.0 µM on exposing
cells for 24 hours with nitensidine B. For the line C-33A was observed genotoxicity
profiles of the same cell line SiHa in both treatment times tested. There was no
induction in cells mutagenicity at conditions tested. Thus it could be suggested that the
nitensidine B as a candidate to cytotoxic agent against SiHa cells and C-33A cells.
Keywords: cervical cancer, HPV, nitensidine B, cytotoxicity, apoptosis.
Lista de Figuras
Figura 1 Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados
para 2012 por sexo.
Figura 2. Lesão cervical e sua evolução.
Figura 3. Representação esquemática do capsídeo e do genoma viral do HPV-16.
Figura 4. Ciclo viral do Papilomavírus Humano (HPV).
Figura 5. Planta Pterogyne nitens em seu habitat.
Figura 6. Estrutura Molecular Nitensidina B.
Figura 7. Características morfológicas de apoptose e necrose.
Figura 8. Ilustração da externalização da camada de fosfatidilserina da membrana
celular e ligação com a anexina V.
Figura 9. Níveis de dano no DNA após exposição por peróxido de hidrogênio através
do ensaio do cometa.
Figura 10. Micronúcleo.
Figura 11. Ensaio de citotoxicidade (MTT). Nitensidina B na linhagem celular SiHa
nas concentrações de 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47,0 µM em dois tempos
de tratamento (24 e 48 horas).
Figura 12. Ensaio de citotoxicidade (MTT). Nitensidina B na linhagem celular C-33A
nas concentrações de 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47,0 µM em dois tempos
de tratamento (24 e 48 horas).
Figura 13. Ensaio de apoptose por citometria de fluxo utilizando anexina V conjugada
com FITC e iodeto de propídio. Linhagem SiHa tratada com de 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00
µM, 16,0 µM e 47,0 µM de nitensidina. Relação entre apoptose precoce e apoptose
tardia em células tratadas com nitensidina B por 24 horas.
Figura 14. Ensaio de apoptose por citometria de fluxo utilizando anexina V conjugada
com FITC e iodeto de propídio. Linhagem C-33A tratada com de 0,67 µM, 2,00 µM,
5,00 µM, 16,0 µM e 47,0 µM de nitensidina B. Relação entre apoptose precoce e
apoptose tardia em células tratadas com nitensidina B por 24 horas.
Figura 15. Taxas de apoptose e necrose por coloração Hoechst / IP em células SiHa.
Resultados são expressos como a média de três experimentos independentes e
analisados por one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (tratados vs CV). A) Relação
entre apoptose total e necrose em células tratadas com nitensidina B por 24 horas; B)
Relação entre apoptose precoce e apoptose tardia em células tratadas com nitensidina B
por 24 horas
Figura 16. Taxas de apoptose e necrose por coloração Hoechst / IP em células C-33A.
Resultados são expressos como a média de três experimentos independentes e
analisados por one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (tratados vs CV). A) Relação
entre apoptose total e necrose em células tratadas com nitensidina B por 24h; B)
Relação entre apoptose precoce e apoptose tardia em células tratadas com nitensidina B
por 24 horas
Figura 17. Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular SiHa tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 6 horas.
Figura 18 .Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular SiHa tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 24
horas.
Figura 19. Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular C-33A tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 6
horas.
Figura 20. Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA in tail em
linhagem celular C-33A tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 24
horas.
Figura 21. Mutagenidade da nitensidina B representada pela % de micronúcleos
linhagem celular SiHa tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47 µM por
24 h. Resultados são expressos como a porcentagem de micronúcleos em 1000 células
analisadas por concentração e controles, resultados analisados pelo Kruskal-Wallis teste
com pós-teste de Dunn’s (tratados vs CV). CP: 50 µg/ml de doxorrubicina, CV: controle
de veículo DMSO 1%, * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 ****p < 0,0001.
Figura 22. Mutagenidade da nitensidina B representada pela % de micronúcleos
linhagem celular C-33A tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47 µM
por 24 h. Resultados são expressos como a porcentagem de micronúcleos em 1000
células analisadas por concentração e controles, resultados analisados pelo KruskalWallis teste com pós-teste de Dunn’s (tratados vs CV). CP: 50 µg/ml de doxorrubicina,
CV: controle de veículo DMSO 1%, * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 ****p <
0,0001.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANOVA – análise de variância
ATCC- American Type Culture Collection
ATV – associação de tripsina e versene
CN – controle negativo
CP – controle positivo
CV- controle de veículo
CI50 – concentração capaz de reduzir em 50% a viabilidade celular
C-33A- células de carcinoma cervical humano não imortalizadas pelo HPV-16
DAF – diacetato de fluoresceína
DMEM – Dulbecco’s modification of Eagle´s medium
E- early
EDTA- Ácido Etilenodiaminatetracético
EP - erro padrão
E2F- fator epitelial 2
FITC - isotiocianato de fluoresceína
FN - fragmentos do nucleóide
Gy/min- gray por minuto
HO – Hoechst
HO / IP – Hoechst Iodeto de Propídio
HUVEC- células endoteliais da veia umbilical humana
HPF- high power field
HPV – Human Papilomavirus
IP – iodeto de propidio
IPC - Instituto de Patologia Clínica
L – late
LCR – long control region
MF- fator mitótico
MTT – 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- brometo de difeniltetrazólio
NuBBE- Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos Naturais
OECD - Organization for Economic Co-Operation & Economic Development
PB – pares de base
PBS – solução salina tamponada com fosfato
pRb- proteína do retinoblastoma
PS – fosfatidilserina
p53- proteína p53
q.s.p.- quantidade suficiente para
RT-PCR- transcrição reversa reação em cadeia de polimerase
SiHa- linhagem de carcinoma cervical humano imortalizadas pelo HPV-16
SFB – soro fetal bovino
TM – tail moment
URR – upstream regulatory region
Vero – linhagem celular de rim de macaco verde africano
WB- Western Blot
3T3-L1 – fibroblasto de camundongo
SUMÁRIO
1- INTRODUÇÃO................................................................................... 17
1.1- Câncer de Colo Uterino e Papilomavírus Humano (HPV) .......... 18
1.1.1- HPV – Biologia e Ciclo de Vida ................................................... 22
1.2- Pterogyne nitens ................................................................................ 26
1.2.1- Nitensidina B ................................................................................. 27
1.3- Morte Celular – Apoptose e Necrose ............................................. 28
1.4- Genotoxicidade ................................................................................. 31
2.1- Objetivo Geral .................................................................................. 36
2.2- Objetivos Específicos ....................................................................... 36
3.1- Procedimentos fitoquimicos: Obtenção de nitensidina B ............ 38
3.2- Cultura de células – SiHa e C-33A ................................................. 39
3.3- Tratamento das linhagens celulares ............................................... 39
3.4- Citotoxicidade com MTT ................................................................ 40
3.5- Ensaios de Apoptose ........................................................................ 40
3.5.1- Anexina V ...................................................................................... 40
3.5.2- Hoechst e Iodeto de propídio ....................................................... 41
3.6- Ensaio de Genotoxicidade –Ensaio do Cometa ............................ 42
3.7- Ensaio de Mutagenicidade - Teste do Micronúcleo ...................... 43
3.8- Análises Estatísticas ......................................................................... 44
4.1- Ensaio de citotoxicidade- MTT ...................................................... 46
4.2- Ensaios de apoptose: Anexina V..................................................... 48
4.3- Ensaio de apoptose Hoescht-Iodeto de propídio ........................... 51
4.4- Avaliação da genotoxicidade - Ensaio do cometa ......................... 55
4.5- Avaliação da mutagenicidade - Ensaio do micronúcleo............... 59
5- DISCUSSÃO........................................................................................ 61
6- CONCLUSÕES ................................................................................... 62
7- REFERÊNCIAS .................................................................................. 66
1.INTRODUÇÃO
18
1.1 - CÂNCER DE COLO UTERINO E PAPILOMAVÍRUS
HUMANO (HPV)
O câncer é a designação dada ao conjunto de manifestações patológicas que se
caracterizam pela perda de controle da proliferação, ganho de capacidade de invadir
tecidos adjacentes ou de sofrer metástases para tecidos distantes. Esta perda de controle
é consequência direta de danos hereditários e irreversíveis causados aos mecanismos de
regulação do ciclo celular bem como, aos genes que nele atuam. Sendo assim, a
malignidade de uma célula é resultado de mutações no material genético, que podem ser
hereditárias (quando a predisposição a uma determinada neoplasia pode ser diretamente
ligada aos genes alterados e estes são transmitidos ou quando os distúrbios
que
levem a doença são levados como um efeito secundário) ou adquiridas somaticamente
pela exposição a uma variedade de fatores ambientais (MONTESANO & HALL, 2001).
Por outro lado, um tumor benigno significa uma massa localizada de células que se
multiplicam vagarosamente e se assemelham ao seu tecido original, raramente
constituindo um risco de vida (INCA, 2010).
As causas de câncer são variadas, podendo ser classificadas como externas e
internas, estando ambas inter-relacionadas. As causas externas relacionam-se ao meio
ambiente e aos hábitos ou costumes próprios de um ambiente social e cultural. As
causas internas são, na maioria das vezes, geneticamente pré-determinadas, estão
ligadas à capacidade do organismo de se defender das agressões externas. Esses fatores
causais podem interagir de várias formas, aumentando a probabilidade de
transformações malignas nas células normais. De maneira que esses fatores atuem de
maneira conjunta aumentando o risco de desenvolvimento da doença (GREENWALD et
al. 1995). Como cerca de 70% a 80% dos casos de câncer são de origem externa,
podemos considerá-los, portanto, passíveis de prevenção (GREENWALD et al. 1995;
ALBERTS et al., 1999; PEZZUTO et al., 2005).
Estimativas mostram que, no Brasil, o câncer do colo do útero é a segunda
neoplasia mais comum na população feminina, de acordo com dados absolutos sobre a
incidência e mortalidade por câncer divulgada pelo Instituto Nacional de Câncer em
2012, como demonstra a figura 1.
19
Localização
primária
casos
novos
percentual
Localização casos
primária
novos
percentual
Próstata
60.180
30,8%
Mama
52.680
Feminina
27,9%
Traqueia,
Brônquio
e Pulmão
17.210
8,8%
Colo do
Útero
17.540
9,3%
Cólon e
Reto
14.180
7,3%
Cólon e
Reto
15.960
8,4%
Estômago
12.670
6,5%
Glândula
Tireoide
10.590
5,6%
Cavidade
Oral
9.990
5,1%
Traqueia,
Brônquio 10.110
e Pulmão
5,3%
Esôfago
7.770
4,0%
Estômago 7.420
3,9%
Bexiga
6.210
3,2%
Ovário
6.190
3,3%
Laringe
6.110
3,1%
Corpo do
4.520
Útero
2,4%
Linfoma
não
Hodgkin
5.190
2,7%
Sistema
Nervoso
Central
4.450
2,4%
2,5%
Linfoma
não
Hodgkin
4.450
2,4%
Sistema
Nervoso
Central
4.820
Figura 1 -Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados
para 2012 por sexo. Fonte: ( INCA, 2012 )
Os tipos mais incidentes, à exceção do câncer de pele do tipo não melanoma,
serão os cânceres de próstata e de pulmão no sexo masculino e os cânceres de mama e
de colo do útero no sexo feminino, acompanhando o mesmo perfil da magnitude
observada no mundo (INCA, 2012).
A principal maneira utilizada para detecção precoce das lesões que podem levar
ao câncer de colo uterino é a realização do exame popularmente conhecido como
Papanicolaou. Este exame consiste na coleta do material citológico da parte externa
(ectocervice) e também da parte interna (endocervice) do colo uterino, por meio da
introdução de um espéculo vaginal e coleta, realizado com uma espátula de madeira e
com uma escova endocervical, mediante os movimentos de 360º. Esse rastreamento que
é realizado entre as mulheres permite a detecção precoce das lesões do colo uterino,
reduzindo significativamente o aparecimento do câncer cervical. Em relação à
20
morfologia celular o mais comum é a coilocitose nos estágios iniciais e a consequente
perda de morfologia conforme a lesão se maligniza, até o ponto da irreversibilidade
apresentado na figura 2.
Figura 2- Lesão cervical e sua evolução. Fonte: www.gisttumo-r.com, 2011. Acessado
em 14/11/2012.
O câncer de colo uterino é uma doença causada por fatores ambientais, genéticos
e também infecciosos, onde o HPV relaciona-se com 90% dos casos entre a população
mundial, o Papilomavirus Humano se destaca como uma das doenças sexualmente
transmissíveis (DST) mais comuns no mundo. A única forma visível da doença
provocada por esse vírus são verrugas, também conhecidas como “crista de galo”, que
aparecem nas regiões genitais de homens e mulheres. No entanto, só os tipos mais
benignos do HPV desenvolvem tais sintomas (PSYRRI & DIMAIO, 2008).
Mais de 200 tipos de HPV foram isolados, não havendo dúvidas de que existem
outros tipos que ainda não foram identificados. Eles são vírus que infectam as células
21
epiteliais escamosas e possivelmente podem dar origem a grandes lesões epiteliais,
principalmente hiperplasia benigna (por exemplo, verrugas ou papilomas), com baixo
potencial maligno. Uma pequena fração de pessoas infectadas com HPV de alto risco irá
desenvolver câncer, que geralmente surgem muitos anos após a infecção inicial
(PSYRRI & DIMAIO, 2008). HPVs da mucosa e genital são compostos por cerca de 30
tipos, sendo divididos em papilomavírus humano de baixo risco (tipos 6, 11, 42, 43 e
44) e HPVs de alto risco que estão associados com lesões pré-cancerígenas (tipos 16,
18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 e 56), de acordo com a sua presença em lesões malignas do
colo do útero (NAIR & PILLAI, 2005)
O Brasil é um dos líderes mundiais em incidência de HPV, que é considerado
como um problema de saúde pública que afeta principalmente os países em
desenvolvimento, as vítimas preferenciais são mulheres entre 15 e 25 anos, embora a
doença também acometa os homens. Especialistas acreditam que o número menor de
registros entre pessoas do sexo masculino tenha como origem a baixa procura dos
homens por serviços de urologia, por fatores como o preconceito ou a falta de
informação (Ministério da Saúde, 2011).
A infecção por subtipos de alto risco oncogênico do HPV é o maior fator de
risco para o desenvolvimento de lesões malignas no colo uterino. Embora a infecção
pelo o HPV possa ser o fator desencadeante do câncer cervical estudos recentes
mostram a correlação com fatores genéticos e funções imunes intimamente relacionados
com a prospecção da carcinogênese cervical e a infecção pelos principais subtipos de
alto risco (ZUR HAUSEN, 2009).
O Sistema Único de Saúde (SUS) oferece exames gratuitos à população para
detecção do vírus. Para evitar que a contaminação pelo HPV se transforme em câncer, é
fundamental que as mulheres se submetam ao exame Papanicolaou regularmente. O
Ministério da Saúde recomenda visitas frequentes a ginecologistas, para prevenção de
doenças sexualmente transmissíveis (DST) e à reprodução. Alguns fatores aumentam a
probabilidade de desenvolvimento desse câncer em mulheres infectadas pelo HPV.
Entre eles, estão o número elevado de gestações, o uso de contraceptivos orais,
tabagismo e infecção pelo HIV e outras DST (Ministério da Saúde, 2011). O uso de
preservativos durante a relação sexual é também uma prevenção primária do câncer do
colo do útero, uma das formas de evitar o contágio pelo HPV, sendo que este é
transmitido pelo contato genital com a pessoa infectada (incluindo sexo oral). Pode ser
transmitido também por via sanguínea, de mãe para filho na hora do parto. Na maioria
22
das vezes, a infecção é transitória e desaparece sem deixar vestígios. Por isso, quando se
realiza o diagnóstico, não se consegue saber se a infecção é recente ou antiga. A doença
viral pode permanecer sem se manifestar no corpo da pessoa. A explicação para tantos
casos pode ter como causa o fato de a infecção do HPV se desenvolver de forma
silenciosa no corpo humano. A maioria das pessoas não apresentam nenhum sintoma ao
contrair a doença e, por isso, não procura tratamento. Esse comportamento é o grande
responsável pela disseminação do vírus (Ministério da Saúde, 2011).
1.1.1- HPV – BIOLOGIA E CICLO DE VIDA
O HPV é um vírus de DNA, da família Papovaviridae do gênero Papovavirus
que foi identificado por Strauss em 1949, e vem sendo isolado em inúmeras espécies
animais. As partículas virais completas não são envelopadas e possuem capsídeo
protéico (composto por duas proteínas estruturais) de padrão icosaédrico, com 55 nm de
diâmetro (FIGURA 3).
Figura 3: Representação esquemática do capsídeo e do genoma viral do HPV-16
A figura 3A representa a partícula viral com capsídeo de padrão icosaédrico, sem
envelope, composta por 72 capsômeros (SPPV, 2011). Na figura 3B está representado
23
esquematicamente o genoma do HPV-16, genes da região precoce (E), genes da região
tardia (L) e a Long Control Region (LCR).
Dentro do capsídeo, o genoma se apresenta circular de fita dupla de DNA,
contendo aproximadamente 8.000 pares de base (pb) e peso molecular de 5,2 x 10 6 Da
(DELIGEOROGLOU et al., 2009; ZUR HAUSEN, 2009; HORVATH et al., 2010).
O genoma viral é dividido em três regiões gênicas, diferenciadas de acordo com
os genes que são codificados em cada região. A região precoce (E, de early), com 7 a 8
genes funcionais, a região tardia (L, de late) que codifica as duas proteínas estruturais
do capsídeo e uma região regulatória, não-codificadora, conhecida como long control
region (LCR) ou upstream regulatory region (URR ) (SPPV, 2011).
O tamanho relativamente pequeno do genoma do HPV permite uma análise de
cada gene e a interação das proteínas virais com a célula hospedeira. Os genes precoces
formam 60% do genoma viral, são responsáveis pela replicação do DNA (gene E1),
controle de transcrição (gene E2), maturação do vírus e alteração da matriz e
citoesqueleto celular (gene E4), e no estímulo da proliferação e manutenção da
transformação celular (genes E5, E6 e E7). Os genes da região tardia, L1 e L2, formam
40% do genoma viral e constituem sequências altamente conservadas em todos os
papilomavírus. Esses genes codificam proteínas do capsídeo viral que são responsáveis
por sua antigenicidade, sendo a proteína L1, de 54 kDa como principal, e L2, de 52 kDa
como secundária.
As proteínas virais E6 e E7 apresentam função de estimular a progressão do
ciclo celular ao se associarem com proteínas reguladoras do ciclo celular hospedeiro. A
proteína E7 associa-se com a proteína do retinoblastoma (pRb), um regulador negativo
do ciclo celular que normalmente previne a progressão da fase G1 para a fase S por se
associar ao fator de transcrição E2F. Ao se ligar a E7, pRb é degrada liberando E2F, a
qual estimulará a transcrição de genes alvos associados a replicação do DNA,
resultando na proliferação celular desordenada (MOTOYAMA et al., 2004; ZUR
HAUSEN, 2002).
A proteína viral E6 completa o papel de E7, prevenindo a apoptose em resposta
à entrada não programada na fase S induzida por E7 (DOORBAR & CUBIE, 2005). A
associação da proteína E6 dos tipos de HPV de alto risco, com a proteína p53 da célula
hospedeira resulta na degradação da p53, comprometendo a interrupção do crescimento
celular e a ativação da apoptose induzida por erros no DNA genômico. A perda do
24
controle do ciclo celular mediado por p53 favorece a instabilidade cromossômica e
acúmulo de mutações na célula infectada (DOORBAR & CUBIE, 2005).
O HPV tem afinidade por células epiteliais da pele e mucosas. Dependendo do
tipo de vírus, pode causar proliferação benigna ou maligna. Os diferentes tipos de HPV
são definidos como tendo mais de 10 % de diferença em regiões específicas do seu
genoma. Portanto, determinados tipos virais com diferentes formas de interação
determinam, em conjunto, o potencial oncogênico do vírus. A infecção de pele e
mucosas pelo HPV ocorre por meio de microlesões existentes na camada basal do
tecido (ZUR HAUSEN, 2002).
A infecção pelo papilomavírus exige a disponibilidade de células epiteliais da
epiderme ou da mucosa que são capazes de proliferação, onde o ciclo de vida produtivo
do vírus ocorre juntamente ao ciclo de diferenciação das células do hospedeiro
infectado. A infecção inicial pelo HPV ocorre em células basais, uma única camada de
células proliferativas indiferenciadas (STANLEY, 2008).
As células escamosas epiteliais normais se dividem como células tronco e
formam o epitélio estratificado. Após a divisão uma das células-filhas migra para a
superfície do epitélio e começa a sofrer diferenciação terminal enquanto a outra
permanece na camada basal desempenhando um lento ciclo para manter a renovação da
população celular (WATT, 1998; DOORBAR, 2006; NARISAWA-SAITO &
KIYONO, 2007).
A figura 4 ilustra o acesso às células basais que acontece por meio de
microlesões causadas por diversas formas de trauma físico e pela interação com
integrinas como α6β1 e α6β4 integrina (YOON et al., 2001; PSYRRI & DIMAIO,
2008). Nas células infectadas da camada basal são sintetizados baixos níveis de DNA
viral, formando aproximadamente 50 a 100 cópias epissomais do genoma viral por
célula (PETT & COLEMAN, 2007). A infecção das células basais pelo HPV leva à
ativação de uma cascata de expressão de genes virais que resulta na replicação de seu
genoma, no entanto, a expressão destes genes é amplamente reprimida, existindo apenas
uma limitada expressão de genes virais específicos da região precoce. Os primeiros
genes virais a serem expressos são os fatores de replicação, E1 e E2, que formam um
complexo que se liga à origem de replicação e atua no sentido de recrutamento de
polimerases celulares e proteínas acessórias que mediam a replicação de DNA
(CONGER et al., 1999; STANLEY, 2008).
25
Figura 4: Ciclo viral do Papilomavírus Humano ( modificado de DOORBAR, 2006)
Por meio de microlesões, o HPV é capaz de infectar células da camada basal do
epitélio. Ao migrar para as camadas suprabasais os genes virais são ativados, o DNA do
vírus é replicado e as proteínas do capsômero são sintetizadas. As partículas virais
formadas são liberadas na superfície da mucosa onde podem infectar outras células
(DOORBAR, 2006).
A replicação viral ocorre exclusivamente no núcleo da célula hospedeira e o
genoma viral pode interagir com o DNA celular de forma epissomal (vegetativa) ou
integrada (KANODIA et al., 2007). Assim, há dois modos de replicação do HPV: o
primeiro ocorre nas células da camada basal do epitélio, onde o genoma viral é
distribuído às células filhas, principalmente quando o DNA pró-viral encontra-se
integrado ao genoma da célula hospedeira. O segundo modo de interação é chamado
epissomal ou vegetativo, e a replicação do HPV ocorre nas camadas mais diferenciadas
do epitélio, não havendo integração do DNA viral ao genoma celular. Neste caso, são
produzidas múltiplas cópias do DNA do HPV que serão envolvidas pelo capsídeo
protéico formando assim as partículas virais maduras denominadas vírions (ZUR
HAUSEN, 2002; DOORBAR, 2006).
Nas lesões benignas (por exemplo, verrugas) o genoma do HPV está presente na
sua forma epissomal, enquanto que em lesões malignas o genoma é tipicamente
integrado. Sugere-se que a integração do DNA pode alterar a expressão gênica viral
(MADKAN et al., 2007).
26
1.2- PTEROGYNE NITENS
Pterogyne nitens (FIGURA 5) é a única espécie do gênero, e por esse motivo se
encontra na lista de proteção florestal. Popularmente conhecida como “amendoim-docampo”, “amendoim-bravo”, “bálsamo”, “yvi-raró”, “cocal”, “tipa”, etc. Essa espécie
arbórea pode alcançar a altura de 5 a 12 m e ocorre desde o Ceará até o Paraná, bem
como em outros países latino-americanos tais como, Argentina, Bolívia e Paraguai
(LORENZI, 2000a). A madeira do “amendoim-bravo” apresenta-se moderadamente
densa e relativa resistência física, sendo amplamente empregada na construção civil
(CARVALHO, 1994; COLETTI et al., 2010).
Figura 5: Planta Pterogyne nitens em seu habitat. (A) Árvore completa. (B)
Detalhe das folhas e flores (LORENZI, 2000).
Além da utilização comercial, P. nitens também é recomendada para plantios
mistos em áreas degradadas de preservação permanente devido à rusticidade e rápido
crescimento de suas árvores (BOLZANI et al., 1999; LORENZI, 2000a). Contudo, esta
espécie possui valor ornamental muito grande, não somente pela beleza e odor de suas
flores, bem como de sua folhagem brilhante e frutificação, que apresenta tons variáveis
à medida que amadurecem, sendo recomendada para arborização de vias urbanas e
rodovias e, na reposição de mata ciliar em locais com inundações periódicas. Esta
espécie habita os remanescentes do cerrado brasileiro e da mata atlântica e encontra-se
sob risco de extinção, fazendo parte da lista das espécies nativas recomendadas para o
programa de recomposição de florestas em áreas de preservação permanente do Estado
de São Paulo (LORENZI, 2000b; TONIN et al., 2005, REGASINI et al., 2009). Mesmo
27
com sua importância econômica, são relatados poucos dados na literatura que permitam
fornecer informações para sua conservação e uso sustentável (SALIS et al., 2006). Em
trabalhos fitoquímicos anteriores, foram isolados cinco alcalóides guanidínicos das
folhas e caules de P. nitens, os quais mostraram atividade citotóxica sobre linhagens
mutantes de Saccharomyces cerevisiae e atividade antifúngica contra fungos
oportunistas humanos, sugerindo uma potencial ação antitumoral dessas substâncias,
bem como a presença de flavonas (BOLZANI et al., 1995). Frações obtidas do extrato
etanólico de P. nitens apresentaram atividade antioxidante (VELLOSA, 2005;
REGASINI, 2009)
Estudos etnofarmacológicos em comunidades guaranis do nordeste da
Argentina revelam o uso das cascas do caule no tratamento de infestações parasitárias,
principalmente no combate ao “tacho”, nome popular de Ascaris lumbricoides
(CRIVOS et al., 2007). Segundo Duarte et. al., (2010), alcaloides isolados de P. nytens
possuem um amplo espectro de atividades biológicas, entre elas, relata que a pteroginina
e a pteroginidina possuem atividade citotóxica e apoptótica em linhagem de células de
câncer de mama (ZR-7531). Outro alcalóide isolado de Pterogyne nytens, análogo da
nitensidina B, denominado nitensidina A, apresentou atividade biológica nas linhagens
de células SiHa e C-33A (SORBO, 2010)
1.2.1- NITENSIDINA B
Com o intuito de buscar agentes antineoplásicos a a partir de substâncias
isoladas de fontes naturais, foram avaliados alguns alcalóides guanidínicos inovadores a
partir de estruturas de Pterogyne nitens, denominados de nitensidinas. A análise da
estrutura química desta substância permitiu a caracterização de variações destas
substâncias, denominadas nitensidinas A-E. Esses alcalóides apresentam-se substituídos
por unidades terpênicas, tais como isoprenilas e geranilas (REGASINI, 2008).
No presente estudo foi utilizado o alcalóide denominado de nitensidina B (figura
6).
28
Figura 6: Estrutura da nitensidina B
1.3- MORTE CELULAR – APOPTOSE E NECROSE
A apoptose é uma forma de morte celular rigorosamente controlada, de maneira
que complementa a mitose e o crescimento celular. É desencadeada por excesso ou falta
de estímulos de crescimento celular, proliferação e até mesmo dano celular. Portanto, a
apoptose é de fundamental importância para o controle do crescimento de órgãos e
tecidos e na manutenção da vida (BRAS et al., 2005). A perda no controle dos
mecanismos de apoptose na célula é uma das causas do aparecimento do câncer
(BOERSMA et al., 2005).
Existem diversas classificações para o processo de morte celular programada. A
maioria delas envolve observação da célula quanto ao fenótipo nuclear, organização do
citoesqueleto e alteração de organelas (FIGURA 7).
Em nível molecular, a liberação de citocromo c pela mitocôndria, que complexa
com fatores de ativação de apoptose e procaspase 9, forma o apoptossomo, responsável
pelo início da morte celular controlada (BRAS et al., 2005). A célula em apoptose
caracteriza-se por uma diminuição no tamanho, fragmentação do DNA e condensação
da cromatina, levando ao aparecimento de núcleo picnótico, formação de vacúolos
autofágicos, dilatação de organelas citoplasmáticas como mitocôndria e complexo de
Golgi. Isso demonstra que a mitocôndria está ligada em coordenar os sinais de morte
celular. Por fim, ocorre uma desintegração controlada da membrana formando os corpos
apoptóticos (BRAS et al., 2004).
29
Outro evento intracelular característico da apoptose é a ativação de enzimas
conhecidas como caspases. Dentro desse contexto, a mitocôndria desempenha um papel
fundamental na apoptose (GREEN et al., 2004). A ativação das enzimas efetoras, as
caspases 3 e 7, são responsáveis pela perda de potencial de membrana da mitocôndria e
liberação de fatores indutores de apoptose. Além disso, também amplificam o sinal de
morte inicial, contribuindo para uma maior liberação de citocromo c (LAKHANI et al.,
2006).
Por outro lado, o processo causado por um estímulo intenso que resulta na perda
de controle por parte da célula, rápida interrupção dos processos de manutenção da
integridade celular, rompimento da membrana plasmática, destruição do citoplasma e,
como consequencia, na morte celular, é chamado de necrose (BRAS et al., 2004) como
demonstrado abaixo na figura 7.
Corantes fluorescentes como a bisbenzidina Hoechst 33342 (HO) que possuem a
característica de emitir fluorescência quando se ligam ao DNA, são usados para
determinar a concentração de DNA e corar núcleos. O HO é permeável nas membranas
celulares e se une a ligações adeninatimina, sendo utilizado na avaliação de ciclo
celular, apoptose e quantificação de células viáveis. Este corante é usado após
tratamento de células com substâncias indutoras de apoptose (KIECHLER et al., 2003).
Ele é rapidamente absorvido pelas células durante as fases iniciais da apoptose,
enquanto que a membrana citoplasmática íntegra permanece impermeável a outros
corantes, como iodeto de propídio (IP). Fases tardias da apoptose apresentam corpos
apoptóticos e são acompanhadas pelo aumento da permeabilidade da membrana celular,
o que permite a entrada de IP nas células. Desta forma, a combinação do HO e IP é
utilizadas para a diferenciação dos estágios de apoptose precoce, apoptose tardia e
necrose, quando observados em microscopia de fluorescência (DUARTE, 2010).
Também adiciona-se o corante diacetato de fluoresceína (DAF) que marca
células com membrana celular intacta, revelando o citoplasma. Assim sendo, um ensaio
de 3 espectros coloridos diferentes. As células são avaliadas de acordo com a coloração
e morfologia em citoplasma verde e núcleo azul intacto (células viáveis), núcleo azul
condensado e fragmentado (apoptose precoce), núcleo vermelho condensado e
fragmentado (apoptose tardia) e núcleo intacto vermelho (necrose) (HASHIMOTO et
al., 2003)
.
30
Corpos apoptóticos
Fagócito
Digestão
enzimática
extravazamento
do
e
Fagocitose das células células
conteúdo
apoptóticas e seus fragmentos-
nuclear - NECROSE
Figura
7-
Características
APOPTOSE
morfológicas
de
apoptose
e
necrose.
Fonte:
http://creationwiki.org, acessado em 14/11/12)
O ensaio de marcação com Hoechst e Iodeto de propídio (HO / IP) permite
caracterizar com maior eficiência as diferenças entre apoptoses precoce, tardia e
necrose. É um ensaio de fundamental importância para complementar os estudos
realizados com anexina V.
A apoptose é acompanhada de perda de simetria da membrana e exposição de
fosfatidilserina (PS) da face intracelular para a superfície celular. A expressão de PS na
superfície da célula tem um papel fundamental no sistema imunológico responsável
pelo reconhecimento e remoção das células apoptóticas pelos macrófagos e sua
apresentação pela célula coincide com a condensação da cromatina durante a apoptose
(MUNOZ et al., 2007).
As anexinas fazem parte de uma família de proteínas que possuem a habilidade
de se ligarem a fosfolípideos de membrana na presença de Ca2+ . A anexina V é um
ligante altamente específico a PS e de ocorrência natural (MUNOZ et al., 2007).
Portanto, a presença de PS em células apoptóticas (FIGURA 8) pode ser medida in vitro
31
com anexina V conjugada com fluorocromos (VAN GENDEREN et al., 2008). A
medição da anexina V deve ser feita em conjunto com um corante de exclusão, usado
para marcar a integridade da membrana e permitir a diferenciação entre células em
apoptose ou necrose. O ensaio de anexina V apresenta a vantagem de ser um teste
sensível, de fácil execução e boa correlação clínica, além de oferecer a possibilidade de
detectar as fases inicias da apoptose (VAN GENDEREN et al., 2008).
Células vivas
Células em apoptose
Anexina V
Apoptose tardia
IP
Membrana plasmática
fosfatidilserina
núcleo
Figura 8- Ilustração da externalização da camada de fosfatidilserina da membrana
celular e ligação com a anexina V. Fonte:www.imgenex.com/apop_kits_list.php?id=76,
acessado em 12/11/2012
1.4- GENOTOXICIDADE
Danos causados ao DNA por mutagênicos ambientais podem ser nocivos para
diversos organismos, incluindo agentes humanos. O acúmulo de mutações está
relacionado com o desenvolvimento da maioria dos tumores malignos e desordens
degenerativas, o mesmo ocorre com o aumento da idade e com as anomalias genéticas
(CUZZOCREA et al., 2001; MIGLIORE et al., 2002). A fim de prevenir o risco
genotóxico, é pertinente tanto identificar os mutagênicos e diminuir a exposição a eles,
bem como aumentar a exposição a substâncias antigenotóxicas (NOGUEIRA et al.,
2006; JEONG et al., 2006).
Desta maneira, ao avaliarmos extratos, frações e substâncias, cujo mecanismo de
ação ainda é desconhecido, faz-se necessário avaliar o efeito genotóxico, buscando
caracterizar tais mecanismos. Para elucidar esses mecanismos foi proposto para
32
avaliação da genotoxicidade da nitensidina B, o ensaio do cometa, que pertence à classe
de testes indicadores, pois é capaz de detectar danos de DNA que podem futuramente
originar mutações. Em relação aos outros ensaios de genotoxicidade, as vantagens deste
teste incluem: sua aplicabilidade a vários tecidos e/ou tipos celulares; a grande
sensibilidade em detectar pequenos níveis de danos no DNA; a necessidade de utilizar
um pequeno número de células por amostra; sua fácil execução; o curto tempo
necessário para completar um experimento e obter resultados; e o seu relativo baixo
custo econômico (TICE et al., 2000).
Em sua forma mais simples, o ensaio do cometa se baseia na adição de células a
uma lâmina recoberta por agarose. Em contato com a agarose, ocorre lise das células e
membranas nucleares, e o DNA agora exposto é submetido a uma eletroforese alcalina.
Por fim, o DNA é observado por microscopia de fluorescência após a coloração das
células (FIGURA 9).
Resumidamente, o DNA migra porque contém quebras que podem sofrer arraste,
e esses danos aumentam frente à exposição a agentes genotóxicos (MOLLER, 2005).
↑ dano DNA
Nucleóide
Cauda
Figura 9- Níveis de dano no DNA após exposição por peróxido de hidrogênio em
diversas
concentrações,
por
meio
do
ensaio
do
cometa.
www.libyanjournalofmedicine.net/index.php, acessado em 10/11/2012
Fonte:
33
Quando este ensaio é comparado a testes como o de micronúcleo ou de
aberrações cromossômicas, o ensaio do cometa mostra-se capaz de detectar danos mais
recentes e passíveis de serem reparados (BRENDLER-SCHWAAB et al., 2005;
MOLLER, 2005). Ainda, pode ser utilizado para avaliar danos genéticos in vitro em
cultura de linfócitos ou em células metabolicamente ativas (HepG2) ou adicionando
frações microssomais às células não competentes para a metabolização (MERSCHSUDERMANN et al., 2004). Nos casos onde é relevante especular que determinado
tratamento induz danos ao DNA em órgãos específicos (estômago, rins, bexiga, etc), o
ensaio cometa é considerado o método mais confiável (BRENDLER-SCHWAAB et al.,
2005). Para o presente estudo será utilizado o protocolo desenvolvido por Singh et al.,
1988 para a avaliação da taxa da genotoxicidade induzida pela nitensidina B.
Para avaliação da atividade mutagênica a técnica escolhida foi a quantificação de
micronúcleos que segundo Heddle e colaboradores (1991) são originados de fragmentos
acêntricos de cromossomos ou danos cromossômicos os quais são ocasionados por
perda mitótica de fragmento acêntrico, ação mecânica ocasionando quebra
cromossômica, ou ainda, danos cromossômicos ocasionados por atraso ou ruptura do
filamento mitótico durante a anáfase (FIGURA 10).
Micronúcleo
FIGURA 10 – Micronúcleo. Fonte: www.crios.be/genotoxicitytests, acessado em
13/11/12
34
Devido a sua simplicidade, confiabilidade e sensibilidade, o teste de
micronúcleo tem sido requisitado para a avaliação de mutagenicidade de substâncias, as
quais podem exercer atividades clastogênicas (capacidade ou predisposição a quebra
cromossômica), aneugênicas (capacidade ou predisposição de alterar o fuso mitótico
resultando na perda de cromossomo), ou ambas (TOROUS et al., 1998).
Enquanto a versão alcalina do ensaio cometa detecta um amplo espectro de
lesões ao DNA, incluindo quebras únicas, sítios álcali-lábeis e ligações cruzadas (TICE,
2000) que são passíveis de serem reparadas, os micronúcleos são pequenas massas
intracitoplasmáticas resultantes tanto de quebras cromossômicas durante a divisão
celular, como de cromossomos com atrasos na anáfase, sendo estes danos cromossomais
irreversíveis
de
serem
reparados
(KIRSCH-VOLDERS
et
al.,
2000).
2.OBJETIVOS
36
2.1 - OBJETIVO GERAL
O presente estudo tem por objetivo, avaliar a atividade citotóxica, apoptótica,
genotóxica e mutagênica de nitensidina B, por meio de experimentos in vitro, utilizando
células de carcinoma cervical infectadas por HPV-16 (SiHa) e não infectadas pelo vírus
(C-33A).
2.2- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a citotoxicidade e determinar a concentração inibitória de 50 % das
células (CI50), nas linhagens celulares de carcinoma cervical SiHa e C-33A;
Avaliar quantitativamente a apoptose e necrose celular, utilizando o ensaio de
anexina V por citometria de fluxo nas linhagens celulares de carcinoma cervical
SiHa e C-33A;
Avaliar qualitativamente e quantitativamente a apoptose e necrose celular, para
diferenciação de apoptose precoce, tardia e necrose, utilizando os corantes de
Hoechst e iodeto de propídio, nas linhagens celulares de carcinoma cervical
SiHa e C-33A;
Detectar danos precoces de DNA nas linhagens celulares de carcinoma cervical
SiHa e C-33A, para avaliação de genotoxicidade por meio do teste do cometa;
Detectar danos tardios no DNA nas linhagens celulares de carcinoma cervical
SiHa e C-33A para avaliação da mutagenicidade por meio do ensaio do
micronúcleo;
3. MATERIAIS E MÉTODOS
38
3.1- PROCEDIMENTOS FITOQUIMICOS: OBTENÇÃO
DE NITENSIDINA B
O processo de obtenção do alcalóide guanidínico, nitensidina B, foi realizado
nas dependências do Núcleo de Bioensaios, Biossíntese e Ecofisiologia de Produtos
Naturais (NuBBE), Departamento de Química Orgânica, Instituto de Química,
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) sob supervisão do
Prof. Dr. Luis Octávio Regasini.
As folhas foram coletadas no Instituto Botânico, São Paulo – SP, Brasil, entre os
meses de abril e maio de 2003, pela Dra. Maria Cláudia Marx Young e identificado
como Pterogyne nitens Tulasne (Fabaceae) pela Dra. Inês Cordeiro do mesmo instituto.
Uma exsicata (SP204319) encontra-se depositada no herbário “Maria Eneida P.
Kaufmann” do Instituto Botânico, São Paulo – SP, Brasil.
O material botânico foi seco à temperatura ambiente e então submetido à
moagem empregando moinho de facas. O pó obtido foi levado à maceração empregando
hexanos e com posterior maceração em etanol. O extrato etanólico foi então dissolvido
em mistura metanol: água (7:3) e seguido de extração líquido-líquido empregando-se
acetato de etila e posteriormente n-butanol, obtendo-se três frações.
A fração n-butanólica foi acidificada com CH3SO3H aquoso (25 %) e levada à
partição líquido-líquido em CHCl3. A fração clorofórmica foi separada, e a fração
aquosa tratada com NH4OH até pH 7 e novamente submetida à partição líquido-líquido
em CHCl3. A fração clorofórmica foi então evaporada, obtendo-se a fração alcaloídica.
A fração alcaloídica foi cromatografada por sucessivas colunas de gel de sílica,
eluídas em CHCl3:MeOH (0-25% de MeOH), obtendo-se o metanossulfonato de
nitensidina B, o qual teve sua estrutura molecular identificada por técnicas
espectroscópicas, tais como: RMN de 1H e RMN de 13C (REGASINI, 2010).
39
3.2- CULTURA DE CÉLULAS – SIHA E C-33A
O potencial efeito citotóxico, apoptótico, genotóxico e mutagênico da
nitensidina B foi avaliado na linhagem de carcinoma cervical imortalizada pelo HPV-16
(SiHa-ATCC:HTB-35) e não imortalizada pelo HPV (C-33A-ATCC:HTB-31).
As linhagens American Type Culture Collection (ATCC) foram cedidas pela
Dra. Luiza Lina Villa, do Laboratório de Virologia, do Instituto Ludwig para Pesquisa
do Câncer. As linhagens SiHa e C-33A foram cultivadas em uma mistura 1:1 (v/v)
DMEM e Ham’s F10 (Sigma Co., St. Louis, USA) acrescido de 100 U/mL de
penicilina, 100 µg/mL de estreptomicina, 0,25 µg/mL de anfotericina B, 0,1 mg/mL de
kanamicina (Sigma) e 10 % de soro fetal bovino (Cultlab, Campinas, Brasil).
As células foram cultivadas em frascos de cultura, mantidas a 5% de CO2 e a
temperatura de 37 ºC até que a monocamada celular estivesse confluente.
Posteriormente, as células foram lavadas com 5 mL de solução de Hanks (0,4 g de KCl,
0,06 g de KH2PO4, 0,04 g de Na2HPO4, 0,35 g de NaHCO3, 1 g de glicose, H2O q.s.p.
1000 mL) e tripsinizadas acrescentado-se 1 mL de ATV (Associação de Tripsina (0,2
%) e Versene (0,02 %) – Instituto Adolpho Lutz, São Paulo, Brasil). Após o
desprendimento da monocamada de células, estas foram homogeneizadas com volumes
variados do meio acrescido de 10 % de soro fetal bovino. A suspensão celular obtida em
um frasco foi transferida para outros frascos, de modo a obter 105 células/frasco. Esse
procedimento foi repetido até que houvesse quantidade de células suficientes para os
experimentos.
3.3- TRATAMENTO DAS LINHAGENS CELULARES
Para todos os experimentos as células foram tratadas por diferentes
concentrações (0,67 µM; 2,00 µM; 5,00 µM; 16,0 µM; 47,0 µM) de nitensidina B.
Como controle positivo, foram utilizados a doxorrubicina 50 µg/mL (exceto para o teste
do MTT que foi utilizado 15 µg/mL) para o ensaio de citotoxicidade (MTT) , apoptose
por Hoechst-iodeto de propídio e para o ensaio do micronúcleo, para os ensaios de
apoptose por citometria de fluxo, foi utilizado a curcumina na concentração de 30 µM,
para a avaliação da genotoxicidade, foi utilizado péroxido de hidrogênio na
concentração de 1 mM, diluído em meio de cultura sem soro fetal bovino por 10
minutos, como controle de veículo, o meio de cultura sem soro fetal bovino contendo
40
até 1 % de DMSO (v/v). Todos os testes foram realizados com três experimentos
independentes em três replicatas.
3.4- CITOTOXICIDADE COM MTT
O método de citotoxicidade empregado foi MTT, tendo como princípio a
determinação da habilidade de células vivas em reduzirem 3-(4,5-dimetil-2-thiazolil)2,5-difenil-2H-brometo tetrazólio (MTT, Sigma®), formando cristais insolúveis de
formazana de coloração violeta. Foi utilizada uma suspensão de 2,5 ×103 células/poço
das linhagens SiHa e C-33A. As células foram cultivadas em placas de 96 poços, e após
24 h de cultivo, as células foram tratadas com nitensidina B. As células foram tratadas
por 24 h 48 horas, procurando avaliar o efeito concentração-resposta citotóxica.
Após o tratamento descrito no item 3.3, o meio de cultura foi removido e 5
mg/mL de MTT em PBS foram adicionados em cada poço, as células na microplaca
foram incubadas a 37 ºC, ao abrigo da luz, até a observação da presença dos cristais
violetas de formazana (3 h). Para a solubilização dos cristais de formazana, 100 L de
álcool isopropílico absoluto foi adicionado a cada poço e a leitura espectrofotométrica
da absorbância, em comprimento de onda de 540 nm, foi realizada em leitor de placas
(Bio-Tek Powerwave X, BioTek Instruments, Inc.,USA). A porcentagem de células
vivas foi calculada em relação ao controle negativo, representando a citotoxicidade de
cada tratamento, segundo proposto por ZHANG et al. 2004:
Células vivas (%) = Absorvância do teste - Controle Branco x100
Absorvância do controle veículo – Controle Branco
3.5- ENSAIOS DE APOPTOSE
3.5.1- ANEXINA V
Para os ensaios de apoptose por citometria de fluxo com anexina V, cerca de
1×105 células/poço foram cultivadas em placas de 12 poços por 24 horas para a
formação da monocamada confluente.
41
Após o tratamento de 24 horas , as células foram tripsinizadas, transferidas para
microtubos estéreis e centrifugadas por 10 minutos. As células foram lavadas com meio
de cultura e centrifugadas novamente. Para o ensaio da anexina V foi utilizado o kit de
detecção de apoptose por anexina-V conjugada com FITC. A seguir, as células foram
ressuspendidas com 500 L de tampão de ligação, 5 L de anexina V conjugada com
FITC, e 5 L de IP. A reação foi incubada por 5 minutos, a temperatura ambiente, sob
abrigo da luz. A intensidade de fluorescência (FITC e IP) foi avaliada utilizando o
equipamento FACSCanto, nas dependências do laboratório de Imunologia da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto-USP pela técnica Fabiana.
3.5.2- HOECHST E IODETO DE PROPÍDIO
O ensaio citomorfológico para detecção de células apoptóticas, utilizando os
corantes Hoechst 33342 e iodeto de propídio foi realizado nas linhagens celulares (SiHa
e C-33A). Para este ensaio, complementar ao teste da anexina V, foram plaqueadas 105
células/poço em placas de 12 poços (1 mL/poço), as linhagens celulares SiHa e C-33A
foram tratadas com nitensidina B conforme descrito no item 3.3.
A avaliação de células apoptóticas e necróticas foi realizada pelo método de
exclusão de fluorocromos, utilizando-se uma solução fluorescente, contendo DAF, IP, e
Hoechst 33342 (Invitrogen®). Após o tratamento com nitensidina B, o meio de cultura
foi recolhido (células mortas em suspensão), as células aderentes foram tripsinizadas, e
ambas foram centrifugadas. Na suspensão celular de 100 μL foi acrescentada uma
solução de fluorocromos, contendo 25 % da solução aquosa de IP (1 mg/mL), 50 % da
solução de DAF em DMSO (1,5 mg/mL), 10 % da solução aquosa de Hoechst (1
mg/mL) e 15 % de PBS. A reação foi incubada por 5 minutos a 37 ºC e as células foram
observadas em microscopia de fluorescência, em espectro de absorção em dois
comprimentos de ondas de 360 nm e 538 nm.
Em seguida, a apoptose foi avaliada qualitativa e quantitativa, estabelecendo-se
a porcentagem de células em apoptose precoce, tardia e em necrose, levando-se em
consideração a morfologia e coloração das células. As células foram classificadas como
normais (núcleo azul esférico corado pelo HO, citoplasma verde, 360 nm), apoptóticas
(núcleo azul com corpos apoptóticos corado pelo HO, citoplasma verde, 360 nm), e
necróticas (núcleo vermelho esférico ou em vesículas corado pelo IP, citoplasma
vermelho, 538 nm). Ainda, as células foram classificadas em apoptose precoce (núcleo
42
em azul e morfologia nuclear com corpos apoptóticos), apoptose tardia (núcleo corado
em vermelho e com presença de corpos apoptóticos) e necrótica (núcleo preservado e
com coloração em vermelho) segundo proposto por KOROSTOFF et. al. (1998) e
HASHIMOTO et al. (2003).
3.6- ENSAIO DE GENOTOXICIDADE –ENSAIO DO
COMETA
O ensaio do cometa foi realizado segundo protocolo estabelecido por Singh e
colaboradores (1988). Primeiramente torna-se necessária a quantificação do ensaio o
plaqueamento das células da linhagem SiHa e C-33A em uma concentração de 2 x 105
células/ml em placas de 24 poços (105céls/poço), para a avaliação da atividade
genotóxica foram selecionadas concentrações não citotóxicas que foram determinadas
pelo ensaio do MTT, as células passaram por tratamentos de 6 e 24 horas nas
concentrações de 0,67 µM; 2,00 µM; 5,00 µM e 16,0 µM de nitensidina B.
Posteriormente as células foram tripsinizadas da placa e ressuspendidas com agarose de
baixo ponto de fusão e colocadas em lâminas limpas de microscopia óptica contendo
uma fina camada de agarose ponto de fusão normal. Em seguida as lâminas preparadas
foram lisadas com sal e detergente (NaCl 2,5 mM, EDTA 100 mM, Tris 10 mM) no
mínimo por 3 horas e máximo 24 horas para a formação de nucleóides ligados à matriz
nuclear e posteriormente aplica-se uma eletroforese alcalina (pH 13) nas condições de
25 V, 280 mA por 20 minutos em uma solução de eletroforese que vai fornecer tal
situação, esta solução é composta por Ácido Etilenodiaminatetracético (EDTA) e NaOH
. Por fim, as lâminas são coradas com corante brometo de etídio na concentração de 0,8
mg/ml e são observadas ao microscópio de fluorescência para que sejam capturadas as
imagens de 50 células por lâmina, totalizando 150 células por concentração, incluindo
os controles positivo, negativo e veículo. Assim, as imagens foram mensuradas por
meio do software TRiTek Comet Score™ v1.5, utilizando como parâmetro a medida da
porcentagem de DNA na cauda, avaliando assim o grau de genotoxicidade da
nitensidina B.
43
3.7- ENSAIO DE MUTAGENICIDADE - TESTE DO
MICRONÚCLEO
O ensaio do micronúcleo foi realizado segundo protocolo do IN Cell Analyzer
2000 (Analysis of in vitro micronucleus assay using the IN Cell analyser 2000
micronuclei formation analysis module), (GE, 2009). As células foram plaqueadas na
concentração de 104 células/poço em placas de 96 poços, posteriormente fez-se o
tratamento com nitensidina B nas concentrações de 0,67 µM; 2,00 µM; 5,00 µM; 16,0
µM e 47,0 µM. Como controle positivo, foi utilizado a doxorrubicina na concentração
de 50 µg/ml e controle de veículo (dimetilsulfóxido 1%). Após o tratamento por 24
horas, fez-se o bloqueio da citocinese com 10 µl/poço de citocalasina B na concentração
de 30 µM por 24 horas. Após o bloqueio da citocinese celular, a placa é lavada com
PBS e as células são fixadas com 100 µl de etanol (PA) por poço por 30 minutos, em
temperatura ambiente. Após a fixação das células, foi adicionado FITC diluído em PBS
(marcador de citoplasma) na concentração de 10 µM por 30 minutos, lavou-se os poços
por 3 vezes com PBS e adicionou-se o outro marcador, o Hoechst 33342 na
concentração de 5 µM por 15 minutos, afim de marcar o núcleo e o citoplasma da
célula.
As imagens foram capturadas no aparelho IN cell Analyser modelo 2000, no
laboratório de Micologia Clínica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UnespAraraquara pela técnica Cláudia. Foram capturadas no mínimo 1000 células por
concentração e controles. Os dados foram analisadas pelo software IN Cell Analyser
workstation, onde todos os parâmetros como, contagem de células, formação de células
mononucleadas, binucleadas e formação de micronúcleos foram ajustados.
Os resultados refletem e frequência de formação de micronúcleos em 1000
células analisadas por concentração testada e controles positivo (doxorrubicina 50
µg/ml) e veículo (DMSO 1%). Foram realizados 3 ensaios independentes e a variância
foi calculada pelo Kruskall-Wallis teste com pós teste de Dunns (Tratados vs CV).
44
3.8 ANÁLISES ESTATÍSTICAS
Para os resultados de citotoxicidade, no caso o MTT, a determinação da CI50
foram feitas linhas de tendências lineares e por meio das equações das retas obtidas, os
valores foram definidos. Para comparação dos resultados foi aplicado o teste de análise
de variância oneway (ANOVA) com pós teste de Tukey.
Para o ensaio de Anexina-V foi utilizado a mesma metodologia estatística que
foi a aplicada ao ensaio de citotoxicidade. No ensaio do Hoechst/IP, pelo tratamento
com nitensidina B nas diferentes concentrações, foram aplicados o teste de análise de
variância oneway (ANOVA) com pós-teste de Tukey.
Para o ensaio do Cometa e o micronúcleo foi utilizada a comparação entre as
concentrações por meio do teste não paramétrico de Kruskal Wallis com pós teste de
Dunn’s. As análises foram realizadas com software GraphPad Prism® Version 5.01
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Para todos os testes estatísticos foi
considerado
o
nível
de
p<0,05
(*p<0,05
**p<0,01
***p<0,001).
4. RESULTADOS
46
4.1- ENSAIO DE CITOTOXICIDADE- MTT
A citotoxicidade da nitensidina B foi avaliada nas concentrações de 0,67 µM,
2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47,0 µM, solubilizadas em meio de cultura nas duas
linhagens celulares (SiHa e C-33A), em dois tempos de tratamento (24 e 48 h) para a
determinação da CI50, concentração capaz de reduzir em 50 % a viabilidade celular.
Foi possível observar um aumento da citotoxicidade proporcionalmente ao
aumento da concentração de nitensidina B nos dois tempos de tratamento e nas duas
linhagens celulares estudadas (Figuras 11 e 12), na qual a exposição das células SiHa e
C-33A por 48 h a nitensidina B ocorreu aumento na citotoxicidade, já nas concentrações
menores as porcentagens de morte celular foram baixas não havendo variação
significante entre elas. A análise estatística foi realizada com o teste oneway ANOVA
com pós-teste de Tukey (Tratados vs CV).
Para a linhagem de células SiHa a concentração inibitória de 50 % das células
foi 28,95 µM por 24 h e 20,96 µM por 48 h. Para a linhagem de células C-33A a CI50 foi
25,78 µM por 24 h e 20,77µM no tempo de 48 h de tratamento.
47
Figura 11- Ensaio de citotoxicidade (MTT). Nitensidina B em linhagem celular Siha
nas concentrações de 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47,0 µM em dois tempos
de tratamento (24 e 48 horas). Os dados referem-se às médias de três experimentos
independentes e erro padrão (M ± EP). CP (controle positivo, doxorrubicina 8,15 µM) e
CV (controle de veículo – DMSO 1%). CI50 nitensidina B - 24 horas: 28,95 µM; IC50
nitensidina B - 48 horas: 20,96 µM. Oneway ANOVA com pós-teste de Tukey
(Tratados vs CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001.
48
Figura 12 - Ensaio de citotoxicidade (MTT). Nitensidina B na linhagem celular C-33A
nas concentrações de 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47,0 µM em dois tempos
de tratamento (24 e 48 horas). Os dados referem-se às médias de três experimentos
independentes e erro padrão (M ± EP). CP (controle positivo, doxorrubicina 8,15 µM) e
CV (controle de veículo – DMSO 1%). CI50 nitensidina B - 24 horas: 25,78 µM; CI50
nitensidina B - 48 horas: 20,96 µM. Oneway ANOVA com pós-teste de bonferroni
(Tratados vs CV). * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001.
4.2- ENSAIOS DE APOPTOSE: ANEXINA V
Com o intuito de avaliar a atividade apoptótica, foi realizado o ensaio de anexina
V por citometria de fluxo nas linhagens SiHa e C-33A tratadas com 0,67; 2,00; 5,00;
16,0 e 47,0 μM de nitensidina B.
Para a realização do experimento, as células foram tratadas por 24 horas. Todos
os dados do ensaio de anexina V por citometria de fluxo referem-se às médias de três
experimentos independentes (média ± erro padrão). CN (controle negativo), CP
(controle positivo, curcumina (30 µM), CV (controle de veículo-DMSO 1%). As
análises estatísticas foram feitas pelo teste one Way ANOVA com pós-teste de Tukey
49
(Tratados vs CV). Sendo a significância representada por * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p <
0,001.
Na linhagem SiHa tratada com nitensidina B observou-se uma elevada indução de
morte celular por apoptose na concentração de 47,0 µM (Figura 13), sendo esta morte,
na maior concentração testada, por apoptose tardia/necrose.
Na linhagem C-33A (Figura 14) foi possível notar uma abrupta diminuição da
taxa de células apoptóticas, tanto por apoptose precoce, quanto na apoptose
tardia/necrose, em todas as concentrações testadas.
Figura 13- Ensaio de apoptose por citometria de fluxo utilizando anexina V conjugada
com FITC e iodeto de propídio. Linhagem SiHa tratada com de 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00
µM, 16,0 µM e 47,0 µM de nitensidina B. Relação entre apoptose precoce e apoptose
tardia em células tratadas com nitensidina B por 24 h .Os dados referem-se às médias de
três experimentos independentes (Média ± Erro Padrão). CN (controle negativo), CP
(controle positivo, curcumina 30 µM), CV (controle de veículo- DMSO1%). one Way
ANOVA com pós-teste de Dunnet (Tratados vs CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p <
0,001.
50
Figura 14- Ensaio de apoptose por citometria de fluxo utilizando anexina V conjugada
com FITC e iodeto de propídio. Linhagem C-33A tratada com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00
µM, 16,0 µM e 47,0 µM de nitensidina B. Relação entre apoptose precoce e apoptose
tardia em células tratadas com nitensidina B por 24 h .Os dados referem-se às médias de
três experimentos independentes (Média ± Erro Padrão). CN (controle negativo), CP
(controle positivo, curcumina 50 µM), CV (controle de veículo- DMSO 1%). One Way
ANOVA com pós-teste de Dunnet (Tratados vs CV). %; * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p <
0,001.
51
4.3- ENSAIO DE APOPTOSE HOESCHT-IODETO DE
PROPÍDIO
O ensaio do Hoechst / iodeto de propídio foi utilizado como ensaio
complementar ao ensaio da anexina V, diferenciando assim, a apoptose precoce, a
apoptose tardia e a necrose, nas linhagens SiHa e C-33A tratadas nas mesmas condições
do ensaio de anexina V.
Todos os dados do ensaio o Hoechst-iodeto de propídio referem-se às médias de
três experimentos independentes (Média ± Erro Padrão). CN (controle negativo), CP
(controle positivo- doxorrubicina 8,15 µM), CV (controle de veículo-DMSO 1%). As
análises estatísticas de variância foram feitas pelo teste One Way ANOVA com pósteste de Tukey (Tratados vs CV). Sendo a significância representada por * p < 0,05 ** p <
0,01 *** p < 0,001.
Houve uma diferença na concentração do controle positivo relacionado ao ensaio
de citotoxicidade devido ao baixo índice de morte celular. Para o controle positivo, no
ensaio do Hoechst / Iodeto de Propídio, a concentração adotada foi de 50 μg/mL.
Os gráficos demonstraram a apoptose por coloração Hoechst / IP em células
SiHa, no tratamento realizado por 24 horas com nitensidina B (Figura 15-A), foi
possível observar um efeito concentração-resposta de aumento de apoptose quando
comparada com a morte por necrose. A partir da análise da diferença entre apoptose
precoce e apoptose tardia (Figura 15-B), observou-se uma maior morte celular por
apoptose tardia nas concentrações testadas.
52
Figura 15: Taxas de apoptose e necrose por coloração Hoechst / IP em células SiHa.
Resultados são expressos como a média de três experimentos independentes e
analisados por one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (tratados vs CV). A) Relação
entre apoptose total e necrose em células tratadas com nitensidina B por 24 h; B)
Relação entre apoptose precoce e apoptose tardia em células tratadas com nitensidina B
53
por 24 h %; CP: doxorrubicina 50 µg/mL, CN: células não tratadas, CV: controle de
veículo DMSO 1%. * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001.
A apoptose avaliada pelo ensaio de Hoechst / IP em células C-33A foram
demonstradas na Figuras 16A e 16B. Ao avaliar o tratamento com nitensidina B na
linhagem C-33A (Figura 16-A), não foi possível observar uma diferença entres os tipos
de morte celular (apoptose total e necrose), exceto na maior concentração utilizada (47,0
μM), no tempo de tratamento de 24 horas, apresentando assim, um número pequeno de
morte celular. Quando foi avaliada a morte celular por apoptose precoce e apoptose
tardia (Figura 16-B), não houve morte celular e, portanto ausência de diferença
significativa em todas as concentrações, com exceção da concentração de 47,0 μM.
54
Figura 16: Taxas de apoptose e necrose por coloração Hoechst / IP em células C-33A.
Resultados foram expressos como a média de três experimentos independentes e
analisados por one-way ANOVA com pós-teste de Tukey (tratados vs CV). A) Relação
entre apoptose total e necrose em células tratadas com nitensidina B por 24 h; B)
Relação entre apoptose precoce e apoptose tardia em células tratadas com nitensidina B
por 24 h. CP: doxorrubicina 50 µg/mL, CN: células não tratadas, CV: controle de
veículo DMSO 1% * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001.
55
4.4- AVALIAÇÃO DA GENOTOXICIDADE - ENSAIO
DO COMETA
Os resultados do ensaio do Cometa para avaliação de genotoxicidade, por meio da
medida de fragmentação do DNA na cauda distante do nucleóide estão demonstrados
nas Figuras 17, 18, 19 e 20. Foram utilizadas as linhagens celulares SiHa e C-33A
tratadas com 0,67; 2,00; 5,00 e 16,0 μM de nitensidina B. Para a realização do
experimento, as células foram tratadas por 6 e 24 horas. Os resultados
estão
apresentados como média ± erro padrão (M±EP) da porcentagem de DNA na cauda. As
análises estatísticas de variância foram feitas pelo teste Kruskal Wallis com pós-teste de
Dunns (Tratados vs CV). Sendo o significância representada por * p < 0,05 ** p < 0,01 ***
p < 0,001 **** p < 0,0001.
Para o tratamento por 6 horas (SiHa) todas as concentrações do alcalóide testadas
apresentaram significância em relação ao controle de veículo, sendo que nas maiores
concentrações (2,00 μM 5,00 μM, 16,0 μM da nitensidina B) esta significância
apresentou-se maior. (Figura 17). Na análise de genotoxicidade da nitensidina B na
linhagem celular SiHa e tratamento por 24 h apresentou efeito concentração-resposta
nas concentrações testadas, quando comparadas ao controle de veículo, que demonstrou
significância em relação ao controle de DMSO 1% nas concentrações de 5,00 e 16,0
μM (Figura 18).
56
% DNA na cauda
50
40
30
***
***
20
***
***
*
10
µM
µM
µM
16
.0
5.
00
0.
67
2.
00
µM
V
C
C
P
0
Figura 17: Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular SiHa tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 6 h.
Resultados são expressos como a média da % de DNA na cauda de 150 células por
concentração e controles analisados por Kruskal-Wallis test com pós-teste de Dunn’s
(tratados vs CV). CP: 1mM de peróxido de hidrogênio por 10 minutos, CV: controle de
veículo- DMSO 1%.* p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001**** p < 0,0001.
% DNA na cauda
50
***
40
***
30
20
**
10
µM
16
.0
µM
5.
00
µM
2.
00
µM
V
0.
67
C
C
P
0
Figura 18 : Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular SiHa tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 24 h.
Resultados são expressos como a média da % de DNA na cauda de 150 células por
concentração e controles e analisados por Kruskal-Wallis test com pós-teste de Dunn’s
(tratados vs CV). CP: 1mM de peróxido de hidrogênio por 10 minutos, CV: controle de
veículo- DMSO 1%.* p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001**** p < 0,0001.
57
Para a avaliação da genotoxicidade no tempo de tratamento por 6 h (C-33A)
todas as concentrações testadas da nitensidina B apresentaram significância em relação
ao controle de veículo. (Figura 19). Na análise de genotoxicidade na linhagem celular
C-33A e tratamento por 24 h, observou-se efeito concentração-resposta nas
concentrações testadas, quando comparadas ao controle de veículo, e genotoxicidade
maior com 5 e 16 μM de nitensidina B nesta condição (Figura 20).
% DNA na cauda
50
40
30
***
20
***
***
***
***
10
µM
16
.0
µM
5.
00
µM
2.
00
µM
V
0.
67
C
C
P
0
Figura 19: Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular C-33A tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 6 h.
Resultados são expressos como a média da % de DNA na cauda de 150 células por
concentração e controles e analisados por Kruskal-Wallis test com pós-teste de Dunn’s
(tratados vs CV). CP: 1mM de peróxido de hidrogênio por 10 minutos, CV: controle de
veículo DMSO 1%, * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 ****p < 0,0001.
58
% DNA na cauda
50
40
***
30
20
***
***
10
µM
16
.0
µM
5.
00
µM
2.
00
µM
V
0.
67
C
C
P
0
Figura 20: Genotoxicidade da nitensidina B representada pela % de DNA na cauda em
linhagem celular C-33A tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM e 16,0 µM por 24 h.
Resultados são expressos como a média da % de DNA na cauda de 150 células por
concentração e controles e analisados por Kruskal-Wallis test com pós-teste de Dunn’s
(tratados vs CV). CP: 1mM de peróxido de hidrogênio por 10 minutos, CV: controle de
veículo DMSO 1%, * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 ****p < 0,0001.
59
4.5- AVALIAÇÃO DA MUTAGENICIDADE - ENSAIO
DO MICRONÚCLEO
A análise dos resultados do ensaio do micronúcleo (figuras 21 e 22) em
linhagem de carcinoma cervical infectada pelo HPV-16 (SiHa) e não infectada pelo
vírus (C-33A), demonstra que não houve diferença significativa entre as concentrações
testadas e o controle de veículo. Esses resultados demonstram que nitensidina B não
induz mutagenicidade nas condições testadas.
% micronúcleos
40
*
30
20
10
µM
µM
47
.0
16
.0
µM
µM
5.
00
µM
2.
00
V
C
0.
67
C
P
0
Figura 21: Mutagenidade da nitensidina B representada pela % de micronúcleos
linhagem celular SiHa tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47 µM por
24 h. Resultados são expressos como a porcentagem de micronúcleos em 1000 células
analisadas por concentração e controles, resultados analisados pelo Kruskal-Wallis teste
com pós-teste de Dunn’s (tratados vs CV). CP: 27 µM de doxorrubicina, CV: controle
de veículo DMSO 1%, * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p < 0,001 ****p < 0,0001.
60
% micronúcleos
40
**
30
20
10
µM
µM
47
.0
16
.0
µM
µM
5.
00
µM
2.
00
V
C
0.
67
C
P
0
Figura 22: Mutagenidade da nitensidina B representada pela % de micronúcleos
linhagem celular C-33A tratadas com 0,67 µM, 2,00 µM, 5,00 µM, 16,0 µM e 47 µM
por 24 h. Resultados são expressos como a média da porcentagem de micronúcleos em
1000 células analisadas por concentração e controles, resultados analisados pelo
Kruskal-Wallis teste com pós-teste de Dunn’s (tratados vs CV). CP: 27 µM de
doxorrubicina, CV: controle de veículo DMSO 1%, * p < 0,05 ** p < 0,01 *** p <
0,001 ****p < 0,0001.
5- DISCUSSÃO
62
O papilomavírus humano (HPV-16) encontra-se relacionado ao câncer cervical e
por estar integrado ao genoma dessas células, contribui para a instabilidade genômica e
conseqüente desenvolvimento de tumores. De acordo com o Ministério da Saúde, o
Brasil apresenta uma das maiores incidências de HPV e esse fato torna a carcinogênese
associado ao vírus um grave problema de saúde pública (Ministério da Saúde, 2011;
ZUR HAUSEN, 2002).
O alto índice de disseminação dessa doença pode estar relacionado ao fato do
HPV se desenvolver de uma forma silenciosa no corpo humano, relacionando-se
também com fatores ambientais e genéticos (MACIAS et al., 2000; LIN et al., 2001;
BOSCH, 2003; STANLEY, 2003; ZUR HAUSEN, 2009; D’ANDRILLI et al., 2010).
Trabalhos demonstram que alcalóides guanidínicos de Pterogyne nytens
possuem um amplo espectro de atividades biológicas, Duarte (2010), relata que dois
alcalóides isolados da planta, pteroginina e pteroginidina, possuem atividade citotóxica
e apoptótica em linhagem de células de câncer de mama (ZR-7531), ainda outro
alcalóide isolado de Pterogyne nytens, análogo da nitensidina B, denominado
nitensidina A, apresentou citotoxicidade nas linhagens de células SiHa e C-33A, além
de morte ocasionada por apoptose e danos genotóxicos nas linhagens celulares
estudadas, ainda em experimentos in vivo realizados com nude BALB/c, com implante
xenográfico de tumor com células infectadas por HPV-16 (SiHa) (SORBO, 2010).
Dos resultados de citotoxicidade pode-se observar que a nitensidina B induziu
citotoxicidade proporcionalmente ao aumento da concentração nos dois tempos de
tratamento, 24 e 48 horas, e nas duas linhagens celulares estudadas, sendo esta maior
no tratamento por 48 horas. Cao et. al., 2009 observou citotoxicidade de um isolado
polissacarídeo derivado de Angelica sinenses
em células de carcinoma cervical
humano, outros estudos realizados berberina e ácido ganodérico T, demonstraram
citotoxicidade as células de carcinoma cervical humano (HeLa), ( LU, 2010, LIU,
2011).
No presente estudo foram realizados experimentos para a avaliação de morte
celular por apoptose ou necrose, nas linhagens de carcinoma cervical SiHa e C-33A, o
que se pode verificar, pelo ensaio de anexina V por citometria de fluxo e pelo método
de exclusão de fluorocromos, é que na linhagem de células infectadas pelo HPV-16
(SiHa) na maior concentração testada, houve morte das células por apoptose tardia,
entretanto para a linhagem não infectada pelo vírus (C-33A), pelos métodos usados, não
63
houve apoptose, sugerindo possível seletividade da nitendidina B frente as linhagens
infectadas por HPV.
A inibição da proliferação celular apresenta-se claramente associada com a
indução de apoptose, em estudos realizados utilizando substância witaferina A de
Withania somnifera, onde se observou por meio do teste de anexina V, na linhagem
CasKi (HPV positiva) que houve morte celular por apoptose em 24 horas. Neste estudo,
onde quatro linhagens de câncer cervical foram testadas (CasKi, HeLa, SiHa e C-33A),
a witaferina A inibiu a proliferação celular, deixando claro que a seletividade da lactona
esteroidal sobre as oncoproteínas E6 e E7 do HPV exercem profundo efeito na
supressão das proteínas do tumor, acelerando a degradação da ubiquitinização
(MUNAGALA, et al 2011). No estudo de Munagala et al. (2011) houve um diminuição
da expressão da proteína E6 em todas as linhagens HPVs positivas e subseqüente
aumento nos níveis de p53 e P21cip1/waf1, de forma concentração dependente determinada
pelo Western Blot, sendo que na linhagem celular C-33A os níveis de p53 mutante
permaneceram constantes e a expressão de P21cip1/waf1 aumentou. Portanto, esses dados
sugerem que a witaferina A reprimiu a oncoproteína E6 e favoreceu a modulação da p53
que é efetor da molécula P21cip1/waf1 sugerindo a apoptose nessas células (MUNAGALA,
et al 2011).
Estudos com jasmonato de metila demonstraram, por meio de testes como o
ensaio de anexina V e a verificação dos níveis protéicos por Western Blot, a indução de
apoptose precoce em maior quantidade na linhagem SiHa, quando comparada com
outras linhagens tumorais (C33A, Caski, HeLa), sem apresentar diferença entre os
tempos de tratamento, alternados entre 24 e 48 h. Essa substância afetou diretamente a
expressão de p53 nos diferentes alvos, sendo que na linhagem CasKi o nível foi
aumentado, em HeLa e SiHa houve diminuição e em C33A não houve alteração
(KNIAZHANSKI et al, 2008). No estudo de Kniazhanski e colaboradores, a diminuição
observada nos níveis de expressão de p21 poderiam explicar a indução de apoptose em
SiHa e HeLa, e os baixos níveis de p21 em C-33A poderiam ser responsáveis pela
indução nessas células, sugerindo que o jasmonato de metila foi eficaz contra linhagens
de câncer cervical, sendo capaz de induzir mortes celulares características de apoptose e
necrose independentemente do status do HPV e da p53.
Com a finalidade de avaliar a genotoxicidade da nitensidina B, estudos indicam
que diferentes metabólitos secundários, tais como flavonóides e alcalóides, podem ser
potencialmente genotóxicos (SCHMITTA et al., 2003).
64
Os mecanismos envolvidos que explicam a clastogenecidade e/ou interação com
o DNA não estão totalmente elucidados, o dano ao DNA, tanto por agentes químicos
como físicos, pode ser avaliado em vários tipos celulares por meio de análises
citogenéticas (aberrações cromossômicas, troca entre cromátides irmãs, formação de
micronúcleo) e bioquímicas (teste do cometa). Para a avaliação dos níveis de dano no
DNA, existem algumas técnicas disponíveis. A eletroforese de células isoladas (ensaio
do cometa), por exemplo, de células epiteliais humanas, nos permite avaliar o índice de
danos no DNA. É uma técnica simples, rápida e não requer altos investimentos com
equipamentos analíticos. Os cometas podem ser classificados por imagem
computacional em diversas categorias, com base no comprimento de migração e na
proporção relativa de DNA na cauda, atribuindo-se características a cada classe de
migração (COSTA et al., 2001).
O dano ao DNA, no ensaio do cometa pode ser induzido por fármacos, radiações
e substâncias inorgânicas. A exposição do DNA ao estresse oxidativo leva a mais de 20
diferentes tipos de danos, produzindo bases nitrogenadas oxidadas (COSTA et al.,
2001). O dano mais comum às purinas é a formação do produto oxidado 8-oxo-dG, o
qual é usado para avaliação de ensaios ao DNA (BARZILAI & YAMAMOTO 2004).
Dessa maneira faz-se necessária a utilização dos testes do cometa e do micronúcleo,
para avaliar a atividade genotóxica e mutagênica, respectivamente, da nitensidina B,
pois no presente estudo, por meio do ensaio do cometa, a substância demonstrou ser um
agente genotóxico. Para os dois tempos de tratamento propostos, houve genotoxicidade
nas duas linhagens de carcinoma cervical, na exposição de nitensidina B por 6 horas
observou-se taxas significantes de dano no DNA, representada pela porcentagem de
DNA na cauda da célula com 2,00 μM, 5,00 μM e 16,0 μM da nitensidina B em ambas
linhagens celulares de carcinoma cervical. Para o tratamento com 24 horas essa
genotoxicidade apresentou-se menor, com destaque para as concentrações de 5,00 μM e
16,0 μM.
Um estudo com o alcalóide sanguinarina relata que este, possui propriedades
antimicrobianas e possivelmente antineoplásicas, mas não é elucidado até que ponto
essas atividades envolvem danos no DNA, assim foi medida a capacidade da
sanguinarina de promover quebras no DNA em células de câncer de colo de útero com a
proteína p53 normal e outra linhagem de câncer de colo de útero com a p53 mutada,
notou-se que não houve seletividade na taxa de genotoxicidade entre as linhagens, o
65
que se considera, é que o possível mecanismo de morte destas células é independente de
p53 (MATKAR, 2008).
Os resultados do presente estudo permitem inferir que nitensidina B exibe
atividade citotóxica e genotóxica concentração-dependente nas duas linhagens de
células estudadas e atividade apoptótica em linhagem de células infectadas por HPV-16
(SiHa), porém a nitensidina B não exibiu atividade mutagênica, esta não aumentou a
frequência de micronúcleos nas linhagens de células testadas em relação a frequência de
micronúcleos do controle de veículo (Figuras 21 e 22). Esses resultados não corroboram
com os apresentados por Ferreira et al (2009), na qual demonstra que fração butanólica
e hidroalcoólica de P. nitens apresentaram ação mutagênica. No estudo realizado por
Sorbo (2011), foi constatado que a nitensidina A, análogo similar da nitensidina B,
apresentou citotoxicidade nas linhagens de células SiHa e C-33A, além de morte
ocasionada por apoptose nas linhagens celulares estudadas, ainda em experimentos in
vivo realizados com nude BALB/c, com implante xenográfico de tumor com células
infectadas por HPV-16 (SiHa), foi observado que a nitensidina A foi genotóxica
(sangue caudal dos camundongos), mas não foi mutagênico (células da medula óssea
dos camundongos), corroborando assim com os dados do presente estudo (SORBO,
2011).
6- CONCLUSÕES
67
O alcalóide guanidínico nitensidina B, extraído de Pterogyne nitens, apresentou
citotoxicidade concentração-resposta nas linhagens de carcinoma cervical imortalizadas
pelo HPV-16 (SiHa) e não imortalizadas (C-33A).
A morte celular na linhagem de células SiHa demonstrou ser por apoptose tardia
o que não se verificou para a linhagem não imortalizada pelo vírus (C-33A), nas
condições testadas.
A avaliação de genotoxicidade pelo ensaio do Cometa, demonstrou que o tratamento
com nitensidina B ocasionou danos genotóxicos nas linhagens de carcinoma cervical
imortalizadas pelo HPV-16 (SiHa) e não imortalizadas (C-33A), nos tempos de 6 e 24
horas de tratamento.
Por fim, a nitensidina B não induziu mutagenicidade (ensaio do micronúcleo) em
nenhuma das linhagens de carcinoma cervical humano estudadas, nas condições
testadas.
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