R E V I S TA P O R T U G U E S A
RPCV (2008) 103 (565-566) 47-52
DE
CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Apoptose na nefropatia da leptospirose em ovinos
Apoptosis in nephropathy of the leptospirosis in ovine
Carvalho S.M. , Macedo N.A. , Silva S.M.M.S. , Quessada A.M. , Mineiro A.L.B.B. , Costa F.A.L. *
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2
2
1
2
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CCA-UFPI
Departamento de Clínica e Cirurgia Veterinária, Centro de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Piauí – Campus da Socopo – 64049-550- Teresina, PI
2
Resumo: Leptospirose é uma zoonose amplamente distribuída
em todo o mundo, mas pouco sabemos sobre as alterações
histopatológicas e a patogênese da nefropatia nos animais
domésticos, principalmente nos ovinos. Neste estudo foram
analisadas 34 amostras de rim de ovinos seropositivos após
exposição natural a L. interrogans e cinco controles seronegativos,
para detecção de apoptose, pelo método de ApopTag Peroxidase
In Situ. A análise histopatológica revelou nefrite intersticial em
33 (97,05%) animais seropositivos. Lesões tubulares foram
observadas em 20 (58,82%). Havia presença de cilindros hialinos,
degeneração de células epiteliais, desprendimento de células
para o lume tubular, necrose de membrana basal tubular, atrofia
tubular e degeneração hialina goticular. Foi observada a presença
de leptospiras nos túbulos em oito animais seropositivos
(23,52%). Apoptose foi detectada em células epiteliais tubulares
da região cortical e medular em 30 (88,23%) animais seropositivos
e somente na medular em 4 dos cinco animais, sem infecção, de
intensidade mínima. A presença de apoptose foi significantemente maior nas regiões cortical (p = 0,035) e medular (p = 0,004)
nos animais seropositivos comparado com os seronegativos.
Apoptose foi observada em células epiteliais tubulares de
ovinos naturalmente infectados por leptospiras, na presença de
alterações inflamatórias intersticiais.
ApopTag Peroxidase In Situ. The histopathological analysis
showed interstitial nephritis in 33 (97.05%) seropositive
animals. Tubular lesions were observed in 20 (58.82%) infected
animals. There was presence of hyaline cylinders, degeneration
of epithelial cells, detachment of cells to the tubular lumen,
necrosis of tubular basement membrane, tubular atrophy and
hyaline droplet degeneration in seropositive animals. The
presence of leptospira in the tubules was observed in eight
(23.52%) infected animals. Apoptosis was observed in tubular
epithelial cells of the cortical and medullary region in 30
(88.23%) infected animals and only in the medullary region in
four seronegative animals. The presence of apoptosis was
significantly greater in the cortical (p = 0.035) and medullary
(p = 0.004) region in seropositive compared with seronegative
animals. Apoptosis was observed in tubular epithelial cells
of naturally infected ovines in the presence of interstitial
inflammatory alterations.
Palavras-chave: Leptospira, rim, morte celular, pequeno
ruminante.
Introdução
Summary: Leptospirosis is a widely distributed zoonosis in the
whole world, but few know on the histopathologic alterations
and pathogenesis of the nephropathy in the domestic animals,
mainly in ovines. In this study 34 samples of kidney of seropositive ovines naturally exposed to L. interrogans were analyzed
and five seronegative controls, for detection of apoptosis, using
*Correspondência: [email protected]
Tel: + 55 (86) 3215-5760
Keywords: Leptospira, cell death, kidney, small ruminant.
Leptospirose é uma zoonose amplamente difundida
em todo o mundo, constituindo sério problema de
saúde pública. O homem e animais podem se infectar
a partir do ambiente contaminado ou do contato direto
com urina de outros portadores (Farr, 1995). O homem
é bastante sensível à infecção, mas ovinos são mais
resistentes com manifestações clínicas inaparentes
(Ellis, 1994).
Durante a fase de bacteremia, leptospiras virulentas
disseminam-se por via sanguínea para colonizar os
rins (Levett, 2001), onde se multiplicam, provocando
lesões túbulo-intersticiais (Scanziani et al., 1989),
consideradas alterações patológicas básicas da doença
(Maxie, 1993), de onde são eliminadas pela urina
(Plank e Dean, 2000).
As alterações renais na leptospirose parecem estar
relacionadas a diversos antígenos de membrana, como
lipopolissacarídeos (LPS), peptideoglicanos, hialuro47
Carvalho SM et al.
nidases, fosfolipases e glicoproteínas (Yang et al.,
2001; Sitprija et al., 2003). Leptospiras patogênicas se
movimentam em espiral (Baranton, 1995) e aderem ás
células epiteliais tubulares renais por meio das
lipoproteínas Lip 41, LipL 36 e LPS (Dobrina et al.,
1995). Assim, fatores a serem considerados no desencadeamento de injúria renal na leptospirose, envolvem
a ação direta da bactéria sobre o tecido renal (Barnett
et al., 1999; Yang et al., 2002), a ação de antígenos de
membrana, a infiltração celular ou a ativação do
sistema imune humoral e celular (Costa et al., 1981;
Abdulkader et al., 2002; Dorigatti et al., 2005).
Entretanto, o mecanismo preciso de lesão renal na
infecção por leptospiras ainda não está claramente
definido (Sitprija et al., 1980).
A participação de apoptose no mecanismo de lesão
é um evento bem conhecido em vários processos
patológicos renais (Wong et al., 2001). A morte
celular por apoptose regula o número de células
durante indução e resolução de injúria renal (Savill,
1994; Ortiz et al., 2002).
Vários fatores estão envolvidos em morte de células
túbulo-intersticiais do rim por apoptose. Estudo em
rato "Lewis" mostrou que BSA (albumina sérica
bovina) injetada intraperitonealmente induz apoptose
de células epiteliais de túbulos proximais, o que
permite uma relação direta entre proteinúria e lesão
túbulo-intersticial (Thomas et al., 1999). Apoptose de
células epiteliais tubulares mediada por macrófagos é
observada também em casos de nefrite nefrotóxica em
camundongos (Tesch et al., 1999). Na falha renal
aguda isquêmica em ratos, apoptose observada três
dias após injúria, é responsável pela perda de células
tubulares (Jo et al., 2001).
Assim, pela análise da literatura pertinente, nenhum
estudo foi ainda realizado sobre a participação de
apoptose na nefropatia da lesão renal na leptospirose,
nem no homem nem em qualquer outra espécie animal
e, particularmente, em ovinos naturalmente infectados
por Leptospira interrogans.
Este trabalho tem como objetivo detectar a presença
de apoptose e avaliar a sua participação na indução de
lesões renais em ovinos naturalmente infectados por
Leptospira interrogans.
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Dos 34 animais reagentes sorologicamente para
leptospira, fragmentos de rim foram colhidos, fixados
em formol neutro a 10%, tamponado com fosfato, 0,01
M pH 7,4 (formol tamponado), incluídos em parafina e
os cortes corados para análise histopatológica.
Lâminas também foram tratadas com adesivo Silane
A174 (Pharmacia, USA) para detecção de apoptose. O
grupo controle foi constituído de 5 animais negativos
para leptospirose.
Detecção de Apoptose In Situ
Apoptose foi detectada por meio do kit apopTag
Peroxidase In Situ (Chemicon International) segundo
protocolo recomendado pelo fabricante. Os cortes
foram desparafinados com xilol e posteriormente
hidratados em concentrações decrescentes de álcool
etílico. Em seguida, as lâminas foram incubadas com
proteinase K (20 µl/ml; Invitrogen Life Technologies),
durante 15 minutos. O bloqueio de peroxidase endógena foi realizado com peróxido de hidrogênio a 3% em
PBS, por 30 minutos. Após lavagem das lâminas em
PBS, foi feita incubação com Equilibration buffer por
10 segundos em temperatura ambiente. Os cortes
foram então incubados em câmera úmida a 37ºC com
solução contendo Terminal Deoxinucleotidil Transferase
(TDT) durante 60 minutos. A reação foi interrompida
pela imersão dos cortes no tampão stop/wash por 10
minutos em repouso. Após lavagem em PBS, foram
incubados com conjugado anti-digoxigenina por 30
minutos e feita lavagem em PBS por 8 minutos. A
revelação da reação foi realizada com solução de 3,3’diaminobenzidine tetrahidrocloride (Sigma) e a
contracoloração, com hematoxilina de Harrys. As
lâminas foram montadas com entelan para análise em
microscópio de luz. Como controle positivo, foi
utilizado tecido mamário de uma fêmea normal de
roedor, em que ocorre apoptose extensiva 3 a 5 dias
após o desmame. Como controle negativo, foi omitida
a enzima TdT na reação, conforme recomendação do
fabricante.
A intensidade de apoptose foi mensurada
semi-quantitativamente, numa escala de 0 a 5 em
que 0 = normal, 1 = mínima, 2 = média, 3 = moderada,
4 = moderadamente severa, 5 = severa.
Análise estatística
Material e métodos
Animais e colheita das amostras
Foram submetidos à pesquisa de anticorpos
anti-leptospira por teste de soroaglutinação microscópica (SAM), 119 ovinos, ambos os sexos, adultos,
provenientes de diversos municípios do Estado do
Piauí (Brasil), abatidos para consumo em feiras livres,
no período de junho de 2003 a março de 2004.
48
Os resultados semi-quantitativos foram analisados
no programa estatístico Sigma Stat. Os seguintes
testes não-paramétricos foram empregados: a) método
de Kruskal-Wallis para análise de variância. Havendo
diferença significante aplicava-se o teste de StudentNewman-Keuls para comparação múltipla de grupos.
b) método de Mann-Whitney para comparação entre
dois grupos. Adotou-se o nível de significância de
0,05.
Carvalho SM et al.
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Figura 1 - Rim de ovino seropositivo naturalmente exposto a L.
interrogans. Infiltrado inflamatório intersticial de células
mononucleares (setas). H-E. 140x.
Figura 2 - Rim de ovino seropositivo naturalmente exposto a L.
interrogans. Presença de cilindros hialinos nos túbulos proximais (setas). PAS. 140x.
Figura 3 - Rim de ovino seropositivo naturalmente exposto a L.
interrogans. Atrofia tubular (setas). PAS. 140X.
Figura 4 - Rim de ovino seropositivo naturalmente exposto a L.
interrogans. Presença de leptospiras (seta) aderidas ao epitélio
do túbulo proximal, em forma de aglomerados. Warthin Starry.
350x.
Resultados
glomerulares discretas caracterizadas predominantemente por proliferação de células mesangiais nos
animais seropositivos. Leptospiras foram observadas
em túbulos de oito animais seropositivos (23,52%).
Estas formavam aglomerados (Figura 4) ou
apresentavam-se em formas únicas aderidas ao
epitélio ou livres no lume tubular, com a característica
conformação espiralada e coloração enegrecida
conferida pela técnica de Warthin Starry.
Núcleos de células apoptóticas foram facilmente
identificados pela coloração marrom, conferida pela
técnica imuno-histoquímica empregada. Células
A análise histopatológica revelou nefrite intersticial
de células mononucleares (Figura 1) em 33 (97,05%)
animais seropositivos e em quatro animais seronegativos. Alterações tubulares foram observadas em 20
(58,82%) animais seropositivos. Havia presença de
cilindros hialinos nos túbulos da região cortical
(Figura 2), degeneração de células epiteliais,
desprendimento de células para o lume tubular,
necrose de membrana basal tubular, atrofia tubular
(Figura 3), degeneração hialina goticular e lesões
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Carvalho SM et al.
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Figura 5 - Rim de ovino com presença de apoptose. Método de ApopTag Peroxidase. A - Apoptose de células epiteliais tubulares na
região cortical, em rim de ovino seropositivo após exposição natural a L. interrogans. Intensidade Média (escore 2). B - Apoptose de
células epiteliais tubulares na região medular, em rim de ovino seropositivo após exposição natural a L.
interrogans. Intensidade severa (escore 5). C - Apoptose em célula glomerular, em rim de ovino seropositivo após exposição natural
a L. interrogans. Intensidade Mínima (escore 1). D - Apoptose de célula epitelial na região medular de ovino
controle seronegativo. Todas as fotografias foram realizadas usando a objetiva 140x, exceto no item 3B onde se utilizou a objetiva
70x.
epiteliais tubulares em apoptose estavam presentes em
30 amostras (88,23%) de rim de animais seropositivos
incluindo o glomérulo, de intensidade variando de
mínima a severa (Figura 5A, B, C). Nos animais
controles seronegativos, apoptose estava presente
apenas na região medular em quatro dos cinco animais
e era de intensidade mínima (Figura 5D).
Em sua maioria, células em apoptose estavam
aderidas à membrana basal tubular, mas também eram
observadas livres no lume dos túbulos. Verificou-se
que células em apoptose eram significantemente
maior na cortical (p = 0,035, Mann-Whitney)
(Figura 6) e medular (p = 0,004, Mann-Whitney)
(Figura 7) nos animais seropositivos quando comparados aos seronegativos.
A presença de células apoptóticas nos animais
seropositivos era significantemente maior em células
epiteliais de túbulos da região medular (p = 0,0001,
Teste de Kruskal Wallis, Student-Newman-Keuls)
quando comparada às células de túbulos da região cortical e células do glomérulo (Figura 8).
50
Figura 6 - Análise semi-quantitativa da presença de apoptose na
região cortical (mediana de escores e intervalo entre percentis
25 e 75) em ovinos seropositivos a L. interrogans e controles
não seropositivos. N = Nº de animais por grupo. * p = 0,035
em relação ao grupo controle não infectado (Teste de MannWhitney).
Carvalho SM et al.
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Figura 7 - Análise semi-quantitativa da presença de apoptose na
região medular (mediana de escores e intervalo entre percentis
25 e 75) em ovinos seropositivos a L. interrogans e controle
seronegativos. N = No de animais por grupo. * p = 0,004 em
relação ao grupo controle (Teste de Mann-Whitney).
Figura 8 - Análise semi-quantitativa da presença de apoptose
(mediana de escores e intervalo entre percentis 25 e 75) em
ovinos seropositivos a L. interrogans em diferentes regiões do
rim. N = No de animais por grupo. * p = 0,001 em relação a
cortical (teste de Kruskall Wallis, Student-Newman-Keuls).
Discussão
epiteliais tubulares renais em hospedeiro naturalmente
infectado por L. interrogans.
A detecção de apoptose nos animais seropositivos
foi significantemente maior nas células epiteliais
tubulares da região medular, comparada às células da
região cortical e do glomérulo. Em outros processos
patológicos renais, como insuficiência renal aguda (Jo
et al., 2001) e na injúria isquêmica experimental em
ratos (Oberbauer et al., 2001) apoptose, também, foi
mais evidente em células epiteliais da região medular.
Na infecção por leptospiras é observada diminuição
do fluxo sanguíneo renal (De Brito et al., 1979; Yang
et al., 2001), provocado, provavelmente, pelo agente
na microcirculação. Assim, o dano vascular pode
causar isquemia renal e lesão tubular (Pereira et al.,
1997) e propiciar condições adequadas para indução
de morte por apoptose (Ortiz et al., 2000), principalmente, em células da região medular onde o fluxo
sanguíneo naturalmente já é menor (Tisher e Brenner,
1994; Osborne e Fletcher, 1995). Embora a lesão básica da leptospirose se localize nos túbulos proximais,
verificou-se que apoptose era menos intensa nessa
região do que em túbulos coletores, provavelmente
pelo aumento do déficit sanguíneo devido à injúria
renal.
No presente estudo verificou-se que apoptose de
células glomerulares foi encontrada em apenas
4 (11,76%) animais seropositivos, com intensidade
mínima, ratificando, assim, que lesões glomerulares
na leptospirose são de baixa expressão (Sitprija et al.,
1980; Marinho et al., 2003).
Os resultados deste trabalho mostram, pela primeira
vez, que apoptose está presente em rim de ovinos
seropositivos naturalmente expostos a Leptospira
A regulação do fenômeno de apoptose é essencial
para a nefrogênese e manutenção da função renal
normal no indivíduo adulto. No rim sadio completamente desenvolvido, apoptose ocorre em baixa
freqüência, sendo difícil sua detecção devido ao
rápido clareamento (Maderna e Godson, 2003), mas
pode aumentar como resultado de um processo
patológico (Sorenson, 1998). Apoptose é evidente nos
rins em casos de cisto renal, inflamação intersticial e
glomerulonefrite, cicatrização e esclerose renal
(Menè e Amore, 1998), tendo grande importância na
regulação do número de células durante a indução e
resolução de uma lesão (Ortiz et al., 2000).
A detecção de apoptose nos animais deste estudo foi
significantemente maior em células epiteliais de
túbulos da região cortical (p = 0,035) e medular
(p = 0,004), nos animais seropositivos, quando
comparado aos animais seronegativos, revelando que
a lesão renal por apoptose ocorre no local preferencial
de colonização por leptospiras, as células epiteliais
tubulares (Barnett et al., 1999; Sambasiva et al.,
2003). Além disso, nos animais seronegativos, a
apoptose só foi observada em células epiteliais da
região medular, em intensidade mínima. Estes dados
em conjunto sugerem que apoptose participa do
processo de lesão de células epiteliais dos túbulos
proximais na leptospirose em ovinos. Estudos in vitro
sobre apoptose causada por L. interrogans revelam sua
ocorrência somente em macrófagos (Merien et al.,
1997) e hepatócitos de cobaias (Merien et al., 1998).
Assim, dentro do que se conhece até o momento, este
parece ser o primeiro registro de apoptose em células
51
Carvalho SM et al.
interrogans, com ação primária sobre células epiteliais
tubulares, na presença de alterações inflamatórias
intersticiais.
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