ANÁLISE QUANTITATIVA DO RNA MENSAGEIRO DOS
RECEPTORES DE DOPAMINA EM ADENOMAS HIPOFISÁRIOS
CLINICAMENTE NÃO FUNCIONANTES E EM HIPÓFISES HUMANAS
NORMAIS
Evelyn de Oliveira Machado
Dissertação de mestrado apresentada
ao programa de Pós-Graduação em
Medicina, área de concentração em
Endocrinologia, da Universidade
Federal do Rio de Janeiro, como parte
dos requisitos necessários para a
obtenção do título de mestre em
Endocrinologia.
Orientadora:
Profa. Dra. Mônica Roberto Gadelha
2007
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Faculdade de Medicina
Curso de Pós-Graduação em Endocrinologia
ANÁLISE QUANTITATIVA DO RNA MENSAGEIRO DOS RECEPTORES DE
DOPAMINA EM ADENOMAS HIPOFISÁRIOS CLINICAMENTE NÃO
FUNCIONANTES E EM HIPÓFISES HUMANAS NORMAIS
Evelyn de Oliveira Machado
Orientadora:
Profa. Dra. Mônica Roberto Gadelha
Banca examinadora:
Profa.Dra.
Prof.Dr.
Profa. Dra.
2
Ficha Catalográfica
Machado, Evelyn de Oliveira
Análise quantitativa do RNA mensageiro dos receptores de dopamina em
adenomas não funcionantes e em hipófises humanas normais / Evelyn de
Oliveira Machado. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina, 2007.
xx, 106 f. : il. ; 31 cm
Orientador: Mônica Roberto Gadelha
Dissertação (mestrado) -- UFRJ, Faculdade de Medicina, Programa
de Pós-graduação em Medicina, 2007.
Referências bibliográficas: f. 85-106
1. Agonistas de dopamina. 2. Receptores dopaminérgicos química.
3. Adenoma - patologia. 4. Adenohipófise. 5.
Reação em cadeia da polimerase via transcriptase reversa - métodos. 6.
RNA mensageiro.
7. Análise quantitativa. 8. Endocrinologia - Tese. I.
Gadelha, Mônica Roberto. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Medicina. III.
Título.
3
“Aprender é a única coisa de que a mente nunca se cansa, nunca tem
medo e nunca se arrepende.”
(Leonardo da Vinci)
4
Dedicatória
À minha querida e preciosa filha Júlia, que há quatro meses, trouxe tanta
luz e alegria para minha vida, que não imagino prosseguir esta caminhada sem
seu amor.
Aos meus pais, Paulo e Sônia, por terem feito por mim o possível e o
impossível, sempre. Que estiveram ao meu lado me apoiando e me ensinando
para que eu me tornasse uma pessoa de princípios.
Ao meu marido Fabrício, pelo amor sempre presente, que há 10 anos
compartilha comigo todos os momentos de sonhos e conquistas.
5
Agradecimentos
- A Deus, pois sem ele, com certeza este estudo não teria se concretizado.
- Às minhas irmãs Ellen e Erika pela confiança e incentivo em todos os
momentos.
- A minha querida sobrinha Maria Eduarda pelos momentos de alegria.
- Aos meus avós Íris e Octacílio pelo eterno amor.
- À minha orientadora, Profa. Mônica Roberto Gadelha, um exemplo a seguir de
determinação e competência. Agradeço por jamais ter deixado de confiar e
investir em mim, mesmo com a minha gravidez inesperada. Muito obrigado pela
amizade e compreensão durante a chegada da minha filha.
- Ao corpo docente do serviço de Endocrinologia, por ter me acolhido e me
tratado com respeito em todos momentos.
- Aos colaboradores Raul Luque e Profa. Rhonda Kineman da Universidade de
IIIinois – Chicago, com os quais fiz uma grande amizade, pelos ensinamentos e
ajuda na realização da técnica de RT- PCR quantitativa em tempo real.
- Às professoras Doris Rosenthal e Denise Pires de Carvalho por terem deixado
disposição o Laboratório de Fisiologia Endócrina e possibilitado a realização de
parte deste projeto.
- Ao serviço de Neurocirurgia do HUCFF – UFRJ, em especial, o professor Dr.
Jorge Marcondes, pela colaboração na coleta dos tumores.
6
- À amiga Giselle Fernandes Taboada pelo companheirismo e ajuda
incondicional na realização deste projeto.
- Ao amigo Leonardo Vieira Neto, que aceitou o desafio de fazer uma viagem
internacional com uma gestante de seis meses, sempre me apoiando e
preocupado com o meu bem estar. Obrigado pelas sugestões que com certeza
aprimoraram este estudo.
- Ao nosso grupo de neuroendocrinologia, Alessandra Cassini, Cíntia Marques,
Flavia Regina, Giovanna Balarini e Lívia Lugarinho pela ajuda sempre
disponível.
- À amiga Fabiana Saldanha pela nossa amizade ontem, hoje e sempre.
- A Nádia Queiroz, secretária do serviço de Endocrinologia, sempre disponível.
- Às alunas da faculdade de Medicina Aline Pegas e Ada Rúbia pelo auxílio
neste trabalho.
- À Claudia Roxo, minha secretária e amiga, cuja ajuda foi fundamental.
- Aos pacientes pela confiança depositada. Pois sem eles este trabalho não
seria possível.
7
Resumo
Análise quantitativa do RNA mensageiro dos receptores de dopamina em
adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes e em hipófises
humanas normais
Evelyn de Oliveira Machado; Mônica Roberto Gadelha
A abordagem inicial dos adenomas clinicamente não funcionantes (ACNF)
é a remoção cirúrgica do tumor, para aliviar os efeitos de massa sobre as
estruturas adjacentes, principalmente o quiasma óptico. Entretanto, devido ao
seu tamanho, a cirurgia não é curativa em alguns casos. Nestes pacientes, o
tratamento com agonistas dopaminérgicos (AD) pode ser uma opção. O objetivo
deste estudo foi avaliar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) dos
receptores dopaminérgicos em ACNF e hipófises humanas normais por RT-PCR
quantitativa em tempo real.
Foram incluídos 30 tumores de pacientes portadores de ACNF (16
homens, 54%) e oito hipófises normais obtidas durante autópsias (5 homens,
62%). O receptor mais freqüentemente expresso nos ACNF [mediana (mínimo e
máximo)] foi o D2 total [13383 (109-184767)], seguido do D4 [555 (55-11767)],
D1 [77 (0-910)], D5 [28 (0-701)]. O número de cópias da isoforma longa de D2
foi de 5952 (0-28342) e a relação D2 longo/D2 total foi de 0,38.
Em hipófises humanas normais, o receptor mais freqüentemente
expresso também foi o receptor D2 total [29865 (4709-81606)], seguido do D4
[2335 (1149-8231)], D5 [407 (50-3335)], D1 [160 (0-674)]. O número de cópias
8
da isoforma longa de D2 foi de 12591 (1758-25208) e a relação D2 longo/D2
total foi de 0,36. Não foi observada expressão do receptor D3.
Hipófises humanas normais apresentaram maior expressão do receptor
D4 (p=0,041) e do receptor D5 (p= 0,001) em relação aos ACNF.
Em conclusão, o fato de que todos os ACNF expressarem o receptor D2,
com o predomínio da isoforma curta deste receptor em 72% dos casos, reforça a
possibilidade do emprego dos AD como terapia complementar no tratamento
desses tumores.
Unitermos: receptores dopaminérgicos, adenomas hipofisários clinicamente não
funcionantes, hipófises humanas normais.
9
Abstract
Quantitative analysis of messenger RNA for dopamine receptors in
clinically nonfunctioning pituitary adenomas and normal human pituitaries
Evelyn de Oliveira Machado; Mônica Roberto Gadelha
The initial approach of clinically nonfunctioning pituitary adenomas
(CNPA) is surgical removal of the tumor, to relieve mass effects on adjacent
structures, principally the optic chiasm. However, owing to their size, surgery
alone is not curative in some cases. In these patients, treatment with dopamine
agonists can be an option. The goal of this study was to evaluate the expression
of dopamine receptors D1, total D2, D2 long isoform (D2L), D3, D4 and D5 in
CNPA and normal human pituitary by real time RT- PCR.
Thirty tumors of patients with CNPA (16 men, 54%) and eight normal
human pituitaries obtained during autopsy (5 men, 62%) were included in the
study.
The most expressed receptor in CNPA [median (min-max)] was total D2
[13383 (109-184767)], followed by D4 [555 (55-11767)], D1 [77 (0-910)], D5 [28
(0-701)]. The D2 long isoform copies number was 5952 (0-28342) and the D2
long/D2 total ratio was 0.38.
In normal pituitaries, the most expressed was also total D2 [29865 (470981606)], followed by D4 [2335 (1149-8231)], D5 [407 (50-3335)], D1 [160 (0674)]. The D2 long isoform copies number was 12591 (1758-25208) and the D2
long/D2 total ratio was 0.36. Expression of the D3 receptor was not observed in
10
this group. Normal human pituitaries have higher D4 receptor (p=0,041) and D5
receptor (p=0,001) expression.
In conclusion, the fact of all CNPA expressed D2 receptor with the
majority of the short isoform of this receptor in 72% of the cases; support the
possibility of using DA as a complementary therapy in the treatment of these
tumors.
Key words: Dopamine receptors, clinically nonfunctioning pituitary adenomas,
normal human pituitaries.
11
Lista de Abreviações
ACNF: Adenoma clinicamente não funcionantes.
ACTH: Adrenocorticotropic hormone – hormônio adrenocorticotrófico.
AD: Agonista dopaminérgico.
ADC: Adenilato ciclase
AMPc: Adenosina monofostato cíclico.
BLAST: Basic Local Alignment Search Toll.
BRC: Bromocriptina.
CAB: Cabergolina.
CEP: Comitê de Ética e Pesquisa.
COMT: Catecolamina-o-methyltransferase.
CONEP: Comissão Nacional de Ética em Pesquisa.
ct: threshold cycle.
D2L: D2 long- D2 longo.
D2S: D2 short- D2 curto.
DAG: Diacilglicerol.
DR: Receptores dopaminérgicos.
EGF: Epidermal growth factor – fator de crescimento da epiderme.
ERK: Extracellular-signal regulated kinase – quinase regulada por sinal
extracelular.
FN: Fator de normalização.
FGF: Fibroblast growth factor - fator de crescimento do fibroblasto.
.
12
FSH: Follicle-stimulating hormone – hormônio folículo estimulante.
GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase - gliceraldeído trifosfato
desidrogenase.
GDP: Guanosina difosfato.
GH: Growth hormone – hormônio de crescimento.
Gi: Proteína G inibitória.
GnRH: Gonadotropin-releasing hormone − hormônio liberador de gonadotrofinas
Gs: Proteína G estimulatória.
GTP: Guanosina trifosfato.
HPRT: Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltrasferase – hipoxantina
fosforibosiltransferase.
HUCCF/UFRJ: Hospital Universitário Clementino Fraga Filho/Universidade
Federal do Rio de Janeiro.
123
I-IBZM: 123I-metoxibenzamida.
IM: Intramuscular.
IP3: 1,4,5-inositol trifosfato.
LAN: Lanreotide.
LAR: Long action release.
LH: Luteinizing Hormone – Hormônio luteinizante.
MAO: Monoamina oxidase.
MAPK: Mitogen-actvated protein kinase – proteína quinase regulada por
mitógenos.
MEN1: Multiple Endocrine Neoplasia Type 1 – Neoplasia endócrina múltipla tipo
1.
NCBI: National Center for Biotechnology Information.
OCT: Octreotide.
13
PGF: Platelet growth factor - fator de crescimento plaquetário.
PHDA: Peri-ventricular-hipofisário.
PKA: Proteína Kinase A.
PKC: Proteína Kinase C.
PLC: Fosfolipase C.
PRL: Prolactina.
PTTG: Pituitary tumor transforming gene - gene transformador de tumores
hipofisários.
RM: Ressonância magnética.
RT-: Reverse transcriptase – transcriptase reversa - (controle negativo)
RT-PCR: Reverse transcriptase-polymerare chain reaction – transcriptase
reversa - reação em cadeia de polimerase
SC: Subcutânea.
SR: Slow realease – liberação lenta.
SSTR: Somatostatin receptors – receptores da somatostatina.
TC: Tomografia computadorizada.
TCLE: Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
TH: Tirosina hidroxilase.
TIDA: Túbero-infundibular.
TSH: Thyrotropin-stimulating hormone – Hormônio tireoestimulante.
UIC: University of Illinois at Chicago.
UV: Ultravioleta.
14
Sumário
I - Introdução..................................................................................................20
II - Revisão de literatura..................................................................................22
1. Adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes
(ACNF)...........................................................................................................22
1.1. Epidemiologia.........................................................................................23
1.2. Patogênese.............................................................................................23
1.3. Diagnóstico.............................................................................................26
1.4.Tratamento..............................................................................................27
1.4.1. Cirurgia...............................................................................................27
1.4.2.Radioterapia.........................................................................................28
1.4.3 Medicamentoso....................................................................................30
A) Agonistas Dopaminérgicos..............................................................30
B) Análogos da Somatostatina.............................................................38
C) Análogos do GnRH.........................................................................42
D) Novas perspectivas.........................................................................43
2 . Dopamina.................................................................................................45
2.1. Síntese e metabolismo...........................................................................45
2.2. Mecanismo de ação................................................................................48
2.2.1. Receptores da dopamina.....................................................................48
2.2.1.1. Receptor da dopamina tipo 1 (D1)....................................................50
2.2.1.2. Receptor da dopamina tipo 2 (D2)....................................................50
2.2.1.3. Receptor da dopamina tipo 3 (D3)....................................................53
2.2.1.4. Receptor da dopamina tipo 4 (D4)....................................................54
15
2.2.1.5. Receptor da dopamina tipo 5 (D5).................................................54
2.2.2. Proteínas G........................................................................................55
2.2.3. Segundo mensageiros e vias efetoras..............................................57
2.3. Ações da dopamina na adenoipófise...................................................60
2.3.1. Atividade anti-secretora.....................................................................60
2.3.2. Atividade anti-proliferativa.................................................................61
III - Objetivo..................................................................................................66
IV - Pacientes e métodos.............................................................................67
4.1. Pacientes e amostras...........................................................................67
4.2. Métodos................................................................................................69
4.2.1. Extração do RNA e transcrição reversa............................................69
4.2.2. Seleção dos iniciadores (primers).....................................................70
4.2.3. Avaliação da especificidade do iniciador...........................................72
4.2.4. PCR quantitativo em tempo real........................................................75
4.2.5. Controle interno.................................................................................79
4.2.6. Análise estatística..............................................................................80
V - Resultados.............................................................................................81
5.1. Caracterização da casuística................................................................81
5.2. Caracterização histológica....................................................................81
5.3. Validação dos resultados da PCR........................................................82
5.4. Perfil de expressão dos genes constitutivos e dos receptores de
dopamina.....................................................................................................82
5.5. Comparação da expressão dos DR nos ACNF e hipófises humanas
normais........................................................................................................90
16
VI - Discussão.............................................................................................95
VII - Conclusões..........................................................................................104
VIII - Referências.........................................................................................105
IX - Anexos
Anexo A - TCLE
Anexo B - Aprovação do projeto pelo CEP e pela CONEP
Anexo C - Protocolo de extração do RNA
Anexo D - Protocolo da reação de transcrição reversa
Anexo E - Artigo publicado:
- Two hour mean GH is not superior to basal GH for the follow-up of
acromegalic patients treated with Octreotide LAR®. Growth Horm IGF Res 2007;
17:77-81.
17
Lista de Tabelas
Tabela 1 - Eficácia dos AD na redução dos níveis séricos de gonadotrofinas e
subunidade α em pacientes com ACNF............................................................36
Tabela 2 - Eficácia dos AD na melhora visual em pacientes com ACNF..........36
Tabela 3 - Eficácia dos AD na redução tumoral em pacientes com ACNF.......37
Tabela 4 - Características moleculares dos receptores dopaminérgicos em
humanos............................................................................................................55
Tabela 5 - Vias efetoras ligadas aos diferentes receptores da dopamina.........65
Tabela 6 - Seqüência dos oligonucleotídeos dos receptores de dopamina e dos
genes constitutivos, tamanho dos produtos e temperatura de anelamento......74
Tabela 7 - Número absoluto de cópias subtraído do controle negativo (RT-) dos
genes constitutivos e o fator de normalização calculado pelo programa
GeNorm.............................................................................................................84
Tabela 8 - Número absoluto de cópias subtraído do controle negativo (RT-) e
corrigido pelo fator de normalização dos receptores de dopamina em ACNF..85
Tabela 9 - Número absoluto de cópias subtraído do controle negativo (RT-) e
corrigido pelo fator de normalização dos receptores de dopamina em hipófises
humanas normais..............................................................................................86
Tabela 10 - Expressão ( %) dos quatro receptores de dopamina.....................88
Tabela 11- Expressão (%) da isoforma longa do receptor D2 (D2L) em relação
ao total...............................................................................................................89
18
Lista de Figuras
Figura 1 - Biossíntese, liberação e metabolismo da dopamina.........................47
Figura 2 - Isoformas do receptor da dopamina 2...............................................52
Figura 3 - Estrutura do gene do receptor da dopamina 2..................................53
Figura 4 - Esquema ilustrado alguns dos sistemas efetores envolvidos com a
ligação da dopamina às suas duas famílias de receptores...............................54
Figura 5 - Localização dos iniciadores para o receptor D2 isoforma longa.......71
Figura 6 - Localização dos iniciadores para o receptor D2 total (ambas
isoformas)..........................................................................................................71
Figura 7 - Curva de fusão adequada (pico único)..............................................77
Figura 8 - Curva de fusão inadequada (mais de um pico único).......................78
Figura 9 - Comparação das medianas do receptor D2 total corrigido pelo fator de
normalização entre ACNF e hipófise normal.......................................................91
Figura 10 - Comparação das medianas da isoforma longa do receptor D2
corrigido pelo fator de normalização entre ACNF e hipófise normal.................92
Figura 11 - Comparação das medianas do receptor D4 corrigido pelo fator de
normalização entre ACNF e hipófise normal.....................................................93
Figura 12 - Comparação das medianas do receptor D5 corrigido pelo fator de
normalização entre ACNF e hipófise normal.....................................................94
19
I-Introdução
Os adenomas constituem a neoplasia primária mais comum da adenohipófise, representando 10 a 15% de todos os tumores intracranianos (1). São
tumores benignos de origem monoclonal e a sua patogênese parece envolver
mutações inativadoras de genes supressores tumorais ou mutações ativadoras
de proto-oncogenes (2).
Os adenomas hipofisários são divididos em funcionantes e não
funcionantes, de acordo com a presença ou ausência de síndromes clínicas de
hipersecreção hormonal. Cerca de 25 a 30% dos adenomas hipofisários são
clinicamente não funcionantes (ACNF), manifestando-se por efeitos de massa
sobre o quiasma óptico e estruturas parasselares (3).
O tratamento dos ACNF visa controlar os sintomas neuro-oftalmológicos,
sendo seu principal objetivo a descompressão das vias ópticas e do tecido
hipofisário normal. A abordagem cirúrgica constitui-se o tratamento de escolha.
Entretanto, por se tratarem de macroadenomas muitas vezes com extensão
extraselar, a remoção cirúrgica completa nem sempre é possível (4,5).
No caso de insucesso cirúrgico, tratamento adjuvante com radioterapia
poderá ser indicado para os adenomas não controlados com a cirurgia, pois
permite a melhora das alterações visuais e a redução da taxa de recidiva
tumoral pós-cirúrgica (6,7). No entanto, a radioterapia não é um procedimento
isento de riscos, sobretudo o desenvolvimento de hipopituitarismo (8,9). De tal
20
forma, que o emprego sistemático da irradiação hipofisária em pacientes
operados tem sido questionada.
Até o presente momento não existe nenhum tratamento farmacológico
específico para os ACNF. O tratamento com agonistas dopaminérgicos (AD) tem
sido avaliado em pacientes com ACNF, baseado em estudos que confirmaram a
expressão de receptores dopaminérgicos tipo 2 (D2) nestes tumores (10,11).
Entretanto, resultados conflitantes têm sido relatados na literatura (12,13,14).
Dessa forma, é possível que o estudo quantitativo da expressão dos
receptores de dopamina nos ACNF seja capaz de prever os pacientes com
maior chance de êxito na terapia com AD e explicar a variabilidade de resposta
clínica e do volume tumoral nos pacientes com ACNF em tratamento com
agonistas dopaminérgicos.
21
II-Revisão da literatura
1. Adenomas hipofisários clinicamente não funcionantes (ACNF)
Os ACNF são tumores hipofisários que não estão associados a
manifestações clínicas ou bioquímicas da hipersecreção de hormônios
hipofisários. Entretanto, contrariamente a sua nomenclatura, estes tumores são
capazes de produzir hormônios glicoproteicos ou suas subunidades em
quantidades suficientes para serem detectados em estudo imunocitquímico ou
por métodos mais refinados como a hibridização in situ, ou técnicas de biologia
molecular (15,5). Contudo, ocasionalmente, essa produção hormonal pode ser
observada in vivo, através das dosagens séricas das gonadotrofinas e das suas
subunidades no estado basal ou após estímulo com TRH (15,16).
A dosagem de hormônios glicoproteicos e suas subunidades em meio de
cultura de células tumorais dos ACNF, ou a pesquisa de RNA mensageiro das
subunidades das gonadotrofinas nesses tumores têm confirmado a natureza
gonadotrófica da grande maioria desses adenomas. Na série de Black e cols
(15), através da técnica de imunocitoquímica, foram detectados hormônios
glicoproteicos em 73% dos ACNF estudados, com positividade para a
subunidade β do hormônio folículo estimulante (Follicle-stimulating hormone FSH-β) em 58%, para a subunidade β do hormônio luteinizante (Luteinizing
hormone - LH-β) em 47%, para a subunidade α em 42% e para a subunidade β
do hormônio tireotrófico (Thyrotropin-stimulating hormone - TSH-β) em 33% dos
adenomas. Corroborando estes dados, Jameson e cols (17) ao avaliarem a
22
expressão gênica dos hormônios adenoipofisários em 54 ACNF, através da
quantificação do RNAm, puderam observar que em 86% dos tumores havia a
expressão
de
um
ou
mais
genes
para
os
hormônios
glicoproteicos
adenoipofisários (LH-β, FSH-β,TSH-β). Embora as subunidades β do FSH e do
LH tenham sido encontradas com freqüência semelhantes nos ACNF,
quantitativamente, a expressão do RNAm do FSH-β foi mais abundante.
1.1 Epidemiologia
Os ACNF incidem principalmente entre a quarta e a sexta décadas de
vida, acometendo igualmente ambos os sexos (18). Estes tumores podem ser
classificados radiologicamente de acordo com o tamanho, em microadenomas
(<10 mm) ou macroadenomas (≥10mm).
1.2 Patogênese
A patogênese dos ACNF, assim como dos outros tipos de adenomas
hipofisários não está totalmente esclarecida. Inicialmente, acreditava-se na
origem hipotalâmica para o estímulo inicial da oncogênese hipofisária, entretanto
estudos posteriores confirmaram que vários tipos de adenomas são constituídos
por proliferações celulares de natureza monoclonal (19,20). A monoclonalidade
sugere que os tumores hipofisários resultam de mutações genéticas em uma
única célula envolvendo a ativação de oncogenes e inativação de genes
supressores tumorais.
23
Alguns oncogenes têm sido implicados no desenvolvimento dos ACNF.
Mutações ativadoras do gene GNAS1 (mutações gsp) resultam na substituição
de
um
aminoácido
na
proteína
G
α estimulatória
(Gsα),
tornando-a
constitutivamente ativa por perder a capacidade intrínseca de hidrolisar o GTP
(guanosina trifosfato). Essa mutação transforma o proto-oncogene GNAS1 no
oncogene gsp. Mutações gsp têm sido observadas em cerca de 40% dos
somatotropinomas e em 10% dos ACNF (21-24). Mutações inativadoras do gene
GNAI2 (proteína G α inibitória) também foram observadas em menos de 10%
dos ACNF (23).
O PTTG (Pituitary tumor transforming gene - gene transformador de
tumores hipofisários) codifica a proteína PTTG, altamente expressa em células
com atividade proliferativa. A PTTG é capaz de induzir a expressão do FGF
(Fibroblast growth factor - fator de crescimento do fibroblasto), um importante
mediador do crescimento celular (25). Além disso, o PTTG codifica uma securina
humana, ou seja, uma proteína que participa na regulação da divisão celular por
influenciar na ligação das cromátides irmãs durante a mitose. Para que ocorra a
separação equivalente do material genético em duas células durante a mitose,
as duas cromátides se ligam através de coesinas, que são degradadas pelas
separinas ao sinal do término da metáfase. A PTTG na sua função de securina,
se liga as separinas impedindo a proteólise prematura das coesinas. Portanto a
superexpressão do PTTG, impede a separação equivalente das cromátides, com
a formação de células aneuploides (isto é, com perda ou ganho de
cromossomas). A aneuploidia é um achado invariável em tumores sólidos, já foi
24
documentada em tumores hipofisários e está freqüentemente associada à
progressão tumoral (26,27).
O gene da proteína kinase C (PKC) codifica uma quinase que apresenta
importante papel na regulação do crescimento e proliferação celular através da
fosforilação de proteínas. A PKC está envolvida na síntese e secreção de
hormônios hipofisários (28). A análise da expressão da PKC nos vários
adenomas hipofisários tem demonstrado uma superexpressão desta proteína
em ACNF e em somatotropinomas, mais intensamente nos invasivos (29,30).
Além disso, mutações desse gene foram observadas em apenas alguns
adenomas, incluindo um ACNF (31).
A inativação de genes supressores tumorais também parece estar
envolvida na patogênese hipofisária. Dentre estes genes, um dos primeiros
associados a tumores hipofisários, foi o gene MEN 1, localizado no cromossomo
11q13 (32). Este gene codifica a menina, uma proteína que interage com várias
proteínas supressoras de tumor, reprimindo a transativação gênica. Cerca de
25% dos pacientes com a mutação germinativa no gene MEN 1 desenvolvem
adenomas hipofisários (33,34). Entretanto, o seqüenciamento desse gene nos
tumores esporádicos revelou mutações inativadoras na região codificadora do
gene em apenas 1% dos adenomas (35,36).
25
1.3 Diagnóstico
Os ACNF podem manifestar-se por sintomas compressivos do tumor ou
menos freqüentemente por um quadro de apoplexia hipofisária. Adicionalmente,
alguns casos poderão ser diagnosticados de forma incidental através de exames
radiológicos.
Os pacientes com ACNF freqüentemente apresentam na ocasião do
diagnóstico quadro de perda visual, sintomas neurológicos e ou sintomas de
hipopituitarismo, decorrentes do aumento do volume tumoral (8). De acordo com
a literatura, comprometimento visual está presente em até 87% dos pacientes
(14,18,37), seguido por hipogonadismo, presente em mais de 50% dos casos
(14,37) e cefaléia que pode ser observada em 35 a 75% dos casos (14). Os
ACNF podem manifestar-se com hiperprolactinemia secundária a desconexão
hipotalâmico-hipofisária e conseqüente redução do aporte de dopamina aos
lactotrofos, nesta situação também são denominados de pseudoprolactinomas,
sendo necessário diferenciá-los dos prolactinomas verdadeiros (18,38).
A apoplexia hipofisária seja isquêmica ou hemorrágica, representa uma
expansão aguda do volume tumoral, manifestando-se por quadro de cefaléia de
forte intensidade, comprometimento visual, diplopia e alterações do nível de
consciência. O risco de ocorrência de tal acidente vascular em ACNF variou na
literatura de 9,5 a 21%. Arita e cols (39) acompanharam 42 pacientes
assintomáticos com ACNF através ressonância magnética (RM) por um período
médio de 60 meses. Durante este período, 10 pacientes apresentaram sintomas
compatíveis com apoplexia, porém sem evidência radiológica. Quatro pacientes
26
evoluíram com quadro de cefaléia e oftalmoplegia sendo confirmada extensa
necrose tumoral nestes pacientes.
Atualmente,
devido
a
maior
disponibilidade
da
tomografia
computadorizada (TC) e da RM de crânio na investigação de inúmeras
condições clínicas, tem sido crescente o número de ACNF diagnosticados em
pacientes assintomáticos ou sem sinais que sugiram patologia hipofisária. Nesta
situação, os ACNF são denominados de incidentalomas, que podem se
apresentar como microadenomas em 10 a 20% dos casos ou macroadenomas
observados em 16% das patologias selares (40,41).
A
avaliação
laboratorial,
através
das
dosagens
dos
hormônios
adenoipofisários, tem o objetivo de excluir a hipersecreção hormonal. A
dosagem da subunidade α dos hormônios glicoproteicos, além de diagnóstica,
pode ser útil no diagnóstico diferencial entre os ACNF e outras neoplasias
intracranianas.
1.4 Tratamento
1.4.1 Cirurgia
Constitui-se no método de escolha para o tratamento dos ACNF. O
principal objetivo é a descompressão das vias ópticas e a preservação das
estruturas adjacentes, assim como do tecido hipofisário normal. De acordo com
a literatura, melhora visual pode ser observada em até 80% dos pacientes
(37,42) e recuperação da função hipofisária em 30 a 50% dos casos (43). A
27
ressecção total do tumor possibilita a cura, mas só ocorre nos adenomas sem
invasão do seio cavernoso e com maior freqüência naqueles com pequena ou
nenhuma extensão supra-selar (18). Na prática, redução do volume tumoral é o
resultado mais observado, e as taxas de recidiva tumoral pós-cirúrgicas são
elevadas podendo variar de 12 a 69% após cinco a dez anos da cirurgia (14,44).
A principal via de acesso para a cirurgia é a transesfenoidal, que
apresenta baixas taxas de morbidade e mortalidade. Ela está reservada para
tumores com pequena ou moderada extensão supra-selar. A via transcraniana
estará indicada na presença de grande extensão supra-selar. O sucesso do
tratamento cirúrgico varia diretamente com a experiência e habilidade do
cirurgião e inversamente com a consistência, aderência, invasão do tumor.
As possíveis complicações do tratamento cirúrgico são o hipopituitarismo,
a ocorrência de diabetes insípidus (DI) transitório ou permanente, e
complicações locais como a formação de fístula liquórica, sinusite, dano visual e
meningite. De acordo com a literatura, a ocorrência de tais complicações é
inferior a 7%, contudo esta freqüência pode ser elevada em caso de cirurgia ou
radioterapia prévia (45).
1.4.2 Radioterapia
A radioterapia tem sido utilizada como tratamento complementar à
cirurgia, com o objetivo de reduzir o risco de recidiva tumoral (46, 47). De acordo
com alguns autores, durante um período de seguimento que variou de um a 21
anos, as taxas de recidiva tumoral após tratamento cirúrgico isolado puderam
28
ser reduzidas de 19 a 21% para 5 a 10% quando instituído tratamento
radioterápico complementar (7).
Entretanto, não existe um consenso sobre o emprego sistemático da
radioterapia no pós-operatório dos pacientes que permanecem com resíduo
tumoral. Para alguns autores, se o remanescente tumoral for pequeno, é
possível acompanhar a evolução através de exames periódicos de imagem e
indicar a radioterapia apenas quando houver evidência de crescimento do tumor
(6). Enquanto que outros autores, como Turner e cols (46), sugerem que a
radioterapia deve ser considerada para todos os pacientes com ACNF devido ao
risco de crescimento do tumoral, que pode chegar até 50% dos casos em 10
anos de seguimento.
A indicação de radioterapia deve ser individualizada, uma vez que o risco
de hipopituitarismo é elevado e cresce com o tempo de acompanhamento. A
incidência de hipofunção hipofisária pode ser superior a 50% em pacientes
submetidos à cirurgia seguida de radioterapia (7,47,48). De fato, Littley e cols
(48) avaliaram 165 pacientes submetidos radioterapia, e observaram que após 5
anos deste tratamento, a incidência de deficiência de hormônio de crescimento
(Growth hormone − GH), de gonadotrofinas (LH e FSH), de corticotrofina
(Adrenocorticotropic hormone − ACTH) e tireotrofina (TSH) foi respectivamente,
de 100%, 91%, 77% e 42%. Além de danos à hipófise, existe o risco de lesão
actínica, sobretudo sobre o quiasma óptico (49,50), disfunção neuro-cognitiva, e
mais raramente, a indução de outros tumores do sistema nervoso central,
29
principalmente meningiomas e gliomas (51). Entretanto, estes riscos podem ser
minimizados com o emprego da radioterapia estereotáxica (radiocirurgia). Esta
modalidade tem substituído com sucesso a radioterapia convencional no
controle do crescimento de restos tumorais. Apresenta a vantagem de liberar
uma elevada dose de irradiação, com alto grau de precisão sobre a área do
tumor numa única sessão com mínimo efeito nocivo ao tecido normal
circunjacente (52).
1.4.3 Medicamentoso
Três classes de drogas têm sido utilizadas no manuseio dos ACNF:
agonistas dopaminérgicos, análogos da somatostatina e análogos do GnRH
(Gonadotropin-releasing hormone − Hormônio liberador de gonadotrofinas).
A. Agonistas Dopaminérgicos
Os agonistas dopaminérgicos (AD) foram a primeira classe de drogas
usadas no tratamento dos prolactinomas e somatotropinomas. No Brasil, os dois
AD comercialmente disponíveis no mercado são a bromocriptina (BRC) e a
cabergolina (CAB). Estas drogas atuam diretamente sobre os receptores
dopaminérgicos tipo 2 (D2), presentes no tecido hipofisário normal (53,54) e
tumoral (55-57). O emprego desta classe de drogas no tratamento dos ACNF
está baseado na observação de que aproximadamente 70% destes tumores
expressam receptores D2 (11). Apesar destes dados, resultados conflitantes e
30
desapontadores têm sido relatados sobre a eficácia dos AD no controle do
crescimento tumoral destes adenomas.
Dados da literatura demonstraram que a BRC é capaz de reduzir os
níveis de gonadotrofinas e subunidades α in vitro e in vivo, porém em um
número reduzido de casos foi capaz de produzir redução tumoral significativa em
ACNF (58-60). Wollesen e cols (61) em 1982 avaliaram o efeito da BCR no pósoperatório de 11 ACNF e nove funcionantes (quatro prolactinomas, três
somatotropinomas, um corticotropinoma e um tireotropinoma). Foi encontrada
redução tumoral média de 32% em nove de 11 ACNF (81%) e de 51% em 4 dos
nove adenomas funcionantes (44%) com 30 a 60mg/dia de BRC. Concluindo ser
a BCR uma droga capaz de causar redução tumoral clinicamente significativa
em todos os tipos tumorais. Entretanto, na grande maioria dos estudos, a BRC
não foi capaz modificar o tamanho tumoral. Bevan e cols (12) ao compilarem os
dados de sete estudos sobre a eficácia da BRC no tratamento de 84 pacientes
com ACNF, observaram que em 76 pacientes (90%) não houve qualquer
redução no volume tumoral, sendo que em um caso houve aumento. Em sete
pacientes (8%), pequena redução tumoral foi observada, apesar de um dos
casos ter evoluído coincidentemente com apoplexia hipofisária. Deterioração
visual foi observada em 5 pacientes (6%), enquanto que apenas um paciente
apresentou melhora do quadro visual.
Estudos posteriores avaliaram a eficácia da quinagolida no tratamento
dos ACNF, baseados na observação de que pacientes com de prolactinomas
pouco responsivos, ou resistentes a BRC, apresentaram normalização nos
31
níveis séricos de prolactina (PRL), e redução tumoral que variou de 25 a 100%
com a quinagolida (62,63). Kwekkeboom e Lamberts (64) em uma série com 5
pacientes com ACNF, tratados com quinagolida na dose de 0,3 mg/dia durante
12 meses, evidenciaram redução nos níveis séricos de gonadotrofinas e
subunidade α em 80% dos pacientes, redução tumoral em 20% e estabilização
do crescimento tumoral em 60%. Entretanto, resultados conflitantes foram
observados quando Nobels e cols (13) avaliaram a eficácia do tratamento
prolongado com a quinagolida em 10 pacientes com de ACNF. Redução
significativa nas concentrações séricas das gonadotrofinas e subunidade α foi
observada em nove pacientes (9/10). Dois de três pacientes, com alterações
visuais prévias, apresentaram discreta melhora visual nos primeiros meses de
tratamento, seguida de deterioração visual em todos os três pacientes durante o
seguimento. Regressão do volume tumoral foi constatada em três pacientes
durante o primeiro ano de tratamento, porém em dois destes pacientes, houve
aumento tumoral durante o seguimento. Seis pacientes evoluíram com aumento
do volume tumoral no decorrer do estudo, a despeito da supressão dos níveis de
gonadotrofinas e subunidade α. Baseados nestes dados, os autores concluíram
que o tratamento prolongado com a quinagolida não foi capaz de prevenir o
aumento progressivo do volume tumoral na grande maioria dos pacientes
estudados. Por outro lado, Ferone e cols (65) demonstraram que o emprego da
cintilografia com
123
I-metoxibenzamida (123I-IBZM), um ligante específico para
receptores D2, cuja captação, correlaciona-se com o grau de expressão destes
receptores, seria capaz de prever nos pacientes com ACNF, os que
32
apresentariam normalização sérica da subunidade α e redução tumoral com
emprego da quinagolida.
Recentemente, a CAB devido a sua maior potência e tolerância em
relação aos demais AD tem substituído a BRC no tratamento dos ACNF. A CAB
tem capacidade de ligação mais específica com os receptores D2 e duração de
ação mais prolongada. Isso evita grandes flutuações nos níveis séricos da
droga, aumentando a eficácia clínica e reduzindo a freqüência de efeitos
colaterais, como foi mostrado em um estudo duplo-cego de pacientes com
hiperprolactinemia (66).
Lohmann e cols (67) avaliaram a segurança e a eficácia da CAB na dose
de 1mg/semana durante um ano de tratamento em 13 pacientes com ACNF.
Destes pacientes, 12 já haviam sido submetidos a tratamento cirúrgico prévio e
apresentavam resíduo ou recorrência tumoral. Redução do tumor foi observada
em aproximadamente 60% dos casos (8/13). Sete dos treze pacientes
apresentaram redução de 10% sobre o volume inicial do tumor. Redução
tumoral de 25% do volume inicial foi observada apenas em 1 paciente. Nove
pacientes apresentavam comprometimento visual previamente ao início da
terapia com CAB, e destes, apenas dois (22%) apresentaram melhora visual
com esta droga. Não foram observados efeitos colaterais significativos com o
regime terapêutico.
Colao e cols (68) avaliaram a redução tumoral e os níveis séricos de
subunidade α em 10 pacientes com de ACNF durante o tratamento com CAB
(0,5 a 3,0 mg/semana) e quinagolida (0,075 a 0,6 mg/dia) por um período de
33
doze meses. Redução dos níveis séricos de subunidade α foi observada em
90% dos pacientes e redução tumoral em dois casos (20%).
Pivonello e cols (11) buscaram correlacionar a expressão dos receptores
D2 e suas isoformas com o efeito da CAB na síntese de subunidade α in vitro e
na resposta tumoral in vivo em ACNF. Foram estudados 18 pacientes
submetidos a tratamento cirúrgico, destes nove (50%) permaneceram com
resíduo tumoral e foram tratados com CAB por 1 ano. Após este período de
tratamento, foi observada inibição dose-dependente da CAB, na síntese de
subunidade α em 56% dos pacientes. Em relação às manifestações clínicas,
resolução completa da cefaléia ocorreu em cinco de sete pacientes (71%) que
apresentavam o sintoma no início do tratamento. Melhora visual foi observada
em dois dos três pacientes (67%) com comprometimento visual prévio. Um
exame de campimetria visual foi realizado em todos os pacientes do estudo,
constatando-se que, quatro de cinco pacientes (80%) que apresentavam
defeitos no campo visual, apresentaram melhora significativa. Redução tumoral
significante (acima de 25%) foi observada em 56% dos pacientes. Destes,
notável redução tumoral (superior a 50% do volume inicial) foi identificada em
dois pacientes e moderada redução tumoral (25-50% do volume inicial) foi
observada em três pacientes. Todos os pacientes com significativa redução do
adenoma expressavam receptores D2.
Mais recentemente, Greenman e cols (69) avaliaram o emprego dos AD,
preferencialmente após o tratamento cirúrgico ou tão logo se observasse
crescimento do remanescente tumoral. Trinta e três pacientes receberam AD
34
durante um período médio de 40 meses e foram pareados com um grupo de 47
pacientes não tratados com a droga. Foi observada redução ou estabilidade do
volume tumoral em 18 de 20 pacientes (90%), cuja instituição do AD foi iniciada
logo após a detecção do resíduo tumoral pela ressonância magnética pósoperatória. Em 13 pacientes, o tratamento apenas foi iniciado após a detecção
de crescimento do remanescente tumoral durante as consultas de rotina. Neste
grupo, redução ou estabilização do crescimento tumoral foi detectada em oito
dos 13 dos pacientes (61,5%) estudados. Em contraste, o volume tumoral
permaneceu estável em apenas 18 dos 47 pacientes (38,3%) não tratados com
AD e aumento tumoral foi detectado em 29 pacientes (61,7 %). Melhora visual
foi detectada em quatro de oito pacientes com comprometimento visual prévio.
Baseados, nestes resultados, os autores concluíram que o tratamento com AD é
capaz
de
promover
redução
ou
estabilização
do
volume
tumoral,
particularmente, quando o tratamento for iniciado antes da detecção da recidiva
tumoral.
As tabelas 1, 2, 3 sumarizam os resultados dos AD na redução dos níveis
séricos de gonadotrofinas e subunidade α, melhora visual e redução tumoral,
respectivamente.
35
Tabela 1 - Eficácia dos AD na redução dos níveis séricos de gonadotrofinas e
subunidade α em pacientes com ACNF.
Autor
N
Agonista
dopaminérgico
Dose
5
Quinagolida
0,3*
10
6
10
Quinagolida
Quinagolida
Quinagolida; CAB
(Referência)
Kwekkeboom
(64)
Nobels (13)
Ferone (65)
Colao (68)
Redução dos
níveis séricos
de
gonadotrofinas
e subunidade α
(%)
80
0,075 − 0,3*
0,3 − 0,6*
0,075 − 0,6*; 0,5 −
3,0**
Pivonello (11)
9
CAB
1,0 − 3,0**
N= número de pacientes avaliados; BRC= bromocriptina; CAB= cabergolina;
**= mg/sem
90
50
90
56
*= mg/dia;
Tabela 2 - Eficácia dos AD na melhora visual em pacientes com ACNF.
Autor
N
Agonista dopaminérgico
Dose
Melhora
visual (%)
(Referência)
Bevan (12) #
84
BRC
1
7,5 − 20,0*
Nobels (13)
10
Quinagolida
0
0,075 − 0,3*
Lohmann (67)
13
CAB
1,0**
22
Pivonello (11)
9
CAB
1,0 − 3,0**
67 − 80
Greenman
33
BRC;Quinagolida;CAB
50
5 − 10,0*; 0,3*;
(69)
1,5**
N= número de pacientes avaliados; BRC= bromocriptina; CAB= cabergolina; *= mg/dia;
**= mg/sem
# = resultados compilados de sete séries
36
Tabela 3 - Eficácia dos AD na redução tumoral em pacientes com ACNF.
Autor
(Referência)
Wollesen (61)
Bevan (12) #
Kwekkboom
(64)
Nobels (13)
Ferone (65)
Lohmann (67)
Colao (68)
N
Agonista
dopaminérgico
11
84
5
BRC
BRC
Quinagolida
10
6
13
10
Quinagolida
Quinagolida
CAB
Quinagolida; CAB
Dose
Redução
tumoral (%)
30,0 – 60,0*
7,5 − 20,0*
0,3*
81
8
20
0,075 − 0,3*
0,3 − 0,6*
1,0**
0,075 − 0,6*; 0,5 −
3,0**
1,0 − 3,0**
5 − 10,0*; 0,3*; 1,5**
10
33
60
20
Pivonello (11)
9
CAB
56
Greenman
33
BRC; Quinagolida;
15,4 − 45
(69)
CAB
N= número de pacientes avaliados; BRC= bromocriptina; CAB= cabergolina; *= mg/dia;
**= mg/sem
# = resultados compilados de sete séries
Em resumo, os AD parecem ser eficazes na redução dos níveis séricos
de gonadotrofinas e subunidade α. Em relação à melhora visual e redução
tumoral, os melhores resultados foram observados com o uso da CAB.
As reações adversas aos AD compreendem: náuseas, cefaléia, tonteiras,
constipação intestinal, xerostomia, congestão nasal e hipotensão postural (70).
Os efeitos colaterais à CAB são idênticos aos observadas com a BRC, mas com
uma freqüência significativamente menor. Intolerância à CAB tem sido relatada
em apenas 3 a 4% dos pacientes nas grandes séries em que esta droga foi
testada (71-74). Risco de regurgitação valvar relacionada ao uso de AD
derivados do ergot, foi avaliado por Schade e cols (75) em uma coorte de 11417
indivíduos entre 40 a 80 anos através de dados do United Kingdom General
Practice
Research
Database.
Todos
os
indivíduos
usaram
agonistas
dopaminérgicos para tratamento de doença de Parkinson. Os autores mostraram
37
que o uso de pergolida ou CAB foi associado com risco significativamente
aumentado de regurgitação mitral. Esse risco foi particularmente maior entre os
pacientes que fizeram uso de pergolida ou CAB em doses diárias maiores do
que 3,0 mg, por pelo menos, seis meses. Em outro estudo sobre a prevalência
de regurgitação valvar e o uso de AD em 155 pacientes com de doença de
Parkinson, foi demonstrada uma freqüência elevada de doença valvar em
pacientes usando pergolida (23,4%) ou CAB (28,6%). Entretanto, não foi
constatada em pacientes que faziam uso de agonistas dopaminérgicos nãoderivados do ergot, quando comparado com indivíduos controles (5,6%) A dose
média diária de pergolida e CAB usada pelos pacientes foi de 2,8±1,2 e 3,6±2,1,
respectivamente (76). Entretanto, vale mencionar que para o tratamento dos
adenomas hipofisários, as doses máximas utilizadas de CAB e pergolida são
respectivamente, 1mg/dia e 0,15 mg/dia e não existem dados disponíveis sobre
a incidência de lesões orovalvulares neste grupo de pacientes.
B. Análogos da Somatostatina
Os
análogos
da
somatostatina
exercem
suas
propriedades
farmacológicas através dos receptores da somatostatina (SSTR), sendo que
cinco subtipos já foram identificados em humanos (SSTR 1, 2, 3, 4 e 5). Todos
presentes nos tecidos hipofisários normal e tumoral.
Os análogos sintéticos da somatostatina disponíveis na prática clínica, o
octreotide (OCT) e o lanreotide (LAN, este não disponível no Brasil), exercem a
sua ação principalmente através da ligação aos subtipos SSTR 2 e 5 (77). Eles
38
estão disponíveis em formulações de curta e longa duração de ação. O OCT de
formulação subcutânea (SC) de curta duração apresenta como inconveniente a
necessidade de várias aplicações diárias, resultando em menor adesão ao
tratamento. Os análogos da somatostatina de longa duração [OCT-LAR (long
acting release) - para aplicação intramuscular (IM) a cada 28 dias, LAN SR (slow
release) - para aplicação IM a cada sete a quatorze dias e o LAN autogel - para
aplicação SC profunda a cada 28 dias] apresentam melhor comodidade
posológica para os pacientes, e são atualmente os mais utilizados.
A detecção de SSTR em ACNF (78), principalmente os subtipos SSTR 2
e 5, suscitou a possibilidade de que os análogos da somatostatina pudessem ser
utilizados no tratamento deste tipo de tumores. Entretanto, os efeitos benéficos
da terapia com os análogos da somatostatina têm se mostrado variáveis e pouco
freqüentes, além de se correlacionarem precariamente com a expressão dos
SSTR(79).
Warnet e cols (80) relataram que o uso do OCT (300-600 µg/dia)
possibilitou melhora visual em 46%, 61% e 41% dos pacientes após,
respectivamente, 4, 30, 60 dias de tratamento. Após dois meses de tratamento,
redução tumoral foi observada em 43% (3/7) dos pacientes, com magnitude que
variou de 26 a 73%.
De Bruin e cols (81), avaliaram in vitro e in vivo a resposta dos ACNF ao
OCT. Foram estudados sete pacientes com macroadenomas. Os SSTR foram
expressos em seis adenomas. Dos sete pacientes selecionados, quatro
receberam tratamento com OCT 1200 µg ao dia. Positividade para os SSTR foi
39
encontrada em três dos quatro pacientes em tratamento com OCT. Dois
pacientes apresentaram significativa redução dos níveis séricos de FSH (cerca
de 83% e 93% dos valores prévios com tratamento, respectivamente). Melhora
visual foi observada em três pacientes (3/4), inclusive no paciente negativo para
SSTR, embora redução tumoral não tenha sido observada em nenhum paciente.
Portanto, os autores concluíram que o OCT foi capaz de prover melhora visual
nos pacientes estudados, porém, tal efeito não parece estar relacionado à
redução tumoral, sendo uma ação independente do OCT, que poderia exercer
seus efeitos diretamente sobre a retina ou nervo óptico.
Katznelson e cols (82) em seu estudo confirmaram o efeito do OCT em
inibir a produção de gonadotrofinas e suas subunidades in vivo, porém a
redução do volume tumoral não ocorreu em paralelo com a capacidade inibitória
desta droga. Em todos os seis ACNF estudados foi observada redução de
gonadotrofinas, entretanto, redução do tumor somente foi encontrada em um
caso.
Plokinger e cols (83) estudaram o uso pré-operatório do OCT no volume
tumoral em ACNF e somatotropinomas. Foi avaliada também a correlação entre
a redução do volume tumoral, a imunohistoquímica do tumor e a captação do
111
I-pentreotide (radioligante específico para SSTR). Foram incluídos no estudo,
10 pacientes com somatotropinomas e 14 ACNF, que foram tratados com OCT
inicialmente na dose de 300µg/dia com progressão até 1500µg/dia por três
meses. A cintilografia com
111
I-pentreotide foi realizada antes do início do
tratamento com OCT. Após uma semana de tratamento, apenas em dois ACNF,
40
foi detectada redução tumoral (57% e 96%). Quatro de 12 ACNF apresentaram
aumento da captação do radioligante, que não se correlacionou com redução do
tumor e/ou imunohistoquímica (dois adenomas, um gonadotropinoma e um null
cell).
Andersen e cols (84) avaliaram a combinação de octreotide (OCT) e CAB
no tratamento de ACNF.
Em dez pacientes com macroadenomas, foram
avaliadas a capacidade secretora basal e estimulada de gonadotrofinas e
subunidade α dos ACNF. Também foi analisada a redução tumoral antes e após
6 meses da terapia combinada de OCT 200 µg três vezes ao dia e CAB 0,5 mg
diariamente. Foi observada redução do volume tumoral de 30% (18 − 46%),
apenas, nos pacientes que apresentavam capacidade secretora. Dos seis que
apresentavam capacidade secretora pré-tratamento, todos demonstraram
redução dos níveis de gonadotrofinas e subunidade α, que em média foi de 66%
(50-98%). Entretanto, ausência de redução tumoral foi observada em quatro
pacientes, destes, três permaneceram com volume inalterado e em um houve
aumento do volume.
Em resumo, os análogos da somatostatina são capazes de promover
melhora visual e inibição da secreção de gonadotrofinas, embora não produzam
efeito significativo sobre o volume tumoral nos pacientes com ACNF.
Os efeitos colaterais dos análogos da somatostatina geralmente são leves
e transitórios, com alterações gastrointestinais (flatulência, aumento do trânsito
intestinal, náuseas, desconforto abdominal), ocorrendo em metade dos
pacientes. Colelitíase assintomática ocorre em cerca de 15% dos pacientes em
41
uso de análogos da somatostatina de longa duração. São também descritos dor
no local da aplicação, queda transitória de cabelos, hipotireoidismo central e
bradicardia sinusal assintomática (85,86).
C. Análogos do GnRH
Esta classe de drogas atua via receptores para GnRH exercendo seus
efeitos através da saturação destes receptores nas células gonadotróficas,
reduzindo a produção hormonal. Devido ao fato de que alguns ACNF expressão
positividade para gonadotrofinas, drogas agonistas ou antagonistas do GnRH
foram testadas no tratamento destes adenomas (16). Entretanto, o uso de
análogos agonistas do GnRH teve um efeito nulo ou exacerbou a secreção de
gonadotrofinas sem que houvesse alteração nas dimensões tumorais (16,44).
McGrath e cols observaram que a administração de Nal-Glu GnRH, um
potente análogo antagonista do GnRH, foi capaz de reduzir os níveis circulantes
de FSH em todos os cinco pacientes com ACNF incluídos no estudo, porém sem
modificação do volume tumoral em nenhum dos pacientes (87).
Em resumo, os análogos do GnRH não estão recomendados na
terapêutica medicamentosa dos ACNF, uma vez que não propiciam redução
tumoral e, eventualmente, podem exacerbar a hipersecreção hormonal.
42
D. Novas perspectivas
Recentemente foram criadas moléculas híbridas (BIM 23A387) que
contêm elementos estruturais da somatostatina e da dopamina e possuem
atividade agonista tanto no SSTR2 como no receptor D2 (88).
Gruszka e cols (89) investigaram os efeitos, in vitro, dos análogos da
somatostatina específicos para os SSTR 1 (BIM-23926), para os SSTR 2 (BIM23120), para os SSTR 5 (BIM-23206), da molécula quimérica ligante do SSTR2
e do receptor D2 (BIM-23A387), da BRC e da somatostatina (SST-14) em
ACNF. Foram avaliados 10 adenomas removidos cirurgicamente, para cada
adenoma foram testados todos os seis tipos de drogas. Foi considerado um
efeito positivo das drogas uma redução da viabilidade celular superior ou igual a
20%. Utilizando este critério, três adenomas falharam em responder a qualquer
composto deste estudo. O emprego da SST-14 resultou em efeito positivo em
quatro dos dez adenomas. Para o BIM 23926, análogo do SSTR1, três em 10
adenomas apresentaram redução da viabilidade celular. O emprego do análogo
do SSTR2 (BIM 23120), assim como do análogo do SSTR5 (BIM 23206),
produziu efeitos positivos em quatro de 10 adenomas. Melhores resultados
foram observados com o emprego do BIM 23A387, molécula quimérica ligante
do SSTR2 e o receptor D2, e da BRC que obtiveram efeito positivo em seis de
dez pacientes em ambos os casos. Entretanto, maior intensidade no decréscimo
da viabilidade celular foi observada com a BRC. Estes resultados confirmam a
importância dos receptores D2 no tratamento dos ACNF, no entanto, mais
43
estudos são necessários para avaliar a verdadeira utilidade das moléculas
quiméricas nestes tipos de tumores.
A razão para a potência aumentada da supressão da secreção hormonal
com as moléculas quiméricas ainda não é conhecida, mas pode estar
relacionada à oligomerização dos receptores dopaminérgicos (DR) e SSTR. Isso
poderia criar um receptor funcionalmente distinto, com maior eficácia em
promover a inibição da adenilciclase quando comparado à inibição provocada
pela ativação individual dos receptores (88).
Outra medicação ainda em fase de estudo II, é o SOM230 (Pasireotide),
um análogo do SSTR, considerado universal por ter ação nos subtipos 1, 2, 3 e
5. Estudo em cultura de células de somatotrofo demonstrou maior potência
inibitória da secreção de GH pelo SOM230 quando comparado ao OCT (90).
Taboada e cols (91) avaliaram a expressão dos cinco subtipos de SSTR em 19
ACNF e observaram maior expressão do SSTR3, seguido do SSTR2. Portanto,
é possível que o SOM230 (Pasireotide) possa se uma opção na abordagem
medicamentosa dos ACNF.
44
2. Dopamina
2.1. Síntese e metabolismo
A dopamina é sintetizada primariamente no sistema nervoso central
(SNC), mas também, em menor proporção, na medula adrenal. A presença de
dopamina no interior da hipófise anterior sugere que esta seja sintetizada de
novo nesse local ou trazida para a hipófise através do sangue pelo sistema
porta-hipofisário. No hipotálamo, dois sistemas dopaminérgicos regulam a PRL:
o túbero-infundibular (TIDA) e o peri-ventricular-hipofisário (PHDA). O TIDA é o
maior responsável pelo aporte de dopamina à hipófise anterior. Os neurônios
TIDA respondem a mudanças agudas ou crônicas na PRL com poucas
exceções, como a gravidez, lactação e prolactinomas. Nestas situações, estes
neurônios dopaminérgicos tornam-se refratários a níveis elevados de PRL,
assim sustentando hiperprolactinemias fisiológicas ou patológicas (54).
A biossíntese da dopamina inicia-se com o aminoácido tirosina,
proveniente na sua maior parte da alimentação, contudo, pequena quantidade
deste aminoácido tem sua origem na hidroxilação hepática da fenilalanina pela
fenilalanina hidroxilase. A tirosina é captada pelos neurônios por processo ativo,
e convertida em L-dopa pela ação da tirosina hidroxilase (TH), que representa a
etapa limitante na síntese da dopamina. Em contraste com o que é observado
nos demais neurônios dopaminérgicos, esta enzima está continuamente ativa na
unidade hipotálamo-hipofisária, devido ao tônus inibitório exercido por este
neurotransmissor sobre a síntese e liberação da PRL. Seqüencialmente a L-
45
dopa
sob
ação
da
L-aminodescarboxilase,
também
denominada
hidroxifenilalanina descarboxilase, é convertida em dopamina (54,92).
A dopamina recém sintetizada é translocada para o interior de vesículas
secretoras, onde permanece armazenada para estoque, secreção e proteção
contra a inativação enzimática. O processo de catabolismo é um dos
mecanismos mais eficientes da inativação da dopamina, envolvendo vários
mecanismos, dentre eles a deaminação oxidativa pela enzima monoamina
oxidase (MAO), a O-metilação pela catecolamina-o-metiltransferase (COMT), e a
conjugação pelas sulfotransferases ou glucoronidases. A via metabólica utilizada
depende do sítio no qual está ocorrendo o processo catabólico: a MAO atua em
compartimentos
intracelulares, enquanto COMT
está envolvida
com
o
extracelular, como é o caso da unidade hipotálamo-hipofisária (54,92).
De acordo com a demanda, ocorre a fusão das vesículas secretoras com
a membrana plasmática dos neurônios, com a secreção da dopamina para a
fenda sináptica ou para o para o espaço extracelular como no caso dos
neurônios hipotalâmicos. Uma vez secretada, a dopamina se acoplará a
receptores de membrana, que através de vias intracelulares diversas, exercem
uma série de efeitos em suas células efetoras, dentre eles, controle da síntese e
secreção de hormônios e efeitos antiproliferativos, que serão detalhados adiante
(54).
A
biossíntese,
liberação
e
metabolismo
da
dopamina
estão
esquematizados na figura 1.
46
Figura 1 - Biossíntese, liberação e metabolismo da dopamina.
Adaptado de Ben-Jonathan e cols, Endocrine reviews, 2001 (54).
D2: receptor de dopamina subtipo 2; TVMA: transportador vesicular de monoamina; TDA:
transportador de dopamina
1) captação da tirosina pelo neurônio por um mecanismo sódio-dependente; 2) conversão da
tirosina em L-dopa pela tirosina hidroxilase; 3) conversão da L-dopa em dopamina pela
hidroxifenilalanina descarboxilase; 4) estocagem da dopamina em vesículas de secreção; 5)
fusão das vesículas com a membrana plasmática resultando em liberação da dopamina na fenda
sináptica ou espaço extracelular; 6) ligação da dopamina no seu receptor; 7) dopamina livre é
captada pelo TDA, localizado na membrana plasmática do neurônio pré-sináptico; 8) dopamina
recém-sintetizada e a recaptada pela célula são translocadas para o interior das vesículas
secretoras; 9) MAO, localizada na membrana mitocondrial, converte dopamina em metabólitos
deaminados; 10) COMT converte dopamina ou seus metabólitos deaminados em produtos
biologicamente inativos.
47
2.2. Mecanismo de ação
2.2.1. Receptores da Dopamina
No fim da década de 1970, estudos revelaram a ligação da dopamina a
dois receptores dopaminérgicos distintos que foram denominados de D1 e D2.
Essa classificação foi feita com base em suas características farmacológica,
biológica, fisiológica e distribuição anatômica. Esses receptores exercem suas
ações biológicas através do acoplamento com diferentes proteínas G. O tipo 1
encontra-se ligado à proteína G estimulatória (GS), sendo capaz de aumentar os
níveis de adenosina monofosfato cíclico (AMPc) intracelular quando estimulado.
O tipo 2 interage com a proteína G inibitória (Gi), impedindo elevações dos
níveis de AMPc (54).
Atualmente, existem cinco tipos de DR, que são agrupados em duas
famílias: a família DR1-like (semelhante ao DR1) que engloba os subtipos de
receptores D1 e D5, enquanto os receptores D2, D3 e D4 estão incluídos na
família DR2-like (semelhante ao DR2) [93]. Todos são membros da família de
receptores ligados à proteína G, e são formados por uma única cadeia
polipeptídica.
Os
cinco
tipos
de
receptores
possuem
sete
domínios
transmembrana formando três alças intra e extracelulares. Em seus domínios
transmembrana, os receptores D1 e D5 têm 79% de homologia e os receptores
D2, D3 e D4 51-75%. Quando comparados os dois tipos (DR1-like e DR2-like), o
grau de homologia é de apenas 40-45% (94). A terceira alça intracitoplasmática
representa a região funcionalmente mais importante, onde ocorre a interação
48
com as proteínas G e outras moléculas efetoras que regulam os efeitos
fisiológicos e neuroquímicos dos DR (93).
A porção carboxi-terminal intracitoplasmática é mais longa na família dos
DR1-like, enquanto a terceira alça intracelular é significativamente maior na
família dos DR2-like. Ambos possuem um ou dois resíduos de cisteína na
porção proximal da região carboxi-terminal. Estes resíduos parecem sofrer
palmitoilação (tioesterificação reversível com uma molécula de ácido graxo no
carbono 16). Tem-se especulado que o ancoramento da membrana via cisteína
palmitoilada cria uma quarta alça intracelular, mas o significado funcional desta
alteração requer maior definição.
Um ou mais sítios para N-glicosilação estão presentes na porção aminoterminal. Funcionalmente, a glicosilação não é importante para a ligação com o
ligante, mas pode ser importante para a síntese do receptor e sua inserção na
membrana (95).
Os genes dos receptores D1 e D5 não contêm introns, enquanto os genes
que codificam os receptores D2, D3 e D4 apresentam seis, cinco e três introns,
respectivamente.
A presença de introns permite a geração de variantes do
receptor por splicing alternativo (54). Todos os DR2-like apresentam variantes.
No entanto, até o momento, somente para o receptor D2, foram identificadas
isoformas com significado biológico reconhecido. O receptor D2 apresenta duas
variantes, denominadas curta (D2 short - D2S) e longa (D2 long - D2L), que são
geradas por splicing alternativo, com a inserção de 29 aminoácidos na terceira
alça intracitoplasmática (Fig. 2 e 3) [54]. Os promotores dos genes dos DR não
49
contêm as regiões TATA e CAAT box e suas transcrições parecem ser
reguladas por fatores nucleares (96,97).
2.2.1.1. Receptor da dopamina tipo 1 (D1)
É o receptor mais abundante no SNC. Seu gene codifica uma proteína
composta por 446 aminoácidos. Está localizado, em humanos, no braço longo
do cromossomo 5 na região 35.1 (98).
Os receptores D1 são amplamente expressos nos núcleos da base
(putamen, caudado, accumbens), tubérculo olfatório, seguidos pelo córtex
cerebral, hipotálamo e tálamo (93). Estes sítios estão envolvidos no controle da
execução de movimentos, no controle da fala e na regulação da memória.
2.2.1.2. Receptor da dopamina tipo 2 (D2)
Os receptores D2 foram os primeiros a serem clonados (99). O gene do
receptor D2 codifica uma proteína de 414 aminoácidos, e está localizado no
braço longo do cromossomo 11, na região 22-23. O receptor D2 pode ser
encontrado nos núcleos accumbens, putamen e caudado, trato olfatório,
substância nigra (pars compacta) e área tegmental ventral. Também é
encontrado em hipófise, retina, rim e sistema vascular (100). Através de estudos
subseqüentes, foi identificado um segundo cDNA deste receptor, composto pela
inclusão de 87 pares de bases codificando uma proteína de 443 aminoácidos,
posteriormente identificada como D2L (Fig. 2). Assim, o receptor D2 existe sob
duas isoformas. Nos mamíferos, o comprimento da 3° alça citoplasmática pode
50
ser modificado por splicing alternativo do pré-RNAm. Nesta situação, o exon 6,
que codifica uma seqüência de 29 aminoácidos, pode ou não ser incluso no
RNAm transcrito, levando a expressão das isoformas D2L ou D2S,
respectivamente (54).
Os receptores D2 estão envolvidos com muitos dos efeitos que a
dopamina exerce no SNC e periférico, assim como na porção anterior e média
da hipófise (93, 101,102), sendo capazes de promover a inibição da síntese e
secreção da PRL pela dopamina nos lactotrofos. Como já referido anteriormente,
estes receptores possuem a terceira alça intracelular significativamente maior do
que os DR1-like, o que determina a eficiência e a afinidade do acoplamento às
proteínas G e de outros efetores (93,102).
51
Figura 2 - Isoformas do receptor da dopamina 2.
Adaptado de Daniela Valonne, Neuroscience and Biobehavioral Reviews, 2000 (100).
52
Figura 3 - Estrutura do gene do receptor da dopamina 2.
Adaptado de Nira Ben-Jonathan e cols, Endocrine reviews, 2001 (54).
Organização do gene do receptor D2 e o splicing alternativo que gera ambas as isoformas, a
longa e a curta. Exons, introns e seqüências não traduzidas estão representados pelas caixas
azuis e branca, linha preta e caixas vermelhas, respectivamente. O número seis corresponde ao
exon 6 que está ausente na isoforma curta.
2.2.1.3. Receptor da dopamina tipo 3 (D3)
O gene do receptor D3 codifica uma proteína de 400 aminoácidos. Está
localizado no braço longo cromossomo 3, na região 13.3. Duas isoformas,
também denominadas de curta e longa, originadas por splicing alternativo foram
identificadas em ratos, porém não em outras espécies (102). Os receptores D3
estão distribuídos na região subcortical límbica e, em menores proporções, nos
núcleos da base. O RNAm deste receptor foi detectado no cerebelo e parece
estar envolvido na regulação dos movimentos oculares (93,102). O receptor D3
também tem sido descrito como um inibidor da adenilciclase, mas o faz menos
eficazmente do que o receptor D2 (102).
53
2.2.1.4. Receptor da dopamina tipo 4 (D4)
O gene do receptor D4 codifica uma proteína de 387 aminoácidos. Está
localizado no braço curto do cromossomo 11, na região 15.5 (93). Análises do
gene do receptor D4 humano revelaram a existência de vários polimorfismos
diferentes dentro das seqüências codificadoras deste gene, variando de 2 a 11
repetições de pares de bases expressas na terceira alça citoplasmática (93). As
repetições 2, 4 e 7 (denominadas DR4,2; DR4,4 e DR4,7) são as isoformas mais
freqüentemente expressas, dentre elas a D4,4 é expressa na hipófise anterior,
entretanto a sua importância na fisiologia da glândula ainda é incerta (102). O
receptor D4 é expresso no córtex frontal, amigdala, bulbo olfatório, hipocampo,
hipotálamo e mesencéfalo (103).
2.2.1.5. Receptores de dopamina tipo 5 (D5)
O gene do receptor D5 codifica uma proteína de 477 aminoácidos. Este
gene está localizado no braço curto do cromossomo 4, na região 15.1-16.1.
Expressão do RNAm do receptor D5 foi observada no hipocampo e núcleos
talâmicos que sabidamente estão envolvidos com a percepção dolorosa. Estes
dados sugerem que os receptores D5 possam estar envolvidos no processo
talâmico do estímulo doloroso (104).
As características moleculares dos receptores da dopamina estão
ilustradas na tabela 4.
54
Tabela 4 - Características moleculares dos receptores da dopamina em
humanos.
DR2-like
DR1-like
D1
D5
D2
D3
D4
400
387-515*
5
3
D2S D2L
Aminoácidos
Introns
Localização
446
477
0
0
414
443
6
5q 35.1 4p 15.1-16.1 11q 22-23
3q 13.3 11p 15.5
* O número de aminoácidos do receptor D4 depende do número de repetições na
terceira alça intracitoplasmática.
2.2.2. Proteínas G
As vias de sinalização intracelular ativadas pelos DR são inúmeras. A via
mais bem documentada é a de ativação e inibição do AMPc via adenilciclase e
modulação da sinalização do cálcio. Proteínas G heterotriméricas, compostas
pelas subunidades α e dímeros βγ, estabelecem a conexão entre vários
receptores e sistemas efetores, tais como adenilciclase, canais de cálcio e
potássio e fosfolipases (105-107). Receptores ativados pelos seus agonistas
catalisam a mudança de GDP (guanosina difosfato) para GTP na subunidade α,
resultando em dissociação da α–GTP do receptor e do dímero βγ. As
subunidades α–GTP e os dímeros βγ livres regulam vários sistemas efetores
para alterar o nível intracelular de segundo mensageiro. A atividade GTPase
intrínseca da subunidade α hidrolisa GTP em GDP, criando assim o
heterodímero GDP inativo. Devido à numerosa combinação de subunidades α, β
55
e γ, uma diversidade de vias de sinalização associadas ao acoplamento
receptor-proteína G pode ser esperada (108).
Muitos receptores interagem com apenas um tipo de proteína G, como,
por exemplo, Gs, Go/Gi ou Gq/G11, embora receptores possam interagir com
mais de uma proteína G (109). Receptores acoplados a proteína Gi/Go sensível
à toxina pertussis, como o receptor dopaminérgico, podem interagir com mais de
um membro dessa classe de proteína G (106). No núcleo estriado, os receptores
D1 foram identificados acoplados a proteínas Gαi enquanto que em células
GH4C4 (células de tumores hipofisários de ratos) transfectadas com receptores
D1 encontravam-se acoplados a proteínas Gs e Go (110).
Para os receptores D2, a existência das duas isoformas tem gerado
hipóteses de que elas poderiam interagir com diferentes proteínas G, além de
apresentar diferentes afinidades de acoplamento a proteínas G e vias de
sinalização, podendo estar envolvidos em diferentes funções, dependendo do
tipo celular e da disponibilidade do tipo de proteína. Montmayeur e cols (111)
estudaram o acoplamento da proteína G a ambas as isoformas em cultura de
células de coriocarcinoma (JEG3), que expressam apenas as subunidades Gαi1
e Gαi3. Foi observado que, quando estas duas subunidades estão presentes,
D2S foi mais eficiente do que D2L em inibir a atividade da adenilciclase.
Entretanto, quando essas células foram transfectadas com a subunidade Gαi2, a
mesma atividade inibitória foi atingida, sugerindo que a inserção de 29
aminoácidos presentes no receptor D2L pode afetar a interação deste receptor
com a proteína G, favorecendo especificamente a interação do receptor D2L
56
com a subunidade Gαi2. Guiramand e cols (112), em estudo semelhante,
encontraram os mesmos resultados.
2.2.3. Segundo mensageiros e vias efetoras
Os DR1-like guardam entre si semelhanças nas vias de sinalização. A
ativação destes receptores resulta em estímulo da adenilciclase com formação
do AMPc e em ativação da fosfolipase C (PLC), com formação do 1,4,5-inositol
trifosfato (IP3) e do diacilglicerol (DAG) [79-97,88-106]. O APMc ativa a proteína
kinase A (PKA) que, por sua vez, fosforila proteínas citoplasmáticas e nucleares
e regula o metabolismo celular, incluindo as funções de canais iônicos
(113,114).
Os receptores D1 parecem modular as concentrações de cálcio
intracelular através de três mecanismos: (1) hidrólise do fosfatidil inositol (PI)
pela fosfolipase C, resultando na produção de IP3, que mobiliza os estoques de
cálcio intracelular (88); (2) aumento dos níveis de AMPc, provavelmente via
ativação de PKA (115); e (3) modulação da atividade dos canais de cálcio,
através da fosforilação direta destes canais por PKA, como demonstrado por
Surmier e cols (116).
Existe pouca evidência que o receptor D1 afete a liberação de ácido
aracdônico. Piomelli e cols (117) relataram que em células de ovário de hamster
chinês, o receptor D1 não afeta a liberação de ácido aracdônico evocada pelo
cálcio. Entretanto, quando os receptores D1 e D2 foram expressos
simultaneamente nessas células, a combinação de agonistas D1 e D2 causou
57
uma potencialização maior de liberação de ácido aracdônico, quando
comparado com D2 apenas. Entretanto, em cultura de neurônios estriatais,
agonistas D1 causaram inibição da liberação de ácido aracdônico evocada pelo
cálcio (118), um efeito mimetizado pela forskolina (substância oriunda da planta
Plectranthus barbatus, ativadora da adenilciclase e, com conseqüente aumento
do AMPc) sugerindo o envolvimento da PKA nesta resposta.
As vias de sinalização intracelular ativadas pelos receptores D2 são
inúmeras e são as mais bem documentadas entre os cinco subtipos de DR. A
via mais bem documentada é a da inibição do AMPc e modulação da sinalização
do cálcio intracelular. A estimulação dos efetores intracelulares a partir dos
receptores D2 é mediada pela interação com membros das proteínas
heterotriméricas ligadoras de GTP (119). Ambas isoformas do receptor D2 se
acoplam às proteínas Gi e Go, sensíveis à toxina pertussis (103,120).
Os DR2-like podem reduzir os níveis de cálcio intracelular por inibição das
correntes dos canais de cálcio, como já demonstrado em células GH4C4,
lactotrofos e melanotrofos. Em células hipofisárias, dois mecanismos parecem
estar envolvidos com estes efeitos: ativação de canais de potássio, levando a
alterações no potencial de membrana, e ativação de proteínas G que inibiriam
diretamente os canais de cálcio. De fato, Wolfe e cols (121), ao estudar as
isoformas D2S e D2L transfectadas em células AtT20, células derivadas de
corticotropinomas, observaram que ambas as isoformas foram capazes de
reduzir o influxo de cálcio através de canais da cálcio de alta voltagem.
58
Entretanto, tal efeito foi mediado por diferentes tipos de proteínas G, enquanto
D2L encontrava-se acoplado a Gαi3, D2S estava acoplado a Gαi2.
A figura 4 ilustra algumas das vias de sinalização intracelular envolvidas
na ligação da dopamina às suas duas famílias de receptores.
Figura 4 – Esquema ilustrando alguns dos sistemas efetores envolvidos com a
ligação da dopamina às suas duas famílias de receptores.
ADC:
adenilciclase;
Gs
e
Gi:
proteínas
G
estimulatória
e
inibitória,
respectivamente; PLC: fosfolipase C; +: estimulação; -: inibição;
59
2.3. Ações da dopamina na adenoipófise
2.3.1. Atividade anti-secretora
Os lactotrofos in vivo estão continuamente expostos à dopamina, que
exerce um contínuo tônus inibitório sobre estas células. Após segundos de
exposição à dopamina, ocorre redução dos níveis de cálcio livre intracelular, e
inibição da liberação da PRL de grânulos secretores. Tais efeitos são mediados
pelo acoplamento direto ou indireto dos receptores D2 aos canais de potássio,
via proteínas Go, induzindo hiperpolarização da membrana celular, ocasionando
a inativação dos canais de cálcio voltagem-dependente. Decréscimos adicionais
nos níveis de cálcio intracelular são mediados pela inibição da fosfolipase C e da
PKC,
resultando
em
redução
da
mobilização
de
cálcio
do
retículo
endoplasmático (102).
Em cerca de minutos a horas, observa-se supressão da expressão do
gene da PRL, este efeito é principalmente mediado por redução dos níveis
intracelulares de AMPc. Vários estudos têm demonstrado que a dopamina é
capaz de inibir a atividade da adenilciclase na hipófise anterior in vivo e in vitro,
e tais efeitos parecem ser mediados por ativação de proteínas Gαi e Gαo
(122,123) A complexa interação dessas vias após a ativação dos receptores D2,
reduz os níveis de AMPc, resultando em supressão da atividade da PKA. A PKA
atua como segundo mensageiro, ativando proteínas nucleares e citoplasmáticas,
além da regular a função dos canais iônicos e dessensibilização de proteínas G
ligadas a receptores (102).
60
A grande maioria dos ACNF possui receptores dopaminérgicos (10,11) e
o emprego do AD levam a inibição da secreção de hormônios glicoproteicos e
suas subunidades (59,60,64). Embora evidências indiquem que receptores D2
expressos em prolactinomas mantenham o acoplamento receptor-efetor
tipicamente presente em lactotrofos normais (124,125), pouca informação está
disponível sobre o mecanismo de ação da dopamina nos adenomas não
secretores. Lania e cols (126) avaliaram o efeito da dopamina sobre a atividade
da ADC e sobre as concentrações de cálcio livre citoplasmáticas em 8 ACNF
removidos cirurgicamente. Foi observado que em 100% dos adenomas, a
dopamina não foi capaz de inibir atividade da ADC. Em contra partida, em cinco
dos oito adenomas, houve um decréscimo das concentrações citoplasmáticas de
cálcio livre, após o emprego da dopamima. Estes dados reforçam o conceito que
a transdução do sinal dopaminérgico após a interação da dopamina com o seu
receptor é heterogêneo nos ACNF, e que alterações nas proteínas G podem
estar envolvidas.
2.3.2. Atividade anti-proliferativa
Evidência da atividade anti-proliferativa da dopamina foi confirmada
através da observação de hiperplasia hipofisária em ratos transgênicos
deficientes de receptor D2 e hipoplasia hipofisária nos deficientes em
transportadores da dopamina, cuja deficiência aumenta a disponibilidade de
dopamina (127,128). De fato, o emprego de agonistas dopaminérgicos no
tratamento de prolactinomas além de provocar efeitos inibitórios sobre a síntese
61
e liberação da PRL, também se observa importante papel na redução da massa
tumoral (129), e pronunciado efeito antiproliferativo e citotóxico em lactotrofos in
vitro (130). Confirmando estes dados, Trouillas e cols (131), estudaram in vivo,
cinco linhagens diferentes de tumores hipofisários de ratos transgênicos
(SMtTW) exibindo diferentes fenótipos de GH/PRL, sendo que uma destas
representava uma linhagem celular maligna com predominância de lactotrofos
(carcinoma). Foi observado, que os prolactinomas ou mamosomatotropinomas
foram os mais sensíveis na redução do volume tumoral e síntese hormonal com
o emprego da BRC, pois apresentavam elevada expressão dos receptores D2.
Por outro lado, os somatotropinomas e o carcinoma, não apresentaram
expressão do RNAm do receptor D2 e, portanto, não demonstraram efeito de
redução tumoral e ou produção hormonal com o emprego da BRC.
Em estudos por microscopia de lactotrofos tumorais em ratos, após
tratamento com BRC, foram observados sinais de necrose celular: agregação da
cromatina, redução do volume do retículo endoplasmático rugoso e do complexo
de Golgi (132). Em adição, significativa redução do volume plasmático celular e
atrofia mitocondrial foram observados por Johansen e cols (133). Estes achados
sugerem o potencial efeito citotóxico e antimitogênico dos AD.
A proteína quinase ativada por mitógenos (mitogen-activated protein
kinase - MAPK), também denominada quinase regulada por sinal extracelular
(extracellular-signal regulated kinase - ERK), responde principalmente a
mitógenos e fatores de crescimento, como os fatores de crescimento da
epiderme (epidermal growth factor - EGF) e derivados das plaquetas (platelet
62
growth factor - PGF). Essas proteínas são responsáveis pela diferenciação e
proliferação celular (134). Kanasaki e cols (134) estudaram o envolvimento da
p38 MAPK na apoptose induzida pela BRC em células GH3. Foi observado que
a BRC induziu um incremento de 3 a 5 vezes nas concentrações da p38 MAPK
com concomitante aumento das células apoptóticas. A adição de inibidores
específicos da p38 MAPK (SB212090 e SB203580) ao meio de cultura resultou
em abolição dos efeitos da BRC sobre a quinase e sobre a apoptose celular.
Entretanto, o uso de antagonista do receptor D2 (etieropride) não foi capaz de
afetar o efeito da BRC sobre a ação da p38 MAPK e/ou apoptose celular,
sugerindo que em células GH3, o efeito da BRC na apoptose celular não é
mediado pelo receptor D2. No entanto, estudos posteriores demonstraram o
papel dos receptores D2 no controle da proliferação dos lactotrofos, através da
ativação das ERKs. Iaccarino e cols (135) criaram ratos transgênicos com
hiperexpressão de ambas as isoformas de D2 em hipófises. O incremento na
expressão da isoforma D2S gerou a ativação da p44/42 ERKS da via da MAPK,
com conseqüente hipoplasia hipofisária. A hiperexpressão de D2S causou
redução dos níveis de RNAm da PRL, assim como redução no número de
lactotrofos. Em avaliação por hibridização in situ de outros setores celulares
como os tireotrofos, somatotrofos, gonadotrofos e corticotrofos, não foi
observado efeito semelhante.
Estudos sobre os efeitos anti-proliferativos envolvendo o receptor D2,
sugerem a ativação da via intracelular da PKCε. Senogles (136) observou que
ativação de D2 inibiu o crescimento de células tumorais hipofisárias de ratos
63
transfectadas com cDNA deste receptor (GH4ZR7). No entanto, o efeito inibitório
não foi incrementado com a adição da toxina pertussis, sugerindo uma via
inibitória diferente das proteínas G. O tratamento das células GH4ZR7 com
inibidores da PKC, como o stauporine e o H7, bloquearam o efeito da dopamina,
sugerindo ser a PKCε uma via sinalizadora dos efeitos anti-proliferativos da
dopamina.
Florio e cols (137) reproduziram o efeito anti-proliferativo da dopamina em
cultura de células hipofisárias de ratos transfectadas com cDNA do receptor D2.
Foi observado que a inibição dopaminérgica da síntese de DNA ocorreu em
paralelo à estimulação da atividade da tirosina fosfatase. Ambas as ações foram
bloqueadas pela toxina pertussis e por um inibidor da tirosina fosfatase
(vanadata), sugerindo que o efeito anti-proliferativo é mediado, pelo menos em
parte, pela estimulação da tirosina fosfatase.
A tabela 5 resume o efeito sobre as vias de sinalização intracelular
envolvidas na ligação da dopamina as suas duas famílias de receptores.
64
Tabela 5 - Vias efetoras ligadas aos diferentes receptores da dopamina.
DR1-like
Adenilciclase
D1
D5
D2 D3 D4
Canais de K+
Canais de Ca2+
DR2-like
MAP kinase
Tirosina fosfatase
Trocador Na+/H+
Fosfolipase C/IP3
MAP = mitogen-activated protein; IP3 = inositol trifosfato;
= inibição; = ativação.
65
III - Objetivo
Avaliar a expressão gênica dos receptores dopaminérgicos D1, D2 total,
D2 isoforma longa, D3, D4 e D5 em adenomas hipofisários clinicamente
não funcionantes e hipófises humanas normais.
66
IV - Pacientes e Métodos
4.1. Pacientes e amostras
Foram selecionados 30 adenomas de pacientes com ACNF oriundos dos
serviços de endocrinologia e do serviço de neurocirurgia do Hospital
Universitário Clementino Fraga Filho da Universidade Federal do Rio de Janeiro
- HUCFF/UFRJ, no período de 2000 a 2006. O procedimento cirúrgico foi
indicado em função da necessidade terapêutica do paciente. Todos os pacientes
assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE, anexo A). O
projeto foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética e Pesquisa (CEP) do
HUCFF e da Faculdade de Medicina da UFRJ e da University of Illinois at
Chicago (UIC), e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa (CONEP)
[anexo B].
Em todos os pacientes, o diagnóstico do ACNF foi baseado: (1) na
ausência de sinais e sintomas de hipersecreção hormonal; (2) Confirmação
laboratorial da ausência de hipersecreção de GH, TSH e ACTH, PRL; (3) análise
histopatológica do tumor excisado. Em todos os pacientes, foi demonstrada a
presença de um adenoma hipofisário por TC ou RM de sela túrcica antes da
cirurgia. O exame histopatológico do tumor consistiu de coloração pela
hematoxilina e eosina e análise imunohistoquímica pela técnica do complexo
avidina-biotina-peroxidase, utilizando anticorpos contra todos os hormônios
adenoipofisários e subunidade alfa dos hormônios glicoproteicos. O diagnóstico
do ACNF foi baseado na ausência de imunopositividade significativa para GH,
67
PRL, TSH e ACTH. Dados sobre a presença de hipopituitarismo e reposição
hormonal antes do procedimento cirúrgico foram coletados a partir dos
prontuários dos pacientes.
Amostras de tecido tumoral foram coletadas durante as cirurgias
transesfenoidais em um tubo contendo uma solução estabilizadora de ácidos
nucléicos, RNA later (Ambion Inc., Austin, TX). Este material foi estocado a 4°C
até o dia seguinte ao da cirurgia, quando o RNA later foi desprezado, conforme
o protocolo do fabricante, e o tumor congelado em nitrogênio líquido até a
extração do RNA.
Foram coletadas também oito hipófises sem evidências de quaisquer
patologias, provenientes de necropsias. Essas hipófises foram adquiridas no
serviço de anatomia patológica do HUCFF/UFRJ mediante a aprovação pelo
CEP do HUCFF e da Faculdade de Medicina e da assinatura do TCLE (anexo A)
pelo representante legal do cadáver. O tempo estimado entre a hora da morte e
a coleta das hipófises variou de 6 a 12 horas. Um fragmento do tecido hipofisário
foi imediatamente fixado em formol na diluição a 10% para análise histológica
através da coloração pela hematoxilina e eosina. A análise histológica foi
realizada a fim de excluir a presença de tumor adenoipofisário ou de metástases
de outros tumores primários. O restante do tecido hipofisário foi acondicionado
em RNA later (Ambion Inc). Este material foi estocado a 4°C até o dia seguinte,
quando o RNA later foi desprezado, conforme o protocolo do fabricante, e a
hipófise congelada em nitrogênio líquido até a extração do RNA.
68
4.2. Métodos
4.2.1. Extração do RNA e transcrição reversa
O RNA total foi extraído a partir de aproximadamente 30 mg de tecido
(tumor e hipófise normal), com o RNeasy Mini kit (Qiagen, Valencia, CA) e
tratado com RNase-free DNase Set (Qiagen) para eliminar contaminação com
DNA genômico, conforme o protocolo do fabricante (anexo C). Ao final deste
processo, foi gerado um volume de 40 µL de solução (RNA total + 40 µL de água
RNase-free). Pequena quantidade de RNA (0,5 µg) foi submetido à eletroforese
em gel de agarose a 1,5% em brometo de etídio (EtBr) e visualizado em
transiluminador de luz ultraviolieta (UV) para verificar a integridade do material
pela presença das bandas de RNA ribossomais 28S e 18S. O RNA ficou
armazenado a – 800C até posterior utilização.
O RNA total foi quantificado com o RiboGreen RNA quantitation kit
(Molecular Probes, Eugene, OR): uma solução de 50 mL foi preparada com 47,5
mL de tampão 20x acrescidos de 2,5 mL de água para PCR. Em seguida, em
800µL desta solução foram acrescidos 1µL de RNA de cada amostra.
Posteriormente, 110µL desta solução são adicionados a 110 µL do Ribogreen e
aplicados ao leitor FluoDia T70 (Photal Otsuka eletronics, Birmingham, NJ).
A transcrição reversa foi realizada a partir de 1 µg de RNA total pela
utilização da transcriptase reversa com hexâmeros randômicos (0,2 µL/mL) e
com o kit First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, Hanover, MD) em uma
reação com volume final de 20µL, segundo o protocolo do fabricante (anexo D).
Um controle negativo para cada amostra foi preparado, procedendo-se à mesma
69
reação na ausência da transcriptase reversa (RT-), para averigüar a presença de
DNA genômico contaminante.
4.2.2. Seleção dos iniciadores (primers)
Todos os iniciadores foram selecionados através do programa Primer 3,
usando seqüências genômicas obtidas a partir do programa Genbank do
National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os seguintes parâmetros
foram utilizados para seleção: (1) iniciadores (sense e antisense) que não
tenham diferença entre suas temperaturas de anelamento maior do que 0,20C;
(2) iniciadores que não gerassem dímeros entre si (primer-dimer); e (3) produtos
entre 100 – 200 pares de bases. Os pares de iniciadores (sense e antisense)
para os receptores de dopamina 2 (ambas isoformas e isoforma longa) e 4 foram
construídos em exons diferentes, possibilitando detectar a amplificação de
possível DNA genômico contaminante presente nas amostras de RNA. As
seqüências dos iniciadores selecionados foram aplicadas no programa Basic
Local Alignment Search Toll (BLAST - NCBI) para checar potencial homologia
com outras seqüências que não aquelas para as quais foram desenhadas.
Informações sobre a seqüência de nucleotídeos, tamanho do produto
amplificado (pares de bases) e temperatura de anelamento encontram-se na
tabela 6.
O receptor de dopamina 2 existe sob duas isoformas: a longa e a curta,
geradas por splicing alternativo, que diferem entre si pela ausência de 29
aminoácidos (87 pares de bases, as quais correspondem a todo exon 6) na
70
terceira alça protéica intracitoplasmática, o que gera a isoforma curta. Na
seleção dos iniciadores da isoforma longa, portanto, as seqüências de
nucleotídeos escolhidas encontram-se no exon 5 (sense) e 6 (antisense) [Figura
5]; para ambas as isoformas (D2 total), os iniciadores situam-se nos exons 3
(sense) e 4 (antisense) [Figura 6].
Figura 5 – Localização dos iniciadores para o receptor D2 isoforma longa.
Figura 6 – Localização dos iniciadores para o receptor D2 total (ambas
isoformas).
71
Foram desenhados seis pares de iniciadores para o receptor D3 e
testados em diferentes tecidos de diferentes espécies como, hipófise humana
normal, hipófise, córtex frontal e corpo caloso de ratos (balb c), hipotálamo e
hipófise de macaco (Hamadryas Baboon). Entretanto, quando os produtos da
PCR foram aplicados no gel de agarose a 1,5% e visualizados em luz UV não se
observou a formação de qualquer banda, indicando a ausência deste receptor
nestes tecidos estudados. Assim, neste estudo, não foi possível a análise deste
receptor.
4.2.3. Avaliação da especificidade do iniciador
A especificidade do iniciador pode ser avaliada através (1) da formação
de banda única no gel de agarose, (2) seqüenciamento por PCR e (3) da curva
de fusão na RT-PCR quantitativa em tempo real.
Para verificar a especificidade do iniciador, para cada um foi realizada
reação de PCR convencional (MRI Fermentas PCR Master Mix – Fermentas)
para amplificar o cDNA obtido pela reação de transcrição reversa do RNA total
isolado de tecido hipofisário humano normal. A reação ocorreu no termociclador
Perkin Elmer GeneAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer, Downers Grove, IL) e
consistiu de 35 ciclos, iniciando com uma temperatura de 95°C por 10 minutos,
seguido de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelação de 610C
por 1 minuto e alongamento a 72°C por 1 minuto. Os produtos da PCR contendo
os fragmentos amplificados dos genes foram aplicados no gel de agarose a
1,5% e visualizados em luz UV.
72
Uma alíquota dos produtos da PCR foi purificada usando o MinElute PCR
Purification kit (Qiagen) e utilizada como modelo para seqüenciamento por PCR,
que foi realizado no DNA Core Facility da UIC, utilizando-se o ABI PRISM
BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer). Os
produtos do seqüenciamento foram determinados pelo ABI PRISM 377 DNA
Sequencer e a análise dos dados foi realizada utilizando-se o ABI integrated
software (Perkin Elmer).
Ao final da reação de RT-PCR quantitativa em tempo real, uma curva de
fusão foi usada para confirmar a presença de um único produto de PCR.
73
Tabela 6 - Seqüência dos oligonucleotídeos dos receptores de dopamina e dos genes constitutivos,
tamanho dos produtos e temperatura de anelamento.
Sense
Anti-sense
Tamanho produto
(pares de bases)
Temperatura de
anelamento
(0C)
D1
gaccaccacaggtaatggaaag
aagaaaggtagccaacagcaca
141
61
D2 total
cgagcatcctgaacttgtgtg
gcgttattgagtccgaagagg
172
61
D2 longo
ctcctccatcgtctccttct
cggtgcagagtttcatgtcc
188
61
D4
gacgcccttcttcgtggt
gacagtgtagatgacggggttg
130
61
D5
ctgggctaactcctcactcaac
attgctgatgttcaccgtctc
130
61
HPRT
ctgaggatttggaaagggtgt
taatccagcaggtcagcaaag
157
61
GAPDH
aatcccatcaccatcttcca
aaatgagccccagccttc
122
64
β-actina
actcttccagccttccttcct
cagtgatctccttctgcatcct
176
64
GAPDH – gliceraldeído trifosfato desidrogenase; HPRT – hipoxantina fosforibosiltransferase.
74
4.2.4. PCR quantitativa em tempo real
Um vigésimo da reação de transcrição reversa foi amplificado por PCR
em um volume final de 25µL em uma máquina de PCR quantitativa (Mx3000P,
Stratagene), utilizando o corante fluorescente pré-misturado nos reagentes da
reação de PCR, iQ SYBR Green Supermix 12,5µL (BioRad, Hercules, CA) e
0,375µL dos oligonucleotídeos (concentração 10µM) especificados na tabela 6.
A concentração de cloreto de magnésio (MgCl2) do iQ SYBR Green Supermix é
6mM e a sua concentração final na reação foi de 3mM. A amplificação foi feita
com 35 ciclos, iniciando com uma temperatura de 95°C por 10 minutos, seguida
de 35 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelação por 1 minuto e
alongamento a 72°C por 30 segundos. A temperatura de anelação foi 61°C para
todos os receptores de dopamina e para hipoxantina fosforibosiltransferase
(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase - HPRT) e 64°C para a
gliceraldeído
trifosfato
desidrogenase
(Glyceraldehyde-3-phosphate
dehydrogenase - GAPDH) e para a β-actina.
O SYBR® Green emite pouca fluorescência quando em solução, mas é
incorporado ao DNA de dupla-fita durante a fase de alongamento, gerando
desta forma maior fluorescência, e posteriormente liberado durante a fase de
desnaturação. À medida que vão avançando os ciclos da PCR, aumenta a
quantidade de produto gerado e a fluorescência emitida durante a fase de
alongamento. O ciclo no qual um aumento significativo da fluorescência em
relação àquela de fundo foi detectado (threshold cycle - ct), foi considerado para
75
quantificar o produto inicial em cada amostra, utilizando-se como referência uma
curva-padrão do produto, elaborada conforme descrito a seguir.
Para a realização da curva-padrão, os produtos (receptores de dopamina
e genes constitutivos) foram amplificados por PCR convencional com 35 ciclos.
Foram utilizados os oligonucleotídeos já citados e o 2X PCR Master Mix 25µL
(Fermentas Inc.), cuja concentração de MgCl2 é 4 mM. A concentração final de
MgCl2 na reação foi 2 mM. Os ciclos constaram de uma fase de desnaturação a
94°C por 1 minuto, anelamento por 1 minuto e alongamento a 72°C por 1
minuto, precedidos por uma fase inicial a 95°C por 10 minutos. As temperaturas
de anelamento usadas foram as mesmas citadas anteriormente. Os produtos
assim obtidos foram purificados com o MinElute PCR Purification Kit (Qiagen)
e quantificados com o PicoGreen dsDNA Quantitation Reagent (Molecular
Probes Inc). Em seguida, foram preparadas diluições de 10 a 106 cópias por
1µL de solução que foram utilizadas nas reações de PCR quantitativa. Quanto
maior a concentração inicial, mais precoce o ct. Assim, constrói-se uma curvapadrão na qual são plotados os resultados das amostras em investigação,
permitindo a sua acurada quantificação. Os iniciadores selecionados devem
produzir uma curva padrão cuja eficiência situa-se entre 90 e 110%. Uma
eficiência de 100% indica que todas as cópias em cada ciclo foram
amplificadas.
Ao final da amplificação, uma curva de fusão foi usada para confirmar a
presença
de
um
único
produto
de
PCR.
A
temperatura
eleva-se
progressivamente e a fluorescência emitida é monitorada. A temperatura de
76
fusão da dupla-fita de DNA depende de sua composição em nucleotídeos.
Assim, havendo um único produto, a fluorescência deve diminuir abruptamente
quando ultrapassada a sua temperatura de fusão. Uma curva de fusão
adequada deve apresentar um único pico (Figura 7), sem interferência de
artefatos como primer-dimers ou contaminação com DNA genômico nos casos
de seqüências com introns entre os exons, que fundem a temperaturas menores
(Figura 8).
A contribuição do DNA genômico contaminante foi avaliada nas reações
com RT-. Todos os resultados foram expressos, subtraindo-se os resultados
dos RT-.
Figura 7 - Curva de fusão adequada com pico único. (Fonte: figura cedida pelo
Dr. Raul Luque, da UIC).
77
Figura 8 - Curva de fusão inadequada (mais de um pico). A seta azul indica o pico
correspondente aos primer-dimers, com temperatura de fusão menor do que o produto
estudado. (Fonte: figura cedida pelo Dr. Raul Luque, da UIC).
78
4.2.5. Controle interno
Para controlar as variações na quantidade de amostra, na quantidade e
qualidade do RNA usado na reação de transcrição reversa e a eficácia desta
reação, em cada amostra foi determinado o nível de expressão (número de
cópias) de três genes constitutivos: GAPDH, HPRT e β-actina. Para determinar
se esses genes são apropriados para o uso como controle interno, a estabilidade
da expressão de cada gene foi calculada usando o programa GeNorm 3.3 visual
(http://medgen.ugent.be/~jvdesomp/genorm/),
previamente
desenvolvido
e
validado por Vandesompele e cols (138). Esse programa calcula a média de
variação de um determinado gene com todos os outros genes usados como
controle (M), permitindo a eliminação do pior gene (caso M > 1,5) e recalculando
um novo M para os genes restantes. Um valor de M < 1,5 é indicativo de um
gene estável. A média geométrica do número de cópias para os genes mais
estáveis é usada como fator de normalização (FN). Nesse estudo, para o cálculo
do valor de M, foram usados 3 genes controles (GAPDH, HPRT e β-actina), cujo
M para cada gene foi: GAPDH (M= 0,994), HPRT (M= 1,345) e β-actina (M=
1,039). Em todos, o valor de M foi inferior a 1,5. Assim, esses três genes
mostraram-se estáveis, permitindo, portanto, o cálculo da média geométrica do
número de cópias para esses três genes em cada amostra que foi utilizada como
FN. Os resultados da expressão dos DR são calculados pela subtração do
número de cópias no controle negativo (RT-) do número absoluto de cópias de
cada receptor. Essa diferença é então dividida pelo FN [(número de cópias de
cada receptor - RT-)/FN].
79
4.2.6. Análise estatística
As análises foram realizadas utilizando o programa estatístico SPSS
versão 11.0 para Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL). Os resultados foram
apresentados como mediana (mínimo - máximo). O teste não-paramétrico de
Mann-Whitney foi utilizado para a comparação de variáveis numéricas entre
grupos. Um p-valor menor que 0,05 foi considerado estatisticamente
significativo.
80
V- Resultados
5.1. Caracterização da casuística
Foram incluídos 30 macroadenomas de pacientes com ACNF (16
homens, 54%), com mediana de idade ao diagnóstico de 50 anos (18-84; n=30).
Todos foram submetidos à cirurgia transesfenoidal.
O paciente n° 5 foi o único da casuística medicado com CAB por três
meses antes do procedimento cirúrgico, sendo admitido em nosso serviço já em
uso desta medicação. Este paciente foi submetido à cirurgia transesfenoidal
cerca de 30 dias após a interrupção do tratamento com CAB.
Para análise comparativa da expressão dos DR foram estudadas oito
hipófises obtidas de cadáveres (três mulheres, 38%), com mediana de idade ao
falecimento de 40 anos (30-50 anos).
5.2. Caracterização histopatológica
Em todos os pacientes foi confirmada a presença de adenoma hipofisário
pela análise histopatológica com coloração por hematoxilina e eosina. Em 16
adenomas foi realizada a avaliação por imunohistoquímica, que foi compatível
com ACNF em todos os casos.
Todas as hipófises humanas normais tinham sua arquitetura preservada.
81
5.3. Validação dos resultados da PCR
A especificidade do iniciador foi avaliada através (1) da presença de
banda única no gel de agarose, (2) seqüenciamento por PCR e (3) da curva de
fusão na reação de RT-PCR quantitativa em tempo real.
A corrida, em gel de agarose 1,5%, dos produtos da PCR para a
realização da curva-padrão revelou bandas únicas e com tamanhos moleculares
conforme o esperado, de acordo com as especificações dos (tabela 6).
O seqüenciamento confirmou a origem dos produtos amplificados, tanto
dos DR como dos genes constitutivos.
As diluições para a realização das curvas-padrão foram feitas em
duplicata e os valores de ct foram concordantes entre as duplicatas. As curvas
de fusão para todos os receptores e para os genes constitutivos evidenciaram
um pico único, semelhante à curva da figura 7, confirmando a presença de
somente um produto amplificado e descartando a presença de primers-dimers
ou outros produtos inespecíficos.
5.4. Perfil de expressão dos genes constitutivos e dos receptores de
dopamina
Com o objetivo de controlar as variações na quantidade e qualidade do
RNA usado na reação de transcrição reversa e a eficácia desta reação, em cada
amostra foi determinado o nível de expressão (número de cópias) de três genes
constitutivos. Nesse estudo, foram usados três genes controles (GAPDH, HPRT
e β-actina) para o cálculo do valor de M, cujo valor para cada gene foi: GAPDH
82
(M= 0,919), HPRT (M= 1,365) e β-actina (M= 1,011). Em todos, o valor de M foi
inferior a 1,5. Assim, esses 3 genes mostraram-se estáveis, permitindo, portanto,
o cálculo da média geométrica do número de cópias para esses 3 genes em
cada amostra. A média geométrica, então, foi utilizada como FN. O número de
cópias, FN e o valor de M estão mostrados na tabela 7. Os resultados da
expressão dos DR, corrigidos pelos genes constitutivos, são calculados pelo
número absoluto de cópias em tumores e hipófises normais subtraindo-se o
número de cópias no controle negativo (RT-) e então dividindo-se pelo FN.
Esses dados estão mostrados nas tabelas 8 e 9, respectivamente.
83
Tabela 7 – Número absoluto de cópias subtraído do controle negativo (RT-) dos
genes constitutivos e o FN calculado pelo programa GeNorm.
(HPRT) − (RT-)
(Beta-actina) − (RT-)
(GAPDH) − (RT-)
FN
1
1810
6464
27258
0,1308
2
415
15254
38123
0,1192
3
19360
522197
1065980
4,2301
4
11970
445198
817973
3,1283
5
10340
557600
1133000
3,5799
6
23120
308398
762296
3,3671
7
3510
285200
764200
1,7515
8
305
146700
301700
0,4560
9
6549
155700
287300
1,2719
10
909
70310
170600
0,4247
11
8931
126600
296000
1,3296
12
3330
118700
262800
0,9002
13
1727
181700
282700
0,8541
14
6681
105800
272800
1,1064
15
1587
62170
152400
0,4727
16
4719
241000
530500
1,6182
17
2754
133500
738100
1,2399
18
2072
99830
230900
0,6948
19
848
47340
245300
0,4105
20
6354
331900
742100
2,2234
21
6355
98790
436700
1,2441
22
1132
366100
1003000
1,4292
23
2055
159600
287200
0,8713
24
1301
81720
219500
0,5473
25
18650
485385
1644615
4,7111
26
4587
1251500
1126667
3,5681
27
8112
581300
1273000
3,4804
28
29823
811538
1310000
6,0612
29
671
197853
284583
0,6426
30
88
15715
24764
0,0622
HN1
1839
226197
272590
0,9269
HN2
2576
202397
290990
1,0214
HN3
3432
377797
436390
1,5840
HN4
2776
173617
266590
0,9664
HN5
944
91897
240790
0,5274
HN6
228
45637
86870
0,1852
HN7
2206
123997
210390
0,7394
HN8
1434
1,365
298197
1,011
430390
0,919
1,0893
M<1,5
Expressão dos genes constitutivos subtraído do controle negativo (RT-); FN= fator de normalização
84
Tabela 8 – Número absoluto de cópias subtraído do controle negativo (RT-) e
corrigido pelo FN dos receptores de dopamina em ACNF.
D2T/FN D2L/FN
D5/ FN
0
D4/
FN
798
184767
19022
11767
195
6269
1740
361
2
149
24623
9571
376
54
3,5799
847
29470
10704
127
30
3,3671
7
19388
7329
169
25
472
(D1) –
(RT-)
0
(D2T) (RT-)
27
(D2L) –
(RT-)
0
(D4) –
(RT-)
104
(D5) –
(RT-)
74
FN
D1/FN
0,1308
0
207
2
52
22030
2268
1403
23
0,1192
434
3
319
26520
7362
1526
8
4,2301
75
4
468
77030
29940
1177
169
3,1283
5
3032
105500
38320
454
108
6
22
65280
24678
570
84
1
567
7
569
37810
21530
759
826
1,7515
325
21588
12292
433
8
17
3711
2908
259
0
0,4560
38
8138
6378
568
0
9
279
8856
4956
1187
39
1,2719
219
6963
3897
933
31
10
23
3636
1524
1415
27
0,4247
54
8562
3589
3332
64
11
67
17380
5656
587
14
1,3296
50
13071
4254
441
11
12
8
1999
702
2370
8
0,9002
9
2221
779
2633
9
13
103
11430
5084
4337
19
0,8541
121
13383
5952
5078
22
14
102
14430
7856
1237
246
1,1064
92
13042
7101
1118
222
15
430
9094
3407
709
57
0,4727
910
19239
7208
1499
121
16
44
25190
6796
175
59
1,6182
27
15567
4200
108
37
17
20
64580
35140
174
1
1,2399
16
52087
28342
140
1
18
302
15430
4814
38
487
0,6948
434
22207
6928
55
701
19
0
659
183
30
2
0,4105
0
1604
447
73
4
20
534
19330
7723
1153
23
2,2234
240
8694
3473
519
10
21
22
19500
9619
350
2
1,2441
18
15674
7732
281
2
22
272
202
207
1091
20
1,4292
190
141
145
763
14
23
141
16420
8347
1286
79
0,8713
162
18844
9579
1476
91
24
43
8239
4351
297
3
0,5473
78
15055
7950
542
5
25
45
43581
11435
2449
10
4,7111
10
9251
2427
520
2
26
589
391
19649
848
137
3,5681
165
109
5507
238
38
27
65
65520
22020
6316
20
3,4804
19
18825
6327
1815
6
28
147
76700
30915
3863
1528
6,0612
24
12654
5101
637
252
29
20
7891
650
656
12
0,6426
31
12280
1011
1020
18
30
40
1170
89
148
4
0,0622
648
18812
1431
2375
65
Mediana
-
-
-
-
-
-
77
13383
5952
555
28
RT- = controle negativo; FN= fator de normalização
85
Tabela 9 – Número absoluto de cópias subtraído do controle negativo (RT-) e
corrigido pelo FN dos receptores de dopamina em hipófises humanas normais.
D1 –
RT-
D2T –
RT-
D2L –
RT-
D4 –
RT-
D5 –
RT-
FN
D1 /
FN
D2T /
FN
D2L /
FN
D4 /
FN
D5 /
FN
HN1
625
47296
23240
0
3091
0,9269
674
51025
25072
HN2
86
25020
10666
2476
144
1,0214
85
24496
10443
2424
141
HN3
374
11132
3830
1821
863
1,5840
236
7028
2418
1149
545
0
3335
HN4
0
78860
24360
4100
57
0,9664
0
81606
25208
4243
58
HN5
146
22619
7774
1231
898
0,5274
277
42887
14740
2335
1702
HN6
0
6524
3100
1524
52
0,1852
0
35234
16742
8231
282
HN7
5
9544
2172
1579
37
0,7394
6
12908
2938
2136
50
HN8
420
5130
1915
1459
579
1,0893
386
4709
1758
1339
531
Mediana
RT-: controle negativo; FN: fator de normalização
-
-
160
29865
12591
2235
407
Nos ACNF, o receptor mais frequentemente expresso foi o D2 total
[13383 cópias (109 – 184767)], seguido do D4 [555 cópias (55 – 11767)], D1 [77
cópias (0 – 910)] e D5 [28 cópias (0 − 701)]. O número de cópias do D2 isoforma
longa foi de 5952 (0 − 28342) e a relação D2L/D2 total foi de 0,38. Todos os
ACNF expressaram o receptor D2 total. Houve predomínio da expressão da
isoforma D2L em oito de 29 ACNF, e apenas um adenoma não apresentou
expressão desta isoforma (tabela 11).
Em relação às hipófises humanas normais, o receptor mais expresso foi
D2 total [29865 cópias (4709 − 81606)], seguido de D4 [2235 cópias (0 − 8231)],
D5 [407 cópias (50 − 3335)] e D1[160 cópias (0 − 674)]. O número de cópias da
isoforma D2L foi de 12591 (1758 −25208) e a relação D2L/D2 total foi de 0,36.
Não foi observada expressão do receptor D3 em hipófises normais.
86
O percentual de expressão dos quatro subtipos de DR em ACNF e
hipófises humanas normais e o percentual da isoforma D2L em relação ao D2
total, são demonstrados nas tabelas 11 e 12, respectivamente.
Em relação ao padrão de expressão de cada subtipo do DR entre os dois
grupos estudados, observa-se que os ACNF e hipófises normais diferem entre
si. Nos ACNF, o terceiro receptor mais frequentemente expresso foi D1,
observando-se o seguinte o padrão de expressão: D2 total > D4 > D1 > D5. Nas
hipófises humanas normais, D5 foi em ordem decrescente, o terceiro receptor
mais frequentemente expresso (D2 total > D4 > D5 > D1). A proporção entre as
isoformas de D2 foi mantida em ambos os grupos (0,38 x 0,36). Em números
absolutos, todos os subtipos de DR foram mais frequentemente expressos nas
hipófises.
No adenoma n° 26 foi observado um número de cópias da isoforma D2L
superior ao número total de cópias do receptor D2, de modo que esta amostra
foi excluída da análise estatística dos receptores D2.
.
87
Tabela 10 – Expressão (%) dos quatro receptores de dopamina em ACNF e
hipófises humanas normais.
%D1
%D2T
%D4
%D5
1
0
13
51
36
2
0
94
6
0
3
1
93
5
0
4
1
98
1
0
5
3
97
0
0
6
0
99
1
0
7
1
95
2
2
8
0
93
6
0
9
3
85
11
0
10
0
71
28
1
11
0
96
3
0
12
0
46
54
0
13
1
72
27
0
14
1
90
8
2
15
4
88
7
1
16
0
99
1
0
17
0
100
0
0
18
2
95
0
3
19
0
95
4
0
20
3
92
5
0
21
0
98
2
0
22
17
13
69
1
23
1
92
7
0
24
0
96
3
0
25
0
95
5
0
26
30
20
43
7
27
0
91
9
0
28
0
93
5
2
29
0
92
8
0
30
3
86
11
0
HN1
1
93
0
6
HN2
0
90
9
1
HN3
3
78
13
6
HN4
0
95
5
0
HN5
1
91
5
4
HN6
0
81
19
1
HN7
0
85
14
0
HN8
6
68
19
8
88
Tabela 11 – Expressão (%) da isoforma D2L em relação ao D2 total (D2T).
D2T/FN
D2L/FN
%D2L
0
10
28
39
36
38
57
78
56
42
33
35
44
54
37
27
54
31
28
40
49
100
51
53
26
- *
34
40
8
8
49
43
34
31
34
48
23
37
1
207
0
2
184767
19022
3
6269
1740
4
24623
9571
5
29470
10704
6
19388
7329
7
21588
12292
8
8138
6378
9
6963
3897
10
8562
3589
11
13071
4254
12
2221
779
13
13383
5952
14
13042
7101
15
19239
7208
16
15567
4200
17
52087
28342
18
22207
6928
19
1604
447
20
8694
3473
21
15674
7732
22
141
141
23
18844
9579
24
15055
7950
25
9251
2427
26
109
5507
27
18825
6327
28
12654
5101
29
12280
1011
30
18812
1431
HN1
51025
25072
HN2
24496
10443
HN3
7028
2418
HN4
81606
25208
HN5
42887
14740
HN6
35234
16742
HN7
12908
2938
HN8
4709
1758
FN: fator de normalização
* No adenoma n° 26 foi observado um número de cópias da isoforma D2L superior ao número total de
cópias do receptor D2, de modo que esta amostra foi excluída da análise estatística dos receptores D2.
89
5.5. Comparação da expressão dos DR em ACNF e hipófises humanas
normais
Foram observadas diferenças na mediana de expressão para os
receptores D1, D2 e para a isoforma D2L entre as hipófises normais e os ACNF,
porém sem significância estatística. Entretanto, para o receptor D2 total e para a
isoforma D2L obteve-se um valor de p próximo a 0,05 (p=0,06 e P=0,07) [Figura
9 -10].
Em relação às medianas de expressão dos receptores D4 e D5 entre as
hipófises normais e os ACNF, foram observadas diferenças com um p-valor
significativo (p= 0,041 e p= 0,001) [Figura 11,12].
90
90000
80000
p = 0,06
70000
60000
50000
40000
30000
D2T/FN
20000
10000
0
N=
8
29
HN
ACNF
Figura 9 – Comparação das medianas do receptor D2 total (D2T) corrigido pelo fator de
normalização (FN) entre ACNF e hipófise normal (HN).
* Na confecção do gráfico foram removidos os valores outliers para melhor visualização
dos histogramas.
91
30000
p =0,07
20000
D2L/FN
10000
0
N=
8
29
HN
ACNF
Figura 10 – Comparação das medianas da isoforma longa do receptor D2 (D2L)
corrigido pelo fator de normalização (FN) entre ACNF e hipófise normal (HN).
* Na confecção do gráfico foram removidos os valores outliers para melhor visualização
dos histogramas.
92
5000
p = 0,041
4000
3000
2000
D4/FN
1000
0
N=
8
30
HN
ACNF
Figura 11 – Comparação das medianas da isoforma longa do receptor D4 corrigido pelo
fator de normalização (FN) entre ACNF e hipófises normais (HN).
* Na confecção do gráfico foram removidos os valores outliers para melhor visualização
dos histogramas.
93
2000
p = 0,001
1600
1200
800
D5/FN
400
0
N=
8
30
HN
ACNF
Figura 12 – Comparação das medianas da isoforma longa do receptor D5 corrigido pelo
fator de normalização (FN) entre ACNF e hipófise normal (HN).
* Na confecção do gráfico foram removidos os valores outliers para melhor visualização
dos histogramas.
94
VI - Discussão
A mediana da idade ao diagnóstico dos pacientes deste estudo foi
de 50 anos, compatível com o descrito na literatura (50 a 60 anos) [5,18]. Houve
semelhança entre o número de pacientes do sexo feminino (n=14; 46%) e
masculino (n=16; 54%). Esse achado encontra-se de acordo com o que é
freqüentemente observado nos ACNF, uma vez que nesses tumores não está
descrito diferenças entre os sexos (5,18). A mediana de idade de falecimento
dos indivíduos dos quais a hipófise foi extraída (40 anos) diferiu da mediana de
idade ao diagnóstico dos pacientes com ACNF (50 anos). Adicionalmente,
dentre as oito hipófises normais, apenas três (38%) eram oriundas de indivíduos
do sexo feminino. Entretanto, estas diferenças provavelmente não interferiram
nas análises do estudo, já que não são descritas na literatura diferenças na
expressão dos DR entre os sexos e idade em ACNF e hipófises humanas.
Em todos os pacientes, o tumor diagnosticado foi um macroadenoma.
Este dado nos confere a segurança de que os fragmentos de tecido usados na
avaliação da expressão do RNAm correspondem a um adenoma e não ao tecido
hipofisário normal adjacente ao tumor. Para cada hipófise humana normal, uma
avaliação histológica foi realizada a fim de confirmar a integridade da arquitetura
celular e afastar a presença de adenomas ou metástases.
Apenas um paciente (n° 5) fez uso de CAB no período pré-operatório.
Este é um dado relevante, pois tem sido descrito na literatura que a dopamina
poderia regular a expressão dos seus receptores. Nos receptores D1 ocorre a
dessensibilização, um processo dose e tempo-dependente, onde se observa a
95
curto prazo desacoplamento funcional do receptor D1 com a proteína G (139).
Em médio prazo é observado internalização do receptor. A longo prazo, downregulation (139-141). Entretanto, para os receptores D2, este processo é
controverso. Barton e cols (142) observaram em cultura de células de
retinoblastoma humano Y-79 que a prolongada exposição (24 horas) dessas
células aos AD iniciou o processo de dessensibilização envolvendo um
desacoplamento funcional do receptor D2, além de perda de sua atividade de
ligação ao ligante. Entretanto, Ivins e cols (143) ao estudarem a regulação dos
receptores D2 em células SUP1 (linhagem de células produtoras de PRL)
observaram que nestas células houve um aumento na densidade dos receptores
D2 após 7 horas de exposição à dopamina e que após 24 horas, estas células
mantinham a habilidade de inibir o acúmulo de AMPc. Esses autores (143)
mostraram também que o tratamento com AD causou um aumento tempo e
dose-dependente da isoforma D2L, sem alteração na afinidade de ligação com o
ligante. Ao avaliarmos o paciente n° 5, pudemos observar que o receptor mais
expresso foi D2, seguido de D1, D4 e D5. O receptor D1destaca-se por ter
apresentado um dos maiores números de cópias de RNAm entre os ACNF
estudados, situando-se bem acima da mediana de expressão dos D1 para o
grupo. Sendo o mesmo observado para o receptor D2. Portanto, mesmo que
tenha ocorrido dessensibilização dos DR, isto provavelmente não interferiu no
seu perfil de expressão. Além disso, este fenômeno só foi demonstrado em
células transfectadas, não havendo comprovação de sua ocorrência in vivo.
96
A análise das medianas de expressão DR em ACNF e hipófises normais
mostrou diferenças no padrão de expressão entre os dois grupos. No primeiro
grupo, o receptor D2 total foi o mais expresso seguido do D4, D1 e D5.
Enquanto, que no segundo grupo, observa-se uma inversão no padrão de
expressão entre os receptores D1 e D5 (D2 > D4 > D5 > D1). Adicionalmente,
em números absolutos, todos os subtipos de DR foram mais expressos nas
hipófises normais, provavelmente devido à presença das células lactotróficas.
Durante a avaliação dos receptores D2 total e da isoforma D2L, foi
observada expressão do receptor D2 total em todos os ACNF. Para a isoforma
D2L, com exceção do adenoma n° 1, todos os demais adenomas também
expressaram esta isoforma. Nas hipófises normais, ambos os receptores D2
total e a isoforma D2L foram expressos. Comparando as medianas de expressão
desses receptores entre ACNF e hipófises humanas normais, observam-se
diferenças,
porém,
sem
significado
estatístico
(p>
0,06
e
p>
0,07,respectivamente). Além disso, a relação D2L/D2 total nas hipófises normais
foi discretamente inferior (0,36) quando comparadas com a observada nos
ACNF, cuja relação encontrada foi 0,38 (p>0,05). Entretanto, o dado mais
relevante é a observação de que em ambos os grupos, a isoforma curta do
receptor D2 (D2S) foi expressa em maior proporção. Dal Toso e cols (53)
estudaram a expressão dos receptores D2 em hipófises de ratos e humanos por
meio de hibridização in situ e RT-PCR convencional, e observaram que em
ambos os tecidos houve predomínio da isoforma longa. Renner e cols (10)
avaliaram por meio de hibridização in situ, a expressão do RNAm de D2 total e
97
de ambas as isoformas de D2 em cinco hipófises normais e 18 ACNF. A
expressão do receptor D2 nas hipófises normais foi superior e em todas as cinco
hipófises, a isoforma D2L foi predominante. Enquanto que nos adenomas, a
expressão do RNAm do receptor D2 total foi negativa em dois casos, seis
expressaram apenas a isoforma D2L, dois apenas a isoforma D2S e os demais
adenomas expressaram taxas extremamente variadas de ambas as isoformas.
Finalmente, Pivonello e cols (11), em seu estudo sobre a expressão dos
receptores por meio de RT- PCR convencional, estudaram a expressão dos DR
e de ambas as isoformas de D2 em 18 ACNF. O receptor D2 total foi expresso
em 67% dos pacientes estudados, a isoforma D2L esteve presente em 50%, a
isoforma curta em 17% e ambas as isoformas em 33% dos casos. Portanto, os
nossos resultados, tanto em hipófises normais quanto em ACNF, não estão de
acordo com os descritos na literatura. Entretanto, é importante ressaltar que em
nosso estudo foi utilizada a técnica de RT-PCR em tempo real, ou seja, uma
técnica que avaliou quantitativamente a expressão dos DR, enquanto que os
estudos acima descritos utilizaram de técnicas qualitativas para avaliação da
expressão do RNAm das isoformas do receptor D2.
Os ACNF representam um grupo de tumores heterogêneo, uma vez que
são capazes de produzir pequenas quantidades de hormônios glicoproteicos in
vitro e in vivo (15,16,17). Este comportamento se reflete na expressão dos
receptores D2 extremamente variável descrita na literatura (10) e observada
nesta casuística. Sabe-se que em condições fisiológicas, ambas as isoformas do
receptor D2 são expressas, porém, com predomínio da isoforma D2L (10,53). A
98
comprovação de que alguns ACNF expressam isoladamente apenas uma das
isoformas do receptor D2 (10,11), sugere que mudanças no mecanismo de
splicing alternativo possam ocorrer durante o processo de tumorigênese nesses
adenomas. Estudos sugerem que fatores tecido-específicos poderiam modular o
splicing do pré-RNA mensageiro, favorecendo a expressão de uma isoforma em
relação à outra. Guivarc`H e cols (101) estudaram a expressão de ambas as
isoformas de D2 na presença de esteróides sexuais em células de tumores
hipofisários de ratas (MMQ). Neste estudo foi demonstrado que em condições
isentas de esteróides, a isoforma D2L foi a isoforma predominante nessas
células, em uma relação de 8:1, assim como, quando adicionado estrogênio ou
testosterona, em uma proporção de 30:1 para ambos os esteróides sexuais.
Com o objetivo de confirmar a contribuição destes esteróides, foram aplicados
antagonistas do receptor de estrogênio (58668) e de androgênios (56187),
verificando que apenas o antagonista do receptor de estrogênio, foi capaz de
bloquear o efeito deste hormônio e da testosterona no splicing do RNA
mensageiro do receptor D2. Tais dados sugerem que a testosterona é
provavelmente aromatizada a estrogênio e atua via este receptor. No entanto, a
adição de progesterona, reduziu a proporção de D2L/D2S a valores próximos de
1, antagonizando os efeitos do estrogênio. Este efeito parece ser atribuído à
atividade da progesterona, inibindo a expressão ou efeito do receptor de
estrogênio. Baseados nos dados apresentados, os autores concluíram que os
receptores de esteróides sexuais, principalmente o receptor de estrogênio,
99
regulam o splicing do RNA mensageiro do receptor D2, favorecendo a produção
da D2L em detrimento da isoforma curta.
A isoforma curta do receptor D2 parece desempenhar um papel
fundamental no controle da secreção hormonal e na inibição do crescimento
celular. A redução na expressão desta isoforma ou um aumento na relação D2L/
D2S, parece contribuir para menor resposta aos AD nos ACNF. Renner e cols
(10) avaliaram in vitro, a potência inibitória da BRC no crescimento tumoral em 9
ACNF. Em três adenomas foi observada supressão do crescimento tumoral: em
um adenoma apenas foi expressa a isoforma D2S e nos outros dois houve
predomínio ou equivalente expressão de D2S em relação à isoforma D2L.
Confirmando estes dados, Pivonello e cols (11), correlacionaram a expressão
dos receptores D2 com a resposta a CAB no tratamento de 18 pacientes com
ACNF. Neste estudo, nove pacientes (9/18) permaneceram com resíduo tumoral,
e foram medicados com CAB (1 − 3mg/semana) por um período de 12 meses.
Os efeitos da CAB sobre a síntese de subunidade α in vitro e a redução tumoral
foram correlacionados com a expressão dos receptores D2 e de suas isoformas.
A isoforma D2S foi expressa em todos os cinco adenomas (5/9) que
apresentaram inibição da síntese de subunidade α com a CAB. Além disso, esta
isoforma conferiu maior potência inibitória na síntese de subunidade α, sendo
detectada em três dos casos com elevada inibição deste hormônio (> 50% dos
valores iniciais) e em um dos dois casos com moderada resposta inibitória (25 −
50% dos valores iniciais). A resposta à CAB na redução tumoral também se
correlacionou diretamente com a expressão dos receptores D2. Estes receptores
100
estavam expressos em todos os adenomas (5/9) cuja redução tumoral foi
superior ou igual a 25%. Para os tumores resistentes a CAB, não foi observada
expressão de receptores D2, e quando expressos houve predomínio da isoforma
D2L. Baseado no que foi descrito, poderíamos especular que os pacientes n° 2,
29 e 30 obteriam melhores resultados em termos de redução tumoral com os
AD, quando comparados ao pacientes n° 7 e 9. Os três primeiros pacientes
apresentaram em valores percentuais, a expressão da isoforma D2L em relação
ao D2 total de 10%, 8%, 8% respectivamente, enquanto, os dois últimos de 57 e
78%, respectivamente. Além disso, o paciente n° 1 destaca-se entre os demais,
pois apesar de não expressar RNAm para a isoforma D2L, é um dos pacientes
da casuística com menor expressão do receptor D2 total, situando-se abaixo da
mediana de expressão do receptor D2 total para o grupo de ACNF. Portanto, é
possível que não obtivesse significativa redução tumoral com a CAB, apesar de
expressar somente a isoforma D2S.
Em relação à expressão dos demais receptores em ACNF, poucos dados
estão disponíveis na literatura. Apenas o grupo de Pivonello (11) estudou a
expressão de todos os cinco subtipos de DR em 18 ACNF, por meio de RT-PCR
convencional. Além da expressão dos receptores D2 previamente discutida nos
parágrafos anteriores, foi observada expressão do receptor D4 em 17% (3/18)
dos adenomas em associação com a expressão de ambas as isoformas de D2
nos três casos. Além disso, foi questionado um possível feito sinérgico entre
estes subtipos de receptores, uma vez que os tumores com expressão do
receptor D4 apresentaram uma significante resposta clínica a CAB. Entretanto,
101
para os receptores D1, D3 e D5 não foi encontrada expressão em nenhum dos
ACNF estudados. Em nossa casuística, com exceção de 2 adenomas (1 e 19)
que não apresentaram expressão dos receptores D1, todos os demais tumores
expressaram
em
proporções
variadas
os
receptores
D2
total
e
D4
simultaneamente. Em apenas um adenoma (n= 8) não foi observada expressão
do receptor D5. Em relação aos receptores D4 e D5, observamos que a mediana
de expressão desses receptores foi inferior nos adenomas quando comparada
com as hipófises normais (p= 0,041, p=0,001). O real significado deste dado é
incerto, entretanto, poderíamos especular que a redução na expressão de
ambos os receptores poderia contribuir para o processo de tumorigênese nos
ACNF.
Em relação ao tratamento dos ACNF, não existe um consenso sobre a
melhor opção terapêutica para os pacientes que permanecem com resíduos
tumorais. Os DA representam a melhor opção entre a terapia medicamentosa.
Entretanto, é possível que a diversidade da resposta clínica com os AD
observada nos pacientes com ACNF, possa ser explicada ao menos em parte,
pelo padrão de expressão dos receptores D2 e suas isoformas ou até mesmo
por outros subtipos de receptores dopaminérgicos. Portanto, acreditamos que o
estudo quantitativo da expressão dos DR em ACNF por meio da RT-PCR
quantitativa em tempo real possa auxiliar na seleção dos pacientes candidatos
ao tratamento com os AD. Adicionalmente, este estudo enfatiza a aplicabilidade
das técnicas de biologia molecular no tratamento clínico e poderá servir de base
102
para a correlação entre a resposta clínica com AD e o perfil de expressão dos
DR nos pacientes com ACNF.
103
VII - Conclusões
1) Nos ACNF, o receptor dopaminérgico mais expresso foi o D2, seguido
pelos receptores D4, D1 e D5.
2) Em hipófises humanas normais, o receptor dopaminérgico mais expresso
foi o D2, seguido pelos receptores D4, D5 e D1.
3) O receptor D3 não foi expresso em hipófises humanas normais.
4) Hipófises humanas normais apresentam maior expressão do receptor D4
e do receptor D5 do que os ACNF.
5) Todos os ACNF expressaram o receptor D2, com predomínio da
expressão de D2S em 72% dos adenomas. Este dado reforça a
possibilidade do emprego dos agonistas dopaminérgicos como terapia
complementar no tratamento desses tumores.
104
VIII - Referências
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