XXV CONGRESSO BRASILEIRO DE ZOOTECNIA
ZOOTEC 2015
Dimensões Tecnológicas e Sociais da Zootecnia
Fortaleza – CE, 27 a 29 de maio de 2015
Purificação parcial das proteínas de 12 e 22 kDa do plasma seminal ovino.
Partial purification of 12 and 22 kDa proteins from ram seminal plasma.
Fágner Cavalcante Patrocínio dos Santos1, Ana Luiza Malhado Cazaux de Sousa Velho2, Aderson Martins
Viana Neto2, Révila Bianca Ferreira de Melo3, Jorge André Matias Martins4, Arlindo de Alencar Araripe
Moura5
1,2
Doutorandos do Programa de Doutorado Integrado em Zootecnia UFC/UFPB/UFRPE no campus da
Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza.
3
Graduanda em Biologia pela UFC.
4
Pós-doutorando pela UFC.
5
Docente dos cursos de graduação e pós-graduação em Zootecnia da UFC.
Resumo: O presente estudo teve como objetivo indicar um método para isolar as proteínas de 12 e 22 kDa
contidas no sêmen ovino. O plasma seminal foi submetido às cromatografias de afinidade à gelatina e
posteriormente à cromatografia de afinidade à heparina. Para estimar os pesos moleculares das proteínas,
realizou-se eletroforese e para confirmar as identidades das proteínas espectrometria de massas e o Western
Blot, com anticorpos primários contra BSPs e Espermadesinas. Duas bandas no gel 1D com os pesos 12 e 22
kDa foram identificadas como a Bodhesin-2 Partial (BDH2) e a Bind of Sperm 5 Percusor (BSP5). O
Western Blot com anticorpo anti-BSPs ovina confirmou a presença da banda de 22 kDa (BSP5) nos dois
picos de afinidade à heparina. O método de separação utilizando duas colunas de afinidade é eficente de
modo a se ter apenas as duas bandas de interesse em um elevado grau de pureza.
Palavras–chave: BSPs, eletroforese, espermadesinas, Western Blot
Abstract: The present study aimed to indicate a method to isolate the 12 and 22 kDa proteins from ram
semen. Seminal plasma was subjected, sequentially, to the gelatin-affinity chromatography and latter to the
heparin-affinity chromatography. To estimate the proteins molecular weights, electrophoresis was performed,
and to confirm the protein identities, mass spectrometry and Western Blot using primary antibodies against
Binder of SPerm (BSPs) and Spermadhesins were performed. Two bands in the 1D gel, with 12 and 22 kDa,
were identified as Bodhesin-2 Partial (BDH2) and Bind of Sperm 5 Precursor (BSP5). The Western blot with
anti- rams BSP antibody confirmed the presence of the 22 kDa band (BSP5) in the two peaks. The separation
method using two affinity columns is efficient to have only two bands of interest in a high degree of purity.
Keywords: BSPs, electrophoresis, spermadhesins, Western Blot
Introdução
Devido à ampla gama de proteínas presentes no plasma seminal (PS), este fluido pode interagir com
diluidores durante o processo de criopreservação e com substâncias do trato genital feminino, conferindo à
célula espermática mecanismos que influem na capacidade fecundante do gameta masculino. Dentre as
proteínas mais abundantes no PS de ruminantes destacam-se as Binder of SPerm, (BSPs) caracterizadas pela
presença de dois domínios de fibronectina tipo II (FnII; Manjunath e Thérien, 2002), e as espermadesinas,
caracterizadas por um grande domínio CUB (Romero et al., 1997) em suas estruturas primárias. Entretanto,
para elucidar os mecanismos pelos quais as referidas proteínas atuam durante as etapas da fertilização, é
necessário estuda-las de formas isoladas. Portanto, o presente estudo teve como objetivo indicar um método
para isolar as BSPs e espermadesinas contidas no plasma seminal ovino.
Material e Métodos
Amostras de plasma seminal foram obtidas por meio de centrifugação do sêmen ovino colhido por
eletroejaculação. Um pool contendo 10 mg de proteínas totais foi submetido à cromatografia de afinidade por
gelatina utilizando a coluna Gelatin Sepharose 4B. Os picos proteicos separados pela gelatina foram
concentrados e dessalinizados por centrifugação (5000 x g, 20 min., 4 ºC) utilizando filtros MWCO de 10
kDa e posteriormente submetidos à SDS-PAGE em géis de gradiente de poliacrilamida (8 – 16 %). As
bandas presentes no gel foram cortadas e tripsinizadas para identificação por meio de espectrometria de
massa (ESI-Q-ToF) e por teste imune de Western-Blot (WB) utilizando anticorpos primários anti-BSP ovina
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e anti-bodesinas (Martins et al., 2013). O pico separado pela gelatina que contém as proteínas de interesse
foi, posteriormente, submetido à cromatografia de afinidade pela heparina. Os picos de proteínas com
afinidade pela gelatina separados ainda mais pela heparina foram concentrados, dessalinizados e submetidos
à SDS-PAGE conforme descrito acima. O último gel foi transferido em membrana de PVDF a qual foi
submetida ao WB utilizando anticorpos primários anti-BSP ovina. Os métodos cromatográficos foram
realizados utilizando o sistema Äkta Prime Plus (GE, lifescience, Piscattaway, NJ, EUA) e os pesos
moleculares das proteínas separadas por eletroforese foram determinados com o auxílio do aplicativo
Quantity One (Bio Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA).
Resultados e Discussão
O cromatograma de afinidade pela gelatina das proteínas do plasma seminal de ovinos (Fig. 1A)
demonstrou 2 picos sem afinidade (agrupados como P1), um pico retido na gelatina (P2) e uma elevação (E)
entre P1 e P2, representando proteínas com fraca interação com a gelatina. A amplitude máxima atingida em
P1 e P2 foram de 220 mUA e 100 mUA, eluídos aos 25 e 70 minutos de corrida cromatográfica,
respectivamente. Nove bandas proteicas, com pesos variando entre 9 a 67 kDa, foram detectadas no P2 e seis
com 9 a 24 kDa na E (Fig. 1B). Segundo resultados de espectrometria de massas, a banda de 12 kDa tanto de
P2 como de E, contém as proteínas Binder of SPerm 5 Precursor (BSP5) e a Bodhesin 2 Partial (BDH2),
enquanto as bandas de 14 e 22 kDa contém apenas a BSP5. A imunodetecção pelo WB demonstrou marcação
específica para BSPs no plasma seminal (SP), no P2 e em E, enquanto que em P1 a marcação foi fraca (Fig.
1C). Já o WB anti-espermadesinas (Fig. 1D) não demonstrou marcação específica no P2 nem em E.
Quando o P2 da cromatografia de afinidade pela gelatina foi submetido à cromatografia de afinidade
pela heparina (Fig. 2A), observamos dois picos bem definidos, com amplitude máxima para P1 (que não se liga
à heparina) de 90 mUA, eluído aos 5 minutos de corrida e para P2 (que se liga a heparina) de 30 mUA eluído
aos 33 minutos. P1 apresentou 2 bandas proteicas de 12 e 22 kDa, enquanto P2 apresentou quatro bandas de 10,
12, 21 e 22 kDa (Fig. 2B). O teste de WB utilizando anticorpos contra BSPs confirmou a presença da referida
proteína na banda de 22 kDa tanto em P1 como em P2 (Fig. 2C). Portanto as bandas de 12 kDa e 22 kDa se
ligam à gelatina e são separadas em dois picos quando passadas na coluna de heparina, momento o qual elas
isolam-se mais de outras moléculas. Resultados similares foram identificados por Bergeron et al. (2005),
entretanto, a maior pureza da BSP na pesquisa desses autores se dá pelo fato do uso de mais uma cromatografia
com coluna de fase reversa em HPLC. As bandas proteicas separadas desempenham importantes papéis no
processo de fertilização, pois estudos demonstram que as espermadesinas participam da interação entre gametas
e que as BSPs estão envolvidas nos processos de capacitação espermática e reação acrossômica, eventos
decisivos no sucesso da fertilização (Moura et al., 2011).
Figura 1 – A) Cromatograma das proteínas de afinidade a gelatina no plasma seminal ovino; B) SDS-PAGE
das amostras PS, P1, E e P2 (setas vermelhas indicam bandas identificadas por ESI-Q-ToF); C)
Imunodetecção por WB para BSPs; D) Imunodetecção por WB para Espermadesinas. PM = Marcador de
peso Molecular; PS = Plasma Seminal; P1, E e P2 = frações não retidas, elevação e fração retida na coluna
Gelatin Sepharose 4B, respectivamente.
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Figura 2 – A) Cromatograma das proteínas de afinidade a gelatina e que se ligam à heparina do plasma
seminal ovino; B) SDS-PAGE das frações P1 e P2 do cromatograma de afinidade pela heparina; C)
Imunodetecção por WB para BSPs. PM = Marcador de peso Molecular; P1 e P2 = Proteínas ligadoras de
gelatina não retidas e retidas, respectivamente, na coluna Hitrap Heparin HP.
Conclusões
O método de separação utilizando duas colunas de afinidade é eficiente de modo a se obter apenas as
duas proteínas de interesse (12 e 22 kDa) eluídas em um mesmo pico, entretanto, passo cromatográfico
adicional deverá ser realizado no intuito de separar a banda de 12 kDa da 22 kDa para utilizá-las em testes
funcionais ou incremento em processos biotecnológicos.
Agradecimentos
A Fundação Cearense de Apoia a Pesquisa do Estado do Ceará (FUNCAP) pela concessão da bolsa de
estudo para o doutorado. A pesquisa foi financiada também através de recursos do CNPq e CAPES.
Literatura citada
BERGERON, A. et al. Isolation and characterization of the major proteins of ram seminal plasma.
Molecular Reproduction and Development, v.71, n.4, p.461-470, 2005.
MANJUNATH, P; THÉRIEN, I. Role of seminal plasma phospholipid-binding proteins in sperm membrane
lipid modification that occurs during capacitation. Journal of Reproductive Immunology, v.53, p.109-119,
2002.
MARTINS, J. A. M. et al. Major heparin-binding proteins of the seminal plasma from Morada Nova rams.
Small Ruminant Research, v.113, p.115-127, 2013.
MOURA, A. A. A. et al. Proteínas do plasma seminal, funções espermáticas e marcadores moleculares da
fertilidade. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.35, n.2, p.139-144, 2011.
ROMERO, A. et al. The crystal structures of two spermadhesins reveal the CUB domain fold. Nature
Publishing Group, v.4, n.10, p. 783-788, 1997.
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