Expressão e caracterização bioquímica de uma lipase identificada a
partir do sequenciamento massivo de DNA metagenômico
Rafaela Barbirato Ferreira
Iniciação Científica / PIBIC/CNPq
Emanuel Maltempi de Souza / Faoro, H. ; Monteiro, R.A.; Pedrosa, F.O.
O recente progresso na área da metagenômica
permitiu a descoberta de uma grande diversidade
de enzimas com características interessantes para o
campo da Biotecnologia. Entre elas, as lipases,
altamente investigadas, devido à sua variabilidade e
aplicação em diversos campos da indústria. Tendo
em vista a descoberta de uma nova família de
lipases que torna-se ativa por intermédio de uma
protease, esse trabalho fundamenta-se em
determinar a relação molecular entre ambas e suas
características bioquímicas
A partir da triagem feita em uma biblioteca
metagenômica, construída a partir do DNA extraído
de amostras de solo da Floresta Atlântica
Paranaense, foi identificada uma nova família de
lipases denominada
LipAP (Activate by
Proteolysis), cuja principal característica
é a
dependência de uma protease para a sua ativação
(Faoro et al, 2011). Para tanto, as duas proteínas
serão superexpressas a partir do vetor pET28a,
purificadas e utilizadas em ensaios in vitro para
determinação da relação lipase/protease.
H. Faoro, A. Glogauer, E.M. Souza, Liu U. Rigo,
Leonardo M. Cruz,Rose A. Monteiro and Fábio O.
Pedrosa. Identification of a new lipase family in the
Brazilian Atlantic Forest soil metagenome. Environ.
Microbiol. Rep, v.3(6), 750-755, 2011
Na primeira etapa do trabalho os clones em vetor pET
contendo os genes da lipase lipAP e a peptidase foram
confirmados por restrição. A clonagem do gene lipAP no vetor
pT7-7 também foi confirmada e permitira ensaios de coexpressão. Esses plasmídeos foram transformados na estirpe
Rosetta de E. coli para ensaios de superexpressão. A análise
dos géis indicou que as proteínas estão sendo expressas
corretamente com os tamanhos esperados.
MW I II III IV V VI VII VIII IX
66.2 kDa
45 kDa
35 kDa
I: LipAP (~ 48 kDa);
II: PepAP (~ 65 kDa);
III: PepAP + LipAP – 15 minutos;
IV: PepAP + LipAP – 30 minutos;
V: PepAP + LipAP – 45 minutos;
VI: PepAP + LipAP – 1 hora;
VII: PepAP + LipAP – 1,5 hora;
VIII:PepAP + LipAP – 2 horas;
IX: PepAP + LipAP – 3 horas.
Teste de atividade de PepAp sobre LipAP em E. coli. A partir da
combinação da LipAP purificada e do extrato da PepAP, foram feitos
testes em diferentes tempos de incubação.
As proteínas LipAP e Peptidase PepAP estão sendo
expressas em E. coli. A incubação de LipAP com o extrato
celular contendo PepAP sugere uma atividade hidrolítica de
PepAP sobre LipAP.