ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS BETA-PANCREÁTICAS
DE RATAS DIABÉTICAS EM DIFERENTES IDADES DE VIDA
FRANCIANE QUINTANILHA GALLEGO
Botucatu
2014
FRANCIANE QUINTANILHA GALLEGO
ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS CÉLULAS
BETA-PANCREÁTICAS DE RATAS DIABÉTICAS EM
DIFERENTES IDADES DE VIDA
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina
de Botucatu – Unesp, Programa de Pós-Graduação
em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia. Área de
concentração: Tocoginecologia, para obtenção do
título de Mestre.
Orientadora: Profa. Dra. Débora Cristina Damasceno
Co-orientadora: Profa. Dra. Yuri Karen Sinzato
Botucatu
2014
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE - CRB 8/5651
Gallego, Franciane Quintanilha.
Análise morfológica das células beta-pancreáticas de ratas diabéticas em
diferentes idades de vida / Franciane Quintanilha Gallego. - Botucatu, 2014
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Medicina de Botucatu
Orientador: Débora Cristina damasceno
Coorientador: Yuri Karen Sinzato
Capes: 40101150
1. Pâncreas - Doenças. 2. Diabetes. 3. Regeneração (Biologia). 4. Morfologia.
5. Células secretoras de insulina. 6. Rato como animal de laboratorio.
Palavras-chave: Células beta; Diabete; Morfologia; Ratas; Regeneração.
“Milagres acontecem quando a gente vai à
luta.”
(Sérgio Vaz)
Dedicatórias
Dedico esta dissertação à DEUS...obrigada Senhor por não
somente caminhar ao meu lado em todos os momentos da minha
vida, mas também me guiar em cada momento de indecisão, por
me fazer enxergar nas horas que eu estava cego, me alimentar
quando estava com fome, me consolar nas horas difíceis e me
proporcionar momentos de alegria. Acima de tudo obrigada por
me amar, mesmo sendo quem eu sou!
“Deus é a minha paz,
Deus é a minha felicidade,
Deus é a minha alegria,
Deus é a minha riqueza,
Deus é meu escudo,
Deus é meu TUDO!”
(Carlos Rodrigues Góes)
À minha mãe por ser esta mulher guerreira, que não mediu
esforços para que eu pudesse realizar este trabalho!
Te amo!
“Mãe, você que me deu o bem mais precioso, a vida.
Me esperou com tanto carinho, me ensinou os primeiros passos,
as primeiras palavras.
As lembranças mais antigas que tenho de você é sua mão
segurando a minha para me dar proteção.
Sua voz doce, contando histórias, me fazendo dormir e sonhar.
Um sonho sereno, tranqüilo, sabendo que você estaria ali a me
proteger.
Você que lutou, sorriu, chorou. Mas não deixou a amargura tomar
conta de seu coração. Você que me ensinou a ser mulher, mas
continuar com meus sonhos de criança.
A ser forte, sem ser amarga. Abrir meus caminhos, tomando
sempre cuidado com as plantinhas ao redor.
Com você aprendi a ser “gente” que respeita “gente”.
Aprendi a ter fé, aprendi a aceitar os defeitos das pessoas.
Espero que um dia eu possa ser para meus filhos metade do que
você é pra mim!”
(Autor desconhecido)
Ao meu Pai por sempre estar ao me lado, me apoiando, me
auxiliando e me guiando!
Te amo!
“Pai, que com respeito me viu crescer e deixou
que tome decisões importantes.
Lembra meu pai que sempre te amarei,
as vezes o coração não sabe dizer, só sabe sentir…
Me impulsas a continuar adiante
e a triunfar a me olhar no espelho e saber que tu me apoiarás…
Obrigado, por cada amanhecer que deixaste compartir ao teu
lado, por saber que estás aqui comigo em todo momento,
porque sei que estarás aqui para sempre…”
(Autor desconhecido)
Ao meu noivo Bruno, por todo carinho, paciência e apoio.
Você não é apenas uma pessoa importante na minha vida, você é
parte dela! Obrigada por fazer dos meus dias não apenas horas
passadas, e sim momentos inesquecíveis!
Te amo!
“Eu tenho tanto pra lhe falar
Mas com palavras não sei dizer
Como é grande o meu amor por você
E não há nada pra comparar
Para poder lhe explicar
Como é grande o meu amor por você
Nem mesmo o céu nem as estrelas
Nem mesmo o mar e o infinito
Nada é maior que o meu amor
Nem mais bonito
Me desespero a procurar
Alguma forma de lhe falar
Como é grande o meu amor por você
Nunca se esqueça, nem um segundo
Que eu tenho o amor maior do mundo
Como é grande o meu amor por você”
(Roberto Carlos)
Agradecimentos
Primeiramente gostaria de agradecer a minha orientadora, Profa.
Dra. Débora Cristina Damasceno, por todo ensinamento,
confiança, disponibilidade em me ajudar nos momentos mais
difíceis e por acreditar na minha capacidade em todos os
momentos, até mesmo quando eu não acreditava! Obrigada pelo
convívio, pela amizade e carinho.
“Um mero professor
apenas aponta o
caminho das estrelas;
Um professor de verdade
ajuda a alcançá-las”
(Lídia Vasconcelos)
Á Aline de Oliveira Netto, Bruna Dallaqua, Isabela
Lovizutto Iessi e Silvana Barroso Corvino e pela amizade sincera
dentro e fora do laboratório, por todo apoio nas horas de
dificuldade, pelos ensinamentos que cada uma me proporcionou
e pelos momentos de alegria que fizeram o meu caminho ter
mais vida! Obrigada por vocês terem me acolhido como um
membro da família! Sou eternamente grata pelo que vocês
fizeram e fazem por mim!
Amo vocês!
“Mais que uma mão estendida
mais que um belo sorriso
mais do que a alegria de dividir
mais do que sonhar os mesmos sonhos
ou doer às mesmas dores
muito mais do que o silêncio que fala
ou da voz que cala, para ouvir
é, a amizade, o alimento
que nos sacia a alma
e nos é ofertado por alguém
que crê em nós.”
(Autor Desconhecido)
À minha co-orientadora Profa. Dra. Yuri Karen Sinzato pelo
seu empenho e dedicação nas diversas análises e discussões
deste trabalho. Obrigada por compartilhar comigo seus
conhecimentos.
À Profa. Dra. Maricê Domingues Heubel por ter me iniciado
na pesquisa. Tenho certeza que sem o seu apoio eu não estaria
aqui hoje.
À Faculdade de Medicina de Botucatu – UNESP, em especial ao
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia e ao Laboratório de
Pesquisa Experimental de Ginecologia e Obstetrícia (LAPGO)
pela acolhida e concessão das dependências e aparelhos durante
a realização deste trabalho.
Aos funcionários da Seção de Pós-graduação Janete
Aparecida Nunes Silva, Márcia F. Quadros, Regina C. Spadin, Lilian
Cristina Nunes, Andréia Longo Devide e Nathanael P. Salles pela
dedicação e serviços prestados.
Aos funcionários do Departamento de Ginecologia e
Obstetrícia,
Aparecida
Benedita
Vasques,
César
Eduardo
Guimarães, Regina Célia Gamito e, em especial à Eliana Aguiar
Petri Nahas (coordenadora do programa de Pós-graduação em
Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia) e Solange Sako Cagliari
(secretária do programa de Pós-graduação em Ginecologia,
Obstetrícia e Mastologia) pela dedicação e auxílios prestados.
Aos funcionários da Biblioteca da Unesp de Botucatu pela
atenção durante o período do mestrado, pelo auxílio na pesquisa
bibliográfica e elaboração da ficha catalográfica.
Ao Grupo de Apoio a Pesquisa (GAP) da Faculdade de
Medicina de Botucatu e, em especial ao bioestatístico José
Eduardo Corrente pela assistência nas análises estatísticas e por
toda contribuição prestada.
Ao Carlos Eduardo Fonseca e Dra. Marcela Marcondes
Salgado
por
todo
auxílio
durante
as
técnicas
de
imunoistoquímica, pela paciência para ensinar e responder cada
pergunta realizada.
Á Profa. Dra Renee Laufer Amorim por ceder seu
laboratório para a realização deste projeto.
Aos amigos do Laboratório de Pesquisa Experimental de
Ginecologia e Obstetrícia: Aline Bueno, Aline de Oliveira Netto,
Ana Paula Machado de Almeida, Betina Gimenez Madueño,
Bruna Dallaqua, Cristiane Pernet Hara, Danny Laura Gomes
Fagundes, Fernanda Piculo, Gabriela Marini, Giovana Fernanda
Bento, Giovana Vesentini, Glilciane Morceli, Ilse Sodre da Motta,
Isabela L. Iessi, Jusciele Brogin Moreli, Joice Monaliza Vernini,
Livia Luz, Mariana Alvarez Arantes, Mikaela da Silva Corrêa,
Nathália Macedo, Rafael Gelaleti, Silvana Barroso Corvino e Yuri
Karen Sinzato, pela alegre convivência e ajuda durante os dois
anos de mestrado que foram essenciais para o desenvolvimento
deste trabalho. Muito obrigada!
As professoras Dra. Iracema de Mattos P. Calderon e Dra.
Marilza Vieira Cunha Rudge pelas discussões clínicas sobre
diabete e gravidez.
À Talísia Collachiti Moreto, técnica responsável pelo
Laboratório de Pesquisa Experimental em Ginecologia e
Obstetrícia, pela colaboração nas rotinas laboratoriais e
manutenção dos animais.
Á Marta Regina Russo Sarzi e Florian José Fontana,
funcionários do Laboratório de Histologia da Unipex, por toda
ajuda e serviços prestados.
À Capes pela bolsa concedida durante o início do mestrado.
À FAPESP pela bolsa (2011/15606-6) e auxílio (2011/18519-7)
concedidos que permitiram que eu me dedicasse integralmente à
minha pesquisa ao longo de todo o mestrado.
Aos animais que cederam suas vidas para a realização deste
trabalho, contribuindo cada dia mais com a ciência.
Sumário
CAPÍTULO 1 – Mechanisms of pancreatic beta cell regeneration
Revisão de literatura……………………………………………………….........................16
CAPÍTULO 2 - Análise morfológica das ilhotas pancreáticas do período
neonatal à idade adulta
Resumo.......................................................................................................24
Introdução..................................................................................................25
Materiais e Método....................................................................................26
Resultados..................................................................................................29
Discussão....................................................................................................39
Conclusão...................................................................................................41
Referências.................................................................................................41
CAPÍTULO 3 - Biomarcadores de regeneração de células beta pancreáticas
no modelo experimental de diabete moderado
Resumo.......................................................................................................46
Introdução..................................................................................................47
Materiais e Método....................................................................................50
Resultados..................................................................................................54
Discussão....................................................................................................70
Conclusão...................................................................................................72
Referências.................................................................................................73
ANEXOS......................................................................................................77
Capítulo 1
Artigo de revisão já publicado.
Gallego FQ, Damasceno DC. Mechanisms of pancreatic beta cell regeneration. Nutrição Brasil.
2013;12(5): 312-16.
Capítulo 2
ANÁLISE MORFOLÓGICA DAS ILHOTAS PANCREÁTICAS DURANTE A VIDA
MORPHOLOGICAL ANALYSIS OF PANCREATIC ISLET DURING LIFE
Franciane Quintanilha Gallego1, Yuri Karen Sinzato2, Iracema de Mattos Paranhos
Calderon3, Marilza Vieira Cunha Rudge3, Débora Cristina Damasceno3*
1
Pós-graduanda do Programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia,
Faculdade de Medicina de Botucatu, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil
2
Pós-doutoranda do Programa de Pós-graduação em Ginecologia e Mastologia, Faculdade de
Medicina de Botucatu, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil
3
Docente do Programa de Pós-graduação em Ginecologia e Mastologia, Faculdade de Medicina de
Botucatu, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil
*Correspondência:
Profa. Dra. Débora Cristina Damasceno
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia
Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP
Distrito de Rubião Júnior, s/n
Telefone: (14) 38801631
CEP: 18.618-970
Botucatu, São Paulo, Brasil
Email: [email protected]
Este artigo foi redigido de acordo com as normas de publicação da revista Pancreas (Qualis
A2), para a qual foi submetido para publicação.
RESUMO
Introdução: Muitos estudos mostram a regeneração pancreática em um ambiente diabético e não
exploram este processo no organismo saudável. Para compreender melhor os mecanismos
envolvidos na regeneração das ilhotas pancreáticas sem o envolvimento do diabete. Objetivo:
Avaliar a estrutura morfológica das ilhotas pancreáticas desde o período neonatal até a idade adulta
de ratas. Metodologia: Recém-nascidos do sexo feminino foram distribuídos aleatoriamente em
diferentes grupos de estudo para coleta do pâncreas e soro em diferentes períodos de vida (5, 15,
90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez). Para a análise histopatológica, foram considerados os
aspectos morfológicos observados na coloração de hematoxilina e eosina (HE). A análise
morfométrica foi realizada em sistema computadorizado de imagem (software KS-300, versão 3.0,
Zeiss). Para análise imunoistoquímica, foram utilizados os anticorpos anti insulina, anti PDX-1, anti
GLP-1, anti Ki-67 e anti caspase-3. A avaliação imunoistoquímica foi realizada por contagem de
células positivas através da grade de Weibel modificada. Resultados: Com cinco dias de vida, foi
observado menor área comparado a dos outros períodos. Na fase adulta e durante a prenhez, as
ratas apresentaram diminuição do número de células positivas para insulina e aumento de células
quiescentes comparado às dos dias 5 e 15 de vida pós-natal. Um pico de proliferação celular foi
observado no 15°dia de vida e, em todos os momentos estudados, foi observado maior frequência
de morte celular das células não-beta (β) das ilhotas pancreáticas (células α, δ e PP) em relação às
células β pancreáticas. Durante a prenhez, houve diminuição do número de células positivas para
GLP-1 em relação aos dias 5 e 15 de vida. Conclusão: As ilhotas pancreáticas apresentaram
mudanças em sua morfologia, sobretudo durante os primeiros 15 dias de vida, sendo estas
mudanças suficientes para alterar o funcionamento celular. As alterações encontradas durante a
prenhez ainda não estão bem esclarecidas. Desta forma, são necessários mais estudos em relação
ao período de prenhez visando compreender de forma mais clara os mecanismos fisiológicos
envolvidos.
Palavras-chave: Morfologia, ilhota pancreática, ratas, célula beta.
INTRODUÇÃO
Diabetes mellitus (DM) é considerada uma doença crônica caracterizada por hiperglicemia
resultante de resistência à insulina e/ou deficiência insulínica secundária à falha nas células beta
(β)-pancreáticas (1). Esta doença acomete 6% da população mundial e, até o ano de 2025, 300
milhões de indivíduos serão afetados com Diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e Diabetes mellitus tipo 2
(DM2) (2). DM1 é uma enfermidade autoimune onde ocorre deficiência de insulina e perda do
controle glicêmico, sendo causada por destruição de células β-pancreáticas mediada por células T
(3). O tratamento envolve administração diária de insulina para compensar a deficiência deste
hormônio (2). O DM2 é principalmente causado pela combinação da resistência à insulina e
secreção inadequada de insulina. Porém, em estágios tardios, o DM2 apresenta redução de 50% da
massa das células β-pancreáticas e 20-30% destes pacientes necessitam de insulina exógena para o
controle da hiperglicemia (4). Embora a insulina exógena possa melhorar os níveis de glicose
sanguínea, sua administração não assegura a monitorização contínua da glicemia e não previne
satisfatoriamente as complicações do diabete.
Diversos estudos são desenvolvidos para substituir o tratamento com insulina a fim de obter
uma terapia alternativa. A cura do DM1 e muitos casos do DM2 requerem a substituição ou
regeneração de células produtoras de insulina. Porém, encontrar um substituto funcional para a
“falta de células beta” ou restaurar sua capacidade regenerativa é uma meta no campo da pesquisa
do diabete (4). Para isso, é necessário compreender o mecanismo de formação das ilhotas.
O PDX-1 (fator de transcrição homeobox-1 duodeno-pancreático) é um fator de transcrição
expresso no duodeno e nas células beta (β) e delta (δ) pancreáticas, sendo necessário para o
desenvolvimento do pâncreas (5). Células β de embriões com 8,5 dias secretam PDX-1, o qual é
responsável pelo controle glicêmico estimulando a secreção de insulina (6 e 2). Alguns hormônios,
como o peptídeo glucagon-like 1 (GLP-1), estimulam a expressão do PDX-1 e também apresenta
ação direta sobre as células β induzindo a secreção e a biossíntese de insulina. Além disso, GLP-1
atua na diferenciação, proliferação de células β, além de diminuir o índice de apoptose nestas
células (7).
Em condições normais, o organismo mantém uma quantidade dinâmica de massa de células
β através da replicação de células pré-existentes ou por formação de novas células através de
precursores. Isto é necessário para a manutenção da homeostase da glicose (8). Estudos
demonstram que esta capacidade regenerativa do pâncreas em roedores ocorre por diferentes
mecanismos como neogênese, proliferação e transdiferenciação. A neogênese consiste na geração
de novas células a partir de células indiferenciadas. Quando células diferenciadas se desdiferenciam
e se tornam outro tipo de célula, é denominado transdiferenciação. Já a proliferação, consiste na
replicação de células existentes (9 e 10). Diversos trabalhos demonstram que, após perda de massa
celular severa, ratos apresentam regeneração das células β pancreáticas até o décimo dia de vida
neonatal (11, 12, 13, 14 e 15). Porém, estes estudos não esclarecem os mecanismos envolvidos na
regeneração das células β pancreáticas (16). Embora alguns trabalhos mostrem que a substituição
das células ocorra principalmente por células tronco chamadas de progenitores (17), existem outros
estudos que demonstram que o fígado de mamíferos adultos pode se regenerar a partir da
proliferação de hepatócitos maduros (18). Em ilhotas pancreáticas, tem sido demonstrado que
novas células produtoras de hormônios podem surgir através de replicação ou através da
diferenciação de células tronco que surgem frequentemente na proximidade dos ductos
pancreáticos (19 e 20), contudo estes resultados ainda são controversos.
A maioria dos estudos sobre regeneração pancreática é descrita envolvendo o ambiente
diabético, mas não explora este processo em um organismo saudável. Por isso existe a necessidade
de se investigar melhor o processo de regeneração pancreática em animais de laboratório,
considerando principalmente os aspectos éticos envolvidos. Desta forma, o objetivo do trabalho foi
avaliar a estrutura morfológica das ilhotas pancreáticas desde o período neonatal até a idade adulta
de ratas.
MATERIAIS E MÉTODO
1.
Animais
Foram utilizadas ratas da linhagem Wistar, fornecidas pelo Biotério da Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP) e mantidas no laboratório Experimental de Ginecologia e
Obstetrícia, sob condições controladas de temperatura (22  2ºC), umidade (70  10%) e ciclo
claro/escuro (12h), com água filtrada e ração ad libitum. Fêmeas e machos normoglicêmicos
foram acasalados para obtenção de recém-nascidos (RN) em nosso laboratório de pesquisa.
Todos os protocolos adotados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal de nossa Instituição (Número de protocolo 935/2012).
2.
Grupos Experimentais
Os RN do sexo feminino foram distribuídos aleatoriamente em diferentes grupos de estudo
(n= 5 animais/grupo) para coleta do pâncreas em diferentes períodos de vida:
D5: morte dos animais no 5º dia de vida
D15: morte dos animais no 15º dia de vida
D90: morte dos animais no 90º dia de vida
D18,5: morte dos animais no 18,5º dia de prenhez
3.
Sequência experimental
Obtenção de amostras de sangue e de pâncreas
As descendentes fêmeas foram anestesiadas letalmente com tiopental sódico e dessangradas
para obtenção de amostras de sangue, considerando os grupos experimentais de acordo com dias
de morte previamente estabelecidos. O animal foi colocado em decúbito dorsal e suas patas foram
fixadas à mesa de cirurgia para proceder a tricotomia da região abdominal. Em seguida, foi realizada
a laparotomia com incisão na linha média a partir de cartilagem xifóide terminando no púbis. O
fígado foi movido cranialmente para exposição do pâncreas. A pancreatectomia corpo-caudal foi
realizada por incisão lateral do fígado, estômago e duodeno. Após sua retirada, pâncreas foi fixado
em formalina a 10% para posterior análise morfológica e imunoistoquímica. Foi eleito D5 para
análise do início da regeneração das células β que ocorre até o 10º dia de vida do animal (11). A
partir da suposta regeneração destas células, definimos D15 (logo após a regeneração celular) e
D90 (fase adulta) e 18,5º dia de prenhez (início do crescimento máximo fetal).
Determinação de insulina sérica
As amostras de sangue obtidas nos dias D5, D15, D90 e na prenhez foram centrifugadas para
a obtenção do soro. O soro foi armazenado em freezer -80°C até serem utilizados. Para a dosagem
dos níveis de insulina, foi utilizado kit comercial (Crystal Chem Inc., local) para leitura em
microplacas por ELISA.
Análise morfológica do pâncreas
As amostras de pâncreas de todos os períodos foram fixadas em formalina tamponada 10%
por 24 horas e, em seguida, acondicionadas em etanol a 70%. Os fragmentos foram processados e
incluídos em parafina para posterior corte em micrótomo rotativo. Para análise histológica, foram
considerados os aspectos morfológicos observados na coloração de hematoxilina e eosina (HE). A
análise morfométrica foi realizada em sistema computadorizado de imagem (software KS-300,
versão 3.0, Zeiss), que recebe imagem por câmara digital (CCD-IRIS/RGB, Sony), acoplada a
microscópio (DMR, Leica).
Análise imunoistoquímica (IHQ) do pâncreas
Foram utilizadas amostras coletadas nos dias D5, D15, D90 e 18,5º dia de prenhez. A
técnica de IHQ foi realizada no Laboratório de Imunoistoquímica do Serviço de Patologia
Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnica (FMVZ), UNESP, Botucatu.
Secções de tecido de 5µm foram desparafinizadas e reidratadas por meio de banhos em
soluções de gradientes decrescentes de etanol. Os anticorpos primários foram anti insulina
(Mouse monoclonal [D6C4] to Insulin, abcam, cód.: ab8304), anti PDX-1 (Rabbit polyclonal to
PDX-1, abcam, cód.: ab47267) e anti GLP-1 (Rabbit polyclonal to GLP-1, abcam, cód.: ab39072).
Para a avaliação do índice proliferativo e da taxa apoptótica, foram utilizados os anticorpos
Ki-67 (Monoclonal mouse AntiHuman, Clone MIB-1, Dako Denmark) e anti caspase-3 (9661S,
Asp175, Cell Signalling Technology), respectivamente.
O procedimento imunoistoquímico incluiu as seguintes etapas: (1) recuperação antigênica do
tecido com solução de citrato (pH 6,0) em panela de pressão Pascal (Dako); (2) bloqueio da
peroxidase endógena através da incubação com 92% de metanol e 8% de peróxido de hidrogênio
para o anticorpo anti Ki-67 e anti caspase-3 e solução de peróxido de hidrogênio pronto para uso
(Spring, cód.: DHP-125) para os anticorpos anti insulina, anti PDX-1 e anti GLP-1 (3) bloqueio de
proteínas inespecíficas com Protein Block (Dako) para os anticorpos anti insulina, anti PDX-1, anti
GLP-1 e anti Ki-67, e solução de 8% de leite desnatado em pó para anti caspase-3; (4) incubação
com anticorpo primário com diluição de 1:10.000 para anti insulina por duas horas, 1:500 para
PDX-1 por duas horas e 1:100 para anti Ki-67 overnight, 1:100 para GLP-1 por duas horas e 1:50
overnight para anti caspase-3; (5) incubação com anticorpo secundário Histofine (Simple Stain Max
Po. Universal Immuno-peroxidase Polymer/Anti-Mouse and Rabbit) por 30 minutos à temperatura
de 27°C para todos os anticorpos; (6) revelação da peroxidase através do cromógeno DAB
(3,3-diaminobenzidina); (7) e contra-coloração com hematoxilina de Mayer.
A avaliação imunoistoquímica foi realizada pela contagem de células positivas através da
grade de Weibel modificada. Foram observados 20 campos em cada ilhota pancreática
encontrada em um total de dez ilhotas por lâmina.
4.
Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados por ANOVA seguida do Teste t. Para todas as
comparações, foi considerado limite mínimo de significância estatística de p<0,05.
RESULTADOS
As Figuras 1 e 2 mostram a área das ilhotas pancreáticas nos diferentes momentos de vida
analisados. No D5, foi observada menor área quando comparada a dos momentos D15 e D90 e na
prenhez (Figura 1A). A fotomocrografia das ilhotas pancreáticas (circuladas em vermelho) estão
representadas na Figura 1B.
A
B
5°dia (D5)
15°dia (D15)
90°dia (D90)
Prenhez (D18,5)
Figura 1. Área das ilhotas pancreáticas em diferentes idades de vida. (A) Área média das ilhotas nos
dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5°dia de prenhez. (B) Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas de
ratas nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5°dia de prenhez (Coloração: Hematoxilina e eosina – HE,
aumento 25X, 50 µm).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 5°dia de vida (Teste t).
A marcação para insulina pela técnica de imunoistoquímica foi representada na Figura 2
(células imunomarcadas para insulina representadas por setas pretas). Aos 90 dias de vida e durante
a prenhez, as ratas apresentaram diminuição do número de células positivas para insulina
comparada à dos dias 5 e 15 de vida pós-natal (Figura 2A). No 15°dia de vida e no período da
prenhez, as ilhotas pancreáticas apresentaram células em hipertrofia (células hipertróficas
representadas por setas laranjas). No grupo prenhe, também foi observado aumento de células
quiescentes em relação às das ratas sem prenhez (Figura 2B – células quiescentes representadas
por setas vermelhas).
A
B
5°dia
15°dia
Figura 2. Número de células marcadas para insulina. (A) Número médio de células marcadas para
insulina nos diferentes momentos da vida de ratas. (B) Fotomicrografia de imunoistoquímica com
células marcadas para insulina nas ilhotas pancreáticas de ratas nos diferentes momentos da vida
(Aumento 25X, 50 µm).
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 5°dia de vida (Teste t).
#
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 15°dia de vida (Teste t).
Os resultados para insulina sérica estão representados pela Figura 3. No quinto dia de vida,
a concentração de insulina foi menor em relação aos outros momentos estudados. Com 15 dias, os
animais apresentaram menor concentração em relação aos 90 dias de vida. Durante a prenhez foi
observado menor concentração de insulina quando comparado ao 90°dia (Figura 3).
Figura 3. Concentração sérica de insulina nos diferentes momentos da vida de ratas.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 5°dia de vida (Teste t).
#
$
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 15°dia de vida (Teste t).
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 90°dia de vida (Teste t).
O número médio de células imunomarcadas para Ki-67 foi representado na Tabela 1. Com 15
dias, as ratas apresentaram maior número de células imunomarcadas para Ki-67 em relação ao 5° e
90° dia de vida e 18,5º dia de prenhez. A Figura 4 representa a imunomarcação (representada pelas
setas) de Ki-67 nos diferentes momentos de vida analisados confirmando os achados da Tabela 1.
Tabela 1. Número médio de células marcadas para Ki-67 no ensaio de imunoistoquímica.
Períodos
Número médio de
5°dia
15°dia
90°dia
0,0252 ± 0,03
0,1520 ± 0,22*
0,000 ± 0,00#
18,5 prenhez
0,002 ± 0,009$
células marcadas
para Ki-67
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 5°dia de vida (Teste t).
#
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 15°dia de vida (Teste t).
$
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 15°dia de vida (Teste t).
5°dia
90°dia
15°dia
Prenhez
Figura 4. Fotomicrografia de imunoistoquímica com células marcadas para Ki-67 nas ilhotas
pancreáticas de ratas nos diferentes momentos de vida (Aumento 25X, 50 µm).
Em todos os momentos estudados, foi observada maior frequência de morte celular nas
células não β das ilhotas pancreáticas, ou seja, as células α, δ e PP em relação às de células β
pancreáticas (Figura 5B), porém durante a prenhez as células das ilhotas pancreáticas apresentaram
menor número de células positivas para caspase-3 do que os dias 5, 15 e 90 de vida (Figura 5imunomarcações representadas pelas setas).
A
B
5°dia
15°dia
90°dia
Prenhez
Figura 5. Número de células marcadas para caspase-3. (A) Número médio de células marcadas para
caspase-3 nos diferentes momentos de vida de ratas. (B) Fotomicrografia de imunoistoquímica com
células marcadas para caspase-3 nas ilhotas pancreáticas de ratas nos diferentes momentos de vida
(Aumento 25X, 50 µm).
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 5°dia de vida (Teste t).
#
$
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 15°dia de vida (Teste t).
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 90°dia de vida (Teste t).
O número de células positivas para GLP-1 foi demonstrado na Figura 6. As células não β
(Figura 6C – células não β representadas pelas setas pretas na periferia das ilhotas pancreáticas)
apresentaram diminuição do número de células positivas para GLP-1 em relação aos dias 5 e 15 de
vida de ratas (Figura 6A).
O número de células β positivas para GLP-1 (Figura 6C – células β representadas pelas setas
vermelhas no centro das ilhotas pancreáticas) foi maior no dia 15 de vida em relação aos outros
períodos estudados (Figura 6B).
A
B
C
5°dia
90°dia
15°dia
Prenhez
Figura 6. Número de células marcadas para GLP-1. (A) Número médio de células não β marcadas
para GLP-1 nos diferentes momentos de vida de ratas. (B) Número médio de células beta (β)
marcadas para GLP-1 nos diferentes momentos de vida de ratas. (C) Fotomicrografia de
imunoistoquímica de células marcadas para GLP-1 nas ilhotas pancreáticas de ratas nos diferentes
momentos de vida (Aumento 25X, 50 µm).
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 5°dia de vida (Teste t).
#
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao 15°dia de vida (Teste t).
A Figura 7 representa as ilhotas pancreáticas de ratas em diferentes momentos de vida
marcadas para o anticorpo PDX-1. No grupo D5 e D15 foi observada imunomarcação nas ilhotas
pancreáticas, ductos e ácinos, conforme representados nas fotomicrografias (imunomarcações
representadas pelas setas). Não foram apresentados dados numéricos de células imunomarcadas
com PDX1, porque não foi possível realizar a contagem destas células em função da intensa
marcação em diferentes locais das amostras pancreáticas analisadas.
Ácinos
5°dia
Ilhota Pancreática
Ducto
Ducto
15°dia
Ácinos
Ilhota Pancreática
90°dia
Ilhota Pancreática
Ilhota Pancreática
Prenhez
Figura 7. Fotomicrografia de imunoistoquímica de células marcadas para PDX-1 nas ilhotas
pancreáticas de ratas nos diferentes momentos de vida (Aumento 25X, 50 µm).
DISCUSSÃO
Nossos resultados mostraram que houve maior marcação relacionada à proliferação de
células β pancreáticas e maior número de células marcadas para insulina nos dias 5 e 15 em relação
à idade adulta. Além disso, foi verificado que a regeneração celular ocorreu além do tempo
proposto, isto é, a proliferação celular ocorreu mais intensamente no 15°dia de vida pós-natal.
Entretanto, muitos artigos descrevem que a regeneração pancreática ocorre desde o período
neonatal até o 10º dia de vida (11, 12, 13, 14 e 15), mostrando a necessidade de uma atenção
especial para o período de 10 a 15 dias de vida, que corresponde à terceira fase da lactação.
Embora fosse verificada regeneração das células β, a concentração de insulina sérica foi menor nos
dias 5 e 15 de vida. Aguayo-Mazzucato et al. (22) também observaram que, durante o período de
lactação (21 dias de vida) de roedores, ocorreu aumento do número de células β nas ilhotas
pancreáticas. Sugerimos que o fato de haver divergência entre o aumento do número de células β
secretando insulina e baixo nível de insulina circulante no 15º dia de vida poderia ser devido à
imaturidade destas células em relação aos 90 dias de vida. Com relação à prenhez, modelos in vivo
apresentam evidências que o pâncreas adulto tem capacidade de regeneração e que, durante a
prenhez, roedores apresentam aumento de duas a três vezes na massa de células β (23, 24 e 25). A
proliferação e a hipertrofia são a principal fonte para o aumento de massa celular (23 e 24). Nosso
estudo mostrou células hipertróficas na ilhota pancreática de ratas prenhes e número muito
reduzido de células β pancreáticas em proliferação. Isto pode estar relacionado com o momento
escolhido (18,5º dia de prenhez) para avaliar a proliferação celular, pois a literatura demonstra que
a proliferação de células β é acentuada entre o 13º e 15º dia de prenhez (período da organogênese
fetal) e reduzida entre os dias 18 e 19 (26). Além disso, foi observado aumento do número de
células quiescentes durante a prenhez. Isto sugere que uma diminuição de células β funcionais
reflete diretamente a concentração reduzida de insulina sérica encontrada neste período.
Em todos os períodos estudados, foram observadas células α, δ e PP (células não β)
marcadas para caspase-3. Sabe-se que a frequência de apoptose em células β pancreáticas é menor
que 0,5% em ratos (27), sugerindo que a meia-vida das células não β seja menor em relação à
meia-vida das células β, pois estas apresentam tempo de vida médio variando de 30 a 60 dias de
vida (28). No entanto, em nosso estudo, foi verificado que ocorreu diminuição do número de
células não β em apoptose durante a prenhez em relação aos outros momentos estudados.
Podemos inferir que esta redução se deve a uma nova onda de regeneração de células β
pancreáticas através da transdiferenciação de células não β para células β.
A contagem de células β marcadas para GLP-1 foi compatível ao o que aconteceu com a
imunomarcação para Ki 67, mostrando que o GLP-1 estimulou a proliferação de células β (7),
especialmente no dia 15 de vida, sendo compatível ao maior número de células marcadas para
insulina e à maior concentração de insulina sérica. O maior número de células não β em apoptose
no dia 15 foi equilibrada com o número de células β em proliferação para que fosse mantido o
balanço celular e a citoarquitetura na massa celular da ilhota pancreática. Nos dias 5 e 90 de vida, a
análise do número de células marcadas para Ki 67 e GLP-1 também foram compatíveis, visto que
foram menores em relação ao dia 15. No entanto, o nível de insulina sérica maior no 90º dia de vida
mostrou que as células β que se proliferaram no período neonatal atingiram a maturidade e foram
eficazes para sintetizar e secretar insulina nesta fase da vida.
Com relação à marcação para PDX-1, há evidências na literatura que o PDX-1 é um fator de
transcrição que apresenta papel fundamental para o desenvolvimento e manutenção do
funcionamento das células beta (β). Atua também como promotor da regeneração deste tipo
celular e na reprogramação de células não pancreáticas para células produtoras de insulina (21). Em
nosso estudo, foi observada a marcação de PDX-1 não somente na ilhota pancreática, mas também
em outras células do pâncreas como nos ácinos e nos ductos, mostrando que este marcador foi
inespecífico.
Desta forma, foi evidenciado, neste estudo, que a área das ilhotas pancreáticas aumentou
gradativamente com a idade compatível com os níveis de insulina sérica circulante. Com 15 dias de
vida, ocorreu um pico de proliferação das células β e maior número de células positivas para
insulina em relação à idade adulta. Associado a estes achados, houve aumento na concentração de
insulina sérica aos 90 dias de vida comparado aos primeiros dias de vida. Já na fase adulta e durante
a prenhez, o número de células marcadas para insulina se estabilizou, confirmando a maturidade
das células β pancreáticas. No entanto, no período da prenhez, foi observado maior número de
células quiescentes, que pode estar relacionado à diminuição da concentração de insulina.
Podemos sugerir que, para compensar esta redução, houve diminuição do numero de células não β
mortas por apoptose em relação aos outros momentos estudados através da transdiferenciação das
células não β para células β, sugerindo que houve uma nova onda de regeneração de células β
pancreáticas na prenhez.
CONCLUSÃO
Portanto, foi concluído que, as ilhotas pancreáticas de ratas apresentaram alterações na
estrutura morfológica, sobretudo durante os primeiros 15 dias de vida, e estas mudanças foram
suficientes para alterar a funcionalidade das células ao longo da vida. O processo de regeneração
das células β encontrado durante a prenhez ainda não está totalmente esclarecido. Desta forma,
estudos mais aprofundados são necessários para elucidar melhor os mecanismos pelo quais
ocorrem determinadas alterações morfológicas em períodos específicos da vida.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem Talísia Collachiti Moreto, pelo auxílio técnico no cuidado com os
animais; Yuri K Sinzato, Bruna Dallaqua, Isabela L Iessi, pelas discussões sobre diabete moderado, e
FAPESP, pela bolsa (Processo 2011/15606-6) e pelo auxílio financeiro concedidos (Processo
2011/18519-7).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
(1) American
Diabetes
Association
(ADA),
http://care.diabetesjournals.org/content/33/Supplement_1/S3.full.pdf+html
2013.
(2) Kordowich S, Mansouri A, Collombat P. Reprogramming into pancreatic endocrine cells
based on developmental cues. Mol Cell Endocrinol, 2009; 315(1-2): 11-8.
(3) Pechhold K, Koczwara K, Zhu X, Harrison VS, Walker G, Lee J, Harlan DM. Blood glucose
levels regulate pancreatic β-cell proliferation during experimentally-induced and
spontaneous autoimmune diabetes in mice. PLoS ONE, 2009; 4(3): 1-13.
(4) Limbert C, Päth G, Jakob F, Seufert J. Beta-cell replacement and regeneration: Strategies of
cell-based therapy for type 1 diabetes mellitus. Diabetes Res Clin Pract., 2008;79(3):389-99.
(5) Haber EP, Procópio J, Carvalho CRO, Carpinelli AR, Newsholme P, Curi R. New insights into
fatty acid modulation of pancreatic β-cell function. Int Rev Cytol, 2006; 248: 1-41.
(6) Scharfmann R, Duvillie B, Stetsyuk V, Filhoulaud G, Guillemain G. β-cell development:
the role of intercellular signals. Diabetes, obesity and metabolism, 2008; 10(4):
195-200.
(7) Bregenholt S, Moldrup A, Blume N, Karlsen AE, Friedrichsen BN, Tornhave D, Knudsen
LB, Petersen JS. The long-acting glucagon-like peptide 1 analogue, liraglutide, inhibits
β-cell apoptosis in vitro. Bioch Bioph Res Com, 2005, 330(2): 577-584.
(8) Bouckenooghe T, Vandewalle B, Moerman E, Danzé PM, Lukowiak B, Muharram G,
Kerr-Conte J, Gmyr V, Laine B, Pattou F. Expression of progenitor cell markers during
expansion of sorted human pancreatic beta cells. Gene Expr. 2005;12(2):83-98.
(9) Minami K and Seino S. Regeneration of the pancreas. Nihon Rinsho, 2008; 66(5):926-31.
(10) Bonner-Weir S, Weir GC. New sources of pancreatic beta-cells. Nat Biotechnol, 2005;
23(7):857-61.
(11) Bonner-Weir S, Trent DF, Honey RN, Weir GC. Responses of neonatal rat islets to
streptozotocin. Limited B-cell regeneration and hyperglycemia. Diabetes, 1981; 30(1):
64-69.
(12) Movassat J, Saulnier C, Portha B. Insulin administration enhances growth of the beta-cell
mass in streptozotocin-treated newborn rats. Diabetes, 1997; 46(9):1445-52.
(13) Thyssen S, Arany E, Hill DJ. Ontogeny of regeneration of β-cells in the neonatal rat after
treatment with streptozotocin. Endocrinology, 2006; 147 (5): 2346-56.
(14) Nicholson JM, Arany EJ, Hill DJ. Changes in islet microvasculature following
streptozotocin-induced β-cell loss and subsequent replacement in the neonatal rat.
Experimental Biology and Medicine, 2010; 235 (2): 189–98.
(15) Liang XD, Guo YY, Sun M et al. Streptozotocin-induced expression of Ngn3 and Pax4 in
neonatal rat pancreatic α-cells. World Journal of Gastroenterology, 2011; 17 (23): 2812-20.
(16) Damasceno DC, Sinzato YK, Bueno A, Netto AO, Dallaqua B, Gallego FQ, Iessi IL, Corvino SB,
Serrano RG, Marini G, Piculo F, Calderon IM, Rudge MV. Mild diabetes models and their
maternal-fetal repercussions. J Diabetes Res, 2013; 2013:473575.
(17) Choi Y, Ta M, Atouf F, Lumelsky N. Adult pancreas generates multipotent stem cells and
pancreatic and nonpancreatic progeny. Stem Cells, 2004; 22(6): 1070-84.
(18) Alison MR, Poulsom R, Forbes SJ. Update on hepatic stem cells. Liver, 2001; 21:367–373.
(19) Bonner-Weir S. Life and death of the pancreatic beta cells. Trends Endocrinol Metab, 2000;
11:375–378.
(20) Bouwens L, Kloppel G. Islet cell neogenesis in the pancreas. Virchows Arch, 1996;
427:553–560.
(21) Li SW, Koya V, Li Y, Donelan W, Lin P, Reeves WH, Yang LJ. Pancreatic duodenal homeobox 1
protein is a novel β-cell-specific autoantigen for type I diabetes. Lab Invest, 2010; 90(1):
31-39.
(22) Aguayo-Mazzucato C, Sanchez-Soto C, Godinez-Puig V, Gutiérrez-Ospina G, Hiriart M.
Restructuring of pancreatic islets and insulin secretion in a postnatal critical window. PLoS
One., 2006; 1:e35.
(23) Sorenson RL, Brelje TC. Adaptation of islets of Langerhans to pregnancy: β-cell growth,
enhanced insulin secretion and the role of lactogenic hormones. Horm. Metab Res, 1997;
29:301–7.
(24) Rieck S, Kaestner KH. Expansion of β cell mass in response to pregnancy. Trends
Endocrinol Metab, 2010; 21:151- 8.
(25) Karnik SK, Chen H, McLean GW, et al. Menin controls growth of pancreatic β-cells in
pregnant mice and promotes gestational diabetes mellitus. Science, 2007; 318:806–9.
(26) Ernst S, Demirci C, Valle S, Velazquez-Garcia S, Garcia-Ocaña A. Mechanisms in
the adaptation of maternal β-cells during pregnancy. Diabetes Manag, 2011; 1(2): 239-48.
(27) Scaglia L, Cahill CJ, Finegood DT, Bonner-Weir S. Apoptosis participates in the remodeling
of the endocrine pancreas in the neonatal rat. Endocrinology, 1997; 138(4):1736-41.
(28) Cnop M, Hughes SJ, Igoillo-Esteve M, Hoppa MB, Sayyed F, van de Laar L, Gunter JH, de
Koning EJ, Walls GV, Gray DW, Johnson PR, Hansen BC, Morris JF, Pipeleers-Marichal
M, Cnop I, Clark A. The long lifespan and low turnover of human islet beta cells estimated
by mathematical modelling of lipofuscin accumulation. Diabetologia, 2010; 53(2):321-30.
Capítulo 3
BIOMARCADORES DE REGENERAÇÃO DE CÉLULAS BETA PANCREÁTICAS NO
MODELO EXPERIMENTAL DE DIABETE MODERADO
BIOMARKERS OF PANCREATIC BETA CELL REGENERATION IN
EXPERIMENTAL MODEL OF MILD DIABETES
Franciane Quintanilha Gallego1, Yuri Karen Sinzato2, Marilza Vieira Cunha Rudge3,
Débora Cristina Damasceno3*
1
Pós-graduanda do Programa de Pós-graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia,
Faculdade de Medicina de Botucatu, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil
2
3
Pós-doutoranda do Programa de Pós-graduação em Ginecologia e Mastologia, Faculdade de
Medicina de Botucatu, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil
Docente do Programa de Pós-graduação em Ginecologia e Mastologia, Faculdade de Medicina de
Botucatu, Univ. Estadual Paulista – UNESP, Botucatu, São Paulo, Brasil
*Correspondência:
Profa. Dra. Débora Cristina Damasceno
Departamento de Ginecologia e Obstetrícia
Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP
Distrito de Rubião Júnior, s/n
Telefone: (14) 38801631
CEP: 18.618-970
Botucatu, São Paulo, Brasil
Email: [email protected]
RESUMO
Introdução: As ilhotas pancreáticas apresentam capacidade de se regenerar, porém, existe falta de
marcadores específicos para avaliar esta capacidade regenerativa ao longo da vida de animais.
Objetivo: Avaliar os biomarcadores de regeneração de células beta (β) no modelo experimental de
diabete moderado. Metodologia: Ratas recém-nascidas foram distribuídas aleatoriamente em dois
grupos experimentais: não-diabete (controle) e diabete moderado (DMod). O DMod foi induzido
nas fêmeas no primeiro dia de vida (D0) por via subcutânea no dorso (100 mg de streptozotocin/kg
de peso corporal). As ratas do grupo controle receberam somente o veículo da droga (tampão
citrato). Nos dias D5 e D15 de vida, foram coletadas amostras de sangue para determinação de
glicemia e de insulina. Os pâncreas foram retirados e processados para análise histopatológica e
imunoistoqu í mica (Ki-67, caspase-3, GLP-1, PDX-1, insulina). Estas mesmas an á lises foram
realizadas na fase adulta (D90 e 18,5º dia de prenhez), associadas às dosagens de hemoglobina
glicada (HbA1c) e ao teste oral de tolerância à glicose (TTG). Resultados: No D5, as ratas do grupo
DMod apresentaram aumento na glicemia e na marcação de Ki-67 (proliferação celular) comparado
ao grupo controle. Em todos os momentos analisados, o grupo DMod apresentou menor área das
ilhotas pancreáticas em relação ao controle. A marcação por caspase-3 (morte celular) foi maior nos
dias 5 e 15 de vida e 18,5º dia de prenhez de ratas DMod. Além disso, estas ratas apresentaram
alteração no TTG e maior porcentagem de HbA1c. Com 15 dias de vida, as fêmeas DMod
apresentaram maior número de células marcadas para GLP-1 (estimula a expressão do PDX-1).
Independentemente do grupo, no D5 e D15, foi verificada imunomarcação de PDX-1
(desenvolvimento e manutenção da função de células β) nas ilhotas pancreáticas, ductos e nos
ácinos. Conclusão: Os biomarcadores utilizados neste estudo foram eficazes para demonstrar a
regeneração das células β pancreáticas frente à destruição das mesmas após a indução do diabete.
Contudo, esta regeneração não foi suficiente para compensar a perda de células que ocorreu logo
no início da vida neonatal, levando a prejuízo na fase adulta destes animais.
Palavras-chave: diabete, células beta-pancreáticas, regeneração, morfologia.
INTRODUÇÃO
Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por elevados níveis de
glicose sanguínea que resulta em defeitos na capacidade do corpo de sintetizar e/ou utilizar insulina
(1). Acomete 6% da população mundial e, até o ano de 2025, 300 milhões de indivíduos podem ser
afetados com Diabetes mellitus tipo 1 (DM1) e Diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (2). Na América Latina,
há uma tendência ao aumento da freqüência entre as faixas etárias mais jovens, cujo impacto
negativo sobre a qualidade de vida e os encargos relacionados a esta doença ao sistema de saúde é
preocupante. No Brasil, é observado um número crescente nas hospitalizações por diabete em
proporções superiores aos outros tipos de causa, o que traduz o aumento de sua prevalência (3).
Nos últimos 20 anos, o DM representa um aumento médio de 21,4% (4). Com relação às classes do
DM, DM1 é uma enfermidade auto-imune onde ocorre deficiência de insulina e perda do controle
glicêmico, sendo causada por destruição de células beta (β)-pancreáticas mediada por células T (5).
O tratamento envolve administração diária de insulina para compensar a deficiência deste
hormônio (2). DM2 é caracterizado por disfunção de células β e diminuição da ação da insulina em
alguns tecidos (6). Outra classificação do Diabetes mellitus é o DM gestacional, que ocorre por
diminuição da tolerância à glicose de magnitude variável. É diagnosticado pela primeira vez na
gestação, podendo ou não persistir após o parto (7). Sendo assim, pacientes com secreção
insuficiente de insulina podem desenvolver DM1 ou DM2 (6) por alterações em células
β-pancreáticas. Desta forma, cabe ressaltar que o pâncreas apresenta papel importante na
homeostase nutricional relacionado à síntese e secreção de hormônios e enzimas.
O pâncreas é composto por duas porções: endócrina e exócrina. A porção exócrina consiste
em células acinares responsáveis pela secreção de enzimas digestivas. As células alfa (α), beta (β),
epsilon (γ), delta (δ) e PP são consideradas células endócrinas que, quando agrupadas são
denominadas Ilhotas Pancreáticas (anteriormente denominadas de Langerhans). As células α são
responsáveis pela síntese de glucagon, enquanto que as células β são sintetizadoras e secretoras de
insulina. Já as células δ e PP, sintetizam e secretam somatostatina e polipeptídeo pancreático,
respectivamente (2). Sendo assim é muito importante compreender o mecanismo de formação das
ilhotas para desenvolver terapias para o diabete sob o ponto de vista celular. Alguns hormônios,
como o peptídeo glucagon-like 1 (GLP-1), são utilizados para o tratamento do diabete. Este
hormônio estimula a expressão do PDX-1 e também apresenta ação direta sobre as células β
induzindo a secreção e a biossíntese de insulina (8). O PDX-1 é um fator de transcrição expresso no
duodeno e células pancreáticas β e δ, sendo necessário para o desenvolvimento do pâncreas (9).
Células β de embriões com 8,5 dias secretam PDX-1, o qual é responsável pelo controle glicêmico
por estimular a secreção de insulina (6, 2). Diversos estudos têm demonstrado que células
pancreáticas maduras derivam de células progenitoras secretoras de PDX-1 (10). A inativação do
PDX-1 em células β, em idade gestacional tardia, resulta em diminuição da proliferação de células
secretoras de insulina e aumento daquelas produtoras de glucagon (11, 2). Logo, PDX-1 apresenta
papel fundamental no desenvolvimento e manutenção da função de células β e também atua como
promotor da regeneração deste tipo celular e na reprogramação de células não pancreáticas a
células produtoras de insulina (12). Em condições normais, o organismo mantém uma quantidade
dinâmica de massa de células β pela replicação de células pré-existentes ou pela formação de novas
células através de precursores. Isto é necessário para a manutenção da homeostase da glicose (13).
Porém, em caso de perda celular severa, os roedores apresentam aumento da capacidade
regenerativa das células β para tentar reparar este dano (14, 15).
A maioria dos estudos com pâncreas e regeneração in vivo utiliza animais de
experimentação. Nos roedores (camundongos e ratos), as células β estão agrupadas no centro da
ilhota e as células α, δ e PP se localizam ao redor das células β (16). Já nos seres humanos, estas
células estão dispostas de maneira dispersa, sem organização específica. Esta diferença está
associada a variações na morfogênese do pâncreas. Foi verificado que, nos humanos, ocorre
superexpressão do gene HNF-6 (Hepatocyte Nuclear Factor-6) nas ilhotas e isto faz com que as
células α, δ e PP não estejam presentes na periferia das ilhotas e sim dispersas (11). Embora
existam algumas diferenças na organização das células das ilhotas pancreáticas nos roedores em
relação aos primatas, há muitas semelhanças quanto às funções e às linhagens celulares que as
compõe. Portanto, o uso de animais de laboratório, dentre eles os ratos, para investigar as
alterações biológicas em muitas áreas do conhecimento ainda se mantém como o modelo preferido
(17).
Para desenvolver um modelo animal que mimetize o quadro clínico de Diabetes mellitus,
diferentes metodologias são empregadas, dentre elas a pancreatectomia parcial ou total, uso de
agentes β-citotóxicos (aloxana e streptozotocin) e corticóides. Streptozotocin (STZ) é uma droga
capaz de inibir a síntese de pró-insulina nas células β-pancreáticas, induzindo o diabete (18). Foi
demonstrado que o STZ administrado na vida neonatal de ratos, estes apresentaram diabete
moderado (glicemia entre 120 a 360 mg/dL) na vida adulta. No entanto, estes animais mostraram
rápida remissão do diabete três a cinco dias após a administração de STZ (19, 20). Liang et al. (21)
verificaram que esta remissão ocorre porque as células α foram capazes de se desdiferenciar em
precursores de células β no pâncreas de ratos neonatos, processo denominado de
transdiferenciação. Outros autores demonstraram que a replicação de células β é o primeiro
mecanismo de manutenção de células no período neonatal e que, provavelmente, há proliferação
celular no caso de regeneração pancreática (22). Em outro estudo foi observado a neogênese, ou
seja, formação de novas células β a partir de precursores já existentes, principalmente quando
houve tratamento com exedina-4 (análogo ao hormônio glucagon-like peptide-1 – GLP-1), que
estimula a expressão do PDX-1, mostrando que este análogo apresenta um papel regulatório na
reorganização das ilhotas em filhotes de ratos que receberam STZ (23). Estes estudos apontam que
a regeneração das células β pode ocorrer por diferentes mecanismos: neogênese, proliferação e
transdiferenciação de células. Neogênese consiste na geração de novas células a partir de células
indiferenciadas (stem cell). Transdiferenciação, quando uma célula diferenciada se desdiferencia e
se torna outro tipo celular. Já a proliferação, consiste na replicação de novas células a partir de
células pré-existentes (14, 15). A literatura mostra que muitos dos processos de regeneração
pancreática ocorrem após um estímulo patológico e logo no início da vida dos animais. Entretanto,
há relatos sobre os mecanismos de expansão de células β, sendo verificada divisão celular, em ratos
adultos e camundongos com aceleração do processo em condições patológicas e também
fisiológicas (24). Além disso, foi observado que a taxa proliferativa das células β aumenta na
adolescência, prenhez, obesidade e quando há manipulação da dieta (25, 24, 26).
Sendo assim, frente a vários questionamentos ainda existentes com relação aos momentos
em que ocorre a regeneração pancreática, mecanismos envolvidos e a falta de marcadores
específicos relacionados à regeneração das ilhotas pancreáticas, o objetivo deste trabalho foi avaliar
os biomarcadores de regeneração de células β no modelo experimental de diabete moderado.
MATERIAIS E MÉTODO
1.
Animais
Foram utilizadas ratas da linhagem Wistar, fornecidas pelo Biotério da Universidade
Estadual de Campinas (UNICAMP) e mantidas no Laboratório de Pesquisa Experimental de
Ginecologia e Obstetrícia, sob condições controladas de temperatura (22  2ºC), umidade (70
 10%) e ciclo claro/escuro (12h), com água filtrada e ração ad libitum. Essas ratas foram
acasaladas com machos normoglicêmicos para obtenção de recém-nascidos (RN). Todos os
protocolos adotados neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação
Animal de nossa Instituição (Número de protocolo 935/2012).
3.
Grupos Experimentais
Os RN do sexo feminino foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos de estudo (n= 5
animais/grupo) em diferentes períodos de vida:
- Grupo Não-diabético (Controle):
D5: morte no 5º dia de vida
D15: morte no 15º dia de vida
D90: morte no 90º dia de vida
D18,5: morte no 18,5º dia de prenhez
- Diabético (DMod):
D5: morte no 5º dia de vida
D15: morte no 15º dia de vida
D90: morte no 90º dia de vida
D18,5: morte no 18,5º dia de prenhez
5.
5.1.
Seqüência experimental
Período de diabetogênese - Indução do diabete moderado
O diabete moderado foi induzido nas RN fêmeas no primeiro dia de vida (D0) por via
subcutânea no dorso [100 mg de streptozotocin (STZ)/kg de peso corporal] (27). As ratas do grupo
controle receberam somente o veículo (tampão citrato), na mesma dose, via e idade
correspondente ao grupo que recebeu a droga diabetogênica. No 5º dia de vida (D5), a glicemia dos
RN foi mensurada, sendo que as fêmeas que receberam STZ e apresentaram glicemia ≥ 400 mg/dL
foram incluídas no grupo Dmod e as fêmeas que receberam somente o veículo e apresentaram
glicemia ≤ 120mg/dL foram incluídas no grupo Controle. Todas as ratas foram mantidas com suas
mães (máximo de oito RN fêmeas = número de tetos) até o término do período de amamentação
(21 dias). As mães foram anestesiadas letalmente com tiopental sódico (50 mg/kg - Thiopentax®) e
mortas de acordo com os grupos de experimento (D5, D15, D90 ou D18,5).
5.2.
Experimentos em D5, D15, D90: Obtenção das amostras de sangue e de pâncreas
Para a obtenção de amostras de sangue e coleta de tecido pancreático nos diferentes
momentos da vida, as descendentes fêmeas dos grupos controle e DMod foram anestesiadas
letalmente com tiopental sódico e dessangradas para obtenção de amostras de sangue para
determinação de glicemia e de insulina. Foi eleito D5 para análise do início da regeneração das
células β que ocorre até o 10º dia de vida do animal (28). A partir da suposta regeneração destas
células, definimos D15 (logo após a regeneração celular) e D90 (fase adulta).
Dosagem de glicose sanguínea
Nos dias D5, D15 e D90, as glicemias foram mensuradas colhendo-se uma gota de
sangue por punção com agulha na parte distal da cauda de cada rata e depositando-a em
glicofita. As glicofitas foram lidas em glicosímetro convencional (One Touch Ultra, Johnson &
Johnson®, local) para determinação glicêmica e os valores foram expressos em miligramas por
decilitro (mg/dL).
Determinação de insulina sérica
As amostras de sangue obtidas nos dias D5, D15 e D90 foram processadas para obtenção
do soro, os quais foram armazenados para futura dosagem dos níveis de insulina utilizando kits
comerciais (Crystal Chem Inc., local) para leitura em microplacas por ELISA em nosso laboratório.
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as instruções do fabricante.
Teste oral de Tolerância à glicose (TTG)
Aos 85 dias de vida, foi realizado o TTG para avaliação de alterações no metabolismo
glicêmico. TTG é um marcador empregado rotineiramente na clínica e foi realizado de acordo com o
protocolo clínico para diagnóstico de diabete. Após seis horas de jejum, foi coletada uma gota de
sangue por punção venosa na cauda das ratas para determinação glicêmica (tempo 0). Logo após,
as ratas receberam solução de glicose (0,2 g/mL) via intragástrica (gavage) na dose de 2,0 g/kg de
peso corpóreo. Decorridos 15, 30, 60 e 120 minutos após a administração da solução de glicose,
foram determinadas as glicemias (29).
Dosagem de hemoglobina glicada (HbA1c)
No dia D90, foram colhidas amostras de sangue total materno em tubos com EDTA,
armazenadas em freezer -80ºC e as dosagens foram realizadas em laboratório privado (Vida Vet
Botucatu).
Análise histopatológica do pâncreas
Nos dias D5, D15 e D90, as ratas foram anestesiadas com tiopental sódico (Thiopentax· -
dose de 50 mg/kg) para retirada dos pâncreas. As amostras de pâncreas foram fixadas em formalina
tamponada por 24 horas e, em seguida, acondicionadas em etanol a 70%. Os fragmentos foram
processados e incluídos em parafina para posterior corte em micrótomo rotativo. Para análise
histopatológica, foram observados os aspectos morfológicos das amostras pela coloração de
hematoxilina e eosina (HE). A análise morfométrica foi realizada em sistema computadorizado de
imagem (software KS-300, versão 3.0, Zeiss), que recebe imagem por câmara digital (CCD-IRIS/RGB,
Sony), acoplada a microscópio (DMR, Leica).
Análise imunoistoquímica (IHQ) do pâncreas
A técnica de IHQ foi realizada no Laboratório de Imunoistoquímica do Serviço de Patologia
Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ), UNESP, Botucatu. Secções de
tecido de 5 µm foram desparafinizadas e reidratadas por meio de banhos em soluções de gradientes
decrescentes de etanol. Os anticorpos primários foram anti insulina (Mouse monoclonal [D6C4] to
Insulin, abcam, cód.: ab8304), anti PDX-1 (Rabbit polyclonal to PDX-1, abcam, cód.: ab47267) e anti
GLP-1 (Rabbit polyclonal to GLP-1, abcam, cód.:ab22625). Para a avaliação do índice proliferativo e
taxa apoptótica, foram utilizados os anticorpos Ki-67 (Monoclonal mouse AntiHuman, Clone MIB-1,
Dako Denmark), anti caspase-3 (9661S, Asp175, Cell Signalling Technology). A marcação
imunoistoquímica
foi
realizada
por
contagem
de
células
positivas.
O
procedimento
imunoistoquímico incluiu as seguintes etapas: (1) recuperação antigênica do tecido com solução de
citrato (pH 6,0) em panela de pressão Pascal (Dako); (2) bloqueio da peroxidase endógena através
da incubação com 92% de metanol e 8% de peróxido de hidrogênio para o anticorpo anti Ki-67 e
anti caspase-3. Para os anticorpos anti insulina, anti PDX-1 e anti-GLP-1, foi utilizada a solução de
peróxido de hidrogênio pronto para uso (Spring, cód.: DHP-125) (3) bloqueio de proteínas
inespecíficas com Protein Block (Dako) para os anticorpos anti insulina, anti PDX-1, anti-GLP-1 e anti
Ki-67, e solução de 8% de leite desnatado em pó para anti caspase-3; (4) incubação com anticorpo
primário com diluição de 1:10.000 para anti insulina por duas horas, 1:500 para PDX-1 por duas
horas e 1:100 para anti Ki-67 overnight, 1:100 para GLP-1 por duas horas e 1:50 overnight para anti
caspase-3; (5) incubação com anticorpo secundário Histofine (Simple Stain Max Po. Universal
Immuno-peroxidase Polymer/Anti-Mouse and Rabbit) por 30 minutos à temperatura de 27°C para
todos os anticorpos; (6) revelação da peroxidase através do cromógeno DAB (3,3-diaminobenzidina);
(7) e contra-coloração com hematoxilina de Mayer. A contagem de células positivas foi realizada
através da grade de Weibel modificada. Foram observados 20 campos em cada ilhota pancreática
encontrada em um total de dez ilhotas por lâmina.
5.3.
Experimento durante a prenhez das ratas - Períodos de acasalamento e de prenhez
A fase de acasalamento teve duração máxima de 15 dias, que envolve pelo menos três
ciclos estrais. Cada conjunto de quatro ratas foi colocado em gaiolas de polietileno, com cama de
maravalha, na presença de um rato macho não-diabético durante o período noturno. Este
procedimento foi realizado até atingir o número de réplicas em cada grupo experimental. Na manhã
subsequente, os machos foram retirados e os esfregaços vaginais das fêmeas foram colhidos. O
fator indicativo de prenhez foi presença de espermatozóides (30) nos esfregaços contidos nas
lâminas analisadas, sendo este considerado dia 0,5 de prenhez. Durante a prenhez, as fêmeas foram
mantidas em gaiolas individuais.
Determinação glicêmica e de insulina sérica
No 18,5º dia de prenhez, amostras de sangue foram colhidas para determinação de
glicemia e de insulina sérica (de acordo com as metodologias descritas acima nos dias que
antecederam o período de prenhez).
Teste oral de Tolerância à glicose (TTG)
No 17,5º dia de prenhez, o TTG foi realizado de forma semelhante ao que foi exposto
nos dias que antecederam o período de prenhez (D5, D15 e D90).
Análise histopatológica e imunoistoquímica do pâncreas
As amostras de tecido pancreático foram processadas e analisadas de forma
semelhante ao que foi exposto nos dias que antecederam o período de prenhez (D5, D15 e D90).
6.
Análise estatística
Os resultados foram estatisticamente analisados por ANOVA seguido do Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey ou do Teste t. Para todas as comparações foi considerado limite
mínimo de significância estatística de p<0,05.
RESULTADOS
No 5° dia de vida (D5), as ratas que receberam a droga β citotóxica (streptozotocin)
apresentaram glicemia maior em relação à dos animais do grupo controle. As ratas DMod tiveram
menores níveis glicêmicos nos dias D15 e D90 em relação aos do dia D5 do mesmo grupo (Figura 1).
Na fase adulta (90 dias e na prenhez), as ratas apresentaram maiores valores glicêmicos
comparados aos das ratas controle (Figuras 1 e 2).
Figura 1. Média glicêmica de ratas controle e com diabete moderado (DMod) com 5, 15 e 90 dias de
vida.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste t).
α
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 2. Média glicêmica durante a prenhez de ratas controle e com diabete moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste t).
Aos 90 dias de vida, as ratas DMod mostraram maiores porcentagens de hemoglobina
glicada em relação às das ratas controle (Figura 3).
Figura 3. Porcentagem de hemoglobina glicada de ratas controle e com diabete moderado (DMod)
no 90º dia de vida.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste t).
As Figuras 4 e 5 mostram a curva do teste oral de tolerância à glicose (TTG) de ratas do
grupo controle e diabete moderado com 85 dias de vida (Figura 4) e no 17º dia de prenhez (Figura
5). Após a sobrecarga de glicose, independentemente do período em que foi realizado o teste, foi
verificado aumento nos níveis glicêmicos nas fêmeas do grupo DMod nos tempos 15, 30 e 60
minutos comparados aos das ratas controle.
Figura 4. Teste oral de tolerância à glicose (TTG) no 90o dia de vida de ratas controle e com diabete
moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 5. Teste oral de tolerância à glicose (TTG) no 17o dia de prenhez de ratas controle e com
diabete moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Com relação à área das ilhotas pancreáticas, as ratas DMod apresentaram menor área das
ilhotas em todos os períodos analisados comparados aos do grupo controle. Quando foi realizada a
comparação intra-grupos, as ratas prenhes do grupo DMod apresentaram maior área comparada à
das ratas do dia D15 (Figura 6).
Figura 6. Área média das ilhotas de ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e
90 de vida e no 18,5º dia de prenhez.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo Controle (Teste t).
β
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Nas análises das imagens coradas com hematoxilina e eosina (HE), foi possível observar que
as ratas DMod com cinco dias perderam a citoarquitetura das ilhotas pancreáticas e apresentaram
extensões ao seu redor. Aos 15 e 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez, as ratas DMod
mostraram citoarquitetura similar à do grupo controle (Figura 7). A área das figuras foi
representada pelo círculo em vermelho.
Figura 7. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado
(DMod) aos 5, 15 e 90 dias de vida e no 18,5º dia de prenhez (Coloração: Hematoxilina e eosina –
HE, aumento 25X, 50 µm).
As concentrações de insulina sérica das ratas dos grupos controle e DMod estão
representadas na Figura 8. As ratas adultas (D90 e 18,5º dia de prenhez) do grupo DMod
apresentaram maiores concentrações de insulina sérica comparadas às das ratas DMod nos dias
D5 e D15. No D15, houve diminuição e, no 18,5º dia de prenhez, aumento da concentração de
insulina sérica nas ratas DMod em relação à das ratas controle (Figura 8).
Figura 8. Concentração de insulina sérica de ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos
dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
α
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
β
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Em relação à marcação positiva para insulina nas ilhotas pancreáticas, foi observado que,
no dia D5, D15 e D18,5. As ratas com diabete moderado apresentaram diminuição do número de
células marcadas para insulina comparado ao das ratas controle nos mesmo dias analisados.
Comparando as ratas do grupo DMod, as ratas com 90 dias apresentaram aumento do número de
células imunomarcadas para insulina em relação aos dias D15 e D5. As ratas com 15 dias mostraram
mais células imunomarcadas comparadas as do dia 5. No 18,5º dia de prenhez, houve redução no
número de células marcadas para insulina em relação ao dos dias D5 e D90 (Figura 9). Estas
comparações podem ser observadas nas fotomicrografias das ilhotas pancreáticas marcadas para
insulina apresentadas na Figura 10).
Figura 9. Numero de células imunomarcadas para insulina nas ilhotas pancreáticas de ratas controle
e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
α
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
β
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
δ
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D90 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 10. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para insulina de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez
(Aumento 25X, 50 µm).
O número médio de células imunomarcadas para o marcador de proliferação celular Ki-67
foi representado na Tabela 1. No grupo DMod, o numero médio de células imunomarcadas para
Ki-67 foram menores no dia D15, D90 e D18,5 em relação ao do dia D5. O número de células
imunomarcadas nas ratas do grupo DMod foi maior no D5 e menor no D15 em relação ao do grupo
controle. (Tabela 1 e Figura 11).
Tabela 1. Número médio de células com imunomarcação positiva para insulina nas ilhotas
pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no
18,5º dia de prenhez.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
α
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 11. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para Ki-67 em ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez
(Aumento 25X, 50 µm).
Em relação as células não β marcadas para GLP-1, as ratas DMod nos dias D5 e D15
apresentaram maior número de células imunomarcadas positivamente para GLP-1 em relação ao do
grupo controle nos mesmos períodos. Na comparação intra-grupo do grupo DMod, foi observado
menor número de células na fase adulta, independentemente da prenhez, comparado ao dos dias
D5 e D15 (Figura 12A). As células β marcadas para GLP-1 apresentaram diminuição no número de
células nos dias 5 e 15 quando comparado ao grupo controle. No grupo diabético, houve aumento
no número de células de acordo com a idade do animal, e se estabilizou na vida adulta (D90 e
prenhez) (Figura 12B).
A
B
Figura 12. Número de células imunomarcadas para GLP-1 nas ilhotas pancreáticas de ratas controle
e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez. (A) Número
de células não β imunomarcadas para GLP-1 nas ilhotas pancreáticas de ratas controle e com
diabete moderado (DMod). (B) Número de células β imunomarcadas para GLP-1 nas ilhotas
pancreáticas de ratas controle e com diabete moderado (DMod).
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
α
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
β
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia 15 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
As fotomicrografias das ilhotas pancreáticas das ratas controle e com diabete moderado
(DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez estão apresentadas na Figura 13. A
marcação das células não β para GLP-1 foi representada por setas pretas (periferia das ilhotas
pancreáticas) e a marcação para GLP-1 das células β foram representadas por setas vermelhas
(centro das ilhotas pancreáticas).
Figura 13. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para GLP-1 de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez
(Aumento 25X, 50µm).
A morte por apoptose foi analisada utilizando como marcador a caspase-3 e esta
representada nas Figuras 13 e 14. Foi observado que, independentemente do momento e dos
grupos de estudo, maior numero de celulas com morte por apoptose nas células não β (Figura 15).
O grupo DMod apresentou maior numero de células imunomarcadas para caspase-3 nos dias D5,
D15 e D18,5 comparado ao das ratas controle nos mesmos momentos analisados. No grupo DMod,
as ratas dos dias D90 e D18,5 mostraram menor número de células com morte por apoptose em
relação ao do dia D15 e as ratas do dia D15 tiveram maior número de células imunomarcadas
quando comparado ao do dia D5 (Figura 14).
Figura 14. Número de células imunomarcadas para caspase-3 nas ilhotas pancreáticas de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez.
Dados expressos como média ± desvio padrão.
*p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao grupo controle (Teste t).
α
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D5 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
β
p<0,05 – diferença estatisticamente significativa em relação ao dia D15 do grupo DMod (Teste de
Comparações Múltiplas de Tukey).
Figura 15. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para Caspase-3 de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez
(Aumento 25X, 50µm).
A Figura 16 representa as ilhotas pancreáticas de ratas marcadas para o anticorpo PDX-1 nos
diferentes grupos e momentos de vida. Independentemente do grupo, no dia D5, foi possível
observar imunomarcação nas ilhotas pancreáticas, ductos e ácinos. Nos dias D15, D90 e D18,5, a
marcação para PDX-1 ficou mais evidente nas ilhotas pancreáticas nos diferentes grupos.
Figura 16. Fotomicrografia das ilhotas pancreáticas com imunomarcação para PDX-1 de ratas
controle e com diabete moderado (DMod) nos dias 5, 15 e 90 de vida e no 18,5º dia de prenhez
(Aumento 25X, 50µm).
DISCUSSÃO
No presente estudo, foi verificado pela análise morfológica das ilhotas pancreáticas que,
quatro dias após a administração da droga beta-citotóxica (streptozotocin), as ratas mostraram
estrutura morfológica alterada, deixando de apresentar o formato arredondado para apresentar
extensões a sua volta, abrangendo não somente as células do pâncreas endócrino, mas também
células do ducto e dos ácinos. No 5º dia de vida, as ratas também apresentaram aumento dos níveis
glicêmicos (superiores a 400 mg/dL) e diminuição do número de células beta (β). No entanto, foi
observada proliferação celular aumentada em todo o pâncreas, sugerindo um mecanismo de
regeneração compensatório como resposta à perda de células que ocorreu após a administração do
streptozotocin. A literatura evidencia que a replicação de células β é o primeiro mecanismo de
manutenção celular no período neonatal e que, provavelmente, há proliferação celular no caso da
regeneração pancreática (22).
Com relação aos estudos realizados no 15º dia de vida de ratas que receberam
streptozotocin, o número de células em proliferação diminuiu, não apresentaram mais a
hiperglicemia, mas houve aumento do número de células marcadas para insulina em relação ao 5º
dia de vida. Estudos demonstraram que, quando streptozotocin foi administrado na vida neonatal
de ratos, estes animais apresentaram rápida remissão do diabete três a cinco dias após a
administração da droga β citotóxica, mas desenvolveram o diabete moderado (glicemia entre 120 a
360 mg/dL) na vida adulta (31, 32). Nossos resultados mostraram que as ratas com 15 dias de vida
tiveram aumento do número de células em apoptose, mais especificamente em células não β, pois
a imunomarcação estava localizada na periferia das ilhotas pancreáticas. Além disso, foi verificado
que, embora a concentração de insulina sérica e o número de células marcadas para insulina
estivessem menores que o 5º dia de vida, os níveis glicêmicos estavam normais. Para justificar estes
achados, podemos sugerir que, após a proliferação celular em toda a ilhota no 5º dia e para
compensar o desequilíbrio hormonal existente nas ratas diabéticas, ocorreu uma transdiferenciação
das células não β para células β no dia 15. Esta transdiferenciação também foi observada por Liang
et al. (21), que demonstraram que as células alpha (α) foram capazes de se desdiferenciar em
precursores de células β no pâncreas de ratos neonatos que receberam streptozotocin, levando
estes animais a apresentar normoglicemia. Durante a fase adulta de ratas que receberam
streptozotocin, foi observado que o número de células marcadas para insulina e a concentração de
insulina sérica não apresentaram diferenças significativas em relação ao grupo controle. Entretanto
estas células não foram suficientes ou a insulina produzida não foi eficaz para controlar a
hiperglicemia estabelecida nas ratas diabéticas, confirmando as alterações glicêmicas encontradas.
Considerando as análises realizadas com o biomarcador PDX-1, a literatura demonstra que,
durante o período embrionário, o PDX-1 é necessário para formação e maturação das ilhotas
pancreáticas, sendo expresso em todo o pâncreas (33). Neste trabalho, foi observado que a
marcação para PDX-1 apareceu nos ácinos, ductos e ilhotas logo depois da destruição das células β
pancreáticas (D5) e somente nas ilhotas nos outros dias analisados. Nossos resultados estão de
acordo com os de Guo et al. (33) verificaram que, na vida adulta, este biomarcador não é mais
expresso no pâncreas exócrino, tornando-se específico apenas para as ilhotas pancreáticas. Assim,
sugerimos que, durante o período neonatal, as células pancreáticas ainda são imaturas e
necessitam deste fator de transcrição para se tornarem maduras, porém não está claro como o
PDX-1 atua neste processo de maturação das células pancreáticas, principalmente nas células β.
Além de estimular a expressão do fator de transcrição PDX-1, o hormônio GLP-1 promove
aumento da proliferação e inibe a morte por apoptose de células β pancreáticas. No presente
estudo, foi verificado que a imunomarcação para GLP-1 estava mais intensa em células não β, é
sugerido que, as células α em pontos de clivagem expressam o pró-hormônio convertase que 1/3
(PC1/3), que resulta na produção local de GLP-1 (34, 35). Embora o GLP-1 estimulasse as células β a
se proliferarem a partir do dia 15 de vida das ratas diabéticas, a proliferação destas células foi
menor a partir deste dia e na fase adulta, mostrando que as células β não responderam
diretamente ao estímulo de GLP-1 para se proliferarem. Entretanto, o fato das ratas diabéticas com
90 dias terem apresentado maior nível de insulina sérica e maior número de células marcadas para
insulina está relacionado à maior imunomarcação de GLP-1, que estimulou a biossíntese e secreção
de insulina pelas células β. Isto sugere que a secreção de insulina pelas células β na idade adulta
(D90) foi devido à transdiferenciação das células não β em β visto que o número de células não β
marcadas para apoptose foi reduzida, confirmando a ação de GLP-1 como inibidor de morte celular.
Além disso, não foi verificada alteração na proliferação de células β pela marcação com Ki-67,
confirmando a suposição da regeneração das células β por transdiferenciação das células não β
para β durante a vida adulta.
Na prenhez de ratas diabéticas, o GLP-1 continuou estimulando as células β a sintetizar e
secretar insulina, mas foi insuficiente para manter o nível de insulina, levando à hiperglicemia e
presença de intolerância à glicose. Além disso, o número de células β marcadas para insulina
reduziu drasticamente no grupo diabético.
No presente estudo, embora possa ter ocorrido regeneração entre os primeiros dias de
vida e a fase adulta, os animais com 90 dias e na prenhez continuaram a apresentar área reduzida
das ilhotas pancreáticas, hiperglicemia, intolerância à glicose e porcentagem aumentada de
hemoglobina glicada. Já, na prenhez, houve diminuição de células imunomarcadas positivamente
para insulina em relação aos 90 dias de vida do mesmo grupo e em relação o grupo controle. Além
disso, as ratas prenhes diabéticas apresentaram aumento do número de células quiescentes.
Associado às alterações já mencionadas, nosso grupo de pesquisa evidenciou que os animais com
diabete moderado apresentaram aumento de lipoperoxidação, o que caracteriza um quadro de
estresse oxidativo exacerbado (dados não mostrados) e há evidências que estresse oxidativo é um
fator estimulante para a célula se manter na fase G0 do ciclo celular (36). Desta forma, sugere-se
que, com o aumento do estresse oxidativo nestas ratas, esteja ocorrendo um aumento do número
de células quiescentes, reduzindo assim o número de células marcadas para insulina durante a
prenhez.
Portanto, nossos resultados mostraram que, quando ratos neonatos receberam a droga β
citotóxica (streptozotocin), ocorreu destruição das células β pancreáticas, resultando em alterações
na morfologia das ilhotas pancreáticas e, consequentemente, um quadro de hiperglicemia. Contudo,
estas células conseguiram se regenerar e recuperam a estrutura da ilhota. Porém, esta regeneração
foi parcial ou insuficiente visto que a área e o número de células marcadas para insulina
permaneceram menores. Durante a vida adulta, o número de células positivas para insulina foi
similar aos de ratas não-diabéticas, sugerindo que entre os 15 dias de vida e a fase adulta ocorreu
uma nova onda de regeneração, fazendo com que os animais diabéticos apresentassem número de
células que não diferissem dos animais controle. No entanto, quando as ratas foram submetidas a
uma sobrecarga de glicose, as células produtoras de insulina de ratas diabéticas adultas não
conseguiram manter a homeostase da glicose, levando a picos hiperglicêmicos no teste,
caracterizando um quadro de intolerância à glicose.
CONCLUSÃO
Os biomarcadores utilizados neste estudo foram eficazes para demonstrar a regeneração
das células β pancreáticas frente à destruição das mesmas, contudo esta regeneração não foi
suficiente para compensar a perda de células causada no início da vida (período neonatal). Desta
forma, é necessário compreender de forma mais aprofundada o processo de regeneração, como a
conversão de uma célula não β para uma célula β, visando novas terapias a fim de diminuir as
complicações causadas pelo diabete.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem Talísia Collachiti Moreto, pelo auxílio técnico no cuidado com os
animais; Yuri K Sinzato, Bruna Dallaqua, Isabela L Iessi, pelas discussões sobre diabete moderado, e
FAPESP, pela bolsa (Processo 2011/15606-6) e pelo auxílio financeiro concedidos (Processo
2011/18519-7).
REFERÊNCIAS
(29) American
Diabetes
Association
(ADA),
2013.
http://care.diabetesjournals.org/content/33/Supplement_1/S3.full.pdf+html
(30) Kordowich S, Mansouri A, Collombat P. Reprogramming into pancreatic endocrine cells based
on developmental cues. Mol Cell Endocrinol, 2009; 315(1-2): 11-8.
(31) Sartorelli DS & Franco LJ. Tendências da Diabetes mellitus no Brasil: o papel da transição
nutricional. Cad Saúde Pública Rio de Janeiro. 2003; 19(1): 29-36.
(32) Giannella-Neto D. State of endocrinology and diabetology in Brazil. Indian J Endocrinol Metab.
2011; 15(2): 118-9.
(33) Pechhold K, Koczwara K, Zhu X, Harrison VS, Walker G, Lee J, Harlan DM. Blood glucose levels
regulate pancreatic β-cell proliferation during experimentally-induced and spontaneous
autoimmune diabetes in mice. PLoS ONE, 2009; 4(3): 1-13.
(34) Scharfmann R, Duvillie B, Stetsyuk V, Filhoulaud G, Guillemain G. β-cell development: the role
of intercellular signals. Diabetes, obesity and metabolism, 2008; 10(4): 195-200.
(35) Sociedade Brasileira De Diabetes. Diagnóstico e classificação do Diabetes mellitus e tratamento
do Diabetes mellitus tipo 2. Consenso Brasileiro sobre Diabetes. 2011; 1-60.
(36) Bregenholt S, Moldrup A, Blume N, et al. The long-acting glucagon-like peptide 1 analogue,
liraglutide, inhibits β-cell apoptosis in vitro. Bioch Bioph Res Com. 2005; 330(2): 577-84.
(37) Haber EP, Procópio J, Carvalho CRO, et al. New insights into fatty acid modulation of pancreatic
β-cell function. Int Rev Cytol. 2006; 248: 1-41.
(38) Gu G, Brown JR, Melton DA. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell
fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 2003; 120(1): 35-43.
(39) Gannon M, Ray MK, Van Zee K, et al. Persistent expression of HNF6 in islet endocrine cells
causes disrupted islet architecture and loss of beta cell function. Development. 2000; 127(13):
2883-95.
(40) Li SW, Koya V, Li Y, et al. Pancreatic duodenal homeobox 1 protein is a novel β-cell-specific
autoantigen for type I diabetes. Lab Invest. 2010; 90(1): 31-9.
(41) Bouckenooghe T, Vandewalle B, Moerman E, et al. Expression of progenitor cell markers
during expansion of sorted human pancreatic beta cells. Gene Expr. 2005; 12(2): 83-98.
(42) Minami K & Seino S. Regeneration of the pancreas. Nihon Rinsho. 2008; 66(5): 926-31.
(43) Bonner-Weir S & Weir GC. New sources of pancreatic beta-cells. Nat Biotechnol. 2005;
23(7): 857-61.
(44) Kim BM, Han YM, Shin YJ, et al. Clusterin expression during regeneration of pancreatic islet
cells in streptozotocin-induced diabetic rats. Diabetologia. 2001; 44(12): 2192-202.
(45) Ain R, Konno T, Canham LN, et al. Phenotypic Analysis of the Rat Placenta. In: Placenta And
Trophoblast: Methods And Protocols Vol. 1 (Methods in Molecular Medicine). Ed. Michael J.
Soares and Joan S. Hunt. Humana Press 2005.
(46) Lenzen S.
The
mechanisms
of
alloxan
and streptozotocin-induced
diabetes.
Diabetologia. 2008; 51(2): 216-26.
(47) Portha B, Levacher C, Picon L, et al. Diabetogenic effect of streptozotocin in the rat during
the perinatal period. Diabetes. 1974; 23(11): 889-95.
(48) Portha B, Blondel O, Serradas P, et al. The rat models of non-insulin dependent diabetes
induced by neonatal streptozotocin. Diabete Metab. 1989; 15(2): 61-75.
(49) Liang XD, Guo YY, Sun M, et al. Streptozotocin-induced expression of Ngn3 and Pax4 in
neonatal rat pancreatic α-cells. World J Gastroenterol. 2011; 17(23): 2812-20.
(50) Georgia S & Bhushan A. β cell replication is the primary mechanism for maintaining
postnatal β cell mass. J Clin Invest. 2004; 114(7): 963-8.
(51) Kaya-Dagistanli F & Ozturk M. The role of clusterin on pancreatic beta cell regeneration
after exendin-4 treatment in neonatal streptozotocin administrated rats.
Acta
Histochem. 2013; 115(6): 577-86.
(52) Del Zotto H, Gomez Dumm CL, Drago S, et al. Mechanisms involved in the beta-cell mass
increase induced by chronic sucrose feeding to normal rats. J Endocrinol. 2001; 174(2):
225-31.
(53) Flier SN, Kulkarni RN, Kahn CR. Evidence for a circulating islet, cell growth factor in
insulin-resistant states. Proc Natl Acad Sci USA. 2001; 98(13): 7475-80.
(54) Peshavaria M, Larmie BL, Lausier J, et al. Regulation of pancreatic beta-cell regeneration in
the normoglycemic 60% parcial-pancreatectomy mouse. Diabetes. 2006; 55(12): 3289-98.
(55) Sinzato YK, Lima PH, Campos KE, et al.
Neonatally-induced diabetes: lipid profile
outcomes and oxidative stress status in adult rats. Rev Assoc Med Bras. 2009; 55(4): 384-8.
(56) Bonner-Weir S, Trent DF, Honey RN, et al. Responses of neonatal rat islets to
streptozotocin: limited B-cell regeneration and hyperglycemia. Diabetes. 1981; 30(1): 64-9.
(57) Mello MAR, Souza T, Braga LR, et al. Glucose tolerance and insulin action in monosodium
glutamate (MSG) obese exercise-trained rats. Physiol Chem Phys Med. 2001; 33(1): 63-71.
(58) Damasceno DC, Kempinas WG, Volpato GT, et al. Anomalias Congênitas: Estudos
Experimentais, 1ed. Coopmed, Belo Horizonte, 2008.
(59) Portha B, Levacher C, Picon L, et al. Diabetogenic effect of streptozotocin in the rat during
the perinatal period. Diabetes. 1974; 23(11): 889-95.
(60) Portha B, Blondel O, Serradas P, et al. The rat models of non-insulin dependent diabetes
induced by neonatal streptozotocin. Diabete Metab. 1989; 15(2): 61-75.
(61) Guo L, Inada A, Aguayo-Mazzucato C, Hollister-Lock J, Fujitani Y, Weir GC, Wright CVE,
Sharma A, Bonner-Weir S. PDX1 in ducts is not required for postnatal formation of β-cells but is
necessary for their subsequent maturation. Diabetes. 2013; 62(10):3459-68.
(62) Stoffers DA. The development of β cell mass: recent progress and potential role of GLP-1.
Horm Metab Res. 2004; 36: 811–21.
(63) Abraham EJ, Leech CA, Lin JC, Zulewski H, Habener JF. Insulinotropic hormone
glucagon-like peptide-1 differentiation of human pancreatic islet derived progenitor cells
into insulin-producing cells. Endocrinology. 2002; 143: 3152–61.
(64) Burdon RH, Gill V, Rice-Evans C. Cell proliferation and oxidative stress. Free Radic Res
Commun. 1989; 7(3-6):149-59.