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Fitotoxicidade do extrato aquoso de Duguetia furfuraceae
(St. Hil.) B et H. em ratas (Rattus norvegicus)
Toledo, M.R.S.1, Peres, M.T.L.P.1, Vieira, M.C.2, Bazzano, T.S.C.3; Teixeira, I.R.2; Moreles, L.A.4*, Ramos,
M.B.M. 2 , Valério, D. 4 , Kitaguti, E.H. 4 , Oliveira, H.G.N. 4 , Paula Souza, F. 4 , Lima, Z.V. 5
1Deptº de Ciências Biológicas-UFMS, Campus de Dourados. [email protected]; 2Deptº de Ciências Agrárias-UFMS,
Campus de Dourados, Caixa Postal 533, 79804-970, Dourados, MS. [email protected] ; 3Biotério do Centro de
Ciências Biológicas e da Saúde-UFMS, Campus de Campo Grande; 4Estudantes do Curso de Ciências Biológicas;
* Bolsista CNPq; 5Médica Nefrologista-Instituto do Rim, Dourados, MS.
RESUMO: Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B et H., Anonaceae, é conhecida popularmente como araticum do
campo ou araticum do cerrado. O chá de suas folhas é indicado na medicina popular para combater cólicas
e diarréia. Na literatura científica, poucos são os trabalhos com Duguetia e nenhum descreve a toxicidade
dessa planta. O objetivo deste estudo foi avaliar a possível ação abortiva e tóxica do extrato aquoso de
Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B et H em ratas prenhez (Rattus norvegicus da linhagem heterogênica Wistar).
A extração foi feita por maceração a quente e a frio nas concentrações de 5% (quente/24horas) e 5%, 10%
e 20% (a frio) (p/V), além do controle que recebeu água e ração. Os extratos foram administrados por
gavagem (1 mL/rata) em ratas prenhes, durante a pré-implantação do blastocisto até a organogênese (5º
ao 9º dia de prenhez). No 19º dia de prenhez, os animais foram anestesiados por inalação com éter e
submetidos a laparotomia e histerectomia, quando foram avaliados o peso e tamanho dos fetos, número
de corpos lúteos (para averiguação de aborto ou prenhez), peso dos ovários, útero, placenta, pâncreas, rins,
fígado e das ratas mães (1º, 5º, 9º e 19º). As ratas tratadas apresentaram forte diarréia, epistaxe e prurido.
Houve ainda, perda de peso corporal médio e hepatomegalia. Nas concentrações 5% e 10% a frio ocorreu
maior reabsorção em forma de cistos, evidenciando aborto, que embora não tenha sido significativo, foi
maior nas ratas tratadas, caracterizado também pelos corpos lúteos tanto no ovário direito quanto no
esquerdo. Esses resultados demonstram que, do ponto de vista de uma abordagem clínica, Duguetia
furfuraceae (St. Hil.) B et H. apresentou efeito tóxico nas ratas prenhes.
Palavras-chave: Duguetia furfuraceae, embriotoxicidade, teratologia, plantas medicinais
ABSTRACT: Toxicity of aqueous extract of Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B et H. in rats (Rattus norvegicus).
Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B. et H., Anonaceae, is popularly known as “araticum do campo” or “araticum do
cerrado”. Tea of their leaves is indicated in popular medicine to eliminate colics, diarrhea and hemorrhage of
uterus. On cientific literature there are little works about Duguetia and any one describes the toxicity of that plant.
The objective of this study was to evaluate the possible abortive and toxic action of aqueous extract of Duguetia
furfuraceae (St. Hil.) B et H. in pregnant rats (Rattus norvegicus of heterogenic Wistar lineage). Extraction was
done by maceration at hot and at cold in concentrations of 5% (hot/24 hours) and 5%, 10% and 20% (at cold) (p/
V ), besides control that receved water and ration. Extrats were administered by gavage (1mL/rats) in pregnant
rats, during pre-implantation of blastocyst until organogenesis (5º to 9º day of pregnancy). On 19º day of
pregnancy, animals were anesthetized by inhalation of ether and submited to laparatomy and hysterectomy,
when number, weight and size of fetus, number of luteous bodies (to verification of abort or pregnancy), weight
of ovary, uterus, placenta, pancreas, kidney, liver and mother rats (1º, 5º, 9º and 19º) were evaluated. Treated rats
showed: strong diarrhea, epistaxis and itch. There was also medium body weight loss and hepatomegaly. In
concentrations of 5% and 10% at cold occured great reabsorption in cyst forms, which evidenced abort, that
although it had not be significative, it was higher in treated rats, which was characterized also by luteous bodies
as in right ovary as in left ovary. Those results demonstrated that, from the point of view of a clinic approach,
Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B et H. showed toxic effect in pregnant rats.
Key words: Duguetia furfuraceae, embriotoxicity, teratology, medicinal plants
INTRODUÇÃO
Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B. et H.,
Anonaceae, é um arbusto com troncos lenhosos
múltiplos, com base subterrânea que o torna resistente
ao fogo, formando aglomerados e com (forma moitas)
Recebido para publicação em 01/02/2004.
Aceito para publicação em 31/10/2006.
1 a 3 m de altura. Possui ramos finos, folhas simples
inteiras, geralmente com galhas (caroços),
lanceoladas, pecioladas, alternas, ápice agudo, base
atenuada, margens inteiras, coriáceas, de coloração
mais pálida na face inferior. As flores são solitárias e
axilares, com três sépalas imbricadas e seis pétalas
róseas; os frutos são múltiplos (Corrêa, 1984;
Bontempo,1994; Barroso et al., 1999). Na medicina
popular, é conhecida como marolinho, araticum-do-
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campo, araticum-do-cerrado e araticum-bravo, ata
brava, ata de lobo. Forrageira acessível de mediana
aceitabilidade pelo bovino. O chá de suas folhas é
indicado para combater dismenorréia, metrorragia e
diarréia. (Sangalli, 2000; Lorenzi & Matos, 2002).
Segundo Pott & Pott (1994), cascas e raízes
combatem reumatismo, o fruto é usado para amolecer
feridas. Silva (1998) cita que seu fruto é consumido
“in natura”. O chá da raiz é usado como calmante,
anti-reumático, para dores nos rins e de coluna.
Gottsberge (1987) comenta que a raiz é usada contra
dores de estômago. Rodrigues & Carvalho (2001)
relatam serem suas folhas anti-reumáticas e poderem
ser usadas em infuso ou tisana: uma xícara de café
com ramos e folhas picadas para um litro de água.
Tomar de três a quatro xícaras de chá ao dia. Gavilanes
& Brandão (1998) referem-se ao fato de as sementes
serem utilizadas contra piolho.
O estudo fitoquímico da Duguetia permitiu a
determinação de um óleo essencial contendo betacariotileno, germacreno e delta elemeno como
principais componentes. Dentre os constituintes fixos,
a anonaína (um alcalóide), anonacilina II (de atividade
pesticida), saponinas e acetogeninas, os estudos
farmacológicos demonstraram a existência de várias
propriedades biológicas incluindo a ação citotóxica,
antimalárica e antimicrobiana (Souza et al., 1991).
Em teratogenia, o estudo dos efeitos tóxicos
de algumas drogas, podem se manifestar em
desenvolvimento fetal retardado com redução de peso
fetal. A implantação do blastocisto em mamíferos
prenhes requer uma série de fenômenos integrados
que incluem a preparação uterina, transporte do
embrião, anexos embrionários, transformação uterina,
desenvolvimento placental e sistema hormonal para
apoiar cada passo (Aliverti et al., 1979).
Uma percepção do mecanismo de fracasso
da pré e pós-implantação do blastocisto por toxicidade,
em experiências com drogas, é necessária para avaliar
melhor riscos reprodutivos. Como um auxílio,
pesquisas estão sendo feitas para provar tal situação,
com pools de testes desenvolvidos para sondar estes
mecanismos pelos quais substâncias químicas puras
isoladas de plantas afetam a fertilidade em roedores.
O protocolo de prenhez provê informação doseresposta sobre os efeitos de exposição, em curto
prazo, de animais com indução de prenhez
(Cummings, 1990).
A pré e pós-implantação do blastocisto sofrem
efeitos fisiológicos diferenciais sobre o efeito de tais
substâncias químicas, servindo para distinguir
embriotoxicidade de efeitos tóxicos diretos nas
funções uterinas. Pode-se avaliar, por exemplo, a
perda embrionária por aceleração ou retardo das
implantações dos embriões no útero, o que comprova
então, que efeitos tóxicos podem influir na fertilidade,
seguida de prenhez precocemente interrompida. Além
disso, a toxicidade na mãe é também um possível fator
de malformações fetais em ratas (Khera 1984; Cummings,
1990).
Dada a controvérsia existente acerca do uso
empírico e o pouco conhecimento científico a respeito
dos efeitos fitotóxicos, objetivou-se avaliar a ação fitotóxica
do extrato aquoso a quente e a frio das partes aéreas de
Duguetia furfuraceae (St. Hil.) B. et H. em ratas prenhes.
MATERIAL E MÉTODO
1. Animais
Foram utilizadas ratas albinas, virgens, da
linhagem heterogênica Wistar (Rattus norvegicus)
provenientes do Biotério da Universidade Federal de
Mato Grosso do Sul, Campus de Campo Grande. Os
animais foram mantidos em gaiolas de polietileno
forradas com maravalha, no Biotério do Núcleo
Experimental de Ciências Agrárias, da UFMS, em
Dourados, em ambiente com temperatura controlada
(aproximadamente 26ºC) e ciclo claro-escuro de 12
horas (Almeida & Lemonica 2000).
Antes do início dos experimentos, os animais
foram aclimatizados por um período de 10 dias, para
adaptação ao novo meio, recebendo apenas água
destilada e ração ad libitum. Depois, foram pesadas
e colocadas cinco fêmeas em cada caixa já contendo
dois machos, os quais necessitavam demarcar
território. As gaiolas e as fêmeas foram devidamente
identificadas e fichadas.
2. Material vegetal
A espécie Duguetia furfuracea (St. Hil.) B et
H. foi coletada na Fazenda Santa Madalena, estrada
Dourados – Ithaum, rodovia BR 270, km 45, no período
matutino no mês de junho de 2003. A espécie foi
identificada por Andréia Sangalli e a exsicata está
depositada no Herbário DDMS, sob número 21
(Sangalli, A. - 69 em 16/06/2003).
3. Extração, concentração e via de administração
3.1. Extração a quente:
As folhas foram secas à temperatura ambiente,
sendo 20 g trituradas e submetidas à extração com
água destilada (100 mL) a 40ºC por 24 horas, obtendose, após a filtração, o extrato aquoso. A solução
tratamento foi preparada na concentração 5% p/V.
3.2. Extração a frio
A extração a frio nas concentrações 5%, 10%
e 20%, foram feitas por maceração com água destilada
(100 mL), obtendo-se após filtração, o extrato aquoso,
sendo a solução tratamento preparada nas
concentrações 5%, 10% e 20% p/V. O grupo controle
recebeu água filtrada e ração ad libitum.
4. Procedimentos experimentais
O delineamento experimental utilizado foi o
inteiramente casualizado, com quatro tratamentos
(5%, 10% e 20% a frio e 5% a quente) e cinco
repetições. Cada parcela foi constituída por cinco
fêmeas, que foram submetidas ao acasalamento “over
night”. Foram consideradas prenhes as ratas nas quais
havia presença de espermatozóides nos esfregaços
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vaginais, associado à fase estro. Este dia foi
considerado dia zero de prenhez (Kato et al., 1979).
Confirmada a prenhez, as ratas foram separadas dos
machos e mantidas em gaiolas grandes de polietileno
com capacidade para cinco fêmeas, onde receberam
os diferentes tratamentos.
4.1. Grupos experimentais
Os animais foram distribuídos em oito grupos:
G1, G2, G3, G4, G5, G6, G7, G8, sendo G(n=20) o
grupo da concentração 5% à quente, 24 horas, e G2,
G3, G4, respectivamente (n=20), a 5%, 10% e 20% a
frio. Os demais grupos foram grupos controle de cada
tratamento (n=20).
Do 5º ao 9º dia de prenhez (pré-implantação
do blastocisto até organogênese), cada grupo recebeu
os extratos da planta (1 mL/rata) (p/V) inoculados por
gavagem uma vez ao dia. No 19º dia, as ratas foram
sacrificadas por inalação com éter, realizando-se
laparotomia com histerectomia, expondo os cornos
uterinos, que foram abertos para contagem dos pontos
de implantação, pontos de reabsorção e número de
fetos vivos e mortos. Na ausência de desenvolvimento
fetal ou de pontos de implantação visíveis, o útero foi
submetido à técnica de coloração com reativo de
Salewsky (1964), para visualização e determinação
desses pontos (Rabello-Gay, 1998).
Os fetos foram retirados do útero, contados,
medidos e pesados, separados de suas respectivas
placentas, que também foram pesadas,
individualmente. Todos os fetos foram observados em
estereomicroscopia para diagnóstico de anomalias e/
ou malformações externas. Foi considerada
malformação quando as anormalidades estruturais
encontradas eram incompatíveis com a sobrevivência,
e anomalia quando da ocorrência de alteração do
processo normal do desenvolvimento sem
comprometimento da função geral e desenvolvimento
pós-natal do indivíduo (Almeida & Lemonica, 2000).
Um terço dos fetos de cada ninhada foi
submetida à análise de anomalias e/ou malformações;
um terço, para análise das anomalias e/ou
malformações viscerais e um terço, para o método da
coloração com Alcian Blue (Wilson, 1965) que permite
melhor visualização da meningomielocele e defeitos
no fechamento do tubo neural.
Para a observação de anomalias e/ou
malformações ósseas, os fetos foram diafanizados e
corados com Alizarina S (Rabello-Gay, 1998). Para a
observação de anomalias e/ou malformações viscerais,
os fetos foram colocados em solução de formol a 10%,
para fixação das estruturas viscerais e posterior
descalcificação óssea, que foram avaliadas
posteriormente pelo método de secções semi-seriadas
de Wilson (1965). Foi feita também a contagem dos
pontos de ossificação para determinação do grau de
desenvolvimento fetal (Rabello–Gay, 1998). Foram
contados os corpos lúteos para averiguação de aborto
ou prenhez, e pesado ovário, útero, pâncreas, baço,
rim e fígado. As ratas mães foram pesadas no 1º, 5º,
9º e 19º da montagem do ensaio.
A contagem de pré-implantação de corpos
lúteos foi calculada pela fórmula:
nº de corpos lúteos —_ nº de implantações
nº de corpos lúteos x 100
A contagem de pós-implantação foi calculada
pela fórmula:
nº de implantação —_ nº de fetos vivos
nº de implantações x 100
Análise estatística
Os dados foram submetidos à análise de
variância, e quando detectada diferença significativa
entre tratamentos, as médias foram comparadas pelo
teste de Tukey, considerando-se a significância de 5%
.
RESULTADO E DISCUSSÃO
Em nenhum grupo experimental, houve
mortes maternas; porém, em todos os tratamentos
as fêmeas apresentaram diarréia, prurido e epistaxe,
que ocorreu com maior freqüência conforme o aumento
da concentração do extrato da Duguetia. Não houve
aumento de peso significativo nas fêmeas, desde o
início do tratamento até o dia do sacrifício (Tabela 1),
provavelmente pela presença da diarréia. Esses
resultados indicam uso errôneo da Duguetia, pois de
acordo com a literatura (Sangalli, 2000; Lorenzi &
Matos, 2002) deve ser usada no tratamento de
diarréia. Nas ratas tratadas, após laparotomia e
histerectomia, foram observadas presença de
placentas esbranquiçadas (Figura 1a), certamente, por
redução na circulação e nas trocas materno-fetais.
Em alguns úteros ocorreu presença de
placenta diminuta sem feto (Figura 1a), o que indica
claramente a reabsorção do mesmo. A maioria dos fetos
dos grupos tratados apresentou peso e tamanho
pequeno para a idade de prenhez com relação aos
grupos controle (Figura 1b). Dois úteros achavam-se
preenchidos por um líquido semelhante ao amniótico e
desprovido de fetos (Figura 1c); no entanto a quantidade
de líquido coletada e enviada para a análise foi
insuficiente para um diagnóstico confirmativo.Todavia,
observou-se pontos de implantação de blastocistos
Os pesos dos fígados das ratas tratadas
tiveram aumento médio significativo, em relação à
média das ratas do grupo controle, o que indica ação
hepatotóxica da planta em estudo.
A maioria dos úteros das ratas tratadas
apresentou presença de cistos (Tabela 1), o que
comprova a implantação do blastocisto; porém, sem
desenvolvimento fetal (Figura 2a).O número médio de
abortos e o de absorções em forma de cistos das
ratas que foram submetidas ao tratamento sofreu
redução apreciável, em relação à média daquelas do
grupo controle, porém, não significativa. A presença
de malformações nas ninhadas ocorreu principalmente
durante a organogênese. Independente do tratamento,
as anomalias e malformações esqueléticas e
viscerais foram semelhantes entre os grupos.
Rev. Bras. Pl. Med., Botucatu, v.8, n.4, p.218-222, 2006
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TABELA 1. Médias do peso inicial (Pi), peso ao 5º dia (P5), peso ao 9º dia, (P9), peso final (P19), peso de
fígado (PF), número de cistos (NC), número total de corpos lúteos (NTCL), número de corpos lúteos do ovário
direito (NCLOD) e esquerdo (NCLOE) de ratas prenhes submetidas a diferentes concentrações e temperaturas
do extrato aquoso de Duguetia furfuraceae (ST. Hil.) B. et H. UFMS, Dourados, 2003.
Tratamentos
Características
Pi
P5
P9
P19
PF
NC
NTCL
NCLOD
NCLOE
5% frio
177,0ab
214,2b
207,2b
243,8ab
11,7a
6,2a
15,6ab
7,6ab
6,6ab
10 % frio
197,0ab
213,8b
205,0b
241,3ab
11,2a
10,4a
21,4a
10,0a
11,4a
20 % frio
199,6ab
217,4b
212,2b
220,2 b
12,5a
5,2ab
10,2b
5,2ab
7,4ab
5% quente
172,6b
197,1b
190,8b
254,5ab
11,2a
5,2ab
16,8ab
7,6ab
9,2ab
Testemunha
228,8a
268,6a
255,2a
281,6a
9,2b
0,0b
7,6b
3,6b
4,2b
Médias seguidas por letras distintas diferem entre si, pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.
a
c
b
FIGURA 1. a) placenta diminuta e placentas esbranquiçadas; b) feto normal (controle) e fetos tratados (protrusão
dos olhos e hepatomegalia); c) útero desprovido de fetos, com líquido semelhante ao amniótico.
Em alguns úteros ocorreu presença de
placenta diminuta sem feto (Figura 1a), o que indica
claramente a reabsorção do mesmo. A maioria dos
fetos dos grupos tratados apresentou peso e tamanho
pequeno para a idade de prenhez com relação aos
grupos controle (Figura 1b). Dois úteros achavam-se
preenchidos por um líquido semelhante ao amniótico
e desprovido de fetos (Figura 1c); no entanto a
quantidade de líquido coletada e enviada para a
análise foi insuficiente para um diagnóstico
confirmativo.Todavia, observou-se pontos de
implantação de blastocistos
Os pesos dos fígados das ratas tratadas
tiveram aumento médio significativo, em relação à
a
média das ratas do grupo controle, o que indica ação
hepatotóxica da planta em estudo.
A maioria dos úteros das ratas tratadas
apresentou presença de cistos (Tabela 1), o que
comprova a implantação do blastocisto; porém, sem
desenvolvimento fetal (Figura 2a).O número médio de
abortos e o de absorções em forma de cistos das
ratas que foram submetidas ao tratamento sofreu
redução apreciável, em relação à média daquelas do
grupo controle, porém, não significativa. A presença
de malformações nas ninhadas ocorreu principalmente
durante a organogênese. Independente do tratamento,
as anomalias e malformações esqueléticas e
viscerais foram semelhantes entre os grupos.
b
c
FIGURA 2. a) útero com cistos; b) defeito no fechamento do tubo neural, região posterior; c) fetos pequenos
para o dia de prenhez , com pontos hemorrágicos na região cefálica (a seta indica ainda, atrofia da pata
superior direita.
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Em todos os grupos experimentais foram Em todos
os grupos experimentais foram diagnosticadas mal
formações ou anomalias iagnosticadas malformações
ou anomalias externas, tais como meningomielocele
(Figura 2b) com saco parcialmente epitelializado, pele
fina e pegajosa, defeito no fechamento do tubo neural
na região anterior e posterior, falta de rigidez axial e
pontos hemorrágicos em várias partes do corpo.
Notou-se ainda ocorrência de hepatomegalia com
atrofia pulmonar, língua protrusa, protrusão branda dos
olhos e exocefalia branda. Um único feto nasceu com
atrofia da pata superior direita (Figura 2c).
A contagem total dos pontos de ossificação
foi em média 28,95 no grupo controle e 12,07 nos
grupos tratados, evidenciando diferença significativa
entre os grupos. Também foram observadas hemivértebras, arcos fundidos, vértebras e costelas
fundidas com o externo. Os números de pares de
somitos em alguns fetos foram menores que o
desenvolvimento real do mesmo, indicando um
retardamento de pelo menos três dias na
organogênese. Estas malformações observadas não
foram significativas.
O total de corpos lúteos dos tratamentos
apresentou uma redução significativa em relação a
testemunha (Tabela 1), sendo o mesmo efeito observado
para a característica corpo lúteo ovário direito e esquerdo.
CONCLUSÃO
O efeito da embriotoxicidade na fase de
prenhez (5º ao 9º dia) é mais complexo do que
geralmente é assumido pelos pesquisadores
(Spielmann et al., 1977). No entanto, os resultados
obtidos indicam provável toxicidade dos extratos
testados da Duguetia furfuraceae, trazendo a
necessidade da realização de outras pesquisas, sobre
o uso medicinal desta planta.
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